Introduzione

La filogenetica è la scienza che analizza le relazioni evolutive tra:

- specie
- individui
- geni
- entità biologiche
Ci chiediamo:
• qual'è la relazione evolutiva tra le varie entità ?
• in che modo si trasformano le sequenze durante il processo evolutivo ?
• esistono dei modelli matematici affidabili che possono descrivere l'evoluzione attraverso
l'analisi delle sequenze di nucleotidi o di aminoacidi ?

La filogenesi è una branca della filogenetica, che studia la storia evolutiva di un gruppo di
organismi alla luce delle loro relazioni reciproche di discendenza e di affinità.
La vita sulla Terra si è evoluta da un singolo organismo LUCA (=Last Universal Common
Ancestor).
Oggi viene condotta principalmente a livello molecolare e si basa sul confronto delle sequenze di
basi azotate (nucleotidi, purine: guanina e adenina; pirimidine: citosina e timina o uracile)
degli acidi nucleici (DNA ed RNA) e di amminoacidi delle proteine.
Si procede allineando le sequenze di specie diverse le une accanto alle altre; l'analisi delle
differenze di basi del DNA o di amminoacidi tra ciascuna coppia di sequenze, in tutte le posizioni
dell'allineamento, fornisce la misura della «distanza» tra le specie.

La filogenesi molecolare è una tecnica basata sull'analisi delle sequenze molecolari (DNA o
amminoacidi delle proteine). Nata nei primi anni Novanta, grazie ai progressi della biologia
molecolare e della bioinformatica. Notevole è stato il contributo della biochimica allo studio delle
diverse strutture primarie di alcune proteine (emoglobina, citocromo γ), che ha permesso
l'individuazione dei cosiddetti orologi molecolari. Nello studio della filogenesi è possibile
riconoscere diversi livelli di indagine: dall'analisi dei dati si può passare agli scenari evolutivi, alberi
filogenetici associati, a dati concernenti gli adattamenti, l'ecologia, la biogeografia, la tettonica delle
placche ecc.

• Tecniche tradizionali: basate su differenze fenotipiche (caratteristiche osservabili degli organismi:

omologie e analogie od omoplasie).
• Tecniche attuali: basate su differenze genotipiche, sequenze nucleotidiche o aminoacidiche. La
filogenesi molecolare permette, tramite particolari analisi statistiche e computazionali delle
sequenze nucleotidiche e proteiche, di ricostruire l'albero evolutivo delle specie.

Applicazioni della Filogenesi Molecolare:

• Classificazione degli organismi: La Filogenesi basata sulle sequenze genetiche ci fornisce
modelli più accurati dei gradi di parentela.
• Identificazione dei campioni (diagnostica, controllo qualità)
• Rilevamento di trasferimenti orizzontali di geni
• Studio dell'evoluzione dei geni (duplicazioni, acquisizione di nuove funzioni)
• Epidemiologia: Identificare l'origine e le vie di diffusione di un patogeno: il sequenziamento
molecolare e la filogenesi possono fornirci molte informazioni sulle origini di un focolaio di
infezione. Possono aiutarci ad elaborare nuove linee guida sanitarie.
• Forense: la filogenesi viene utilizzata per valutare le tracce di DNA, per individuare l'autore di un
crimine, per stabilire l'origine della contaminazione microbica di alimenti, stabilire la paternità di
un figlio.

Perchè usare le sequenze?

 a. Le sequenze sono molto adatte agli studi filogenetici perché a una maggiore distanza
evolutiva corrisponde una maggiore differenza tra sequenze omologhe (orologio
molecolare)
b. Fare sequenziamenti di materiale genetico è semplice, affidabile, poco costoso.
c. Le sequenze utilizzate sono molto specifiche e molto ricche di informazioni.
d. Se non fosse possibile reperire materiale genetico per gli studi evoluzionistici (come nei di
fossili) si possono utilizzare caratteristiche morfometriche. Ma non ci assicura lo stesso
livello di affidabilità delle sequenze perché spesso caratteristiche morfologiche simili
provengono da linee evolutive indipendenti (es. ali negli uccelli e nei pipistrelli – caratteri
analoghi)
Strutture omologhe: hanno un’origine evolutiva comune, ma non necessariamente una funzione
comune (es. ala di uccello e zampa di cavallo).
Strutture analoghe: svolgono la stessa funzione e presentano una somiglianza superficiale, ma
hanno origini evolutive diverse (es. ala di uccello e ala di insetto)

Il processo evolutivo
Il DNA è “simile” in organismi evolutivamente correlati.
Le mutazioni, errori nella trasmissione genetica, sono alla base dei processi evolutivi che,
a partire da una forma primitiva hanno prodotto nel tempo l'enorme diversità delle forme di
vita attuali, pur partendo da un unico progenitore comune: la radice dell'albero della vita.
La trasmissione dell'informazione genetica si ottiene attraverso il processo di replicazione
del DNA. Anche se l'apparato di replicazione e molto accurato è possibile che si
verifichino degli errori, ovvero mutazioni della sequenza di DNA che possono poi essere

“fissati” in tutta la popolazione degli individui di quella specie o in una larga frazione di
essa. Oltre alla sostituzione di un nucleotide con un altro, lungo la sequenza di DNA,
possono intervenire altri cambiamenti dovuti all'inserzione o alla delezione di tratti più o
meno lunghi di DNA, oppure a riarrangiamenti di vario tipo. Questo spiega perché gli
organismi viventi, pur discendendo da un unico progenitore comune, posseggono genomi
di dimensioni molto diverse tra loro, da alcuni milioni di nucleotidi nei batteri a circa tre
miliardi nell'uomo.

Le sequenze nucleotidiche di molti geni sono sufficientemente conservate nel corso

dell'evoluzione, tanto che i geni omologhi, cioè le sequenze simili perché derivate da un antenato
comune, sono riconoscibili anche attraverso distanze filogenetiche estremamente elevate. Perciò
si opera su geni omologhi. Ci sono due diversi tipi di omologia:
1. Due sequenze omologhe si definiscono ortologhe se appartengono a due specie diverse e il
loro processo di divergenza ha avuto origine in seguito al processo di speciazione da cui le due
specie suddette hanno avuto origine. In tal caso la sequenza originale da cui le due sequenze
derivano era presente nel più recente progenitore delle due specie.
2. Due sequenze si dicono paraloghe se il loro processo di divergenza ha avuto origine in
seguito ad un processo di duplicazione genica.
Solo nel primo caso l'evoluzione dei geni segue l'evoluzione degli organismi e la filogenesi delle
sequenze dovrebbe riprodurre quella degli organismi da cui queste derivano. Si assume che i
prodotti di geni ortologhi conservino la stessa funzione, mentre quelli di geni paraloghi spesso si
specializzano in funzioni differenti.
I geni codificati dal genoma mitocondriale sono sempre presenti in singola copia (quindi non ci
sono geni paraloghi, ma solo ortologhi), perciò viene spesso usato come modello per determinare
le relazioni filogenetiche tra le specie.

Ricostruzioni filogenetiche basate sul DNA:

1. Vantaggi:
• La descrizione dei caratteri non è ambigua (perché si basa su geni omologhi e
comparabili quantitativamente)
• La somiglianza dovuta a effetti ambientali, quindi non genetici, non interferisce.
L'evoluzione convergente implica spesso fenotipi simili ma genotipi differenti.
• La possibilità di analizzare tanti caratteri, quindi tanta variabilità e quindi maggiore
probabilità che i siti congruenti prevalgano su quelli incongruenti.
• La maggiore facilità di stimare i tempi di divergenza (cioè la lunghezza dei rami).
• I modelli statistici sono rigorosi.
• La possibilità di analizzare DNA non codificante (introni)
• Il DNA è presente in tutti gli individui.

2. Svantaggi:
• L'omoplasia può essere frequente.
• Gli stati del carattere (adenina, guanina, timina, citosina) sono pochi.
• Il tasso di mutazione può essere elevato.
• Le mutazioni ricorrenti modificano la relazione tra distanza genetica e distanza temporale.
• Le duplicazioni e il trasferimento orizzontale di geni possono essere identificati, ma
possono creare problemi nella ricostruzione filogenetica.
• L'omologia e l'omoplasia(=analogia) non possono essere distinte attraverso una analisi
dettagliata come per i caratteri fenotipici.
• I modelli di evoluzione del DNA possono essere molto complessi.
• Gli alberi di geni e di specie possono essere diversi.

 La cladistica
La cladistica, o sistematica cladistica, (dal greco κλάδος kládos = ramo), è un metodo di
classificazione naturale dei viventi, messo a punto dall’entomologo tedesco Willi Hennig
(1913-1976), che si basa sul grado di parentela ovvero sulla distanza nel tempo dell'ultimo
progenitore comune. Produce solo gruppi monofiletici, che comprendono un determinato
antenato e tutti i suoi discendenti.
È nota anche come analisi filogenetica.

Esempio di cladogramma

In base al metodo di classificazione cladistica

animali, piante e funghi vengono disposti in
gruppi tassonomici monofiletici (cladi)
comprendenti ciascuno un antenato comune e
tutti i suoi discendenti.
Le relazioni evolutive sono stabilite a partire
dai caratteri condivisi (omologie),
presumendo che esse stiano ad indicare un
antenato comune. Le strutture omologhe sono
quelle che, in diversi organismi, hanno
un'origine comune, anche se non necessariamente la stessa funzione. Ad esempio, i cheliceri
dei chelicerati sono omologhi alle seconde antenne dei crostacei.
Le omologie si contrappongono alle analogie (omoplasie). Due caratteri sono analoghi quando
non hanno un'origine comune ma condividono la stessa funzione. Ad esempio, le ali degli
uccelli sono analoghe alle ali delle farfalle, anche se evoluzionisticamente sono due cose distinte.
Lo studio cladistico si basa sull'identificazione delle omologie presenti in un gruppo in
studio.
Viene poi determinata la polarità di tali omologie, cioè si assume che gruppi di organismi di più
recente parentela condividano caratteri omologhi derivati. Questi caratteri derivati si sono
originati da una forma ancestrale di quei caratteri, presente prima delle diramazioni che hanno
dato origine al gruppo di organismi in studio.
Per stabilire quale sia la forma ancestrale e derivata di un carattere si identifica un outgroup, cioè
un gruppo di organismi esterno al gruppo in studio, perché originato da un antenato più
antico, ma più vicino evoluzionisticamente al gruppo in studio più di quanto sia qualunque
altro gruppo esterno. Lo stato del carattere presente nell'outgroup viene considerato ancestrale
(plesiomorfo) mentre lo stato o gli stati dei caratteri presenti nel gruppo in studio vengono definiti
caratteri derivati (apomorfi).
La condivisione di "caratteri derivati" da parte di un gruppo di organismi (sinapomorfia) è
indice di monofilia, cioè portano a considerare i membri di quel gruppo come derivati da un unico
antenato comune.
Per la cladistica solo i gruppi monofiletici, cioè organismi che condividono un antenato
comune recente, possono essere elevati al rango di clade e costituire una categoria
tassonomica.
La classificazione si basa inoltre sull'assunto che due nuove specie si formino "improvvisamente"
(cioè in un "breve" tempo geologicamente parlando secondo la teoria degli "equilibri punteggiati")
per separazione da un antenato comune anziché attraverso un graduale cambiamento evolutivo.
Tali relazioni sono illustrate mediante diagrammi (cladogrammi) formati da un sistema di
ramificazioni dicotomiche. Ciascun punto di ramificazione rappresenta una divergenza da un
antenato comune.
Linee filetiche discendenti dallo stesso ramo si dicono gruppi monofiletici. Se tale gruppo non
comprende tutti i discendenti del progenitore ancestrale verrà detto parafiletico.
Due taxa derivanti da un comune progenitore sono chiamati gruppi fratelli o, secondo la
terminologia inglese, sister taxa o sister groups.
Una analisi cladistica si può basare su un'ampia varietà di dati, incluse le analisi di sequenza del
DNA (cosiddetti "dati molecolari"), dati biochimici e dati morfologici.

Abstract:
I veri funghi (funghi) e gli organismi simili a funghi (ad esempio Mycetozoa, Oomycota)
costituiscono il secondo gruppo più grande di organismi sulla base delle stime di ricchezza globale,
con circa 3 milioni di specie previste. Rispetto alle piante e agli animali, i funghi hanno piani
corporei semplici con strutture spesso morfologicamente ed ecologicamente oscure. Ciò pone
sfide per identificazioni accurate e precise. Qui forniamo un quadro concettuale per
l'identificazione dei funghi, incoraggiando l'approccio della tassonomia integrativa (polifasica) per la
delimitazione delle specie, cioè la combinazione di genealogia (filogenesi), fenotipo (inclusa
l'autecologia) e biologia riproduttiva (quando possibile). Ciò consente una valutazione oggettiva
dei caratteri diagnostici, fenotipici o molecolari o entrambi. La verifica delle identificazioni è
fondamentale ma spesso trascurata. A causa delle storie evolutive specifiche del clade,
attualmente non esiste un unico strumento per l'identificazione dei funghi, sebbene il codice a
barre del DNA che utilizza lo spaziatore trascritto interno (ITS) rimanga una prima diagnosi, in
particolare negli studi di metabarcoding. I codici a barre del DNA secondario sono sempre più
implementati per i gruppi in cui ITS non fornisce una precisione sufficiente. Vengono discussi i
problemi delle identificazioni basate sulla similarità di sequenze a coppie e del clustering OTU e si
raccomandano approcci filogenetici basati sull'allineamento di sequenze multiple con successiva
verifica come alternative più accurate. Negli approcci di metabarcoding, il compromesso tra
velocità e accuratezza e precisione delle identificazioni molecolari deve essere attentamente
considerato. La variazione intragenomica dell'ITS e di altri marcatori di codici a barre dovrebbe
essere adeguatamente documentata, poiché la diversità del filotipo non è necessariamente un
indicatore della ricchezza delle specie. Strategie importanti per migliorare l'identificazione
molecolare dei funghi sono: (1) documentare ampiamente la variazione intraspecifica e
intragenomica dei marcatori di codici a barre; (2) espandere sostanzialmente i depositi di
sequenze, concentrandosi su cladi sottocampionati e taxa mancanti; (3) migliorare la cura delle
etichette di sequenza negli archivi primari e aumentare sostanzialmente il numero di sequenze in
base al materiale verificato; (4) collegare i dati della sequenza alle informazioni digitali dei
campioni di voucher, comprese le immagini. In parallelo, i miglioramenti tecnologici al
sequenziamento del genoma offrono alternative promettenti al codice a barre del DNA in futuro.
Nonostante la prevalenza della tassonomia fungina basata sul DNA, gli approcci basati sul
fenotipo rimangono una strategia importante per catalogare la diversità globale dei funghi e
stabilire ipotesi iniziali sulle specie

Conclusioni
“Come per altri organismi, le specie fungine non sono definite solo orizzontalmente attraverso la
coerenza filogenetica e fenotipica, ma anche verticalmente attraverso il tempo di origine e la
successiva diversificazione. Storie evolutive individualmente diverse rendono quindi impossibile
applicare criteri universali e univoci per la delimitazione, il riconoscimento e l'identificazione dei
funghi. La best practice dipende da ciascun gruppo e in molti casi permane ambiguità residua,
anche a causa dell'incompletezza degli strumenti di identificazione e dei dati di riferimento. Il
desiderio di approcci rapidi e automatizzati, come il clustering OTU e la mappatura BLAST basata
sulla similarità a coppie, amplifica questi problemi.
L'esplorazione completa dei vari approcci concettuali per delimitare le specie fungine, inclusa la
biologia riproduttiva, è attualmente possibile solo per taxa selezionati, inclusi gli organismi modello.
Poiché le generalizzazioni degli studi modello sono limitate a parenti stretti o taxa ecologicamente
equivalenti, questo approccio dovrebbe essere esteso per coprire specie selezionate in tutti i
gruppi di funghi, rappresentando la diversità di fenotipi, lignaggi e strategie nutrizionali. Per
catalogare ampiamente la diversità fungina, un approccio tassonomico integrativo (polifasico)
sembra più efficace, adattato al gruppo in studio e combinando dati molecolari e fenotipici. In molti
gruppi, il codice a barre del DNA a marker singolo può essere sufficiente, mentre taxa più
complessi richiedono una combinazione di marker di codici a barre primari e secondari o approcci
multi-marker. La filogenomica può essere impiegata per risolvere complessi di specie
particolarmente difficili, ma questo approccio richiede grandi risorse computazionali e personali ed
è attualmente limitato a casi di studio esemplificativi. Il fenotipo rimane una componente integrativa
della tassonomia fungina, che comprende anche dati derivati da colture e altre fonti. I tassonomi
continueranno a descrivere nuove specie in assenza di dati molecolari, in gruppi in cui questo
approccio è giustificato. Tuttavia, i dati fenotipici dovrebbero essere analizzati a fondo prima di
stabilire nuove specie con qualsiasi metodo. Se il materiale consente la generazione di dati
molecolari ma la metodologia per farlo non è disponibile, si raccomanda la collaborazione per
produrre tali dati. In generale, l'obiettivo rimane quello di documentare tutti i funghi con dati
molecolari. I dati fenotipici sono di particolare importanza quando si valuta lo stato di cladi
filogeneticamente distinti attraverso la tassonomia integrativa. In tali casi, l'analisi quantitativa di
matrici fenotipiche strutturate dovrebbe essere implementata per valutare la variazione fenotipica
in un contesto filogenetico, che consentirà anche l'individuazione di caratteri diagnostici affidabili.
A livello molecolare, ITS rimane il marcatore di codici a barre fungine universale per identificare
inizialmente i lignaggi filogenetici. Può quindi essere considerata una prima diagnosi. Dove ITS
non è sufficiente per discriminare tra specie, è necessario utilizzare marcatori secondari di codici a
barre o approcci multi-locus per ottenere il livello di precisione e accuratezza desiderato. Il modo
in cui i singoli marcatori risolvono le specie è determinato dal contesto e la fattibilità di particolari
marcatori non dovrebbe essere trasferita acriticamente da un gruppo tassonomico a un altro, ma
invece esplorata empiricamente per ogni taxon. Gli ITS rimarranno probabilmente il marker di
scelta per gli studi di metabarcoding dei funghi, sebbene approcci a lettura lunga o l'aggiunta di
marker di codifica a barre secondari miglioreranno l'accuratezza e la precisione. Tuttavia, gli
approcci di metabarcoding dovrebbero allontanarsi dal clustering OTU e dagli esercizi di
mappatura BLAST e implementare invece metodi filogenetici, come il posizionamento di lettura
(binning filogenetico).
I problemi attuali che sorgono con il codice a barre del DNA dei funghi non sono principalmente
dovuti a limitazioni concettuali dell'approccio, ma a carenze dei database di riferimento, tra cui
incompletezza in termini di copertura tassonomica, mancanza di diversità genetica adeguatamente
documentata e imprecisione delle etichette di sequenza. Occorre pertanto impegnarsi
maggiormente per migliorare ulteriormente queste risorse, in particolare la revisione continua e
critica dei dati esistenti per ottenere etichette di alta qualità”
L'orologio molecolare
L' Evoluzione molecolare è un processo divergente e il numero di mutazioni è direttamente
proporzionale al tempo intercorso dalla divergenza delle sequenze (Zuckerkandl & Pauling, 1965)
È quindi possibile calcolare il tempo trascorso dal momento in cui due sequenze hanno cominciato
a divergere, confrontando sequenze geniche corrispondenti (geni omologhi) di specie diverse.

L’impiego di sequenze molecolari per gli studi filogenetici si basa sull’assunto che le mutazioni
nelle sequenze geniche si verifichino casualmente, che dipendano dal tempo trascorso, e che una
certa proporzione di mutazioni si stabilizzi nelle molecole.
L’accumulo di mutazioni in un gene ha originato il concetto di “orologio dell’evoluzione” o
“cronometro molecolare”.
Seguendo l’analogia con l’orologio, le mutazioni (a volte anche in porzioni differenti dello stesso
gene) hanno velocità diverse, come i diversi elementi di un orologio (mesi, giorni, minuti secondi) si
muovono con velocità differenti.
Le sequenze che cambiano molto lentamente (anni, mesi, giorni) sono le migliori per studiare
eventi antichi mentre altre, con un tasso di mutazione maggiore (ore, minuti, secondi) sono un
mezzo per analizzare, con sensibilità e buona risoluzione, gli eventi recenti.