DIAGNOSTICA MOLECOLARE: identificazione di mutazioni nel menoma mediante l’analisi di

dna o rna. Vengono ricercate malattie genetiche ereditarie o acquisite, gnomiche o mitocondriali,
poligeniche, multifattoriali o mendeliane.
- DNA nucleare 2,91 x 10^9 bp; 4% sono esoni, 21% sono introni; i geni sono 80000; le regioni
intergeniche sono il 75%
il 7 % del genoma è specifico umano, mentre la restante parte è omologo a quello di altre specie.
Esistono nel genoma dei cluster:
- geni per RNA organizzati in tandem
- geni fisicamente separati, con pseudogeni, ma regolati da un’unica regione (alfa e beta
globulina)
- cluster composti: geni non correlati (sul cluster hla c’è anche la 21 idrossilasi)
esistono poi geni all’interno di altri geni (negli introni); esistono preudogeni: copie non funzionali
di geni che derivano da duplicazioni. Si suddividono in NON PROCESSATI (tutta la sequenza): in
questo caso possono essere funzionali o meno, e PROCESSATI (derivati da integrazione di cDNA
nel genoma): anch’essi possono essere funzionali o no (sequenze Alu).
- DNA mitocondriale: 16,6 kb, 33 geni; 2 geni x rRNA, 22 geni x tRNA, 13 geni x proteine della
fosforilazione ossidativi.

DIAGNOSI MOLECOLARE
Si esegue su dna, rna o proteine estratti da sangue, tessuti, amniociti o villi coriali.
Talvolta sul materiale genetico estratto da sangue è possibile studiare anche trascritti tessuto
specifici illegittimamente presenti anche in circolo, anche se il loro processing non è
necessariamente uguale a quello subìto nel tessuto.
Per fare diagnosi molecolare si esegue innanzitutto una consulenza genetica, si informa il paziente
dei rischi implicati nella propria riproduzione e nello sviluppare malattie genetiche. Al paziente
viene richiesta l’anamnesi e la storia familiare per costruire se è possibile un albero genealogico.
Molto importante è la diagnosi prenatale, che si può eseguire in prima istanza sul sangue materno
andando a dosare hCG, AFP e VE3 (estriolo no coniugato).

AFP VE3 hCG

Trisomia 21 ↓ ↓ ↑
Trisomia 18 ↓ ↓ ↓

Tecniche per diagnosi prenatali:

- anomalie cromosomiche: cellule fetali vitali
- livelli ormonali o enzimi: cellule o fluidi
- mutazioni puntiformi: DNA

AMNIOCENTESI
Liquido amniotico prelevato con un ago. Da questo campione si ricava liquido (20-30 ml) usato per
indagini biochimiche, cellule per indagini citogenetiche e o molecolari. C’è una percentuale di
rischio aborto (0,5%). Quando è necessaria una quantità > di DNA si tengono gli amniociti in
coltura.

VILLOCENTESI
Tessuto dal coron (placenta fetale); si fa x via transcervicale o transaddominale a seconda di dove si
trova la placenta. Si fa in 10-12 settimana, le cellule vengono usate per indagini citogenetiche o
molecolari; è importante la pulizia dei villi: si fa manualmente al microscopio per evitare
contaminazioni dalla madre. Il rischio di aborto con questa metodica è 1%; tuttavia si preferisce
questa metodica all’amniocentesi quando il rischio di patologie è più alto.
FUNICOLOCENTESI
Condocentesi: 19-21 settimane dall’ultima mestruazione; diagnosi in tempi rapidi; rischio aborto 2-
3%.

DIAGNOSI PREIMPIANTO
Viene eseguita su una singola cellula da un blastomero di 6-10 cellule ottenuto mediante
fecondazione in vitro. Può essere eseguita anche sui corpi polari (prodotto della prima divisione
mitotica nella oogenesi quando i cromosomi materni e paterni sono separati). Solitamente si fa PCR
e FISH.
Tecnologie emergenti mirano a isolare cellule o dna fetali dal sangue materno, dal momento che
quest’ultimo ha una breve emivita e quindi non c’è il rischio di confusione con gravidanze
precedenti.

TECNICHE CITOGENETICHE
Studiano le caratteristiche dei cromatidi, visti al microscopio e trattati con varie procedure.

MUTAZIONI GENICHE
Le mutazioni geniche , come dice la parola stessa, si verificano all’interno di un gene e possono
essere di varia natura: mutazioni puntiformi(a livello del singolo nt), traslocazioni (tipo cromosoma
Philadelfia), duplicazioni, delezioni . Le tecniche diagnostiche utilizzate per individuare queste
mutazioni, che sono causa di malattie, possono essere analisi di citogenetica(tra cui la FISH),
southern blot , PCR e altre ancora.
Per una maggiore chiarezza suddividiamo le mutazioni geniche in due gruppi ed analizziamo le
tecniche usate nell’uno e nell’altro gruppo.
Il primo gruppo comprende le DELEZIONI o le DUPLICAZIONI. Questo tipo di mutazioni
possono coinvolgere l’intero gene , gruppi di nt(inframe o outframe), uno o più esoni di un gene.
L’approccio diagnostico può essere DIRETTO, nel caso in cui sappiamo quali sono i geni o parte di
essi che vengono maggiormente interessati da quel tipo di mutazione e le andiamo a trovare
direttamente tramite analisi di southern blot e PCR quantitativi.(il gold standard per l’analisi
molecolare diretta è il sequenziamento del gene).Altro approccio è quello INDIRETTO(analisi di
linkage )al quale si ricorre spesso, ma non sempre, per lo studio delle malattie ereditarie non note.
La scelta di un sauthern o di una PCR quantitativa scaturisce dal fatto che in moltissimi casi è
necessaria una quantizzazione del materiale genetico, ad esempio nel caso di mutazioni nelle donne,
soprattutto per i geni sull’X, viene sempre effettuata perché sappiamo che la donna va incontro ad
un fenomeno di in attivazione dell’X casuale e la quantizzazione può aiutarci a capire quanto di
quel gene mutato è ancora funzionale. Una quantizzazione la possiamo fare anche nel caso di
duplicazioni a carico di geni che mappano sull’X, negli uomini ecc. Il secondo gruppo comprende
le mutazioni puntiformi(con esse comprendiamo anche le mutazioni che modificano siti di splicing
ecc.), in questi caso vengoo utilizzate altri tipi di tecniche diverse dal southern e dalla PCR il cui
utilizzo però non si esclude completamente.
Detto questo possiamo analizzare le tecniche singolarmente.

SOUTHERN BLOT QUANTITATIVO

Prima di tutto bisogna dire che in qualsiasi caso, qualsiasi tecnica stiamo utilizzando è sempre
necessario un controllo che sia interno o esterno non importa l’importante è che ci sia, tale controllo
o standard diventa fondamentale nel caso di una quantizzazione perché ci servirà come riferimento,
inoltre ci vuole anche un normalizzatore che ci consenta di essere sicuri che abbiamo la stessa
quantità di campione di partenza per ogni campione.
Quindi quando allestiamo un southern abbiamo bisogno di una sonda che ibridizzi con il target di
cui vogliamo attestare la presenza e non solo , ma vogliamo anche quantizzarlo, ed una sonda che
ibridizzi con un gene che sia egualmente espresso in tutte le cellule , che sia costante e non soggetto
a mutazioni(ex la β-tubulina).la figura riassume tutte le fasi salienti di un southern.

Una volta trasportato il contenuto del gel sul filtro del suothern avremo che tutte le bande del gel
sono passate sul filtro dove faremmo avvenire la reazione di ibridazione. Dopo la ibridizzazione
andremo ad effettuare una lettura densitometrica delle bande dei soggetti in esame, del controllo e
del normalizzatore.
Fatta la lettura, otterremo dei valori relativi ai controlli e ai campioni che avremo normalizzato. Per
sapere di quanto varia la dose genica del soggetto analizzato rispetto al o ai controlli usati dobbiamo
fare un semplice rapporto tra il valore ottenuto dal campione normalizzato fratto la media tra i
valori normalizzati ottenuti dai 2 controlli(se usiamo due controlli ovviamente).
Ex la lettura densitometrica del campione 1 ci dà 0,72, i due controlli ci danno 0,5 e 0,4 la media
è0,45. Facciamo il rapporto tra 0,72/0,45 =1,6. 1,6 rispetto ad una dose genica (che in un soggetto
normale è doppia , dato che per ogni gene abbiamo sempre due copie) pari ad 1 avrà una copia di
quello stesso gene in più(se 1 indica normale dose genica cioè 2 copie dello stesso gene 1,6
indicherà una copia in più e così via) . Tale quantizzazione è RELATIVA , infatti noi valutiamo la
dose genica di un paziente in relazione a quella di un soggetto che noi sappiamo essere un soggetto
normale con dose genica nota. Possiamo anche effettuare una quantizzazione ASSOLUTA se
creiamo una retta con varie concentrazioni di DNA ed estrapoliamo dalla retta il valore di
concentrazione del DNA del soggetto in esame.

densitometro
 PCR QUANTITATIVA

Di PCR credo che tutti ne abbiamo la pancia e la testa piena ma cmq ci tocca riascoltare sempre le
stesse cose. Quindi cerchiamo di farle bene.
La PCR quantitativa si basa sul principio di una normalissima PCR solo che precedentemente
facciamo una serie di prove per vedere quale ciclo della PCR rappresenta la fase log cioè la fase di
crescita esponenziale del numero di amplificato. Una volta fatte queste innumerevoli prove sapremo
perfettamente quando stoppare la nostra PCR. Ma perché stoppare la PCR in fase log? Perché ,
prima di tutto sappiamo che la PCR ha una sua cinetica, nel senso che con l’avanzare dei cicli
avremo una variazione nella quantità di DNA di partenza che come volume è uguale per tutti i
campioni(generalmente si mette 1μL di DNA di ogni i campioni, ma non sappiamo in quel micro
litro quanto DNA effettivamente c’è come concentrazione), la quantità di DNA che sarà
ovviamente amplificata aumenterà con l’aumentare dei cicli fino a raggiungere una fase di plateau
dove, pur continuando con i cicli non ci darà altre copie di DNA . Ciò si verifica perché magari
sono finiti i primers, la Taq non funziona più bene, sono finiti i dNTPs ecc.

Se considerassimo la fase di palteau non vedremmo nessuna differenza tra un campione e l’altro o
cmq sarebbero poco apprezzabili, se invece la PCR la stoppiamo alla fase log avremo copie di
DNA in più in quei campioni che partivano da una concentrazioni maggiore e viceversa.(logico
no?)Anche la PCR prevede dei controlli interni e controlli esterni. I controlli interni sono utili per
valutare la dose genica di un soggetto relativamente a quella di un gene che è costante nella sua
espressione e validato sperimentalmente(la solita β-actina),, questo controllo viene amplificato nello
stesso tubino di reazione usando una diversa coppia di oligont. Il controllo esterno , amplificato in
una reazione parallela , effettuata con le stesse condizioni e contemporaneamente, viene usato come
parametro per la quantizzazione assoluta. E’ necessario, come sempre, un normalizzatore che mi
indichi che la reazione di amplificazione stia procedendo bene (il normalizzatore potrebbe fungere
sia da normalizzatore che da controllo interno tranquillamente). Introduciamo , quindi, una coppia
di oligont che amplifichi una regione differente del gene target, deve essere una regione che non sia
soggetta a mutazioni e compagnia cantante. Nel caso del famosissimo gene della distrofina , come
normalizzatore viene usato l’esone 10 che codifica per una piruvato chinasi (PK), tale esone sta su
un autosoma quindi sarà perfetto sia se il paziente è una donna sia se è un uomo.
I prodotto di PCR devono essere separati con opportune tecniche di separazione che possono essere
rese più efficienti e veloci se marchiamo uno dei due primers con un fluorocromo(tecnica che viene
usata soprattutto nella separazione dei prodotti di multiplex PCR), anche i controlli sono marcati
con dei fluorocromi, che sono differenti da quelli dei campioni per distinguerli, vuoi che la ciorta fa
che un campione co-migri col controllo , noi ce ne freghiamo perché il fuolcroomo è differente e li
possiamo differenziare tra loro . Andiamo poi a quantificare la bande ed avremo dei valori per i
singoli soggetti e per i controlli(sia i campioni che i controlli devono essere normalizzati).

Rx= valore del picco dell’esone da quantizzare nel paziente/picco della PK nel paziente

Rc= valore del picco dell’esone da quantizzare nel controllo/picco della PK nel controllo

ID(indice diagnostico)= Rx/Rc

Normali con rapporto uguale a 1 Normali con rapporto di 0,55

Deleta con rapporto pari a 0,55 Deleto con rapporto pari a 0

Duplicate con rapporto pari a 1,5 Duplicato con rapporto di 1

Preciso che questi valori sono quelli di riferimento che si ottengono in patologie X-linked perché
per mutazioni autosomiche dovremmo avere valori uguali indipendentemente se si tratta di un uomo
o di una donna. Le tecniche di separazione sono anch’esse molto variegate, dalla classica
elettroforesi su gel d’agarosio(in cui il Dna migra essenzialmente in base alla massa, al PM .Infatti
per individuare il nostro frammento tra tanti usiamo un marker di PM che facciamo correre in un
pozzetto accanto ai campioni) alla più precisa e sofisticata elettroforesi capillare su gel.
Ma vediamola più nel dettaglio.

Elettroforesi capillare
Non è difficile intuire che questo tipo di elettroforesi avviene all’interno di un capillare dove il
rapporto volume/superficie è tale da favorire la dissipazione del calore quindi si può effettuare
anche ad alti voltaggi(essendo capillari molto sottili e molto lunghi il calore viene dissipato lungo
tutta la lunghezza del capillare).
Tramite l’elttroforesi capillare è possibile diagnosticare anche piccole delelzioni, a carico del
singolo nt perché ogni frammento, in base alla sua lunghezza, avrà un suo tempo di eluzione, ed in
base a quello possiamo fare diagnosi(anche se parziale , ci possono essere casi in cui quella piccola
variazione di tempo non è significativa di malattia, dipende).
La figura rappresenta il classico apparecchio elettroforetico(nella realtà è tutto molto più
coreografico). Ci sono 2 vaschette una contiene l’elettrodo positivo, l’altra quello negativo. Il
capillare va da una vaschetta all’altra e quando applichiamo la differenza di potenziale il tampone
va da una parte all’altra trascinando con sé il campione, che avremo precedentemente caricato nel
capillare, separandolo. Cosa molto sorprendente il rivelatore è posto verso il polo negativo. Questa
immagine mette alla prova l’esame di biochimica generale e le nostre conoscenze, ci chiediamo ma
il DNA non è negativo? Ma mi ricordo bene che migra verso il polo positivo? Se viaggia verso il
polo positivo, il rivelatore, per logica, non dovrebbe stare al polo positivo? Non vi preoccupate il
vostro voto di biochimica è salvo, il DNA è per noto un polianione e migra verso il polo positivo
però il capillare è rivestito da gruppi SiOH(definiti silanonici) che sono carichi negativamente ,
queste cariche negative si liberano quando il pH>4. una volta libere queste cariche saranno attratte
dalle cariche positive e attrarranno cariche positive, presenti nel tampone, creando un flusso di
corrente elletroendosmotica dotato di una forza tale da vincere la naturale attrazione del DNA verso
l’anodo e sarà trasportato di peso verso il polo negativo(catodo). Però nonostante questo flusso di
corrente, il DNA sarà sempre attirato dall’anodo e quindi sarà frenato nella sua corsa, e sarà frenato
proporzionalmente alla carica che porta ed anche , in misura però quasi irrilevante , dalla massa.
L’elettroforesi che utilizziamo generalmente in laboratorio però non è come questa analizzata ma
leggermente differente. La struttura è del tutto simile, ma aiutiamoci con una immagine.

Vediamo sempre due vaschette con due elettrodi , uno positivo e l’altro negativo. Il capillare è
immerso nelle due vaschette della cameretta elettroforetica, la prima differenza che notiamo è la
disposizione del rivelatore. Questo infatti è posto verso l’anodo(polo positivo), questo ci indica che
il campione viaggerà verso il polo positivo, in linea con le nostre conoscenze, il DNA è negativo e
migra verso il polo positivo in base al rapporto carica/massa. Questo si verifica perché il tubicino
capillare è rivestito di una guaina che isola i gruppi SiOH che generavano il flusso
elettroendosmotico forzando la migrazione del DNA verso il polo negativo. In assenza di questi
gruppi , il flusso non si crea e quindi il DNA è libero di migrare in base alla carica.
Questo particolare tipo di elettroforesi capillare prende il nome di elettroforesi capillare su gel.
Conserva il vantaggio di usare alti voltaggi con un’ottima efficienza di separazione.
La fase principale della elettroforesi capillare è il caricamento del capillare. Il capillare può
avvenire in diversi modi:
Applicando pressione ad una della estremità del capillare
Con il vuoto
Effetto sifone
Elettrocinetico. E’ il metodo che abbiamo analizzato più nel dettaglio. Il capillare viene
immerso in una cameretta contenente il campione e viene applicata una differenza di
potenziale , per un determinato tempo(dipende dalla quantità di campione che vogliamo
 caricare), dopo di cui prendiamo il capillare e lo immergiamo nel tampone, in questo modo
quando applicheremo la differenza di potenziale il tampone, migrando ,trascinerà con sé
anche il campione caricato.
Quello ke si ottiene è un diagramma con diversi picchi ke rappresentano gli spettri di emissione dei
campioni marcati con specifici fluorocromi.
Il metodo deve essere standardizzato facendo correre con il campione, ma marcato con un
fluorocromo differente , un marker di peso molecolare. Il diagramma può essere convertito in un
grafico logaritmico in cui sull’asse delle ascisse abbiamo la corsa dei campioni in cm e sulle
ordinate il log del pm. I due parametri sono inversamente proporzionali (come possiamo vedere dal
grafico).
Pm

corsa in cm

MAPH(multiple amplifiable probe hybridization)

L’amplificazione viene preceduta dall’ibridazione con delle sonde che vengono sintetizzate in
modo tale da avere la stessa sequenza al 3’e al 5’. Ci sono due modi per ottenere queste sonde:
Preparare le sonde che ibridizzino con tutti i singoli esoni di un gene(ex nel caso del gene
della distrofina prepariamo 79 sonde), di lunghezza differente. Le sonde vengono clonate in
un plasmide(79 plasimdi tutti uguali) , al clonaggio segue l’escissione della sonda
utilizzando opportuni enzimi di restrizione(uguali per tutti i plasmidi clonati) che taglino un
po’ a monte e un po’ a valle della nostra sonda in modo da avere stessa sequenza in tutte le
sonde per amplificare con la stessa coppia i oligont.
Amplifichiamo la sonda usando dei primers che al 3’e al 5’ presentano una appendice , in
modo tale da poter ottenere delle sonde di differente lunghezza con una eguale sequenza al
3’ e 5’ A questo punto deve avvenire la reazione di ibridazione sonda /DNA(è una
interazione tra catene di nt), per fare questo spottiamo il campione di DNA sul filtro di
nylon e dopo aggiungiamo la sonda che andrà a legarsi dove è presente il corrispettivo
esone. Dopo una notte di incubazione provvediamo con una serie di lavaggi molto stringenti
per eliminare tutto quello che non ha avuto modo di legarsi e posizioniamo il filtro in un
tubino insieme con la mix della PCR, all’interno posizioneremo come primers una sola
coppia,(praticamente un solo oligont perché le due estremità sono uguali) che amplificherà ,
in un numero ridotto di cicli, la sonda che si era legata e che ora si è staccata dal filtro
durante la reazione di PCR.
Quando i cicli impostati terminano
preleviamo una aliquota del
prodotto di PCR e la mettiamo in
un altro tubino dove allestiremo
una normale PCR quantitativa che
fermeremo in fase log, metteremo
tutti i reagenti per la PCR ed uno
dei due primers sarà marcato in
modo da seguire la corsa
elettroforetica e per distinguere i
campioni dal marcatore di peso
molecolare che sarà marcato con
un fluorocromo differente.
Dalla MAPH si è evoluta un’altra tecnica : la MLPA

MLPA(multiplex ligation-dependent probe amplification)

Anche la MLPA prevede l’ibridazione con sonde di oligont che vengono costruite a partire da due
frammenti di oligont che poi formeranno la sonda completa:
Porzione breve con una sequenza al 5’ uguale per tutte le sonde ed una sequenza specifica
per ogni sonda(dove quindi suppongo risieda la omologia con l’esone che dovrà legare);
Porzione lunga formata da una sequenza uguale per tutte le sonde, posizionata a 3’, una
sequenza specifica per ogni sonda ed una sequenza stuffer, che vari nella sua lunghezza da
sonda a sonda in modo da distinguerle.
Le due porzioni di oligont vengono fatti ibridare con il DNA, posto sempre sul filtro. Le due
porzioni sono fatte in modo tale da legarsi in posizione vicine, adiacenti. Alla ibridizzazione segue
l’azione dell’enzima LIGASI che lega le due estremità (estremità 3’ della sonda breve con quella 5’
della sonda lunga). La sonda , in modo del tutto analogo alla MAPH viene amplificata con la stessa
coppia di oligont innesco di cui uno è marcato. Il prodotto di amplificazione potrà essere separato in
vario modo e i frammenti sono distinguibili dato che avranno lunghezza differente.(si può
analizzare tutto il gene della distrofina, ma 79 esoni sono tanti e quindi si preferisce allestire due
reazioni differenti, infatti la tecnica conserva tutte le sue caratteristiche se si analizzano, al massimo
40 sequenze contemporaneamente ). Un piccolo inconveniente è legato al fatto che la presenza di
una mutazione puntiforme o un polimorfismo possono essere erroneamente scambiate per una
delezione esonica . Nel caso in cui ci fosse una mutazione puntiforme o un polimorfismo nel punto
in cui vanno ad appaiarsi una delle due estremità della sonda(nel punto in cui la ligasi va ad agire)
la ligasi non potrà agire e quindi non avremo amplificazione della sonda. Se non abbiamo
l’amplificazione non avremo banda e quindi faremo diagnosi di delezione esonica, ma non è questo
il caso quindi dobbiamo fare molta attenzione. Basta fare un semplice ragionamento: se troviamo
una sola delezione in tutto il gene , andiamo a fare una analisi più attenta perché potrebbe trattarsi di
una mutazione puntiforme o di un polimorfismo, se troviamo più esoni interessati possiamo essere
quasi sicuri che si tratti di una delezione.

La MLPA viene usata per la diagnosi di delezioni ed inserzioni, per anomalie cromosomiche, ed
anche per valutare lo stato di attivazione e silenziamento genico per la presenza di isole metilate.
Basta far denaturare il campione di DNA e poi far seguire la ibridizzazione con le due porzioni
della sonda che vengono legate per azione della ligasi. Effettuiamo una digestione con un enzima di
restrizione che non taglia in presenza di CH3 . Se si ha digestione questo vuol dire che non c’è
metilazione se non c’è digestione vuol dire che il filamento con cui la sonda si è appaiata è metilato.
Verrà amplificato tutto quello che non è metilato, perché se la sonda viene tagliata non potrà essere
amplificata se la sonda viene amplificata vuol dire che la digestione non è avvenuta.
Per effettuare una quantizzazione relativa si quantizzano le sonde amplificate rispetto ai controlli:
RPA (Relative Peak Area): area del picco/area del controllo interno (si usano 5 controlli interni)
RPA 100%: media di RPA di 3 controlli esterni di soggetti senza mutazioni
RPA ratio: RPApaziente/ RPA100%
MASCHIO: assenza di picco=0 copie=delezione; RPA ratio 90-110%=1 copia=normale; RPA ratio
150-250%=2 copie=duplicazione
FEMMINA: RPA ratio 35-55%=1 copia=delezione; RPA ratio 90-100%=2 copie=normale; RPA
ratio 150-250%=3 copie=duplicazione

Vantaggi MLPA:
Possono essere determinate ben 45 regioni esoniche in un solo tubino di reazione e con una
sola corsa;
Bastano solo 20ng di genomico;
Risultati in 24 ore;
Costa meno di 15 euro per reazione;
Discrimina anche sequenze che differiscono per un nt
Svantaggi:
La qualità del campione dev’essere buona, per cui per campioni derivati da liquido
amniotico conviene usare i lisati cellulari per ottenere il Dna da analizzare.

PCR TOUCH AND DAWN

Protocollo secondo il quale solo se c’è un match del 100% si ha amplificazione. Si parte da una
temperatura di 4-5° C in più rispetto alla temperatura ottimale di reazione e ad ogni ciclo
abbassiamo la temperatura di 0,5°C . Così facendo avremo che la temperatura di annealing dei
primi cicli, essendo abbastanza alta (generalmente è di 4-5 gradi al di sotto della Tm) sarà
favorevole solo ad appaiamenti perfetti, poi abbassandola nei cicli successivi faciliteremo
l’amplificazione di ciò che è stato amplificato nei primi cicli, molto stringenti.

Le tecniche che abbiamo visto ci consentono di effettuare una quantizzazione relativa perché
abbiamo sempre confrontato la sequenza in esame con una sequenza costante e non soggetta a
mutazioni. Ma è possibile anche effettuare una quantizzazione assoluta.

QUANTIZZAZIONE ASSOLUTA

Avere un controllo è fondamentale, senza controllo non possiamo ottenere delle quantizzazioni,
perché manca un riferimento. Il controllo è utile, inoltre, per valutare che la reazione proceda nel
migliore dei modi.
Possiamo avere quindi un controllo interno o esterno per quantizzare
CONTROLLO ESTERNO
Possiamo ottenere un controllo da RNA o da DNA, spiegheremo quello ottenuto da RNA perché è
più difficile , quello da DNA è molto più semplice.
Partendo dall’RNA dobbiamo sintetizzare il cDNA e lo facciamo utilizzando una coppia di oliognt
che ibridizzino con una specifica sequenza o con la coda di poly A(così riusciamo a pescare l’RNA
che codifica per il gene di nostro interesse tra i tanti RNA cellulari).
Il cDNA viene amplificato utilizzando una coppia di oligont dotati di una codina con sequenza
riconosciuta dalla RNA pol. Infatti dal cDNA amplificato andremo a sintetizzare l’RNA, che sarà
l’RNA della sola sequenza di interesse ed amplificato opportunamente.
Del prodotto di amplificazione e di trascrizione prenderemo 3 estratti(un determinato volume) , che
conterranno RNA, facciamo una RT-PCR che va stoppata in fase log. Il prodotto di PCR viene
separato e quantizzato otterremo dei valori di lettura che corrisponderanno a determinati valori di
concentrazione. Utilizzando lo stesso metodo di lettura per il nostro campione da quantizzare
potremo valutare la sua concentrazione, in quanto, con i campioni che abbiamo prelevato prima
abbiamo costruito una retta di taratura in base alla quale, a ogni valore di lettura corrisponde una
determinata concentrazione. In realtà si otterebbe una curva, che sarebbe di difficile interpetrazione,
ma valutando il logaritmo della concentrazione, invece che quest’ultima, possiamo ottenere una
retta la cui lettura e interpetrazione sono dirette e immediate.
valore lettura

log []
Il controllo esterno è sicuramente molto più affidabile perché essendo amplificato parallelamente
ma in un tubino di reazione differente non subirà interferenze dovute ad eventuali impurità del
campione. Tuttavia la presenza di impurità che in questo caso influiscono solo sul campione e non
anche sul controllo costituisce un limite per la quantizzazione.

CONTROLLO INTERNO
Si basa sul principio ella competizione tra campione e standard dato che la reazione di
amplificazione è contemporanea e nello stesso tubino di reazione.
Può essere di due tipi:
Omologo(quello più utilizzato): una sequenza che differisce da quella del campione per una
singola mutazione che abolisce o crea il sito per un enzima di restrizione, oppure una
modifica che rende la sequenza controllo più lunga di quella del campione in modo da
distinguerle. Per la sintesi partiamo sempre dall’RNA, sintetizziamo il cDNA con un oligo
che ci consenta di selezionare l’mRNA(con coda di polit oppure che ibridizzi con una
specifica sequenza). Fatto ciò in due reazioni parallele sintetizziamo il nostro standard
utilizzando in una reazione un oligo(che chiameremo C) dotato di una appendice di
sequenza (tail 1)+ un oligo A con il promotore al 5’, nell’altra reazione utilizziamo un altro
oligo (l’oligoD) che contiene il tail 2 complementare al tail1+ un oligo B. mescoliamo i
prodotti delle due reazioni e facciamo denaturare i frammenti e poi rinaturare lentamente.
Alla fine avremo i due amplificati di partenza + un frammento proveniente dall’appaiamento
delle due tails che sono complementari. Inseriamo all’interno della mix gli oligo A e B. il
risultato saranno dei frammenti perfettamente identici alla sequenza del paziente ma
leggermente più lunghi.
Eterologo. Sequenza diversa da quella del campione che viene amplificata con la stessa
coppia di oligo che amplificano anche la sequenza del campione(anche la composizione di
G e C deve essere simile). Mescoliamo una quantità fissa di mRNA target e duna quantità
scalare di mRNA standard che farà da competitore . eseguiamo una RT-PCR e separiamo i
frammenti dove avremo due bande perfettamente equivalenti vuol dire che le concentrazione
di standard e campione sono le stesse.
La real time PCR ci consente di stimare la quantità di amplificato ad ogni ciclo della PCR
consentendoci di monitorare ad ogni ciclo come varia la quantità.
La valutazione istantanea momento per momento è possibile grazie all’utilizzo di sonde oligont
fluorescenti. Ci sono varie sonde che possiamo utilizzare e si dice che la prima sonda è stata la
Taqman(nn è assolutamente vero però) . questo tipo di sonda , che tra l’altro è una delle più costose
che ci siano, sfrutta l’attività 5’-3’ esonucleasica della polimerasi. Quello che succede è questo: la
sonda Taqman si appaia al DNA a singolo filamento e quanto la pol comincia la sintesi del
filamento complementare allo stampo la sonda viene spazzata via , viene degradata consentendo la
rivelazione di fluorescenza. La sonda è costituita da due gruppi , il REPORTER al 5’ ed il
QUENCER al 3’. Il QUENCER è in grado di assorbire la fluorescenza emessa dal REPORTER
quindi quando sono vicini non si ha emissione di fluorescenza, ma durante la fase di sintesi si ha la
degradazione della sonda per cui QUENCER e REPORTER si allontanano e quindi viene emessa
la fluorescenza. Per quanto ho appena detto è evidente che la quantizzazione viene effettuata nella
fase di sintesi del DNA perché p nella fase di sintesi che la sonda emette fluorescenza. La
specificità della sonda è molto alta , non vengono considerati prodotti aspecifici grazie alla natura
della sonda.
Fare ed allestire una real time, per esperienza personale, è una cosa molto semplice ragazzi il grosso
problema è l’interpretazione dei dati. Anche nel caso della real time , come in tutte le PCR, ma in
generale per tutti gli esperimenti, bisogna inserire nella reazione anche un reference in base al quale
andiamo a fare tutti i nostri calcoli.
Avremo:
Rn = intensità della fluorescenza emessa dal fluorocromo normalizzata in rapporto alla fluorescenza
emessa da un reference passivo che sta nel tampone.
Rn+ = Rn ad un determinato ciclo in una reazione che contiene il DNA stampo.
Rn- = Rn ai cicli iniziali prima che si abbia un significativo aumento della fluorescenza.
∆Rn = (Rn+)-(Rn-).

Maggiore è la concentrazione del campione di partenza più velocemente si ha l’aumento della

fluorescenza e più precocemente si raggiungerà il ciclo soglia, vale a dire il ciclo a cui si inizia a
rilevare un aumento significativo di fluorescenza. Se definiamo AVE Rn la Rn+ media ai primi cicli
+/- DS, il ciclo soglia CT sarà uguale a AVE Rn +/- 10 DS.

ΔRn

Cicli
Se facciamo il log della concentrazione in funzione del CT, avremo una retta, più facile da
consultare.

40
CT
15

Log[DNA]
Il ciclo soglia(CT) è il parametro che viene utilizzato per la quantizzazione.
Lo strumento, prima della misurazione, deve essere tarato con uno standard interno (ex si aggiunge
nello stesso tubo di reazione un controllo interno omologo e una sonda marcata con un fluorocromo
differente che ibridizza con la sequenza diversa sul controllo) o esterno. La sonda viene scelta con
un programma e deve avere una temperature di 5-10°C maggiore rispetto alla Tm dell’oligont
innesco ed inoltre non deve presentare una G al 5’. Possiamo agire su diversi parametri per
ottimizzare la PCR, come la concentrazione dei dNTPs (> [dNTPs], < specificità della reazione), la
concentrazione dell’innesco, la concentrazione della sonda, MgCl2.

Ligth cycler
Sono simili alle Taqman nella struttura ma funzionano nella maniera opposta. Sono complementari
a due regioni adiacenti dello stampo. Quando le due sonde sono vicine si verifica un trasferimento
di energia e si ha emissione di fluorescenza . Quindi, mentre per le sonde taqman la fluorescenza
veniva emessa nella fase di sintesi,utilizzando le sonde light cycler la fluorescenza si ha nella fase
di ibridizzazione con lo stampo di DNA.

Molecular Beacons
Sono presenti sempre il quencer ed il reporter . la sonda è strutturata in maniera tale da potersi
ripiegare su sé stessa formando una struttura secondaria di tipo stam and loop. Nell’ansa si trova la
regione di appaiamento con lo stampo . se la sonda è ripiegata nella struttura secondaria con Q e R
vicini, per lo stesso principio della Taqman non si ha emissione di fluorescenza, se la sonda si
linearizza ibridizzando con lo stampo , Q e R si allontanano e si ha fluorescenza. Anche con questo
tipo di sonda abbiamo fluorescenza nella fase di ibridizzaione e quindi in seguito alla denaturazione
dello stampo.

Scorpion primers

Sono dotate sia della sequenza che funziona come sonda sia di una sequenza che fa da innesco. La
struttura è del tutto simile a quella delle molecular beacons , l’unica differenza è la repsenza di
questa sequenza legata alla sonda tramite un linker.
La reazione avviene in questo modo:
1. Fase 1 della PCR: denaturazione del doppio filamento di DNA e dello scorpione primers.
Entrambe si denaturano
2. Fase 2 della PCR: annealing del primers, dello scorpion primes , allo stampo con successiva
polimerizzazione dello stampo. Inoltre la porzione dello scorpion primers che funge da
sonda si riavvolge su sé stessa.
3. Fase 3 della PCR.: seconda denaturazione. Si denatura il doppio filamento neosintetizzato e
si denatura anche lo scorpion primers .
4. Fase 4 della PCR: si ritorna alla temperatura di annealing , in questa fase la sequennza sonda
si andrà ad appaiare con la sequenza a cui è complementare. Di conseguenza si formerà un
ibrido molecolare con quencer e reporter abbastanza lontani da consentire l’emissione di
fluorescenza.
Si sono fatte delle prove poiché è possibile che lo scorpion primer possa fungere solo da sonda ,
proprio come una molecular beacons, ma si è visto anche che la duplice funzionalità è favorita.
Si sono allestite due reazioni di PCR in cui in una veniva messe la coppia di oligont innesco
necessari per l’amplificazione e lo scorpion primer, nell’altra reazione abbiamo messo un oligont
innesco e lo scorpion primero come secondo oligo. Nella reazione dove lo scorpion primer
funzionava solo da sonda si aveva una fluorescenza inferiore rispetto all’altro tubino di reazione.
Questo vuol dire che la reazione di legame del primer è favorita.
Altro punto a favore è la non interferenza con l’attività esonucleasica 5’-3’ della polimerasi. Lo
scorpion primers non interferisce.(con gli scorpion primers possiamo allestire anche un ARMS)

Sybr green

È la tecnica maggiormente utilizzata perla real time. Si tratta di una molecola intercalante il DNA
che si inserisce nel solco minore. Emette quindi fluo0rescenza nella fase di appaiamento non di
sintesi né di denaturazione. Si perde ovviamente di specificità, perché la formazione di ibridi
molecolari aspecifici ha messione di fluorescenza cmq. Possiamo però ovviare a questa aspecificità
facendo denaturare il campione , dopo i cicli della PCR, e facendo rinaturare lentamente e il
risultato viene rappresentato su un sistema di assi cartesiani.

d∆F/d∆T

Tm T
Il picco più piccolo è la chiara espressione di dimeri di primers. Se non ci sono picchi più piccoli
allora vuol dire che non ci sono stati appaiamenti aspecifici se ci sono non li dobbiamo considerare
come segnale.
Un esempio è la LMC(leucemia mieloide cronica) in cui noi possiamo vedere la quantità di
trascritto derivante dal gene ibrido tramite una RT- real time PCR. Il prodotto di amplificazione
viene poi paragonato(quantizzazione raltiva) con un gene HOUSE KEEPING, un gene espresso
costantemente che funge da controllo interno.

Tecniche per la ricerca di mutazioni puntiformi note.

RFLP

Polimorfismi di lunghezza dei frammenti di restrizione. Si tratta di mutazioni puntiformi che

aboliscono o creano o spostano un sito per un enzima di restrizione. La tecnica è abbastanza
semplice basta digerirei il frammento con l’appropriato enzima di restrizione e vediamo se c’è o
meno la digestione. Ci possono però essere delle impurità che non consentono all’enzima di
lavorare correttamente ma questo lo vediamo perché la banda risulterà meno intensa, però possiamo
essere sicuri di no sbagliare se amplifichiamo anche una regione più grande che contiene anche un
altro sito di restrizione , no mutato, oltre a quello che stiamo analizzando. Se questo frammento
viene digerito allora vuol dire che l’enzima sta funzionando bene. Quando una mutazione crea un
sito di restrizione è abbastanza facile identificarla perché noi sappiamo perfettamente quali sono le
sequenze riconosciute dai vari enzimi di restrizione, quando la mutazione abolisce un sito di
restrizione non sappiamo precisamente che tipo di sostituzione abbiamo avuto.
ES: SMA (atrofia muscolo spinale): patologia autosomica recessiva determinata da una mut sul cro
5 (duplicazione invertita) che causa nel 95% dei casi la delezione del gene SMN1 e nel 5% dei casi
mut puntiformi in questo gene. È presente un gene SMN2 ripetuto e invertito ma la sua presenza
non è sufficiente in quanto presenta in una sostituzione in terza base di un codone, che causa uno
splicing alterato. Dal momento che sull’esone 7 SMN2 ha un sito riconosciuto dall’enzima di
restrizione Dra1 che SMN1 non ha, e sull’esone 8 SMN2 ha un sito riconosciuto dall’enzima di
restrizione Dde1 che SMN1 non ha, si può fare un’analisi di RFLP per identificare soggetti malati,
mentre per i portatori è necessaro allestire un’analisi di tipo quantitativo.
ARMS
In parole povere una reazione di PCR allele specifica.
Allestiamo due reazioni di PCR separate usando un oligont che sia uguale nelle due reazioni(quello
che ibridizzerà con l’allele sano) ed un allele specifico per la forma mutata e per la forma non
mutata dello stesso allele che volgiamo sapere se porta o meno la mutazione(questo oligont
specifico al 3’ porta in nt nelle due forme mutata e wt). Se nello stampo c’è il nt complementare
all’innesco avremo appaiamento e quindi amplificazione. Andiamo poi a veder eche cosa è
successo. Separiamo i prodotti di PCR. Se abbiamo segnale dove c’era l’oligont sonda mutato allora
vuol dire che il soggetto ha l’allele mutato, se abbiamo segnale dove c’era l’oligont sonda wt il
soggetto non ha la mutazione .
Inoltre viene utilizzato un oligont sonda che 2-3 nt prima del 3’ ha un mismatch in modo tale che la
complementarietà del nt al 3’ sia essenziale e fondamentale per il corretto appaiamento. Si
utilizzano di solito basse [primers] per aumentare la specificità di reazione. Il controllo è
rappresentanto da un’altra coppia di oligo che amplifica un’altra sequenza.
OLA
Vengono utilizzate una coppia di sonde che ibridizzano in regione vicine . una delle due sonde è
uguale per le due reazioni ed una è allele specifica. Dopo l’ibridizzazione facciamo avvenire la
reazione di ligasi e poi separiamo i frammenti ottenuti. Se c’è un mismatch le due sonde non
saranno correttamente appaiate e abbastanza vicine da poter fa avvenire la reazione e quindi non si
avrà visualizzazione della banda corrispondente alla sonda ligata.

ASO

La mutazione deve essere inserita in maniera tale da rendere instabile il prodotto di ibridizzazione. .
il DNA amplificato e viene trasportato su un filtro di nitrocellulosa e viene fatta avvenire la
reazione di ibridizzazione. Su un filtro il DNA viene fatto ibridizzare con la forma wt della sonda e
sull’altro filtro con la forma mutata, entrambe marcate (radioattivo). Vengono effettuati lavaggi per
togliere tutto quello che non si è legato ,per cui quello che si è legato molto debolmente si staccherà.
Andiamo a visualizzare con autoradiografia e vedremo segnale solo dove c’è stata ibridazione. Se
abbiamo segnale solo sul filtro wt il soggetto è omozigote wt se abbiamo segnale solo sul filtro con
la mutazione il soggetto è omozigote mutato, se abbiamo doppio segnale il soggetto è eterozigote .

Reverse dot plot

Sul filtro sono legate le sonde, e la rivelazione è cromogenica, non si ricorre all’utilizzo di sostanze
radioattive.

Discriminazione allelica

Possiamo allestire una semplice reazione di PCR all’end point.

Vengono costruite due sonde che ibridizzano con la forma mutata e con la forma wt dell’allele e le
sonde vengono, ovviamente ,marcate con due fluorocromi differenti. Facciamo la PCR facciamo
avvenire l’ibridizzazione e quello che otteniamo è raffigurato qui sotto:

Fluor

T
Facendo la derivata negativa del rapporto tra variazione di fluorescenza e ∆T abbiamo le curve più
facili da interpretare.
In nero abbiamo l’omozigote mutato;
In verde l’eterozigote;
-d∆F/d∆T in arancio l’omozigote wt .

T
Possiamo anche individuare il tipo di mutazione usando delle sonde che ibridizzino nella specifica
regione e sito di mutazione.

SONDA TaqMan MGB

Sono state introdotte proprio per la discriminazione allelica. Sono strutturate alla stessa maniera
della TaqMan e funzionano allo stesso modo ma sono dotate di una porzione in più, la porzione
MGB, che si intercala nel solco minore conferendo maggiore stabilità alla struttura. Il gruppo MGB
è generalmente un gruppo antibiotico. Il gruppo MGB consente una maggiore stabilità anche se la
sequenza può essere più corta, e ciò vuol dire maggiore specificità di legame ma uguale stabilità di
una sequenza più lunga. Quando la sequenza è più piccola anche un singolo mismatch rende
l’appaiamento debole e quindi avremo minore fluorescenza perché non c’è una match del 100%.
(queste sonde vengono utilizzate molto per la quantizzazione dei geni SMN1 e 2).

Ricerca di mutazioni puntiformi non note

Non sapendo che mutazione cercare dobbiamo interrogare l’intero gene che però deve essere noto.
Dobbiamo sapere quale gene veicola la mutazione causa della malattia; ostacoli a questo tipo di
analisi sono l’eterogeneità genetica (+ geni che danno uno stesso fenotipo) e l’eterogeneità all’elica
(più mutazioni danno lo stesso fenotipo). Una volta noto il gene, possiamo analizzarlo tutto o parte
di esso con varie tecniche. Molti di questi metodi si basano sulla PCR. Generalmente si amplifica il
gene più una cinquantina di nt a monte e a valle, oppure si amplificano gli esoni con i nt intronaci
adiacenti. Se è possibile analizzare il cDNA è sicuramente meglio perché più piccolo e contiene
solo gli esoni, ma non sempre è possibile ottenere l’RNA e poi ci sono tutta una serie di problemi
collegati alla tessuto-specificità ecc.
SSCP
E’ una elettroforesi su gel di poliacrilammide in condizioni native. Prima di tutto denaturiamo il
campione variano la concentrazione salina o il valore del pH. Dopo la denaturazione, tramite un
repentino trattamento con ghiaccio, sfavoriamo la rinaturazione del campione e lo facciamo
migrare sul gel . Durante la migrazione i frammenti assumeranno delle strutture secondarie dettate
dalla sequenza primaria quindi un frammento che presenta una o più mutazioni assumerà una
conformazione differente dal wt che farà in modo tale che migri in maniera differente. Una volta
individuato il frammento o i frammenti che contengono una mutazione abbiamo solo informazioni
qualitative, solo facendo una analisi di ricerca della mutazione possiamo dare un nome ed una
identità alla mutazione. Cmq con questa tecnica siamo riuscititi a restringere il campo di analisi per
la ricerca della mutazione.
E’ inevitabile effettuare delle corse elettroforetiche di prova con condizioni differente per valutare
quale è la migliore. Tutto ciò è valido per frammenti che vanno dalle 150 alle 250 coppie di basi
perché oltre questa grandezza il singolo evento mutazionale non influenza la struttura secondaria e
la migrazione del frammento. In questi casi possiamo ricorrere all’utilizzo di oligont marcati oppure
colorare con nitrato d’argento.
Durante una PCR è normale che si formino degli ETERODUPLEX tra frammenti che presentano un
mismatch (sempre che la mutazione sia in eterozigosi). Se però la mutazione è in omozigosi non la
vediamo così facilmetne allora dobbiamo fare in modo che si formino gli eteroduplex per
individuarla e come facciamo? Fatta la PCR separiamo il prodotto di amplificazione su gel
d’agarosio e dopo mescoliamo il prodotto di amplificazione del campione con quello di un
controllo. Si formeranno degli omoduplex e degli eteroduplex tra il frammento del controllo (sano)
e quello del campione(con la possibile mutazione).
E’ ovvio che gli eteroduplex si comporteranno in maniera differente rispetto agli omoduplex perché
sono più instabili.
Il controllo deve essere un soggetto che , in quella specifica sequenza, ovviamente quella usata
come controllo, non contenga mutazioni e nemmeno polimorfismo(SNPs) altrimenti è ovvio che si
formeranno mismatch se c’è un polimorfismo e alla fine andremo ad analizzare un frammento che
in realtà è perfettamente sano.
DGGE
Con gradiente di denaturazione. Si denatureranno prima gli eteroduplex, perché sono più instabili.
L’eteroduplex denaturato sarà rallentato nella migrazione . Il gradiente è formato da
urea/formaldeide.
TGGE
Con gradiente di temperatura (uguale ragionamento).
DHPLC
La separazione avviene su una matrice idrofobica di polistirene. Tale matrice interagirà debolmente
con il DNA, che avremo precedentemente denaturato. L’interazione è garantita da un controione
anfipatico che interagisce con la matrice e con il DNA , tale controione è il TRI ETIL AMMONIO
ACETATO(TEAA). La colonna viene equilibrata con TEAA 0,1M e acetonitrile. Dopo aver
equilibrato la colonna carico il DNA e facciamo avvenire le interazioni. Dopo un po’ di tempo ,
quanto basta per far avvenire l’interazione, eluiamo il campione con una concentrazione crescente
di acetonitrile. L’acetonitrile serve per staccare le interazioni tra DNA e TEAA è ovvio che dove
c’è un mismatch il legame è più debole ed il campione sarà eluito prima e ad una concetrazione di
acetonitrile inferiore. Equilibrare la colonna è fondamentale per capire a quale tempo esce il picco.
Possiamo anche far avvenire la reazione ad una temperatura tale da far formare una bolla
nell’eteroduplex, più sensibile, senza intaccare l’omoduplex, possiamo fare avvenire la reazioni in
condizioni di parziale denaturazione e così via per ottimizzare l’ analisi. La temperatura da
utilizzare si sceglie prima e in maniera molto accurata. Quando facciamo la PCR , dopo analizziamo
l’amplicone con un software che traccia il profilo di denaturazione termica. Ci indica anche ad ogni
temperatura quale è la percentuale di DNA denaturato e non. Per avere una buon risultato la
denaturazione non deve superare il 20%.
NB: spesso bisogna ricorrere a più temperature.
Generalmente non si fa tutto il gradiente di concentrazione di acetonitrile altrimenti ci vorrebbero
30 minuti per ogni campione. Il software , in base alla sequenza, traccia il profilo di denaturazione
termica e calcola anche il tempo che ci vuole per eluire un frammento di una determina lunghezza e
quale è la concentrazione di acetonitrile ottimale (+/- deviazione standard). Con queste infomrazioni
traccia una finestra di concentrazioni di acetonitrile che ci consente di vedere quel frammento,
allarghiamo leggermente la finestra per essere più sicuri e una volta stabilita la finestra ci vogliono
appena 7 minuti per fare l’analisi. Potremmo anche aumentare il flusso con cui viene rilasciato
l’acetonitrile, ma questo vorrebbe dire ridurre la sensibilità della tecnica. Nella migliore delle
ipotesi dovremmo vedere 4 picchi, 2 dell’omoduplex e due per l’eteroduplex. Gli eteroduplex vanno
mandati a sequenziare. L’unico limite è rappresentato dai polimorfismi però non potremo mai
sapere se si tratta di un polimorfismo o meno quindi dobbiamo sempre sequenziare nel dubbio. La
DHPLC è una tecnica molto sensibile e quindi la PCR deve essere molto controllata per non avere
interferenza, tipo contaminazioni di frammenti con uguale PM dei nostri. Inoltre è una tecnica
completamente automatizzata , rapida, molto sensibile per mutazioni puntiformi (più del 97%),
analizza frammenti da 100 a 700 bp(i frammenti vengono raggruppati per temperatura).
L’inconveniente è dato dalla frequente presenza di picchi aggiunti o piccole spalle, o differenze di
geometria del picco

PTT

È il protein truncation test , quindi dobbiamo far esprimere la proteina codificata dal gene che ci
interessa studiare. Il frammento viene clonato in un vettore di espressione con il quale un batterio
viene trasformato. Il vettore di espressione contiene una sequenza sensibile all’induzione da parte di
una determinata sostanza, molto spesso IPTG (induzione lac-like). Aggiungendo questa sostanza al
mezzo di coltura batterico si ha la trascrizione e la traduzione della proteina I prodotti di traduzione
vengono marcati (ex metionina con S35). Bisogna sempre far correre un controllo senza la
mutazione e clonato nello stesso tipo di vettore.
Il campione viene fatto correre e vediamo la lunghezza della proteina in analisi rispetto al controllo.
Si possono evidenziare mutazioni non sense(che producono un codone d stop quindi una proteina
tronca), mutazioni dei siti di splicing, delezioni e duplicazioni. Individuata la proteina anomala si
procede con il sequenziare il frammento da cui è stata tradotta, per capire che tipo di mutazione c’è
stata..

DNA CHIPS

Rappresenta l’attuale metodo più automatizzato e veloce per lo studio del genotipo e per la ricerca
di SNPs, sostituzioni e mut puntiformi, trascrittomica, proteomica. È una metodica complessa,
costosa, quantitativa e qualitativa.
Il chip è una superficie solida di nylon o di vetro dove sono adese(in maniera perfettamente
ordinata) delle sonde, che legheranno il target .
Il vetro generalmente si preferisce perché non si deforma e non essendo poroso il DNA non penetra
, quindi la ibridizzazione è più efficiente e veloce. Ci sono due tipologie di sonde:
I TIPO: sonde di cDNA frammentate (fino a 10000 cloni in 1,6cm2);
II TIPO: sonde di oligont (65000-400000 oligont che rappresentano fino a 9000geni su una
superficie di 1,6 cm2) sensibilità 95%; specificità 95%, mut in omozigosi
>specificità98%; mut in eterozigoti: sens 88%.
La tecnica generale prevede la sintesi dell’oligont e poi il trasporto sul chip, ma si sono trovate delle
tecniche per sintetizzare la sonda direttamente sul chip consentendo una max miniaturizzazione.
In vivo la sintesi del DNA è diretta in modo 5’-3’ in vitro avviene nella direzione opposta 3’-5’. La
reazione viene direzionata in quanto i nucleotidi che si aggiungono uno per volta hanno l’estremità
5’ bloccata. Questa estremità viene liberata solamente nel momento in cui si deve effettuare il
legame con il nucleotide successivo.
La reazione inizia con un nt che ha l’estremità 3’ bloccata e il 5’ libero: la reazione di legame
fosfodiestereo del 3’ al chip avviene quando eliminiamo il gruppo che bloccava il 3’. Poi
aggiungiamo il 2 nt, che ha il 5’ bloccato e il 3’ libero, che si lega al gruppo 5’ libero del nt
precedente adeso al chip. Poi liberiamo il 5’ del secondo nt legato dal suo gruppo inibitore, e
aggiungiamo il 3 nt, che sempre avrà il 5’ bloccato e il 3’ libero, che si andrà a legare. E così via
fino alla fine della sonda
NB: i gruppi protettivi possono essere chemiolabili, vanno via con reazioni chimiche, oppure più
semplici ancora quelli fotolabili, basta irradiarli con a luce per eliminarli.
La costruzione delle sonde direttamente sul CHIP è un processo non molto difficile, in quanto
quando si sta costruendo una determinata sonda si sblocca il 5’ di quella e solo quella. Quindi
quando sul CHIP aggiungeremo un nucletotide che deve legarsi, questo non potrà fare altro che
legarsi all’unica estremità che ha il 5’ pronto ad accoglierlo, che è quella che noi abbiamo
volutamente sbloccata grazie a irradiazione con luce.

A G
 A G T

A G T C

Tra la sonda e la superficie del chip si utilizza un polimero spaziatore non troppo lungo, come non
troppo lunga deve essere neanche la sonda altrimenti si perde specificità di interazione e inoltre si
favoriscono legami intramolecolari.
Il nostro target sarà marcato con fluorescenza o radioattività (p33) o biotina-streptavidina per
consentire la successiva rilevazione del segnale. Inoltre si preferisce usare il target come RNA
perché l’interazione RNA/DNA è più stabile di quella DNA/DNA quindi o sintetizziamo l’RNA
direttamente dal campione del paziente aggiungendo solo il promotore oppure dall’RNA del
paziente facendo prima il cDNA e poi l’RNA (che si può trascrivere anche con UTP-biotina)

IDENTIFICAZIONE DEGLI SNPS

I chip, soprattutto quelli di tipo II ,vengono utilizzati per l’identificazione degli snp’s . Hanno una
specificità del 95% ed i metodi sono tre:

MINISEQUENCING ANALYSIS: usata per analisi di mutazioni puntiformi. Vengono usati

ddNTPs e viene fatta una banale reazione di sequenziamento. Il chip è costitutito da
sequenze di oligont non sintetizzati sul chip ma a parte perché il 3’ OH deve essere libero. Il
target viene fatto ibridizzare con il chip, dopodichè aggiungiamo i ddNTPs e la Pol, la
sonda di oligont adesa sul chip funge da innesco per la reazione della polimerasi: se la
sequenza del target per ex presenta una T questa si appaierà con un ddNTP (A) ed avremo
un determinato segnale.
GUADAGNO DI SEGNALE: si costruiscono delle sonde che al centro della sequenza
presentano il nt che vogliamo interrogare, di cui volgiamo conoscere l’identità. In base al wt
costruiamo la sonda e ne facciamo 4 che differiscono per il nt centrale che sarà su una sonda
la A, su una la T poi la G e la C . posizioniamo le sonde sul chip sapendo perfettamente
dove sta una e dove l’altra e facciamo avvenire la reazione di ibridazione con il target. Se
nel target abbiamo la T come nt centrale avremo che questo si sarà legato alla sonda con al
centro la A e quindi avremo segnale nel punto in cui è posizionata la sonda con la A. questo
se il soggetto è omozigote wt , singolo segnale avremo anche nel caso sia omozigote mutato,
ma ovviamente il segnale sarà acceso in un altro punto del chip , se il soggetto è eterozigote
avremo la contemporanea accensione di due segnali. Interrogato questo nt possiamo
 proseguire al nt successivo e così via .Con questa tecnica possiamo diagnosticare anche
micro delelzioni e micro inserzioni.
RIDUZIONE DI SEGNALE: Il chip viene fatto ibridare con 2 target( il controllo e il
campione). Poi si effettua un rapporto tra il segnale emesso dal controllo e quello emesso dal
campione. Fc/Ft =1. se il rapporto è 2 (anche superiore a 1,5 basta) abbiamo una mutazione
in eterozigoti, non sappiamo quale. Se il rapporto tende ad ∞ (2/0 =∞) abbiamo una
mutazione in omozigosi.

I chip possono essere usati anche per studi di trascrittomica. Ad es. per valutare come vengono
espressi i geni in un tessuto tumorale. Gli mRNA (cDNA )dei geni del tessuto malato del tessuto
sano, dello stesso soggetto, vengono mescolati e fatti i bridizzare. In base al segnale possiamo
capire se vengono espressi maggiormente i geni del tessuto tumorale o quelli del tessuto sano e se
un gene è più espresso in un tessuto tumorale o sano.
Si possono , come già detto, anche individuae inserzioni , delezioni, mutaz puntiformi. Si può
vedere che ci sono come mutazioni ma non possiamo identificarle se non tramite il
sequenziamento(glod standard).
SEQUENZIAMENTO:
come detto in precedenza è il gold standard per l’identificazione di mut puntiformi, e viene usato
come prima metodica per geni piccoli e con elevata eterogeneità allelica. Con geni grandi si
preferisce screenare l’intero gene con metodiche diverse alla ricerca dell’esone coinvolto nella
mutazione e poi sequenziarlo. Il sequenziamento seguito da elettroforesi capillare su gel identifica
bene sostituzioni di1nt in omozigosi (sostituzione di un picco con 1 altro) in eterozigosi
(sovrapposizione di due picchi) insezioni o delezioni in omozigosi (dopo la mut, la sequenza
continua identica al wt) mentre per le inserz o delez in eterozigosi la macchina formula un grafico
con una doppia sequenza dal punto della mutazione in poi, e si deve interpretare confrontando con
la sequenza wild type. Per confermare una mut puntiforme si sequenzia anche il complementare del
nostro stampo, e si può fare una ARMS con primers che terminano sul punto della mutazione.
Ora, non appena abbiamo identificato la mutazione dobbiamo capire se questa mutazione è
causativa i una patologia. Queste informazioni le possiamo ottenere da :
DATI INDIRETTI : 1 assenza della mutazione in soggetti normali si devono analizzare
ameno 100 cromosomi per le mutazioni in emizigosi e 50 per le mutazioni autosomiche
dominanti, però si potrebbe trattare anche di un polimorfismo molto raro manifestato da
meno dell’1% della popolazione), 2 il residuo amminoacidico mutato è conservato in
proteine omologhe estratte da altre specie(se è conservato vuol dire che svolge u ruolo molto
importante per la funzione della proteina), 3 valutare se la mutazione segrega con il
fenotipo, 4 natura della sostituzione: aa di classi diverse o uguali
DATI DIRETTI

IPERTERMIA MALIGNA

Si tratta di una malattia a trasmissione autosomica dominante.

La mutazione causativa della malattia è assente nei soggetti sani;
La sequenza della proteina (un recettore) è molto conservata . sono molto conservate , nella
sequenza, tutte tre le isoforme di questo recettore;
Tutti i soggetti malati presentano quella mutazione mentre i soggetti sani non la presentano,
quindi la malattia segrega con quella mutazione,
La sostituzione amminoacidica è molto importante in quanto la valina, aa idrofobico, viene
sostituita dall’ac aspartico, aminoacido acido.
Quando parliamo invece di una malattia a trasmissione recessiva il fatto che 100 pazienti normali
non la presentino non è indicativo a meno che non si tratti di una patologia molto rara, anche andare
a vedere come segrega la malattia nella famiglia non ci aiuta molto perché i soggetti portatori sono
sani , possiamo effettuare dei saggi DIRETTI come il saggio dell’attività della proteina mutata in
vitro.
Ad es. l’intolleranza ereditaria al fruttosio: L’enzima ALDOLSI B (di origine epatica) scinde,
normalmente, il fruttosio 1-6 bisfosfato(1-6BP) in DHA-P e GA-3P(scissione aldolica)oppure può
trasformare il Fruttosio-P in DHA-P e GA.
L’aldolasi B è un omotetramero e conoscere la struttura di una proteina è molto importante per gli
studi di MOLECULAR IMAGING in cui nella struttura normale della proteina andiamo ad inserire
la nostra mutazione e vediamo come si modifica la struttura in funzione di quella sostituzione. Per
esempio l’arginina303 è molto importante per la stabilizzazione del substrato. Se, per esempio,
viene sostituita con GLn non abbiamo una grossa variazione della struttura della proteina, ma
cambierà l’affinità di legame al substrato. Invece se viene sostituita con triptofano abbiamo una
grossa variazione della struttura. In entrambi i casi però non parliamo ancora di analisi dirette.
Possiamo anche clonare il cDNA della proteina, sottoposto a mutagenesi diretta, in un plasmide
dotato di sito per la trascrizione e traduzione. Il plasmide viene trasfettato in E.Coli che
esprimeranno la forma non mutata e la forma mutata della proteina. A questo punto lisiamo le
cellule batteriche e purifichiamo la proteina, per purificarla correttamente possimo ache metterle un
segnale come una coda di His all’N-terminale della proteina. Le His legano ioni metallici come il
Nichel quindi in base a questo separiamo e le proteine con cromatografia per affinità e per attestare
la purezza della proteina effettuiamo una elettroforesi (SDS-PAGE) . A questo punto la proteina
viene saggiata:
Attività specifica in condizioni saturanti di substrato;
Cinetica in condizioni variabili di substrato.

FRUTTOSIO 1-6 BP FRUTTOSIO 1P

V Wt RW V Wt RW

RQ RQ

µg enzima µg enzima

tutte le indagini ci portano a concludere che la mutazione è causa della malattia.

Ci sono situazioni molto più complicate come l‘ipertermia maligna in cui i soggetti sono
suscettibili all’azione di alcuni farmaci. Tale suscettibilità può causare anche la morte se il
farmaco non viene allontanato dal corpo.
La patologia è causata da una inefficiente omeostasi del Ca2+. Il Ca2+ aumenta equinid
aumenta anche la contrazione muscolare, il metabolismo e tutte quelle reazioni catalizzate
da enzimi calcio-dipendenti. Si tratta di una malattia eterogenea ma in più del 50% dei casi
sono state ritrovate mutazioni di un canale del Ca2+presente sulla membrana del reticolo
sarcoplasmatico. Quando RYR1(detto anceh recettore della rianodina) viene stimolato
rilascia il Ca2+. Se ci sono mutazioni il canale può diventare ipersensibile ad alcuni farmaci
(anestetici volatili e biorilassanti) in risposta ai quali si apre lasciando uscire Ca2+. Altre
patologie possono essere alcune miopatie non progressive come il central core desease
(malattia autosomica dominante). Questa malattia è caratterizzata dalla presenza d aree
amorfe dette cores, queste aree corrispondono a zone disorganizzate del sarcomero in cui
sono assenti mitocondri. Il recettore RYR1 è coinvolto anche in un’altra patologia nota
come Multi-mini core desease(autosomica recessiva congenita), anch’essa caratterizzata
dalla formazione di aree di disorganizzazione del sarcomero più piccole e numerose
(minicores).
Il recettore RYR1 ha circa 500 aa ed è codificato da una gene molto grande. Le mutazioni
causa del CCD sono localizzati al C-terminale della proteina (segmento transmembrana). Ci
sono tre regioni di HOT SPOT mutation ed una volta individuata la mutazione dobbiamo
individuare e capire se questa mutazione può essere causa della patologia e come lo
facciamo?
Clonaggio del cDNA di RYR1 mutato in cellule HEK293, in quanto si ha bisogno di
cellule eucariotiche perché le cellule batteriche non sono in grado di maturare il
trascritto primario da cui deriva il canale RYR;
Miotubi disperdici (RYR1 KO)murini;
Analisi di RYR1 mutati in colture di miotubi prelevati da pazienti e controlli,
linfociti b immortalizzati prelevati da pazienti e controlli(il gene è coinvolto in molti
processi basati sul Ca2+ oltre alla contrazione).
Studi eterologhi in cui andiamo studiare proteine coinvolte nella contrazione in
cellule che non si contraggono in modo da studiare solo la proteina e non tutte le
altre coinvolte in quello stesso meccanismo di contrazione;
Trasfettare le cellule con eguale quantità di di forma mutata e non mutata del gene(in
caso di eterozigoti. Quando utilizziamo le cellule del soggetto malato non possiamo
valutare mutazioni in promotori);
Valutare il rilascio di Ca2+ in risposta ad agenti scatenanti (ex alotano);
Rilascio di Ca2+ in seguito a stimolo elettrico(il recettore fa parte del sistema
eccitamento / contrazione, il canale RYR è associato ad un canale voltaggio
dipendente .Con lo stimolo elettrico andiamo a vedere se nel sistema muscolare si ha
un regolare rilascio di Ca2+in seguito alla stimolazione del canale V/dipendente) ;
Legame della rianodina anche se non è detto che una variazione dell’affinità con la
rianodina significhi anche variazione nella funzionalità del recettore:
Aumento del rilascio di protoni (aumento dell’attività metabolica) in risp all’agente
scatenante. La contrazione consuma ATP, l’ATP consumato deve essere ricostituito
con l’intensificazione del metabolismo che provoca acidificazione tramite
produzione di ione H+ che devono essere estrusi. Quindi tramite la misurazione dei
protoni misuriamo l’attività metabolica e quindi la risp allo stimolo;
Per i pazienti MSH (mutazioni nella regione centrale della proteina) facciamo studi
di Fluorescenza. Usiamo un indicatore del Ca2+ con cui carichiamo le cellule che
vengono stimolate e tramite la fluorescenza valutiamo come aumenta il Ca 2+ , in un
soggetto normale il Ca2+ aumenta e dopo ritorna a valori normali;
- Rilascio di Ca2+ in seguito a stimolo con TAPSIGARGINA , inibitore della SERCA
Ca2+ATPase-SarcoEndoplasmaticReticulumCalciumATPase (ci sono pompe che
contro gradiente pompano il Ca2+ nel reticolo sarcoplasmatico). Se inibiamo queste
pompe otteniamo che il Ca2+ non viene più pompato nel reticolo e quindi aumenta
nel citoplasma. Facciamo una misurazione indiretta;
- Stimolazione con 4 cloro-cresolo, che media il rilascio di Ca nel citosol
NB:ci sono dei limiti nella trasfezione infatti vado a vedere le mutazioni in
omozigosi , poi nono sappiamo effettivamente quanto sia stato transfettato ed inoltre
la transfezione è transiente.
 mutato
[CA2+] Wt

[4 Cl-Cresolo]
La concentrazione efficace di 4-Cl-cresolo è < nel soggetto mutato rispetto al Wt.

CCD: central core desease: mutazione al C- che costituisce la porzione

transmembrana della proteina (poro). I soggetti malati esaminati hanno di base degli
accumuli di Ca2+ inferiori rispetto al controllo. Abbiamo rilascio di Ca2+anche senza
stimolazione, quando vado a stimolare con tapsigargina abbiamo un rilascio di Ca2+
inferiore rispetto al controllo questo perché i depositi di Ca2+sono inferiori rispetto al
controllo. Questo ci spiega perché quando abbiamo lo stimolo avremo come risp una
contrazione più debole spiegazione della miopatia associata al CCD.

MUTAZIONI ASSOCIATE A SITI DI SPLICING: Le regioni fiancheggianti i siti

di splicing presentano sequenze consensus che sono molto conservate e per
analizzarle in genere si amplificano le regioni codificanti più una cinquantina di nt al
3’e 5’ per vedere se ci sono eventuali anomalie.

Fino ad ora abbiamo parlato di diagnosi diretta di mutazioni note e non note ora invece
affronteremo tutto quello che riguarda la ricerca di mutazioni in maniera indiretta.

DIAGNOSI INDIRETTA

Nel genoma ci sono un cospicuo numero si polimorfismi con i quali intendiamo degli eventi
mutazionali che si presentano nella popolazione con una frequenza dell’1%. Queste mutazioni nono
vengono corrette e rimangono nel nostro genoma e rappresentano la nostra carta di identità. Ogni
soggetto ha i suoi polimorfismi così come uno stesso soggetto può avere su due alleli dei
polimorfismi diversi. I polimorfismi possono essere:
Di sequenza : in questo caso due soggetti o due alleli dello stesso soggetto
presentano un nt diverso o una sequela di nt diversi;
Di lunghezza: in cui un certo n° di nt vengono ripetuti variabilmente ed è possibile
che la lunghezza di queste ripetizioni, in tandem, differiscano tra due soggetti e tra
due alleli dello stesso soggetto.
Bene conoscendo questi polimorfismi possiamo fare tantissime cose. Per esempio ricorrendo alla
mappatura delle VNTR(variable number tandem repeats) possiamo fare test di paternità in base a
come il neonato ha ereditato le VNTR, può averle ereditate solo dai due genitori(questa metodica
però fa perdere molto tempo e poi sono necessarie grosse quantità di DNA, circa 5 μg). Mappare e
caratterizzare le VNRT non è molto difficile basta tagliare, con opportuni enzimi, la regione che
accosta la VNTR ma non all’interno. Dopo aver isolato la sequenza la caratterizziamo tramite
southern.
Oltre alle VNTR possiamo anche ricorrere alle STR, sono tratti polimorfici intra-intronici di piccole
dimensioni, circa 2-4 bp. Infatti ST sta per short tandem repeats. Si tratta di geni molto polimorfici ,
con una elevata variabilità e ci consentono di seguire la segregazione genica e quindi si possono
utilizzare oltre che per l’attribuzione di paternità e per la valutazione dell’eventuale stato di
contaminazione dei villi coriali, anche per la diagnosi indiretta di mutazioni.
Uno degli utilizzi delle STR è il DNA FINGER PRNTING , è altro che una mappa delle STR del
soggetto e si può effettuare dal DNA prelevato dal sangue , capelli, liquido seminale ecc..
Vengono amplificati i frammenti contenti le STR e poi vengono separati tramite elettroforesi
capillare su gel o elettroforesi su gel di poliacrilammide. Marcando i frammenti amplificati li
possiamo separare contemporaneamente con una sola corsa elettroforetica .Dalla corsa possiamo
ottenere delle bande ombra oltre alle bande di interesse. Le bande ombra sono frammenti di DNA di
piccole dimensioni ed aspecifici dovuti al fatto che la polimerasi amplificando una regione in cui ci
sono delle sequenze uguali ripetute , scivola e quindi può amplificare un po’ in meno o un poco in
più. Le bande ombra possono essere attenuate se utilizziamo marcatori di 4-6bp.
Inoltre è possibile impostare una finestra elettronica in cui indichiamo l’intervello di lunghezza
delle varie STR in modo da identificarle e nominarle. Per esempio indichiamo che il frammento
compreso tra 100-150 è la STR1 , quello che va da 200-235è la STR2 ecc. Inoltre nell’ambito di
una STR possiamo indicare con 1 il nt 100 della STR1 con 2 il nt 101 della STR1 ecc. in base alle
nostre necessità possiamo usare vari marcatori polimorfici. E’ possibile anche stabilire il sesso se
inseriamo un marcatore del sesso come l’AMELOGENINA che ha lunghezza differente sull’x e
sull’y. Per la diagnosi di mutazioni vengono scelte STR altamente polimorfiche e eterozigotiche in
modo da seguire più correttamente la segregazione all’elica (se due genitori hanno la stessa STR e
per giunta in omozigosi noi non possiamo stabilire da chi ha ereditato una e da chi l’altra).
Un esempio dell’utilizzo delle STR nella diagnosi indiretta è la diagnosi prenatale di DMD.
Ipotizziamo che andiamo a valutare l’eventualità che ci siano state delezioni o inserzioni esoniche
ma non troviamo niente e non abbiamo la possibilità di sceenare tutto il gene per trovare possibili
mutazioni puntiformi. Possiamo fare una multiplex PCR che comprende tutti i polimorfismi di
lunghezza presenti sul gene della distrofina e dopo la PCR separiamo tutti i frammenti con una
unica corsa elettroforetica usando fluorocromi differenti(i marcatori polimorfici dovrebbero essere
15). Ovviamente potrebbe tranquillamente capitare che ci siano sovrapposizioni di frammenti che
differiscono per 2 basi o anche una. Possiamo marcare con fluorocromi differenti frammenti che
possono sovrapporsi tra loro. Quando frammenti che differiscono per una base si sovrappongono
abbiamo 3 picchi, uno più grande e 2 più piccoli. Quando mettiamo insieme tutte le STR in ordine
di collocazione cromosomia ca e li dividiamo anche in base a come sono stati ereditati(mettendo a
six l’STR ereditata dal papà e a destra quella ereditata dalla mamma) otteniamo l’aplotipo di quel
soggetto. Le STR si possono seguire anche nella valutazione del rigetto di trapianto.
Abbiamo parlato di VNTR,di STR ma ci sono anche gli SNPs, polimorfismi che interessano il
singolo nt. E proprio per questo dobbiamo utilizzarne più di una se vogliamo fare diagnosi. Quello
che può interferire con la nostra diagnosi è il fatto che molte patologie sono caratterizzate da una
elevate eterogeneità genica, nel senso che molte malattie e la loro manifestazione fenotipica sono
regolate da più geni che possono causare la malattia stessa (una stessa malattia può essere causata
dall’alterazione di geni differenti). Ad es. nel caso dell’ipertermia maligna, patologia di cui abbiamo
già parlato, si sono fatti studi che hanno evidenziato un altro locus genico, oltre a quello di RYR1 ,
che è causativo della malattia se interessato da una mutazione. Questo locus genico codifica per la
subunità α1 di un canale voltaggio dipendente strettamente associata al recettore RYR1 (tale canale
è noto come recettore della diidropiridina).
Se sul gene RYR1 non ci sono mutazioni viene eseguita una analisi di associazione per calcolare il
rischio . il parametro usato è il LOD SCORE.

LOD SCORE= log[Lθ/L(0.5)]  probabilità di linkage/probabilità di non linkage

L= probabilità che il locus sia associato
L(0.5)= probabilità che il locus non sia associato
θ = frazione di ricombinazione.

Se il Lod score è uguale a 3 la probabilità è 1 a 1000, cioè 1000 probabilità che il locus sia associato
ed 1 che non sia associato. Si va a valutare il Lod score teorico (che è il massimo possibile) che si
ottiene facendo analizzare al programma il pedigree insieme con un marker che segrega con la
patologia e che sia eterozigote. In base al Lod score teorico facciamo le nostre supposizioni. Se il
Lod score riscontrato si avvicina a quello teorico le probabilità di segregazione sono molte alte se
non si avvicina dobbiamo cambiare qualcosa. La mutazione causativa della patologia non è quella.
Posso anche decidere, qualora sono soddisfatto del risultato ottenuto, di prendere la sequenza
analizzata e cercare se ci sono effettivamente mutazioni, che tipo di mutazioni e se e come sono
associate alla malattia.

Oltre ad usi diagnostici ed altre applicazioni che abbiamo cercato di illustrare, le STR possono
essere usate anche per individuare nuovi loci genici, ma per fare questo abbiamo bisogno di una
famiglia con una elevata statisticità.
Per esempio possiamo decidere di analizzare tutto il genoma ricorrendo a pannelli di STR e che si
distanziano tra loro per 10 centiMorgan e si vede come segregano i marcatori che mappano quel
cromosoma che può essere patologico o meno non ci interessa perché il metodo è lo stesso. Una
volta individuato il locus possiamo passare a marcatori polimorfici più vicini al locus individuato in
modo da restringere il campo. Questo è un esempio di un approccio metodologico all’utilizzo delle
STR ma possiamo molto concretamente fare un esempio di una applicazione delle STR per quanto
riguarda la diagnosi di TUMORE. Si tratta di un’indagine a scopo prognostico, in cui decidiamo di
analizzare LOH cioè la perdita di eterozigosità in corrispondenza di geni oncosoppressori tramite
l’amplificazione delle STR che marcano tali geni.
Il principio è abbastanza banale, basta prelevare tessuto sano e tumorale, dello stesso soggetto, e
valutare, rispetto ad un controllo, quali STR (e quindi geni vicini) si sono perse nel tessuto tumorale
e quale percentuale di sano e tumorale c’è di quel tessuto prelevato. Possiamo, per esempio, trovare
dei picchi oltre a quello canonico e questo indica che ci sono dei meccanismi di riparo inefficienti
oppure possiamo trovare per un allele un picco più piccolo rispetto al controllo, questo vuol dire che
in una percentuale di cellule si è persa l’eterozigosità (delezione). La percentuale si calcola con
questa formula:
Area allele1 normale/ area allele2 normale

LOH =
Area allele1 mutato/ area allele2 mutato.

ALTERAZIONI DELLO SPLICING

Fenomeni che alterano lo splicing possono essere:

1. Mutazioni nei siti di splicing
2. mutazioni in sequenze esoniche che alterano silencers ed enhancers esonici dello splicing.
3. mutazioni in sequenze introniche
4. mutazioni in sequenze introniche localizzate lontano dai siti di splicing.
Lo splicing è un fenomeno finemente regolato e controllato; ES: nella DMB la gravità del fenotipo
dipende dal mantenimento o meno della cornice di lettura dopo la mutazione di splicing: nella >
parte dei casi il frame è conservato per cui il fenotipo è+lieve. Può essere però persa una regione
importante della proteina, generando un fenotipo più grave.
Il fine macchinario dello splicesoma è regolato da una serie di interazioni di proteine che legano
sequenze esoniche ed introniche in grado di attivare o reprimere lo splicing(Le sequenze ESE
vengono riconosciute dalle proteine SR, serin-treonin), mutazioni in queste sequenze potrebbero
seriamente compromettere lo splicing. Studiando le proteine che intervengo in questo processo si
sono dedotte le sequenze che legano sul DNA e quindi è possibile, volendo, analizzarle in caso di
diagnosi in cui non si sono facilmente ritrovare le mutazioni causa.

SMA
Patologia a trasmissione autosomica recessiva. L’incidenza dei malati è di 1:10000, i portatori sono
1:50
Esistono due copie del gene SMN, e sono SMN 1 ed SMN2 che differiscono solo per 5 sostituzioni.
In corrispondenza dell’esone 7 SMN1 e 2 hanno un nt diverso che in SMN2 nn ha conseguenze
sulla traduzione ma provoca uno skipping esonico producendo una proteina tronca nella > parte dei
casi. La copia SMN2 è poco importante , infatti il 10% dei soggetti sani non ha SMN2. Il fenotipo
SMN1 è variabile e correla con il numero di copie di SMN1 presenti. Studi hanno evidenziato che
un soggetto che manca di SMN1 ha più copie della copia SMN2 per compensare. Questo vuol dire
che in assenza del gene SMN1, la presenza di una maggiore quantità di SMN2 attenua leggermente
la manifestazione fenotipica.
La causa della patologia è l’assenza di SMN1.
Un esempio di skipping esonico può essere fatto anche parlando del gene CFTR a livello dell’esone
12.
Al fine delle analisi di mutazioni estremamente importante è effettuare saggi in vitro. Se non
possiamo analizzare l’RNA, possiamo in alternativa costruire dei minigeni che facciamo esprimere
ad estratti nucleari tenendo conto della differente maturazione che avviene in tessuti differenti.

IMPRINTING

L'imprinting genomico è un processo che lascia nel nascituro un'impronta di diverso tipo nei geni
trasmessi dal genitore di sesso maschile ed in quelli trasmessi dal genitore di sesso femminile. Di
conseguenza, la prole che riceve geni marcati dalla madre sarà geneticamente diversa da quella che
riceve geni marcati dal padre.
Così come esistono due copie dei cromosomi, esistono due copie dei geni, una trasmessa dalla
madre (sul cromosoma materno) e una trasmessa dal padre (sul cromosoma paterno). Di solito viene
usata l’informazione contenuta in ambedue le copie geniche(espressione biallelica).
Alcuni geni vengono espressi solo se sono stati trasmessi dal padre, mentre altri vengono espressi
solo se vengono trasmessi dalla madre(espressione monoallelica dei geni o emizigosi funzionale). Il
fenomeno della espressione differenziale dipendente dal sesso del genitore di origine viene
chiamato imprinting. Alcuni cromosomi, sezioni di cromosomi o geni sono contrassegnati dal
marchio del genitore di origine. La marchiatura avviene mediante meccanismi tutt'oggi non del tutto
chiariti(ma molto probabilmente tutto si basa sulla metilazione delle isole CpG), in parte durante la
gametogenesi, per poi continuare durante la fecondazione della cellula uovo da parte dello
spermatozoo per poi rimanere constante per tutta la vita del soggetto.
L’imprinting viene rinnovato ad ogni generazione a seconda del sesso del soggetto, ovvero: durante
la gametogenesi nella fase precoce di maturazione l'imprinting viene cancellato e successivamente
ripristinato durante la fase tardiva nel gamete maturo in base al sesso (negli spermatozoi avviene +
precocemente che nell’oocita); quindi se il soggetto è maschio, ed il gene che prendiamo in
considerazione segue un "imprinting materno" (la copia materna è inattiva), i suoi spermatozoi, sia
se avranno ereditato la copia cromosomica materna che paterna, avranno il gene in questione NON
IMPRINTED (non metilato e quindi funzionante); viceversa se il soggetto è femmina i suoi oociti,
sia se avranno ereditato la copia cromosomica materna che paterna, avranno il gene in questione
IMPRINTED (metilato e quindi non funzionante). Questo evento è stato scoperto grazie allo studio
fatto su due sindromi: sindrome di Angelman e sindrome di Prader-Willi le quali sono causate della
mutazione dello stesso gene, ma gli effetti sono differenti a seconda che questo sia stato ereditato
dal padre o dalla madre.
Prima di parlare delle sindromi nominate , possiamo fare degli accenni ai tipi di imprinting che si
possono avere. L’imprinting avviene mediante il fenomeno della metilazione, una modificazione
post-replicazionale effettuata da metilasi in maniera sequenziale (la metilazione sul filamento
stampo guida la successiva metilazione sul filamento copia). Esiste anche un’attività di
demetilazione ad opera di specifiche demetilasi non ancora ben caratterizzate.
Possiamo avere metilazione del promotore(l’intero gene o geni sotto il controllo di quel promotore
vengono spenti) oppure viene metilato il gene specifico o parte di esso, in questo caso sarà spento
solo quello specifico gene. Si può verificare anche la metilazione differenziale di due isole CpG a
livello del promotore con la sintesi di un mRNA antisenso.
Elementi boundary: Abbiamo due geni H19 ed Igf2. se H19 non è metilato, sulle isole CpG si lega
una proteina che, una volt legata, recluta un repressore della trascrizione per cui il gene Igf2 non
sarà trascritto, mentre sarà regolarmente trascritto il gene H19, viceversa se H19 viene metilato
sulle isole CpG (regioni di metilazione differenziale DMRS), il legame della proteina e del
repressore non avviene per cui sarà trascritto Igf2 ma non sarà però trascritto H19. questo è un altro
esempio di come l’imprinting può avere effetti differenti, infatti ci sono evidenze che mostrano che
la copia inattiva del gene (quella imprinted) può non presentare alcuna metilazione mentre la copia
attiva potrebbe presentarla.
Come ho precedentemente detto che l’imprinting avvenuto alla gametogenesi viene mantenuto per
tutta la vita e durante il ciclo cellulare, nella fase S,le regioni imprinted vengono replicate in
maniera asincrona (la copia paterna è più veloce) e quando il DNA viene replicato ci sono degli
enzimi che riconoscono la presenza del gruppo metilico sullo stampo e lo riproduce esattamente sul
filamento neosintetizzato. Esistono anche delle metilasi de novo che aggiungono gruppi metilici
sulla base di specifici segnali ancora non ben caratterizzati. Quando in certe fasi il DNA deve essere
demetilato questo può avvenire in manieta passiva quando l’enzima che metila la copia non la
metila e può essere attiva se vengono coinvolte delle demetilasi.

Alterazione dell’imprinting:
1) DISOMIA UNIPARENTALE: un individuo eredita due alleli dallo stesso genitore; questo
può verificarsi per eventi di non corretta disgiunzione meiotica: uno zigote eredita 3 copie di
un dato gene, e mediante meccanismi di riparo uno dei tre viene eliminato. C’è una
probabilità su tre che vengano mantenuti due alleli dello stesso genitore, pertanto entrambi
con lo stesso assetto di imprinting. Nel caso in cui entrambe le copie sono imprinted, non si
avrà espressione del gene. Nel caso in cui entrambe le copie non sono imprinted, si avrà
eccesso di dosaggio genico.
2) DELEZIONI O MUTAZIONI di una regione genica IMPRINTED (repressa): in questo caso
non ci sono problemi
3) DELEZIONI O MUTAZIONI di una regione genica NON IMPRINTED (espressa): in
questo caso non si avrà espressione del gene
4) MUTAZIONI nelle ICR (regioni di controllo dell’imprinting): alterazione dell’imprinting di
più geni.
Gli effetti dell' imprinting appaiono in stadi precoci ed esplicano la loro azione sulla crescita e sul
comportamento. Anche gli incroci tra specie diverse suggeriscono che l' imprinting possa avere
effetti sulla crescita di diverse aree del corpo; basti pensare che nell' incrocio tra cavallo ed asino si
osservano chiare differenze a seconda se il cavallo è il padre ( mulo ) o la madre (bardotto).

1. Sindome di Prader- Willi: La sindrome di Prader Willi è una malattia genetica rara
caratterizzata dall'alterazione del cromosoma 15. La Prader-Willi è la più comune tra le
sindromi di microdelezione cromosomica. Avviene per due diverse cause accertate,
entrambe di tipo genetico:

Delezione da imprinting. Nella PWS il gene materno è silenziato perché sotto

imprinting, mentre quello paterno è deleto. Il gene in questione è del cromosoma 15,
nella regione 15q11-q13. In questa patologia viene quindi a mancare il contributo
paterno, e si avranno una serie di disturbi derivati dalla mancanza della/e proteina/e
da esso derivanti.

Disomia uniparentale fenomeno secondo il quale una coppia di cromosomi o parte di

essi derivano da uno solo dei due genitori. Durante la meiosi viene ereditata anche
una copia dell’altro genitore per cui si ha trisomia ,ed il terzo cromosoma viene
perso ed eliminato casualmente(potrebbe anche non essere perso). Nel caso della
 sindrome di PW il cromosoma 15 non è più composto dalla parte materna più quella
paterna ma bensì da 2 parti materne, perdendo di conseguenza tutto il patrimonio
genetico di quello paterno mancante e mantenendo i due alleli materni entrambi
imprinted.

2. Sindrome di Angelman. È identica alla sindrome di Prader-Willi, il cromosoma è lo stesso ,

il gene è lo stesso, quello che cambia è la copia imprinted. In questo caso la copia paterna è
imprinted e la copia materna è deleta . I sintomi sono molto diversi rispetto alla sindrome di
Prader-Willi.

Ma come possiamo diagnosticare queste patologie? In entrambi i casi il gene coinvolto è SNRPN
sul cro 15q11-13 e codifica per SNR (small nuclear region). Nella sindrome di Prader-Willi è
presente solo l’allele materno (imprinted), nella sindrome di Angelman è presente solo l’allele
paterno

Analisi della metilazione: tale ricerca può essere effettuata in due differenti modi: il
primo è un sothern con frammenti precedentemente sottopsti ad enzimi di restrizione
sensibili alla metilazione, oppure possiamo fare anche una MLPA in cui avremo
l’amplificazione solo dei frammenti(sempre digeriti) che si appaiano con la sonda. Il
secondo metodo è l’MSPCR, che prevede un ciclo di PCR in cui avviene una
reazione chimica che converte le citosine in uracile (reazione di bisolfite con
bisolfite di sodio). Vengono trasformate solo le citosine che non sono metilate, tutte
quelle metilate,essendo protette dal metile , non saranno modificate. A questo ciclo
segue una PCR con primers appositi che avranno tutte le citosine modificate e che
amplificheranno solo dove è avvenuta la reazione di conversione. La PCR ci serve
appunto per vedere se la reazione di conversione è avvenuta e per la regione di
nostro interesse, di cui vogliamo raccogliere notizie, poi per analizzare dobbiamo
sequenziare. Il sequenziamento ci dirà quali C delle isole CpG , ovviamente, sono
metilate .
Ricerca delle STR in quella regione(per valutare se quel gene deriva da solo uno dei
due genitori);
Analisi dell’espressione di un gene;
FISH per valutare se ci sono delezioni , se ci sono solo due cromosomi oppure se c’è
una trisomia e altre aneuploidie.

MALATTIE DA ESPANSIONI

Si tratta di un cospicuo numero di patologie causate da ripetizioni nucleotidiche . Prima tali

patologie venivano , ma ancora oggi succede, definite patologie da espansioni di triplette, ma
sarebbe più adatto identificarle come patologie da espansione nucleotidiche poiché non sempre si
tratta di espansioni di triplette ma anche espansioni di 2 o 4 nt. Possono verificarsi sia nelle regioni
codificanti, dove sono generalmente in frame, che nelle regioni non codificanti in cui i nt ripetuti
possono essere anche meno o più di 3 Tali patologie sono caratterizzate da:

Instabilità mitotica o somatica: il numero dei nt espansi aumentano con il susseguirsi dei
cicli cellulari, e con l’età può aumentare il numero di ripetizioni e la gravità del fenotipo.
Una conseguenza di ciò è che esiste una popolazione di alleli che ha un numero di
ripetizioni in un intervallo (range) relativo a un certo fenotipo
 Instabilità meiotica o germinale: il numero di nt espansi aumenta (anticipazione) o
diminuisce (contrazione) passando da una generazione alla successiva; questo accade perché
la presenza dell’espansione rende la regione genica instabile, cosa che non accade nella
regione genica wild type. L’anticipazione causa un’insorgenza più precoce e un fenotipo più
grave della malattia. Il fenomeno dell’anticipazione si verifica più frequentemente quando
l’espansione è stata trasmessa dal padre rispetto alla trasmissione materna. Fanno eccezioni
la Atassia di Fredrich, X fragile e distrofia miotonia si tipo II che vanno incontro al
fenomeno dell’anticipazione più facilmente se l’espansione in questione viene ereditata dalla
mamma anziché dal babbo;
Anticipazione o contrazione.

Il passaggio dallo stato di soggetto sano a quello di soggetto malato passa attraverso degli stati
intermedi. Infatti anche il soggetto perfettamente sano presenta un determinato numero di nt
espansi, ed il numero di espansioni è altamente polimorfico varia da soggetto a soggetto e da allele
ad allele. Tali espansioni sono però molto stabili e generalmente non si alterano. La cosa cambia
invece se consideriamo la fase di pre-mutazione che precede la condizione di Full Mutation. Nella
fase di pre-mutazione il soggetto non presenta il fenotipo per cui possiamo dire che l’individuo pre-
mutato è stabile mitoticamente ma instabile meioticamente nel senso che la sua progenie erediterà
una espanione instabile che potrebbe essere espansa ulteriormente e quindi manifestare il fenotipo
ereditato, fenotipo che il genitore non presentava, e lo potrà presentare in maniera più o meno grave
ma questo dipende dalla natura della espansione.

Il fenomeno dell’anticipazione si accompagna anche allo stato di Full Mutation, e questo accade
perché questo tipo di patologie possono anche rimanere silenti per gran parte della vita di un
soggetto, che tipo fino a 50-60 anni stava perfettamente bene e viveva tranquillamente nello stato di
pre-mutato o perfettamente sano ma improvvisamente qualcosa accade per cui l’espansione
fisiologica o la pre-mutazione diventano patologiche. Quindi a 60 anni il soggetto considerato sano
manifesta il fenotipo caratteristico di quella patologia da espansione, è chiaro ed intuitivo che in 60
anni questo signore avrà fatto dei figli che avranno ereditato l’espansione e che manifesteranno il
fenotipo più precocemente del genitore poiché ci vorranno meno divisioni mitotiche per accumulare
l’espansione causativa della patologia.

Per spiegare questi fenomeni( instablilità,anticipazione e contrazione) sono stati proposti vari
modelli, bene vediamoli ed analizziamoli insieme.

L’instabilità è dovuta a scivolamenti della polimerasi che mentre replica il DNA,

incontrando sequenze ripetute in tandem può scivolare. Questo si verifica molto più
frequentemente durante la sintesi del filamento ritardato, sul quale la replicazione procede a
passo con l’apertura della forcella di replicazione.

formazione di strutture secondarie che intralciano la Pol;

intervento di un elemento in trans. Si tratta di un enzima detto FEN1 (flap endonuclease1)

che digerisce le strutture a singolo filamento che si formano durante il processo di riparo del
DNA. Se si formano strutture secondarie del singolo filamento l’enzima non potrà agire
quindi non saranno agevolati i processi di riparo da questo consegue l’instabilità. Se
consideriamo esatto questo modello è chiaro che anche l’assenza di questo enzima avrà un
fenotipo patologico abbastanza simile a quello causato dalla espansione di nt;

Esiste una attività enzimatica funzionante durante la meiosi. L’enzima protagonista è DSB
(double strand breack) che rompe un singolo legame fosfodiesterico sui sul DNA a doppia
 elica; su questi filamenti agisce una 5’-3’ esonucleasi che dal sito del taglio, procedendo in
direzione 5’-3’ digerisce il DNA. Se ci sono delle ripetizioni, i due estremi si appaiano e la
ligasi lega i frammenti. Risultato è la contrazione;

i due filamenti tagliati invadono, a livello della ripetizione dove c’è complementarietà, una
molecola di DNA intatta. Ne consegue un allungamento sequenza e quindi espansione.

Nel 1991 è stato identificato il gene responsabile della sindrome dell’X Fragile(FRAXA) causata
dall’espansione della tripletta CGG al 5’UTR del gene FMR presente sul cromosomaX. In seguito è
stato identificato anche il gene causa della Atrofia mucolo-spino-bulbare(SMBA) , la tripletta
espansa è CAG(stessa tripletta che viene espansa anche nella chorea di Hunghtinton), il gene è AR
e si trova anch’esso sull’X. L’ereditarietà delle patologie da espansioni di nt può essere autosomica
dominane o recessiva ed X –linked e si tratta di patologie abbastanza rare e caratteristiche di alcune
popolazioni.

SINDOME DELL’X FRAGILE

La ripetizione è CGG al 5’ UTR.

Espansioni che cadono nell’intervallo 6-44 non sono patologiche(è la normale espansione) e
sono stabili
Espansioni che cadono nell’intervallo 45-200 sono definite pre-mutazioni. Non viene
manifestato il fenotipo ma potrebbe essere manifestavo successivamente quando la sequenza
viene ulteriormente espansa. La espansione è abbastanza stabile mitoticamente ma non lo è
meioticamente.
Espansioni che cadono nell’intervallo >200 è la mutazione completa caratterizzata da alta
instabilità sia mitotica che meiotica e ovviamente viene mostrato anche il fenotipo malattia.
Espansioni che cadono nell’intervallo 45-54 vengono definite zona grigia. Una espansione
che presenta un certo grado di instabilità , presentano una bassa probabilità di sfociare in una
pre-mutazione nella progenie.

La proteina in questione è la proteina FMRP. Questa proteina è dotata di un duplice segnale, uno di
migrazione nucleare e uno di esporto nucleare, questo ha fatto ipotizzare che la proteina è coinvolta
nel trasporto tra nucleo e citoplasma, ed essendo anche dotata di una sequenza di legame all’RNA
quindi potrebbe essere coinvolta nel trasporto dell’RNA dal nucleo al citoplasma oltre che
intervenire nella sua maturazione e traduzione(tra i vari messaggeri la proteina lega anche l’RNA
che codifica per FMRP stessa).

Generalmente le regioni CGG espanse possono essere riconosciute da metilasi che metilano il gene
ed anche il promotore del gene. La proteina MeCP lega le regioni metilate e recluta il repressore Sin
3 che a sua volta recluta le HDA che deacetilano gli istoni favorendo l’addensamento della
cromatina che diventa inaccessibile alla trascrizione. Recentemente si è visto che soggetti con età
superiore ai 50 con atassia e tremori presentavano pre-mutazioni nel gene FMR-1. questa sindrome
è stata identificata come FXTAS . il 30% di soggetti con pre-mutazione hanno questa sindrome.
Anche donne con POF(menopausa precoce) presentavano pre-mutazioni . Quando abbiamo la
mutilazione completa, nel 95% dei casi il promotore è metilato, in caso di pre-mutazione il
promotore non è metilato quindi il messaggero viene trascritto, anzi è presente anche in maggiore
quantità in virtù del fatto che viene fatta meno proteina. La ridotta sintesi proteica può essere dovuta
a due cause:
 Ridotta maturazione degli mRNA: alle sequenze CGG si possono legare proteine che
maturano l’mRNA e che quindi vengono sequestrate alla maturazione di altri mRNA.
Ridotta traduzione dovuta alla formazione di strutture secondarie dell’mRNA in
corrispondenza di queste sequenze ripetute.

DIAGNOSI di FRAXA

Dato che nel 95% dei casi di full mutation il promotore ed il gene sono metilati noi dobbiamo
andare a vedere lo stato di espansione e quello di mutilazione. Con un elettroforesi su gel possiamo
valutare i soggetti sani e quelli pre-mutati, però si è visto che la condizione per cui soggetti sani
presentavano pre-mutazioni o mutazioni complete non era raro e quind era meglio effettuare un
southern ( in caso di DM il southern si fa sempre perché le espansioni sono molto grandi quindi la
PCR fa solo da supporto)

SOUTHERN

Facciamo una doppia digestione . La prima con un enzima non sensibile alla metilazione che taglia
sempre ed è Hind III e la seconda digestione con un enzima sensibile alla metilazione che taglia
solo se non c’è la metilazione ed è EagI. Dall’azione di Hind III abbiamo un frammento di 5,2Kb,
dalla azione di EagI abbiamo un frammetno di 2,8Kb.

Partendo dall’assunto che la espansione cade in un gene che mappa sull’X abbiamo che i maschi
sono emizigoti e le donne hanno due copie dell’X di cui una inattivata. Detto questo analizziamo i
vari casi.

Maschio normale. Vediamo il frammento di 2,8Kb;

Femmina normale. Vediamo un frammento di 2,8Kb, derivato dall’X attivo, ed un
frammento di 5,2 derivante dall’X metilato a causa dell’inattivazione;
Maschio pre-mutato. Frammento compreso tra 2,8 e 3,4 Kb;
Maschio mutato metilato. Frammento > 5,2Kb
Femmina pre-mutata non metilata. Frammento di 2,8Kb normale, framm 5,2 inattivato
normale, fram compreso tra 2,8 e 3,4 Kb premutato, framm 5,2<x<5,8 premutato inattivato
Femmina mutata metilata. Frammento di 2,8 normale, frammento 5,2 inattivato normale,
frammento > 5,2Kb espanso metilato

Ci sono delle alterazioni allo schema generale.

Mosaicismo di metilazione : cellule con la mutazione metilata e cellule con la mutazione

non-metilata;
Mosaicismo di espansione: certe con espansioni maggiori e cellule con espansioni più
contenute (tutte permutazioni)
Mosaicismo pre-mutazione non metilato + espansione metilata;
Inattivazione casuale dell’X nelle donne. Due sorelle con fenotipo differente sono state
studiate. Una aveva un fenotipo molto grave l’altre meno. Si è visto che una aveva una
espansione di 650 e l’altra di 480, non è una grande differenza o cmq un differenza da
spiegare un fenotipo tanto differente. Approfondendo lo studio si vide che la sorella con il
fenotipo più grave presentava l’allele normale inattivato , mentre l’altra sorella aveva per il
70% inattivato l’allele sano ma per il 30% aveva inattivato l’allele malato quindi per il 30%
riusciva a fare la proteina.
DIAGNOSI PRENATALE.

A 10 settimane lo stato di metilazione dovrebbe essere completo allora si sono valutati i livelli di
proteina di soggetti con espansione completa e normali e si è visto che:

A 10.5 settimane c’è una uguale quantità di proteina in entrambe i soggetti;

A11.5 settimane il livello di proteina è intermedio;
A 12.5.settimane la proteina è assente.

Questo vuol dire che per la diagnosi prenatale non possiamo analizzare i villi coriali; che sono
stati analizzati in questo esperimento, ma direttamente gli amniociti.

DISTROFIA MIOTONICA DI TIPO I (sindrome di Steinert)

Frequenza di 1/8000
Trasmissione autosomica dominate
Insorgenza tardiva
La sintomatologia è associata prevalentemente a contrazione prolungata (miotonia) che
precede debolezza muscolare
Disordine multisistemico(facies caratteristica, cataratta, ipogonadismo, problemi cardiaci,
disturbi al SNC, debolezza uterina, diabete nel 5% dei casi ecc.)
L’espansione è di una tripletta CTG al 3’ UTR
Si tratta di una serin-protein-chinasi sul cro 19 DMPK coinvolta nella miogenesi e nella
regolazione della contrazione; l’aploinsufficienza sembra essere coinvolta nella malattia
Alterato splicing di alcuni mRNA(recettore dell’insulina, troponina T cardiaca e muscolare,
pompa Ca2+ e SARCA2, recettore della rianodina): questi geni normalmente fanno splicing
alternativo solo nel passaggio dall’età neonatale ad adulta. Nei pazienti DM1 fanno sempre
splicing alternativo
Ridotto differenziamento delle cellule muscolari.

Quando si sono studiati i soggetti affetti da questo tipo di patologia , che tra l’altro presentavano
anche aploinsufficienza di geni adiacenti come DMAHP (SIX5: responsabile del dimorfismo
facciale e ritardo mentale) e 5P , si è visto che le cause erano troppo poche per spiegare un fenotipo
del genere allora si ipotizzò che la tripletta CTG avesse un effetto tossico-trans-dominante sul
metabolismo dell’RNA .

Per quanto riguarda la DISTOFIA MIOTONICA DI TIPO II si sa ancora poco; quello che si sa è
che è coinvolto un gene codificante per una proteina con un dominio ZINC finger che in un introne
presenta la sequenza CCTG espansa.

Alterato splicing di alcuni mRNA (canale del Cl, proteina del sarcomero)

L’ inadeguata maturazione degli mRNA è un caratteristica comune alle due patologie e si è visto
che i trascritti contenenti lunghe ripetizioni possono essere accumulati in foci nucleari causa di
tossicità. Inoltre esistono delle proteine che legano la sequenza CUG a livello dell’mRNA. Questo
vuol dire che molti messaggeri con questa sequenza espansa sequestrano, legandole, proteine che
sono coinvolte nella maturazione di altri mRNA quindi ne consegue che questi non possono essere
maturati. Prova a favore di questo modello è l’assenza di foci nucleari quando la sequenza CTG
viene cambiata.
DIAGNOSI

Southern accompagnato alla PCR

Tratti di poliQ

La Q sta per glutamina codificata dal codone CAG, che viene espanso nella corea di huntington e
anche nella atrofia muscolo-spino-bulbare. Quando si sono studiate queste patologie ci si è chiesti
se basta l’espansione di PoliQ per avere la manifestazione fenotipica e per fare questo si sono
proposti alcuno modelli sperimentali.

1. H-desease e SCA1 models: si tratta di topi transgenici in cui sono state introdotte delle
ripetizioni per valutare come, se e quando manifestavano la patologia. Da questi
esperimento si è visto che l’espansione CAG in 146 ripetizioni si aveva un fenotipo simile
all’HD umano ma non si verificava la perdita neuronale.
2. Inserzione delle ripetizioni CAG sotto il controllo del promotore del citomegalovirus, il
fenotipo veniva espresso in vari tessuti e i topini manifestavano anche i disturbi neuronali.
3. Gene HD con ripetizioni sotto il controllo di un promotore specifico, anche in questo caso
c’è la neurodegenerazione.

Alla fine è possibile dire che l’espansione del codone CAG e quindi il tratto di poliQ è causa
della patologia, ma la domanda successiva è PERCHE’?

Per risp a questa seconda domanda sono stati effettuati altri studi si modelli murini e sul cervello
di defunti affetti da HD e SCA1,2,3,6,7 ed SBMA. In questi modelli si sono riscontrati:

Aggregati citoplasmatici,
Aggregati con fattori di trascrizione che legano il poliQ e con la TATA Box,
Se la proteina viene trasportata nel citoplasma si formano gli aggregati ma non si ha lo
stesso danno perché non ci sono le interazioni che causano la patologia. Ex topi
transgenici con Ataxina 1 (SCA1)privi della seuenza NLS, che ne consente l’ingresso
nel nucleo, non manifestano il fenotipo,
Elevata ubiquitinazione ed eliminazione in soggetti con HD.

Riassumendo tutte le informazioni trovate possiamo concludere che viene prodotta una proteina
anomala che quindi verrà eliminata ma ci sono delle proteine che resistono e che possono formare
degli aggregati con fattori trascrizionali che poi legano il DNA. Le proteine che formano aggregati
sono proteine che svolgono funzioni molto importanti ed inoltre la stessa degradazione esagerata di
queste proteine occupa il proteasoma a tal punto da non lasciargli il tempo e lo spazio per degradare
proteine che per svariati motivi non vengono correttamente ripiegate.

Tratti di poliA

Queste espansioni causano patologie con anomalie dello sviluppo e della crescita. Molto spesso le
espansioni si trovano in geni che codificano per F.trascrizionali e le espansioni sono molto più
contenute vanno da 17 a 29, quindi anche in caso di Full Mutation abbiamo una espansione molto
più contenuta. La causa dell’espansione è una ricombinazione ineguale e questo spiega le ridotte
dimensioni dell’espansione e non vengono riportati fenomeni di anticipazione o contrazione. Le
mutazioni possono anche cadere in regioni non codificanti e causare patologie multi- sistemiche la
cui gravità dipende dalla grandezza dell’espansione