Corso integrato

“Applicazioni Biotecnologiche nel

Laboratorio Clinico”

CORSO DI LAUREA IN
BIOTECNOLOGIE

Dott.ssa Roberta Rolla

1 Marzo 2021
3 Maggio 2021
Laboratorio di Biomica Clinica
HUB
 > 2.000 analiti valutati in routine

100 analiti
testati in
URGENZA

5.000.000 prestazioni/anno
 BIOCHIMICA BIOLOGIA
CLINICA MOLECOLARE

IMMUNOMETRIA
EMATOLOGIA &
COAGULAZIONE
TOSSICOLOGIA

CITOFLUORIMETRIA
Studiare il sangue…

Il Prof.
Rollo
Presenta
E’ un tessuto fluido che attraversa tutto il
nostro corpo.
 Funzioni del Sangue

1. Trasporta gas disciolti

portando ossigeno dai
polmoni ai tessuti e anidride
carbonica dai tessuti ai
polmoni
 Funzioni del Sangue

2. distribuisce le sostanze
nutritive e i sali minerali
assorbite nell’intestino
 Funzioni del Sangue

3. Trasporta i prodotti di
rifiuto dai tessuti
periferici ai reni
 Funzioni del Sangue

4. Trasporto di enzimi e
ormoni mettendo in
comunicazioni cellule e
tessuti diversi
 Funzioni del Sangue

5. riduce le perdite dei

liquidi attraverso i vasi
danneggiati (emostasi
e coagulazione)
 Funzioni del Sangue

6. Immunità: difende il
corpo dalle tossine, dai
virus e batteri e
parassiti;
 Funzioni del Sangue

7. aiuta a regolare la
temperatura del corpo
Studiare il sangue…
…equivale a studiare tutto il corpo
Laboratorio Analisi

Informazioni
 La diagnostica di laboratorio:
informazione fondamentali per la diagnosi
La diagnostica in vitro è il
risultato di una delle più
entusiasmanti applicazioni della
scienza e della tecnologia:

ricavare da un campione
biologico umano informazioni
relative alla diagnosi dello stato
di salute di un individuo
 Lo schema di Lundberg
sintetizza l’intero processo della diagnostica nell’ambito della pratica clinica
PROCESSO DIAGNOSTICO

DIAGNOSI
 ASPETTIAMO
GLI ESAMI DI
LABORATORIO

Alcune considerazioni

77 %: percentuale delle diagnosi mediche effettuate con

l’impiego di tests di laboratorio

88 %: percentuale di decisioni cliniche modificate da risultati

di tests di laboratorio
> 2.000 analiti diversi
Percorsi diagnostici differenti
 ASPETTIAMO
GLI ESAMI DI
LABORATORIO

Alcune considerazioni

44 %: percentuale di richieste di tests di laboratorio che

risultano inappropriate
Percorsi diagnostici differenti
Solitamente c’è una correlazione inversa tra numero di esami
richiesti e potenza diagnostica raggiunta
 PRIMA PERLA DI SAGGEZZA

Appropriatezza prescrittiva
 Ma esattamente
come dobbiamo
interpretare il dato
di un esame di
laboratorio????
Patologia Medica

Informazioni
a priori:
la teoria
 Patologia Clinica
Informazioni fornite
dall’esperienza:
i sintomi

Soggetto con aumento moderato delle transaminasi

Che probabilità avrà di essere affetto da un’epatite A?

La patologia clinica insegna a diagnosticare la

malattia dati i segni (la causa dato l'effetto).
 Diagnostica di Laboratorio

Il teorema di Bayes consente,

conoscendo la prevalenza di una malattia
e la sensibilità e la specificità di un esame
per la sua diagnosi, di

calcolare la probabilità di malattia in caso

di esame positivo

(o la probabilità di assenza della malattia

in caso di esame negativo).
 La teoria di Bayes
Informazioni fornite dall’esperienza:
i sintomi (indizi)

La medica clinica

La patologia
medica
Informazioni
Informazioni a «posteriori»:
a priori: Teorema di ↓
la teoria Bayes Conoscenza
(diagnosi)
Test ideale
Applicando un test ad un gruppo
di soggetti
 Applicando un test ad un gruppo
di soggetti

Positivi al test Negativi al test Totali

Malati Veri positivi Falsi negativi (FN) VP+FN

(VP)
Sani Falsi positivi (FP) Veri negativi FP+VN
(VN)
totali VP+FP FN+VN
La sensibilità di un test è la sua capacità di identificare tutti
gli individui con la malattia

no falsi negativi

Se sei malato, che probabilità hai di essere positivo al test?

 Sono risultato
positivo al test!
 Valore predittivo positivo

valore predittivo Veri positivi

positivo Veri positivi + Falsi positivi

Se sei positivo, qual è la probabilità di essere malato?

Valore predittivo positive
(secondo il Teorema di Bayes)
 La specificità di un test è la sua capacità di identificare
tutti gli individui sani

no falsi positivi

Se sei sano, che probabilità hai di essere negativo al test?

 Valore predittivo negativo

valore predittivo Veri negativi

negativo
(specificità) Veri negativi + Falsi negativi

Se sei negativo, qual è la probabilità di essere sano?

Valore predittivo negative
(secondo il Teorema di Bayes)
 Un esempio

Informazioni
a priori:
la teoria

probabilità di essere malati a priori

(prima di avere effettuato l’esame)
 VP 3
valore predittivo positivo = = 0,5
VP 3+ FP 3

Possiamo calcolare il valore predittivo dell’esame positivo

P(M+|T+) applicando direttamente il teorema di Bayes:

Qual è la probabilità di essere malato di HIV se sei positivo?

PPP 50 %
 0,3% 50%

Probabilità di
Probabilità di
essere malati
essere malati
a priori: Teorema di a posteriori:
Prima di Bayes Dopo aver
effettuare il
effettuato
test
l’esame
 Esemplificando
Test X
Sensibilità del test: 100 %
Specificità del test: 99.7 %
PPP
Prevalenza della malattia: 0,1 % 25
0,3 % 50
1,0 % 77
5,0 % 94,6
10,0 % 97,4
SECONDA PERLA DI SAGGEZZA

Gli esami vanno eseguiti quando/se servono,

su una popolazione selezionata a priori
 Considerazioni (1)

In condizioni di bassa prevalenza, riduzioni

anche minime della specificità di un esame
possono comportare drastiche riduzioni del
valore predittivo positivo.
 VN 997
valore predittivo negativo = =1
VN 997+ FN 0

Possiamo calcolare il valore predittivo dell’esame negativo

P(M-|T-) applicando direttamente il teorema di Bayes:

Qual è la probabilità di non essere HIV positivo se sei

negativo?

PPN 100 %
 Considerazioni (2)

Questo non avviene per il valore predittivo del

risultato negativo: un esame negativo consente
nel caso specifico di escludere la malattia.
 "Le véritable voyage de
découverte ne consiste pas
à chercher de nouveaux
paysages, mais à avoir de
nouveaux yeux." (Marcel
Proust)
Quando richiediamo/valutiamo un test di
laboratorio…..
Range di riferimento
Variabilità inter-razziale
Variabilità legata all’età
Variabilità legata al sesso
Rapporto maschi-femmine
Variabilità legata ai pasti
Interferenze endogene: torbidità
Variabilità legata al digiuno
Preparazione e stato del pz
Effetti acuti del fumo
Effetti acuti dell'attività fisica
Effetti cronici dell'attività fisica
Variabilità legata all’attività fisica
Variabilità legata all’alcol
Variabilità circadiana
Variabilità circadiana
Variabilità legata alla posizione

Variazioni
clino-ortostatismo
Variabilità legata alla stasi
Il Sangue: come studiarlo?
SEDE: Vene superficiali
dell’avambraccio o della
piega del gomito:
mediana – cefalica -
basilica
Esecuzione corretta del prelievo
Tipologia provette
 Sequenza corretta
per esecuzione prelievi
Campione emolizzato
Campione emolisizzato
 Campione emolisizzato:
effetti sui tests coagulativi
Campione coagulato
 Componenti del Sangue
Il sangue è un tessuto liquido formato da due
principali componenti:

1. una parte
corpuscolata;
2. una parte liquida, il
plasma.
Tipologia provette
La componente corpuscolata
 EDTA
(acido etilendiaminotetracetico)

Meccanismo d’azione: chela irreversibilmente il Ca++

Il migliore per studiare la morfologia delle cellule

del sangue (ne conserva più a lungo le caratteristiche)
· Non altera il volume degli eritrociti
· Non provoca emolisi (EDTA in eccesso raggrinzimento degli
eritrociti
· Riduce al minimo la lisi dei leucociti
· Limita l’aggregazione piastrinica
· E’ rapidamente solubile nel sangue

IDEALE PER LA MORFOLOGIA CELLULARE

(EMOCROMO)
Plasma & siero
 Plasma vs siero

Sangue intero Plasma Siero

(anticoagulante + centrifugazione)
Fibrinogeno; F coag

Per eseguire la maggior parte degli esami di chimica clinica è possibile

utilizzare siero o plasma, matrici che generano risultati equivalenti.
 Plasma vs siero

Tempistica
 Plasma vs siero
Tabella 1
Vantaggi relativi all’impiego del plasma eparinato e del siero per l’esecuzione dei dosaggi di laboratorio
Vantaggi del plasma eparinato
Campione più rappresentativo della situazione in vivo per presenza dei fattori della coagulazione
Emolisi
Riduzione del “turnaround time”, soprattutto per esami in urgenza
Minor rischio di malposizionamento del gel (o altro materiale) separatore
Eliminazione di interferenza da fibrina
Maggior “resa” del campione

Vantaggi del siero

Assenza totale di elementi cellulari dopo centrifugazione
Maggior stabilità del campione in assenza di gel separatore
Assenza di anticoagulante
Possibilità di utilizzare il campione per l’elettroforesi sieroproteica
Minor rischio di attivazione da caldo e/o freddo dei fattori della coagulazione
Numero più ampio di metodi validati su questa matrice
 EPARINA
(Biochimica)
Meccanismo d’azione: attiva Antitrombina
(anticoagulante naturale)
· altera la morfologia e la colorazione dei leucociti
· provoca aggregazione delle piastrine
· è l’anticoagulante che interferisce di meno con le
determinazioni enzimatiche

Concentrazione ottimale: 0.1-0.2mg/1ml di sangue

 Sodio-citrato
(coagulazione)

Meccanismo d’azione: chela reversibilmente il Ca++

Il migliore per studiare la coagulazione

Il Sangue: come studiarlo?
Il Sangue: come studiarlo?
BIOCHIMICA CLINICA & IMMUNOMETRIA
1) dosaggio enzimatico

2) dosaggio immunologico

LIMITI DI SENSIBILITA’
Biochimica Immunometria
 COME ORGANIZZARSI?

PROBLEMA TEMPO:

QUALITA’

N. ESAMI

Tempestività
Lo schema di Lundberg
 FLUSSO DI LAVORO

• Fase pre-analitica

• Fase analitica

• Fase post-analitica

TAT (turn around time)

 FASE PRE-ANALITICA

Post-analitica Pre-analitica

30%
50%
20%

Analitica
 FASE PRE-ANALITICA

E ’ fonte della
maggior parte degli
errori!
 FASE PRE-ANALITICA

Accettazione esami dai

Accettazione reparti a WEB
 FASE PRE-ANALITICA

Prelievo
 TRASPORTO
• Personale dedicato
• Invio materiale mediante utilizzo di
personale ausiliario e posta pneumatica
per PS e terapie intensive
•Corriere
•Droni
 Tempo e campioni ematici
• Tra le 2 e le 4 ore si possono verificare alterazioni nella
stabilità dei seguenti parametri:
– Ematocrito, Volume Globulare Medio degli eritrociti
– Bilirubina, Glucosio, potassio, ferro, Litio, Fosforo

• Oltre le 4 ore:
– LDH, fosfatasi acida, potassio, frazioni di complemento C3
e C4,
– Catecolamine totali, Acido Folico, Gastrina, Vitamina B12,
Zinco
– Studi di popolazioni cellulari in EDTA
– Studi di coagulazione che richiedano la separazione,
refrigerazione o congelamento del plasma
Temperatura e campioni ematici
• A Temperatura ambiente:
– Decremento del glucosio (Per 2h a 23ºC diminuzione del
10% della concentrazione, in misura maggiore se presente
leucocitosi)
– Aumento del fosfato
– Aumento dell’ammonio a 15min
– Diminuzione folati a 30min
– Alterazione delle Vitamine B6 e B12

• A 4°C:
– attivazione piastrinica, attivazione del fattore VII e perdita
di alcuni fattori della coagulazione (il campione per i test
di coagulazione in sodio-citrato deve essere mantenuto a T
ambiente, o in contenitori a T controllata tra 15-25°C, e
arrivare in laboratorio il prima possibile)

• A temperature inferiori ai 4°C o superiori ai 30°C:

– Aumento del rilascio di ioni potassio dagli eritrociti
 Check-in del campione
Check in di tutto il materiale in entrata: l’accettazione viene
eseguita nei reparti o Pronto soccorso

consente di accertare l’arrivo di tutto il materiale biologico in

laboratorio
 Codice colore
Codice colore con cui il personale classifica in
ingresso i campioni in base all’ effettivo grado
di urgenza:

bollino blu esame urgente

bollino rosso libera professione
bollino verde PFA/ emocromo su citrato
bollino giallo sale operatorie
 FASE PRE-ANALITICA

Centrifugazione
Stappatura
FASE ANALITICA
 FASE POST-ANALITICA
LIS

Il collegamento informatico
capillare con tutti i reparti
permette una refertazione in
tempo reale dei parametri
(TAT)
 FLUSSO DI LAVORO

L ’ acquisizione di moderne
tecnologie ha permesso la
riorganizzazione dei laboratori

Ottimizzazione
spazio/tempo/personale
 CONSOLIDAMENTO
Accentramento di più settori di indagine su un unico sistema
analitico, utilizzando strumentazioni che consentono
l ’ esecuzione di esami ritenuti fino ad ora di pertinenza di
discipline separate (biochimica, immunometria, marcatori
tumorali, monitoraggio farmaci, etc.)
 INTEGRAZIONE
Integrare significa processare
dalla stessa provetta test
normalmente afferenti a settori
diversi del laboratorio, ed è
percorribile nella fase analitica
collegando fisicamente (in
catena) strumenti di settori
diversi: chimica clinica, ormoni,
allergologia, sierologia,
virologia…