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I VACCINI

 BASE RAZIONALE

UNA PRECEDENTE RISPOSTA IMMUNE


VERSO UN MICRORGANISMO RENDE
UN INDIVIDUO MENO SUSCETTIBILE O
ANCHE RESISTENTE AD UNA
INFEZIONE DA PARTE DELLO STESSO
AGENTE INFETTIVO
I VACCINI
 DEFINIZIONE

MICRORGANISMI, VIRUS, MATERIALI DI


ORIGINE MICROBICA (TOSSINE) RESI
POCO O PER NULLA DANNOSI PER
L’ORGANISMO, MA IN GRADO DI
FUNZIONARE DA ANTIGENI
I VACCINI
 VACCINAZIONE

INOCULAZIONE DI VACCINI PER


INDURRE UNA RISPOSTA
IMMUNITARIA SIMILE A QUELLA CHE
SI OSSERVA NELL’INFEZIONE
NATURALE, IN ASSENZA DI MALATTIA
CENNI STORICI
 E. JENNER (FINE ‘700)
SCOPERTA DEL PRINCIPIO DELLA
VACCINAZIONE (VAIOLO)
 PASTEUR (FINE ‘800)

ATTENUAZIONE DI MICRORGANISMI
PATOGENI
 WRIGHT

USO DI VACCINI IN TERAPIA


VACCINI TRADIZIONALI
 BATTERICI
- ANATOSSINE O TOSSOIDI
- BATTERI

 VIRALI (CON ORGANISMI)


- INATTIVATI
- ATTENUATI
VACCINI BATTERICI
1. ANATOSSINE O TOSSOIDI

ESOTOSSINE BATTERICHE PRIVE DEL


POTERE TOSSICO, MA CON
INALTERATE PROPRIETA’
ANTIGENICHE
(ES. V. ANTIDIFTERICO E ANTITETANICO)
VACCINI BATTERICI
1. BATTERI

c) PATOGENI UCCISI
 V. ANTITIFICO
 V. CONTRO Rickettsia prowazekii (TIFO
PETECCHIALE)
VACCINI BATTERICI
b) VARIANTI APATOGEN VIVENTI

 V. ANTITUBERCOLARE (B.C.G.: bacillo


di Calmette e Guerin)

 V. ANTITIFICO (CEPPO ATTENUATO Ty


21 DI Salmonella typhi)
VACCINI VIRALI
1. VIRUS INATTIVATI
VIRUS CHE HANNO PERSO LA CAPACITA’
REPLICATIVA. NON HANNO POTERE
INFETTANTE O PATOGENO, MA
CONSERVANO IL POTERE ANTIGENICO
 PUNTO CHIAVE: INATTIVAZIONE

(ES. POLIOVIRUS, VIRUS DELL’EPATITE A,


DELL’INFLUENZA, DELLA RABBIA…)
VACCINI VIRALI
1. VIRUS ATTENUATI
PREPARAZIONI VIRALI CHE MANTENGONO
INALTERATO IL LORO POTERE ANTIGENICO,
DOTATE DI CAPACITA’ REPLICATIVA LIMITATA
NELL’OSPITE SENZA INDURRE MANIFESTAZIONI
PATOLOGICHE E CON CARATTERISTICHE
ATTENUATE STABILI NEL TEMPO
 PUNTO CHIAVE: CONTAMINAZIONE
(ES. POLIOVIRUS, VIRUS DEL MORBILLO, DELLA
PAROTITE, DELLA ROSOLIA, VARICELLA-
ZOSTER…)
Live attenuated virus vaccines

Successful live attenuated vaccines are effective for 3 reasons:


The attenuated viruses replicate to some extent in the host
The attenuated viruses have a reduced capacity to spread from
the site of replication
The attenuated viruses cause mild or inapparent disease.
LIMITI DEI VACCINI
TRADIZIONALI
 CRESCITA IN COLTURA DELI AGENTI INFETTIVI
 COSTI
 MISURE DI SICUREZZA
 INVOLONTARIA DIFFUSIONE DELLA MALATTIA
 POSSIBILE REVERSIONE DEL CEPPO
ATTENUATO
 NON EFFICACI PER TUTTE LE MALATTIE (ES.
AIDS)
 PROBLEMI DI CONSERVAZIONE
VACCINI DI NUOVA GENERAZIONE
(TECNOLOGIA DEL DNA
RICOMBINANTE)
 VACCINI SUBUNITA’
 V. PEPTIDICI
 V. ATTENUATI TRAMITE MANIPOLAZIONE
GENETICA
 VETTORI VACCINICI
 VACCINI GENETICI
VACCINI SUBUNITA’
UTILIZZANO COMPONENTI DELL’ORGANISMO
PATOGENO ANZICHE’ L’ORGANISMO
INTERO
 VANTAGGI
 STABILI E SICURI
 PRIVI DI EFFETTI COLLATERALI INDESIDERABILI

 SVANTAGGI
 PURIFICAZIONE COSTOSA
 ALTERAZIONE DELLA CONFORMAZIONE NATIVA
>ALTERAZIONE DELL’ANTIGENICITA’
New Methods
• Recombinant DNA
•Single gene (subunit)

S-antigen mRNA
Hepatitis B
vaccine
cDNA
raised in yeast
Express plasmid

S-antigen mRNA
protein
PRODUZIONE DI VACCINO CONTRO EPATITE B IN LIEVITO

-VACCINI ATTENUATI SONO VIRUS ALTERATI IN MODO CHE


NON POSSANO PIU’ RIPRODURSI NELL’ORGANISMO IN CUI
VENGONO INOCULATI

-QUESTI VACCINI SONO POTENZIALMENTE PERICOLOSI :


POSSONO ESSERE CONTAMINATI CON VIRUS INFETTIVI

-TENTATIVI DI PRODURRE ANTIGENE DI SUPERFICIE DI


VIRUS EPATITE B (HBsAg) IN E. Coli FALLIRONO

-IL GENE CODIFICANTE HBsAg E’ STATO CLONATO IN UN


VETTORE DI ESPRESSIONE DI LIEVITO.

-LIEVITO TRASFORMATO CON QUESTO VETTORE PRODUCE


ELEVATE QUANTITA’ DI HBsAg

-UTILIZZANDO FERMENTATORI E’ POSSIBILE OTTENERE


50-100 mg DI PROTEINA PER LITRO DI COLTURA
PRODUZIONE DI
VACCINO CONTRO
EPATITE B
IN LIEVITO
VACCINI SUBUNITA’: VIRUS
DELL’HERPES SIMPLEX
HSV:

 TRASMISSIONE DI MALATTIE PER VIA


SESSUALE
 GRAVI INFEZIONI DELL’OCCHIO
 ENCEFALITE
 AGENTE ONCOGENO
VACCINI SUBUNITA’: VIRUS
DELL’HERPES SIMPLEX
 VACCINO TRADIZIONALE:
V. CON VIRUS UCCISO O ATTENUATO >
ESPOSIZIONE A RISCHIO DI TUMORE

 VACCINO DI NUOVA GENERAZIONE:


V. SUBUNITA’> PRIVO DI AZIONE
ONCOGENA
CREAZIONE DI UN VACCINO
SUBUNITA’ ANTI-HSV-1
IDENTIFICAZIONE DELLE COMPONENTI DEL VIRUS
CHE SUSCITANO GLI ANTICORPI CAPACI DI
REAGIRE CONTRO LA FORMA INTATTA DEL VIRUS
STESSO

GLICOPROTEINA D (gD) DELL’INVOLUCRO DI HSV


TIPO I (HSV-1)
CREAZIONE DI UN VACCINO
SUBUNITA’ ANTI-HSV-1

(Difficile da purificare)

(Cellula ospite)

(Solubile)
CLONAZIONE DEL GENE gD MODIFICATO
IN UN VETTOTE DI ESPRESSIONE EUCARIOTICO

TRASFEZIONE IN CELLULE DI OVAIO DEL


CRICETO CINESE (CHO)

GLICOSILAZIONE E SECREZIONE NEL


MEZZO ESTERNO DEL PRODOTTO

FORMA MODIFICATA DI gD

EFFICACE SIA CONTRO HSV-1 CHE HSV-2


TUBERCOLOSI:
Mycobacterium tuberculosis
 VACCINO ATTUALMENTE IN USO IN ALCUNI PAESI:
V. DI CALMETTE-GUERIN (BCG): CEPPO DI
Mycobacterium bovis VIVO

CONTESTAZIONI
 CAUSA DI MALATTIE IN PZ IMMUNODEPRESSI

(AIDS…)
 IMPOSSIBILITA’ DI DISTINGUERE GLI INDIVIDUI

REALMENTE AFFETTI DA TUBERCOLOSI DA


QUELLI VACCINATI CON BCG
TENTATIVI DI CREAZIONE DI UN
VACCINO PIU’ SICURO ED EFFICACE
CONTRO
LA TUBERCOLOSI (V. SUBUNITA’)
COLTIVAZIONE DI M. tuberculosis IN MEZZO LIQUIDO

ISOLAMENTO E PURIFICAZIONE DI 6 PROTEINE


(EXTRACELLULARI) SECRETE

UTILIZZO DI TALI PROTEINE (SINGOLARMENTE ED IN


COMBINAZIONE) PER IMMUNIZZARE LE CAVIE
AEROSOL (200 CELLULE VIVE
DI M. tuberculosis)
LE COMBINAZIONI DI PROTEINE PURIFICATE ASSICURANO
LO STESSO LIVELLO DI PROTEZIONE FORNITO
DAL V. BCG
IMMUNOGENI PROTETTIVI USATI, O
POTENZIALMENTE UTILIZZABILI,
IN V. SUBUNITA’
 Ag DI SUPERFICIE DELL’EPATITE B
 gp 120 DI HIV
 EMOAGGLUTININA DEL VIRUS
DELL’INFLUENZA
 Ag G DELLA RABBIA
 GLICOPROTEINA D DI HSV
VACCINI PEPTIDICI
COSTITUITI DA BREVI PEPTIDI SIMULANTI EPITOPI
(DETERMINANTI ANTIGENICI)
CHE HANNO AZIONE IMMUNOGENA
LIMITAZIONI:
 PER ESSERE EFFICACE, UN EPITOPO DEVE ESSERE COSTITUITO
DA UN BREVE TRATTO DI AA CONTIGUI… NON SEMPRE E’ COSI’ IN
NATURA

 IL PEPTIDE DEVE ESSERE CAPACE DI ASSUMERE LA STESSA


CONFORMAZIONE CHE HA L’EPITOPO DELLA PARTICELLA INTATTA

 UN SOLO EPITOPO PUO’ NON ESSERE SUFFICIENTEMENTE


IMMUNOGENO

N.B. NECESSITANO DI UNA PROTEINA CARRIER!


VACCINI ATTENUATI TRAMITE
MANIPOLAZIONE GENETICA
(BATTERICI O VIRALI)
COSTITUITI DA:
 ORGANISMI NON PATOGENI MANIPOLATI IN MODO CHE
TRASPORTINO ED ESPRIMANO DETERMINANTI
ANTIGENICI DERIVANTI DALL’AGENTE PATOGENO
BERSAGLIO
 CEPPI MANIPOLATI DI ORGANISMI PATOGENI I CUI GENI
DELLA VIRULENZA SONO STATI MODIFICATI O DELETI

I DETERMINANTI ANTIGENICI CHE CONTANO SI


PRESENTANO AL SISTEMA IMMUNITARIO CON UNA
CONFORMAZIONE ASSAI SIMILE A QUELLA CHE AVREBBE
L’ANTIGENE DELL’ORGANISMO PATOGENO
COLERA: Vibrio cholera

V. ANTICOLERA ATTUALE: V. cholera


INATTIVATO CON IL FENOLO

MODERATA PROTEZIONE CHE PERMANE


DA 3 A 6 MESI
ENTEROTOSSINA COLERICA
PEPTIDE A1

 1 SUBUNITA’ A

PEPTIDE A2

 5 SUBUNITA’ B IDENTICHE

CREAZIONE DI ALTRI TIPI DI VACCINI


CREAZIONE DI UN CEPPO DI V. cholera
CON DELEZIONE DEL PEPTIDE A1 :
VACCINO

SELEZIONE TETRACICLINA!!

• 90% PROTEZIONE MA
EFFETTI COLLATERALI
LE SPECIE DI Salmonella
CEPPI DI Salmonella: FEBBRI INTESTINALI, MORTE INFANTILI,
FEBBRE TIFOIDE, INTOSSICAZIONE ALIMENTARE

ATTENUAZIONE DI VARI CEPPI DI Salmonella

DOPPIA DELEZIONE

GENI aro GENI pur


BIOSINTESI DI METABOLISMO PURINICO

COMPOSTI AROMATICI
CEPPI ATTENUATI DI Salmonella: INFEZIONI
DI BASSO LIVELLO. VIRULENZA DI 106
VOLTE O PIU’.

VACCINI ORALI EFFICACI


VETTORI VACCINICI
VIRUS VACCINO UTILIZZATO COME
VETTORE VACCINICO

VIRUS VACCINO
 POXVIRUS, VAIOLO, DNA DOPPIO FILAMENTO,
REPLICAZIONE CITOPLASMATICA
(INDIPENDENTE DALLA CELLULA OSPITE).
INFETTA UOMO E MOLTI ALTRI VERTEBRATI E
INVERTEBRATI.
 BEN CARATTERIZZATO A LIVELLO
MOLECOLARE
 STABILE, SOLITAMENTE BENIGNO
VETTORI VACCINICI
VIRUS VACCINO

IDONEO A SERVIRE DA VETTORE VACCINICO

MA….
 GENOMA MOLTO GRANDE, PRIVO DI SITI DI RESTRIZIONE
UNICI
 IMPOSSIBILE INSERIRE DIRETTAMENTE NEL GENOMA
VIRALE ALTRO DNA

 RICOMBINAZIONE OMOLOGA IN VIVO!


INTEGRAZIONE NEL VIRUS VACCINICO DI
UN ANTIGENE VIRALE CHE EVOCA
LA RISPOSTA IMMUNITARIA
1. COSTRUZIONE DI UN PLASMIDE RECANTE IL
GENE DI UN ANTIGENE (HBcAg)

TRASFEZIONE DI
FIBROBLASTI
DI EMBRIONI DI POLLO
(TK NEGATIVE)
PRECEDENTEMENTE
INFETTATE CON
IL VIRUS VACCINO WT
(TK POSITIVO)
2. INTEGRAZIONE DEL GENE DELL’ANTIGENE NEL
DNA DEL VIRUS VACCINO

TK TK
DOPPIO
TK CROSSING-OVER

HBcAg
 Cellule ospiti: TK-
 Virus ricombinato: TK-

I SELEZIONE : Bromodeossiuridina (MORTE


DI CELLULE TK+)

II SELEZIONE: Sonda di ibridazione a DNA


per l’antigene
Construction of a
recombinant
vaccinia virus
expressing the
influenza virus
HA gene
ALCUNI ANTIGENI INSERITI
NEL GENOMA DEL VIRUS
VACCINO
 PROTEINA G DEL VIRUS DELLA RABBIA
 Ag DI SUPERFICIE DELL’EPATITE B
 PROTEINE NP E HA DEL VIRUS
INFLUENZALE
 PROTEINE N E G DEL VIRUS DELLA
STOMATITE
 GLICOPROTEINE DEL VIRUS
DELL’HERPES SIMPLEX
ESEMPI DI VIRUS VACCINI
RICOMBINANTI EFFICAI
 VIRUS VACCINO RICOMBINANTE-GENE
DELLA PROTEINA G DI TIPO 1 DI HSV:
PREVENZIONE DELL’INFEZIONE
ERPETICA NEI TOPI

 VIRUS VACCINO RICOMBINANTE-Ag DI


SUPERFICIE DEL VIRUS DELLA RABBIA:
NEUTRALIZZAZIONE DEGLI ANTICORPI
NELLE VOLPI (IN EUROPA I PRINCIPALI
PORTATORI DELLA RABBIA)
VACCINI VIRALI
RICOMBINANTI VIVI
 VANTAGGI
- ESPRESSIONE DEGLI ANTIGENI AUTENTICI IN
MODO CHE ASSOMOGLIA MOLTO DA VICINO
ALL’INFEZIONE NATURALE
- ATTIVAZIONE DI CELLULE B (RISPOSTA
UMORALE) E DI CELLULE T (RISPOSTA
CELLULO-MEDIATA)
- RIDUZIONE ULTERIORE DELLA VIRULENZA
DOVUTA ALL’INSERIMENTO DI GENI DEGLI
ANTIGENI IN UNO O PIU’ SITI DEL GENOMA
VIRALE
VACCINI VIRALI
RICOMBINANTI VIVI
 SVANTAGGI
IL LORO IMPIEGO IN INDIVIDUI
IMMUNODEPRESSI (ES. AIDS…) PUO’
CAUSARE GRAVE INFEZIONE VIRALE.
BATTERI COME SISTEMI DI
INSERIMENTO DEGLI
STRATEGIA: ANTIGENI
COLLOCAZIONE DI UN Ag NEUTRALIZZANTE DI
UN BATTERIO PATOGENO SULLA SUPERFICIE
DI UN BATTERIO NON PATOGENO VIVO.

ESEMPIO:
ESPRESSIONE SUI FLAGELLI DI UN
ORGANISMO NON PATOGENO DI UNO
SPECIFICO EPITOPO DERIVANTE DA UN
BATTERIO PATOGENO PER REALIZZARE UNA
IMMUNOGENICITA’ PROTETTIVA.
COSTRUZIONE DI UN
VACCINO ANTI-COLERA
 INSERIMENTO DI UN
OLIGONUCLEOTIDE SINTETICO
(EPITOPO DEALLA SUBUNITA’ B DELLA
TOSSINA COLERICA) IN UNA PORZIONE
DEL GENE DELLA FLAGELLINA DI
Salmonella.

 INTRODUZIONE DEL COSTRUTTO IN UN


CEPPO DI Salmonella FLAGELLINA-
NEGATIVO.
COSTRUZIONE DI UN
VACCINO ANTI-COLERA
IMMUNIZZAZIONE DI TOPI (MEDIANTE
INIEZIONE INTRAPERITONEALE) CON
BATTERI RECANTI “FLAGELLI
INGEGNERIZZATI” E INATTIVATI CON
FORMALINA

PRODUZIONE DI ELEVATI LIVELLI DI


ANTICORPI DIRETTI CONTRO LA
MOLECOLA DELLA TOSSINA COLERICA
INTATTA!
VACCINI GENETICI

 IMMUNIZZAZIONE GENETICA
TRASFERIMENTO DI UN GENE CODIFICANTE
UN ANTIGENE ALL’INTERNO DI UN
ORGANISMO OSPITE CHE NON ESPRIME TALE
ANTIGENE IN CIRCOSTANZE NORMALI.
 ANTIGENE: DNA O RNA
 VACCINI AD RNA: POCHI ESEMPI (BREVE
ESPRESSIONE)
 VACCINI A DNA: SEMPRE PIU’ NUMEROSI
VACCINI A DNA
COSTITUITI GENERALMENTE DA VETTORI PLASMIDICI
(DERIVATI DA BATTERI) CHE CONTENGONO GENI
ETEROLOGHI (TRANSGENI) INSERITI SOTTO IL
CONTROLLO DI UN PROMOTORE EUCARIOTICO,
DETERMINANDO ESPRESSIONE PROTEICA IN CELLULE DI
MAMMIFERO

STIMOLANO EFFICACEMENTE UNA RISPOSTA IMMUNE:

 UMORALE
 CELLULARE
 IMMUNITA’ UMORALE:
PRODUZIONE DI ANTICORPI ANTIGENO-SPECIFICI DA
PARTE DI CELLULE B ATTIVATE
NEUTRALIZZAZIONE DELL’AGENTE PATOGENO
(Sufficiente da sola per la profilassi di alcune
malattie, Es. EPATITE B)

 IMMUNITA’ CELLULO-MEDIATA (CMI):


INDUZIONE DI LINFOCITI T CITOTOSSICI (CTLs)
DISTRUZIONE DI CELLULE INFETTE
(COINVOLGIMENTO DI MOLECOLE CODIFICATE DAI
GENI DEL COMPLESSO MAGGIORE DI
ISTOCOMPATIBILITA’). (MHC) (Essenziale per la
protezione contro malattie causate da patogeni
intracellulari, Es. TUBERCOLOSI)
Plasmid construct
expression gene
cassette
promoters:
- CMVIE or poly (a)-signals:
CMV intron A - BGH
- RSV LTR -SV40
- SV40 early

resistance
gene
ori
bacterial resistance
E. coli origin of replication gene:
- ColE1 - kanamycin
- no mammalian origin - none
DNA
Vaccines
Inoculation technology

 needle inoculation
 i.m.
 i.d.

 gene gun

 air
 food uptake
Types of Injection for DNA
Vaccines
 Gene Gun (bombardment)~ Propels DNA-coated gold
particles directly into the cytoplasm of cells in target tissue
by means of electrical discharge or helium pulse

 Injection by a needle~ “plasmid DNA immunization has


been accomplished using epidermal, mucosal,
intramuscular, and intravenous routes of administration”

 “Striated muscle initially was considered to be the only


tissue capable of efficiently taking up and expressing free
plasmid DNA in an aqueous solution.”
Intra-muscular DNA
vaccine
muscle
gene per
l’antigene

b
materiale
patogeno plasmide
genetico
modificato
c
La preparazione di un Vaccino a DNA muscolo
solitamente si attua isolando uno o più geni
dell’agente patogeno e integrandoli in
plasmidi (a), piccoli anelli circolari di DNA.
I plasmidi vengono rilasciati in piccoli
gruppi di cellule, spesso per iniezione nelle
pelle
cellule muscolari (b) o per trasferimento
attraverso la pelle utilizzando una pistola
genica (gene gun) (c).
I geni codificano per gli Ag del patogeno.
Gli Ag prodotti sono in grado di stimolare
Mechanism of immunisation
T-cell selection
plasmid and stimulation cytotoxic
T-cell response
CD8+ T CELL
cross priming

MHC I
transfection Th I
myocyte
APC

processing processing/ selection of


presentation T-helper cells
transcription
integration ? translation

MHC II
Th II CD4+ T Cell
secretion

antibody-dependent
B-cell stimulation immune responses
and selection • neutralisation
• ADCC • C-lysis
Features of DNA vaccination
 Antigenicity of expressed viral antigens similar to that
observed during natural infection

 Efficient elicitation of CD8+ CTLs


(MHC I presentation)

 Expression of multiple combined antigens possible by


mixing multiple expression plasmids

 Simplicity of vector construction

 Simplicity of vector production and transport


Possible applications of DNA vaccines
 Virus
 HIV/SIV, Influenza, HBV, HCV, HSV, HCMV, Dengue, Rota, Rabies,
LCMV...
 Bacteria
 Borreliosis, Tetanus, Tuberculosis, M. pulmonis, Salmonella typhi, ...
 Parasite
 Malaria, Leishmania major, Schistosoma jap., Toxoplasma gondii, ...
 Tumor
 B-cell lymphoma/ Non-Hodgkin lymphoma, colorectal carcinoma, breast
cancer (CEA+), Melanoma, ...

 Allergy, auto-immune disease, immune tolerance


 Hausstaubmilben, TCR-autoimmune encephalomyelitis, rheumatoid
arthritis, Systemic Lupus Erythematodes (TGF-ß/IL-2), Plasmodium
yoelii-tolerance
Amount of DNA
used as a vaccine
(complete dosage)

100µg plasmid DNA


i.m.
10 mg plasmid DNA
i.m./i.d./gene gun

10-50 mg plasmid DNA


i.m./i.d./gene gun
Clinical trials
 HIV-1 (env,rev,gag,pol, nef)
 HSV-1 (gD,gB,ICP-27)
preventive  Malaria parasite (CSP)
 Influenza A virus (HA,M1,NP)
 HBV (HBsAG)

 tumour vaccines (tumour-specific


therapeutic antigens)
 HIV-1(env, tat, nef, multi-epitope)
Pro and cons of DNA vaccines

 Synthesis in vivo of a • Risk of cancer


selected antigen or designer (insertional mutagenesis) ?
gene product
 No risk of infection • Risk of induction of tolerance ?
 Use of immunogen from yet
uncultured pathogens • Risk of induction of
 Induction of cellular and auto-immune disease ?
humoral immune responses
 Cheap and easy production • Prophylactic use e.g. in
 Easy transport and storage children affords particular
safety features
Special safety considerations

 tumor induction
 due to chromosomal integration
 tolerance
 due to long-term presentation of antigen

 adverse reactions and immunopathology


 due to co-administration of cytokine and/or immun stimulatory

genes
 auto-immune reactions
 correlated with the induction of anti-DNA antibodies

 biologic activity (apart from immunogenicity)


 of the expressed antigen
Chromosomal integration:
Can it take place in vivo?

 No, following i.m. naked DNA inoculation


 up to 8 months after inoculation, no integration has been
detected in muscle tissue

 Yes, following other routes and methods of


administration
 publication describing evidence of integration 17 days after
inoculation in spleen cells
Chromosomal integration:
The variables
 formulation
 naked, lipids, etc.

 type of sequences
 homology to chromosomal DNA sequences

 route of administration
 i.m., i.d., s.c., etc.

 type of tissue
 rate of proliferation?

 quality of the DNA


 amount of linear or nicked plasmid ? Degree of

supercoiledness?
Chromosomal integration:
Where should we look?
 in every tissue
 extensive biodistribution of naked DNA observed in mice

 in gonads
 major concern of germ line gene transfer

 in various tissue depending on formulation


 formulation may target DNA to different cell types or tissues
Chromosomal integration:
What sensitivity of detection should we aim for?

 PCR
 most sensitive
 sensitivity is limited
 due to rapid biodistribution of DNA
 at which time point after inoculation
 5 days or 15 days
 integration assay, if DNA is detected in a given tissue by PCR
Chromosomal integration:
Should we look for it in all cases?
 yes
 because consequences could be detrimental
 preventive vaccines will be used in healthy adults or children

 not in all cases after i.m. inoculation


 FDA: if expression construct is changed (insert), but plasmid
backbone identical: not necessary for early trials
 EU: ?

 yes, in all cases


 if route of administration is changed
 if method of delivery is changed
Production process, risks, consequences

 E.coli fermentation  antibiotics  anaphylaxis

 extraction and primary  endotoxin  toxachia


recovery

 chromatography  bovine ribonuclease  infection with nvCJD or


viral zoonoses

 product  gene transfer to


 antibiotic resistance
genes pathogenic bacteria
with subsequent
reduction in the efficacy
of antibiotic therapy
Quality and safety evaluations

 pre-clinical safety evaluation:


 animal models

 translation of authentic gene product


 absence of replication competent viruses
(vector-derived)
 absence of any other viruses etc.
 titre, dosage
 absence of DNA or protein contaminants,
pyrogens etc.
Toxicity studies

 organ and tissue distribution of transgene,


persistence, expression over time

 exclusion of germ line transmission


and environmental risk

 physiological consequences of gene expression

 include functional end point in vivo


Biological Monitoring

 absence of germ line transfer

 spread into other tissues

 antibodies against vector,


antigen or
genetically modified cell