Gli obiettivi di analisi biochimico-cliniche
L'obiettivo del corso di analisi biochimico-cliniche è la
formazione di personale competente nella gestione di un
laboratorio di analisi biochimico-cliniche, con riguardo alla
conoscenza dei principi dei dosaggi, delle norme di sicurezza
e del controllo della qualità dei risultati. Il programma è diviso
in 5 tesine.
• La prima tesina tratta di: sangue: campioni di analisi,
di emostasi, plasma e siero, PT, PTT, VES; urine; risposta
immunitaria e attivazione del complemento. I due principali
eventi che avvengono nel sangue sono l'emostasi e
l'attivazione del complemento. L'emostasi è il controllo della
coagulazione, che avviene attraverso la formazione e la
dissoluzione del coagulo. Ogni qualvolta si esegue un'analisi
può essere necessario preparare due tipi di campioni di analisi:
il plasma o il siero, a seconda se si eseguono o meno
determinate procedure.
• La seconda tesina è dedicata alle tecniche utilizzate
nei laboratori di diagnostica sanitaria per eseguire i dosaggi:
cromofori, spettrofotometri, radioattività, separazione delle
molecole, applicazione delle tecniche immunochimiche (che
utilizzano anticorpi policlonali o monoclonali).
• La terza tesina tratta dei dosaggi: concentrazione di
proteine totali, quadro proteico (dosaggio di proteine
frazionate attraverso la tecnica elettroforetica), dosaggio di
enzimi, dosaggi che si eseguono con metodo enzimatico e
metodo chimico, dosaggi ormonali. La concentrazione di
proteine totali in un campione di plasma o di urine ha un
significato diagnostico, cioè si può sospettare una qualche
patologia se il risultato di questo dosaggio non rientra
nell'intervallo fisiologico. Per tutte le molecole non proteiche
esistono dei dosaggi di tipo diverso. Gli ormoni sono tutte
molecole che esplicano la stessa funzione, ma che dal punto di
vista strutturale possono essere molto diverse; l'insulina e il
glucagone sono peptidi. Un peptide è una catena formata da
meno di 60 amminoacidi, mentre si può considerare proteina
quando il numero di residui amminoacidici supera i 60.
L'insulina che è appena al di sotto dei 60 è definita un peptide.
Non è la struttura quaternaria o meno quello che fa del
polipeptide una proteina, tant'è vero che l'insulina, pur essendo
piccola, possiede struttura quaternaria ed è fatta di due catene.
• La quarta tesina è dedicata alle diagnosi in
laboratorio. Un semplice dosaggio spesso non basta a portare
avanti una diagnosi. Le diagnosi comprendono quella
dell'emoglobina totale, quella prenatale dell'anemia
falciforme, quella del diabete; marcatori di infiammazione, di
danno cardiaco, epatico, renale, marcatori tumorali; diagnosi
di ipotiroidismo primario o secondario (livello ematico di
ormoni tiroidei T3 e T4 bassi); dosaggi ormonali in
gravidanza. Una delle diagnosi più raffinate è la prenatale
dell'anemia falciforme. L'anemia falciforme è una malattia
ereditaria imputabile ad una mutazione puntiforme
dell'emoglobina. Vi sono varianti fisiologiche
dell'emoglobina. L'emoglobina è un esempio luminoso di
proteina allosterica ed è forse la proteina dalla funzione più
importante nel nostro corpo. Il diabete è una patologia
multifattoriale nella quale si osserva una glicemia
persistentemente elevata. Dosare solo la glicemia e trovare una
iperglicemia è solo un campanello d'allarme, è necessario ma
non sufficiente a diagnosticare il diabete; per diagnosticarlo
serve tutta una serie di dosaggi che alla fine convergono in
questa diagnosi. La gravidanza viene diagnosticata attraverso
il dosaggio dell'ormone HCG (human corionic gonadotropin)
nelle urine. La gravidanza non solo dev'essere diagnosticata,
ma anche monitorata, sempre attraverso i dosaggi ormonali.
• La quinta tesina è dedicata al controllo di qualità dei
risultati. Per legge l'attendibilità dei risultati è fondamentale.
Sicuramente esiste una variabilità che contrasta la bontà dei
risultati: se uno spettrofotometro si danneggia (si esaurisce la
lampada) è avvenuta una variabilità che impedisce
l'acquisizione di dati corretti. Per eseguire i dosaggi sono
necessari dei pipettatori automatici; se sono starati possono
portare a variabilità analitiche non trascurabili. Lo sforzo del
laboratorio si tratta di avere almeno un modo di controllare la
bontà dei risultati. Ogni laboratorio deve applicare un
controllo di qualità interno (CQI), che si occupa di controllare
continuamente i risultati. Per garantire dei risultati ottimali c'è
bisogno di macchine e strumenti funzionanti e di personale
competente, ma è anche necessario mantenere la costanza
della bontà dei risultati. Per essere accreditati bisogna poi
partecipare a programmi di VEQ (valutazione esterna di
qualità) in cui i migliori laboratori della regione si confrontano
per stabilire i metodi migliori per i dosaggi.
Analisi biochimico-cliniche
Le analisi biochimico-cliniche consistono nel dosaggio di
analiti in campioni di analisi.
Per dosaggio si intende il calcolo della concentrazione.
Gli analiti sono le biomolecole di interesse diagnostico. Gli
analiti possono essere molecole diverse per struttura: zuccheri
(glucosio), proteine, molecole azotate non proteiche (urea),
lipidi (colesterolo). Gli analiti possono essere anche molecole
diverse per funzione: enzimi (transaminasi), ormoni
(gonadotropina corionica), molecole di trasporto
(emoglobina), anticorpi. Queste sono molecole il cui dosaggio
può dare un'idea di stato di benessere o malessere, di danno,
di patologia, o di insufficienza di un organo.
I campioni di analisi possono essere il sangue intero, il
plasma, il siero o le urine.
Il dosaggio di questi analiti in campioni di analisi deve
risultare utile per uno scopo diagnostico o uno scopo
prognostico. La diagnosi riguarda la presenza o meno di un
determinato fenomeno. La prognosi invece indica
l'evoluzione della patologia. La prognosi è riservata quando
l'evoluzione della malattia è sconosciuta. La prognosi
considera non solo l'evoluzione della malattia, ma anche la
risposta a una terapia.
Urine
Nelle urine ci sono alcune molecole presenti in quantità
elevata ed è giusto che sia così. Se bisogna fare un'analisi delle
urine di certo non sono quelle le molecole che si vanno a
dosare. L'urina contiene acqua e sostanze idrosolubili. Il giallo
è dovuto agli urocromi.
Il nostro organismo riesce ad eliminare con le urine:
• dai 20 ai 35 g al giorno di urea;
1
• dagli 0,3 ai 2 g al giorno di acido urico, derivante dal Talvolta sarà sufficiente un solo campione di urine, quelle
metabolismo delle purine; della mattina. In alcuni casi invece, quando bisogna stabilire
• 1,5 g di creatinina, che deriva dalla creatina muscolare; • 3 la quantità totale per diem della sostanza, bisogna avere un
campione di urine delle 24 ore.
g al giorno di corpi chetonici;
• 3 g al giorno di amminoacidi.
Nell'urina glucosio e proteine devono essere presenti in
piccole quantità. Grandi quantità di glucosio o proteine sono
campanelli di allarme di patologie, come il diabete, perché i
glomeruli renali devono poter riassorbire queste sostanze utili.
L'urea (urèa) è un composto azotato che si ottiene dalla
degradazione degli amminoacidi. È una molecola molto
semplice costituita da un atomo di carbonio, un gruppo
carbonilico e due gruppi amminici. Questa piccola molecola
polare diffonde liberamente attraverso le membrane cellulari.
Nel nostro corpo le proteine vengono continuamente
idrolizzate (vengono rotti tutti i legami peptidici) e ricostruite.
Gli enzimi che eseguono la demolizione si chiamano proteasi.
Un amminoacido ha sempre un gruppo amminico e un gruppo
carbossilico. Alcuni amminoacidi vengono prontamente
riutilizzati per ricostituire molecole non proteiche, come
ormoni. Tuttavia la maggior parte degli amminoacidi che
derivano dalla demolizione proteolitica di una molecola
proteica vengono riutilizzati per costituire proteine. Questo
avviene soltanto dopo aver perso il gruppo amminico sotto
forma di ammoniaca, che è tossica. Gli animali ammoniotelici
(pesci) liberano l'ammoniaca direttamente nell'acqua. L'uomo
è un animale ureotelico ed ha bisogno di trasformare
l'ammoniaca in una specie atossica e idrosolubile, che è l'urea.
Nel fegato i gruppi amminici vengono convogliati su due
trasportatori che sono l'acido glutammico e l'alanina, entrano
negli epatociti ed entrano nel ciclo dell'urea. Il ciclo dell'urea
è una via metabolica complessa che avviene un po' nel
citoplasma, un po' nei mitocondri, con la quale l'ammoniaca
diventa urea. I gruppi amminici dell'urea possono derivare
anche dal catabolismo delle basi azotate, ma derivano
massicciamente dalla degradazione delle proteine, tant'è vero
che l'azotemia è fisiologicamente elevata nelle persone che,
ingerendo molta carne, assimilano molte proteine. Il gruppo
carbonilico dell'urea proviene dalla CO2. Per ogni ciclo 4
legami fosfodiestere ad alta energia dell'ATP devono essere
rotti. È una via molto dispendiosa, ma patologie genetiche che
interessano uno o più enzimi del ciclo dell'urea sono molto
invalidanti.
Sangue
Il sangue è un sistema bifasico fatto da plasma per la parte
liquida e da cellule per la parte corpuscolare.
Il sangue è caratterizzato da alcuni parametri fisici: la volemia,
la temperatura e il pH arterioso. La volemia è il volume di
sangue totale in un organismo e per un uomo si aggira intorno
ai 70 mL per ogni kg.
Il plasma è un liquido giallo citrino composto per il 90% da
acqua e per il 10% da soluti. Le cellule sono globuli rossi
(eritrociti o emazie), globuli bianchi (leucociti) e piastrine
(trombociti). I globuli bianchi si dividono in granulociti,
linfociti e monociti. A loro volta i granulociti si dividono in
neutrofili, basofili ed eosinofili, mentre i linfociti sono T e B.
I soluti che sono nel plasma sono tutti gli analiti per i quali si
effettuano i dosaggi (glucosio, enzimi, anticorpi, proteine,
urea, ormoni). La maggior parte di questi soluti è rappresentata
dalle proteine.
Per alcuni parametri del sangue c'è un distinguo che va fatto in
base al sesso. Per ogni parametro vi è un intervallo fisiologico,
cioè un range di valori definiti normali, che caratterizzano un
buono stato di salute.
L'ematocrito è il volume percentuale occupato
complessivamente da tutte le cellule del sangue. I valori
fisiologici dell'ematocrito per un uomo sono 40-50%, per una
donna 3845%.
La glicemia è la concentrazione di glucosio nel sangue.
L'intervallo fisiologico della glicemia è 70-120 mg/dl o 100
ml di sangue. Questo intervallo è caratteristico dei
normoglicemici, cioè degli individui che non hanno problemi
del metabolismo del glucosio. Un'iperglicemia ha bisogno di
approfondimento; non è detto che si tratti per forza di diabete,
risultati sballati aprono la via ad un iter diagnostico. Se si ha
un'iperglicemia persistente va ripetuto il dosaggio a digiuno e
a riposo.
L'emocromo è il conteggio dei globuli rossi, dei globuli
bianchi e delle piastrine e la determinazione quantitativa
dell'emoglobina (Hb).
I globuli rossi (red blood cells) sono presenti in 4,5-5,8 milioni
per μl di sangue nell'uomo.
I leucociti (white blood cells) devono essere presenti in un
intervallo tra 4000-10.000 per μl sia nell'uomo che nella
donna.
Altri valori sono i neutrofili, i basofili, gli eosinofili, linfociti
e monociti, piastrine e la quantità di emoglobina. La formula
leucocitaria è la percentuale di ciascun tipo di globulo bianco.
L'emoglobina è una proteina quindi la possiamo quantificare.
Nell'uomo ci sono 14-18 g di emoglobina/dl, nella donna di
meno.
Gli indici eritrocitari si riferiscono ai globuli rossi. Essi sono
MCV, MCH e MCHC. Gli indici eritrocitari sono importanti
soprattutto nel caso di anemie. In tal caso è utile sapere se c'è
poca emoglobina nei globuli rossi (emoglobinopatie) o se ci
sono pochi globuli rossi.
L'MCV (mean cell volume) è il volume cellulare medio di un
globulo rosso, che si ottiene dividendo l'ematocrito per il
numero di globuli rossi. L'MCH (mean corpuscular
hemoglobin) è il contenuto medio di Hb nei globuli rossi
(Hb/RBC in dl). L'MCHC (mean corpuscular hemoglobin
concentration) è la concentrazione cellulare media di Hb
(Hb/ematocrito).
Soluzione fisiologica
Una soluzione fisiologica è una soluzione salina che contiene
NaCl 0,9%, cioè 0,9 g di NaCl/100 ml (9 g/L). La soluzione
si prepara sciogliendo 0,9 g di NaCl in 100 ml di acqua sterile.
Questa è una concentrazione percentuale. La molarità implica
la conoscenza del peso molecolare del sale.
mol = g/(PM)
Una soluzione 1 molare contiene una mole sciolta in un litro
(1 M = 1 mol/L). Una soluzione micromolare contiene una
micromole sempre in un litro (1 μM = 1 μmol/L) perché nel
concetto di molarità è implicito il fatto che il volume del
solvente al denominatore è un litro. Una soluzione 1
millimolare ha una millimole per litro (1 mM = 1 mmol/L).
Una soluzione 1 M, se contiene una mole in un litro, è lo stesso
che dire una millimole in un millilitro.
Emopoiesi
I globuli rossi, i globuli bianchi e le piastrine sono il risultato
di una maturazione di cellule. La cellula staminale
pluripotente che sta nel midollo osseo rosso (si trova nelle ossa
piatte, nelle vertebre e nelle epifisi delle ossa lunghe) può
maturare, può differenziarsi in maniera graduale e dare vita
alle cellule mature del sangue che sono i granulociti, i
macrofagi, i linfociti (B e T), i globuli rossi e le piastrine.
Emostasi
L'emostasi è un processo che ci consente di tamponare
un'emorragia, ma anche di mantenere la fluidità del sangue. La
normale fluidità del sangue può essere considerata come
l'equilibrio tra la tendenza del sangue a coagulare e i
meccanismi anticoagulanti e fibrinolitici. L'emostasi può
essere divisa essenzialmente in tre fasi:
1. La fase vascolare è quella del restringimento del
vaso, dovuta a meccanismi neurogeni riflessi ed accentuata
dalle endoteline, finalizzata alla riduzione tempestiva ma
momentanea della perdita di sangue. Se non ci fossero le altre
fasi comunque si morirebbe dissanguati, seppur lentamente,
ma questa fase è essenziale per limitare le perdite di sangue.
2. La fase piastrinica (emostasi primaria) deve il suo
essere alle piastrine che accorrono a costituire il primo tappo
emostatico, che se non ci fosse la fase coagulativa vera e
propria, comunque non ci salverebbe la vita. Le piastrine si
legano alla matrice extracellulare tramite una glicoproteina;
anche il fattore di von Willebrand (proteina secreta dalle
cellule endoteliali) si associa al collagene della matrice
extracellulare. Entro qualche minuto, le piastrine iniziano ad
aderire al fattore di von Willebrand e cambiano forma (da
discoidale a piatta), aumentano la loro superficie grazie alla
stimolazione da parte di ADP e rilasciano i loro granuli
secretori contenenti prevalentemente ADP e trombossano A2.
Queste sostanze fungono da chemochine per altre piastrine che
si accumulano presso la lesione apponendosi sulle altre già
presenti e formando il cosiddetto “trombo bianco” che
rappresenta il primo tappo emostatico.
3. La fase coagulativa (emostasi secondaria) è resa
possibile dall'esistenza di 13 fattori della coagulazione (molti
sono serin-proteasi) che operano tagli proteolitici (rimozione
di frammenti proteici) a cascata attivando fattori inattivi,
chiamati zimogeni.
Le serin-proteasi sono quegli enzimi proteolitici che hanno
un residuo di serina nel loro sito attivo responsabile della loro
attività catalitica. Le serin-proteasi sono enzimi idrolitici in
grado di rompere specifici legami peptidici che tengono unito
un aminoacido ad un altro. Esistono proteasi con una
specificità diversa, ad esempio alcune preferiscono tagliare
amminoacidi aromatici, altre gli amminoacidi idrofobici, ma
tutte sono in grado di operare un taglio proteolitico.
Un taglio proteolitico a carico di una proteina si traduce in un
allontanamento di un pezzetto in maniera irreversibile. Dopo
la rimozione di quel pezzo lo zimogeno diventa attivo, magari
perché quel pezzetto che viene rimosso impediva l'ingresso del
substrato al sito attivo, e diventa esso stesso una proteasi, che
sarà capace di agire sul prossimo zimogeno. Le serin-proteasi
vengono di solito indicate con i numeri romani. Laddove c'è
una "a" nel nome significa che il fattore è stato attivato.
Esistono due vie della coagulazione: la via intrinseca è
attivata dal collageno liberato dalla ferita, la via estrinseca è
attivata dalla tromboplastina tessutale (fattore III) liberata dai
tessuti danneggiati. Una lesione tissutale attiva entrambe le vie
della coagulazione, il cui contributo è essenziale per la
coagulazione. Queste due vie convergono in una via comune,
il cui obiettivo finale è la trasformazione del fibrinogeno in
fibrina, mediante taglio proteolitico, per formare un coagulo
solido.
3
Il fibrinogeno (340 kDa, abbondante nel plasma) è una
proteina formata da 2 subunità nelle quali si riconoscono 3
regioni (A, B e C); la solubilità della proteina nel torrente
circolatorio è garantita dalle regioni A e B che presentano una
elevata densità di cariche negative.
La trombina (fattore IIa) taglia il fibrinogeno e allontana i
peptidi A e B, generando fibrina, poco solubile; monomeri di
fibrina polimerizzano in un coagulo lasso, caratterizzato da
interazioni deboli. Il coagulo lasso è trasformato in coagulo
solido dal fattore XIII (transglutaminasi), che catalizza la
formazione di legami covalenti crociati tra i gruppi ammidici
di Glu e i gruppi ε-amminici di Lys di diverse molecole di
fibrina.
Fisiologicamente l'emostasi è un compromesso tra la tendenza
a coagulare quando c'è un problema e meccanismi
anticoagulanti fibrinolitici che impediscono la trombosi. La
coagulazione non avviene nei vasi integri, dove le superfici
perfettamente lisce dell'endotelio che tappezza i vasi non
permettono l'adesione delle piastrine. Inoltre nel sangue
l'attività di diversi fattori della coagulazione è annullata da
molecole proteiche (antitrombina III, Proteina C, Proteina S)
o non proteiche (eparina, un mucopolisaccaride solfonato
sintetizzato dai mastociti che inibisce i fattori X e II attivati).
Dopo che è avvenuta la formazione del coagulo su una ferita,
proteasi presenti in numerosi tessuti (urochinasi e t-PA)
tagliano il plasminogeno circolante nel sangue e lo
trasformano in plasmina, che taglia la fibrina (fibrinolisi) e
dissolve il coagulo avviando così il processo di riparazione del
tessuto.
Plasma e siero
Quando bisogna effettuare un'analisi difficilmente si utilizza
come campione ematico sangue intero. Solitamente, a seconda
dell'analisi che bisogna effettuare (che sia un dosaggio o un
test) si ricava il plasma o il siero.
Appena si fa un prelievo ematico il sangue comincia a
coagulare. Se vogliamo ottenere il plasma in laboratorio
dobbiamo impedire la coagulazione aggiungendo un
anticoagulante, una molecola che impedisce la coagulazione,
e allontanando le cellule con centrifugazione per 15 min a
2000-3000 x g (gravità).
Come anticoagulante si può usare l'eparina (anticoagulante
naturale, presente in circolo) oppure l'EDTA
(etilendiamminotetraacetato) che è un agente chelante, cioè
lega a sé ioni metallici bivalenti. Se li lega a sé significa che li
sottrae alla soluzione, quindi sequestrando ioni Ca² rende⁺
inattivi molti fattori della coagulazione che sono proteasi
Ca² -dipendenti, che necessitano di Ca² legato al sito attivo.⁺
⁺ Anche il sodio citrato, il sodio ossalato e il sodio
fluoruro sono anticoagulanti. La scelta dell'anticoagulante è
sempre dipendente dal tipo di analisi che si intende effettuare
poiché alcuni anticoagulanti creano interferenze con alcuni
dosaggi.
Se dopo aver fatto il prelievo non si fa nulla, parte la Il PTT (tempo di tromboplastina parziale) consente di valutare
coagulazione. Il siero ha la stessa composizione del plasma a deficit della via intrinseca e della via comune della
meno dei fattori della coagulazione. Per ottenere il siero, a coagulazione. L'utilizzo più comune di questo parametro è il
monitoraggio della terapia anticoagulante con eparina che
coagulazione completata (circa 30 min a room temperature),
si centrifuga per 10 min a 1500 x g. La centrifugazione toglie
cellule e coagulo. Le cellule non ci sono né nel plasma né nel
siero. Il siero però deriva dal plasma in quanto ha perso anche
i fattori della coagulazione, che sono andati nel coagulo. Se il
plasma contiene acqua e soluti anche il siero contiene acqua e
soluti, ma tra questi mancano i fattori della coagulazione.
Per molti dosaggi di laboratorio plasma e siero possono essere
usati indifferentemente. Una glicemia (dosaggio della
concentrazione di glucosio nel sangue) si può dosare sia su
plasma che su siero. Il siero non può essere utilizzato per i test
di coagulazione che richiedono che tutti i fattori di
coagulazione siano preservati. Per dosare le proteine totali del
sangue si usa il plasma.
PT, PTT e VES
Non sono dosaggi, perché un dosaggio è il calcolo di
concentrazione di un analita, ma sono dei test di velocità per i
quali si misura il tempo, che danno indicazioni su eventi che
riguardano l'emostasi o lo stato di salute del sangue. Il PT e il
PTT si determinano quando si hanno dei problemi di
coagulazione, spesso dovuti a deficit genetici, perché i fattori
della coagulazione sono enzimi e un enzima è una proteina
codificata da DNA, ma anche quando si fanno dei check di
salute o quando si è sottoposti a dei farmaci anticoagulanti.
Persone che hanno tendenza a fare trombi devono prendere
farmaci anticoagulanti in un dosaggio specifico. Un eccesso di
medicinale potrebbe infatti causare emorragie.
Il PT (tempo di protrombina o tempo di Quick) è in particolare
un test che consente di valutare deficit della via estrinseca
della coagulazione e della via comune della coagulazione. Il
sangue viene raccolto in sodio citrato, che deve la sua attività
anticoagulante al fatto che lega ioni Ca² ,⁺ in rapporto 9:1 e
centrifugato per allontanare le cellule; al plasma viene
aggiunto un eccesso di Ca² per annullare⁺ l'effetto
anticoagulante del citrato e tromboplastina (fattore tissutale);
uno strumento misura otticamente il tempo necessario affinché
il campione coaguli. Con questo semplice protocollo si fa in
modo che la coagulazione inizi quando si inizia a fare la
misurazione. Il risultato dipende dal tipo di tromboplastina
utilizzata.
Per confrontare risultati di laboratori diversi, nel 1987 sono
stati introdotti gli indici ISI (International Sensitivity Index) e
INR (International Normalized Ratio). L'INR è il rapporto tra
il PT del paziente fratto il PT di riferimento, elevato alla
potenza del valore ISI specifico per il sistema analitico
utilizzato. Il valore normale di INR varia tra 0,8 e 1,2. Valori
più bassi o più alti sono indice di problemi: deficit nella via
estrinseca, endogeni (problema genetico) o esogeni,
conseguenti all'assunzione di un farmaco con un dosaggio non
corretto.
altera in modo sensibile il valore del PTT. I valori di proteine che interagiscono tra di loro. L'interazione è molto
riferimento sono stabiliti da ciascun laboratorio in dipendenza debole a pH acido. Per rompere il legame antigene-anticorpo
dai reagenti utilizzati (di solito 25-45 secondi). Il sangue viene in vitro basta operare a un pH di 4,5.
raccolto in sodio citrato e centrifugato per allontanare le Tuttavia non esiste soltanto un'immunità generata dagli
cellule; al plasma vengono aggiunti ioni Ca² e⁺ fosfolipidi. anticorpi. Il nostro sistema immunitario si suddivide nelle
Questo test è detto tempo di tromboplastina “parziale” per componenti naturale e acquisita. L'immunità naturale è
l'assenza della tromboplastina tra i reagenti. quella che non prevede la produzione di anticorpi e comprende
La VES (velocità di eritrosedimentazione) è determinata dalla le vie di attivazione del complemento alternativa e della
capacità dei globuli rossi di aggregarsi, formando pile di lectina, oltre che alle barriere meccaniche (la pelle, il muco, le
cellule per attrazione tra le superfici. In condizioni normali, lacrime, le ciglia), chimiche (pH gastrico, enzimi delle
questa capacità è relativamente bassa perché tra i globuli rossi secrezioni come il lisozima della saliva, che è capace di
esistono delle forze di repulsione che li tengono sospesi nel rompere i mucopolisaccaridi della parete batterica) e
plasma. biologiche (microrganismi saprofiti che stanno nel nostro
La VES è comunemente determinata con il metodo intestino) per difenderci dall'assalto dei patogeni. Fagocitosi,
Westergren entro 24 ore dal prelievo. Si pone il sangue lisi e reazione infiammatoria appartengono all'immunità
raccolto in sodio citrato per impedire la coagulazione (in naturale. La risposta immunitaria acquisita è caratterizzata
questo caso non si centrifuga) in una pipetta graduata di 20 cm dalla produzione di anticorpi da parte delle plasmacellule
mantenuta in posizione verticale, e si lasciano sedimentare i differenziate dai linfociti B, agglutinamento e neutralizzazione
globuli rossi; dopo un'ora si misura la sedimentazione. La degli antigeni da parte degli anticorpi, attivazione della via
sedimentazione non è un coagulo, perché il coagulo è stato classica del complemento, ma anche dall'acquisizione della
impedito. memoria immunitaria. Anche il sistema immunitario innato è
in grado di riconoscere strutture self da non-self, come ad
I valori di riferimento variano con il sesso e sono inferiori a 15
esempio la via della lectina distingue i patogeni che presentano
mm dopo un'ora. Aumenti della VES si verificano in caso di
il mannosio, in altri modi vengono riconosciuti gli acidi
alterazioni qualitative e quantitative dei globuli rossi e per
nucleici del patogeno, mentre le proteine dei procarioti
aumento delle proteine della fase acuta dell'infiammazione
vengono distinte per la presenza della formil-metionina all'N-
(l'aumento di fibrinogeno e globuline riduce le forze di
terminale.
repulsione che allontanano i globuli rossi l'uno dall'altro). Una
VES alta può essere quindi un indice di infiammazione. La
VES aumenta fisiologicamente con l'età e durante la Fagocitosi
gravidanza. Valori più bassi si rilevano in caso di affezioni Il patogeno viene internalizzato nel fagocita dopo il contatto
epatiche. con gli pseudopodi. I lisosomi contengono le idrolasi acide,
delle potentissime proteasi. Quando vescicole lisosomiali si
fondono con il fagosoma esse liberano il loro contenuto
Risposta immunitaria
enzimatico portando alla degradazione dell'agente patogeno.
Molecole che sono in grado di suscitare una risposta
I fagociti sono macrofagi e neutrofili. I macrofagi sono
immunitaria sono gli antigeni. Un antigene (ag) è una
presenti nei tessuti, mentre i neutrofili si trovano nel sangue e
macromolecola, le cui dimensioni devono essere superiori ai
penetrano solo nei tessuti infetti.
10 kDa, che possiede un buon grado di complessità chimica.
Un antigene può essere ad esempio una proteina o un
polisaccaride. La parte dell'antigene che è in grado di scatenare Infiammazione
la risposta immunitaria si chiama epitopo o determinante Dosaggi di alcune proteine del torrente circolatorio aiutano a
antigenico. Un antigene può avere anche più di un epitopo e fare diagnosi di un'infiammazione in corso. Le cosiddette
questi epitopi multipli possono essere anche diversi tra loro. proteine della fase acuta sono le proteine che si ritrovano
Una proteina è un antigene che ha sicuramente più di un abbondanti quando vi è un'infiammazione. Oltre a queste, altri
epitopo e nel caso di un antigene proteico esisterono epitopi mediatori sono le chinine e l'istamina. L'istamina è un residuo
sequenziali, riconosciuti da linfociti T e B, caratterizzati da di istidina decarbossilato ed è un vasodilatatore che viene
una sequenza specifica di amminoacidi. Un esempio è la prodotto anche quando si possiedono delle allergie. Siccome
sequenza Arg-Glu-Ser (arginina-glutammico-serina), che l'istamina è una molecola endogena coinvolta nel ritmo sonno-
rappresenta in molti casi un epitopo sequenziale. Per contro, veglia, assumere gli antistaminici non solo combatte le allergie
gli antigeni proteici possiedono anche epitopi ma può anche portare sonnolenza.
conformazionali, riconosciuti solo dai linfociti B. In questo
caso gli amminoacidi della sequenza dell'epitopo possono
Anticorpi
essere anche discontinui nella struttura primaria, ma sono
continui nella struttura terziaria. Esistono 5 classi di anticorpi. Le IgG dal punto di vista
strutturale sono una unità Y, costituita da due catene leggere
Gli antigeni vengono legati dagli anticorpi (ab). L'interazione
(L) e due catene pesanti (H). Le IgG essendo costituite da più
antigene-anticorpo (ag-ab) si basa su legami non covalenti
catene polipeptidiche sono proteine a struttura quaternaria.
(legami idrogeno, interazioni idrofobiche). Se l'antigene è una
Ogni catena leggera pesa 25 kDa ed ha una regione variabile
proteina, la coppia antigene-anticorpo è costituita da due
all'Nterminale e una regione costante al C-terminale. Ogni

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catena pesante pesa 50 kDa ed ha una regione variabile e tre
regioni costanti al C-terminale. Le 4 catene polipeptidiche
sono unite tra loro a costituire una struttura stabile da legami
idrogeno, forze di van der Waals, interazioni idrofobiche,
ponti salini, e anche legami covalenti, quali ponti disolfurici.
La stabilità delle immunoglobuline è molto importante per il
nostro stato di salute. Ponti disolfurici (-S-S-) sono legami
covalenti ottenuti dall'ossidazione del gruppo tiolico di due
residui amminoacidici di cisteina (-SH HS-) che possono
essere anche lontani tra loro nella struttura primaria della
proteina, ma che nell'avvolgimento tridimensionale si possono
trovare affiancati, ad una distanza giusta per poter dare una
reazione di ossidazione in alcuni distretti cellulari in cui vi è
un ambiente ossidante. Per rompere questi forti legami
occorrono agenti riducenti, quali il mercaptoetanolo.
Per capire quali sono le parti funzionali di
un'immunoglobulina è stata utilizzata la papaina, una proteasi
che taglia le IgG in dei punti specifici e ha come prodotti di
questa reazione enzimatica due frammenti fab (fragment
antigen binding), sui quali vi è il sito di legame dell'antigene,
e un fc (fragment crystal), che è un frammento che si può
cristallizzare. Un'IgG può legare due antigeni. Il sito di legame
dell'antigene si forma tra le porzioni variabili della catena
leggera e della catena pesante. L'fc è il frammento che viene
riconosciuto dalla proteina C1 della via classica del
complemento e dai recettori presenti sui leucociti. La regione
variabile è una regione caratterizzata da una sequenza di
amminoacidi variabile, mentre la regione costante presenta
una sequenza costante. Sulla base della sequenza variabile
esistono 5 tipi di catene pesanti: γ, α, μ, δ, ε da cui derivano le
5 principali classi funzionali di anticorpi (IgG, IgA, IgM, IgD,
IgE). Le catene leggere possono essere o entrambe di tipo κ, o
entrambe di tipo λ, e sono presenti in tutte le classi.
Le IgG sono l'80% degli anticorpi del siero, sono gli unici in
grado di attraversare la barriera placentare e le loro azioni
sono: reazioni di opsonizzazione, attività di neutralizzazione
di microbi e tossine, attivazione della via classica del
complemento.
Esistono due tipi di IgM: le IgM di membrana e le IgM
solubili. I linfociti B espongono sulla propria membrana delle
IgM costituite da un'unità Y particolare. Nelle IgM di
membrana c'è un quarto pezzetto costante, che si ottiene a
livello genico per splicing alternativo dal DNA che codifica
per l'anticorpo, e che contiene amminoacidi idrofobici che
permettono l'ancoraggio della proteina alla membrana. Queste
IgM si comportano come dei recettori. Per contro, le IgM
solubili sono anticorpi secreti dalle plasmacellule, linfociti B
che sono differenziati per la produzione di anticorpi. Le IgM
solubili non hanno regione trans-membrana, quindi non
subiscono lo splicing alternativo che caratterizza le IgM di
membrana. Esse sono pentameriche, cioè ci sono 5 unità Y
tenute insieme da ponti disolfurici e da una proteina J (joint).
Le IgM solubili sono le immunoglobuline più grandi che si
conoscano. Esse hanno una grande avidità (ogni pentamero
lega 10 antigeni) però poca specificità, per cui sono gli
anticorpi prodotti per primi in seguito al contatto con
l'antigene.
Le IgD sono immunoglobuline di membrana dei linfociti B e
sono costituite da un'unità Y. Anche queste svolgono un ruolo
recettoriale. Le IgD e le IgM di membrana, insieme ad un
elemento del complemento attivato, costituiscono un
complesso recettoriale che aspetta l'antigene.
Le IgE sono costituite da un'unità Y, sono presenti nelle
secrezioni respiratorie e sono quelle coinvolte nei processi di
resistenza ai parassiti e nelle allergie.
Le IgA (15% delle immunoglobuline nel siero) sono costituite
da 1 o 2 unità Y e sono abbondanti nelle secrezioni esterne. Le
IgG, le IgM e le IgD rappresentano il punto di partenza per la
nostra risposta immunitaria.
Attivazione del complemento
Un altro evento che insieme all'emostasi avviene nel torrente
circolatorio è l'attivazione del complemento. Il complemento
è stato scoperto nel 1919 ed è composto da 30 proteine di
membrana, una delle quali è uno zimogeno, che può diventare
proteasi attiva se da essa viene rimosso un pezzo.
Le vie di attivazione del complemento sono tre:
• quando c'è il riconoscimento antigene-anticorpo parte la via
classica;
• quando i patogeni contengono residui di mannosio parte la
via della lectina;
• i restanti patogeni possono attivare la via alternativa.
Tutte le vie convergono nell'idrolizzare un'importantissima
proteina plasmatica che si chiama C3. Gli obiettivi delle 3 vie
di attivazione del complemento sono dunque comuni:
fagocitosi e lisi del patogeno e stimolazione della reazione
infiammatoria. C'è un forte riconoscimento del self e del
nonself per non permettere al complemento di causare le lisi
delle nostre cellule.
Via classica
La proteina plasmatica C1 è formata da 6 catene
polipeptidiche disposte come i raggi di un ombrello (C1q) a
cui sono associati due zimogeni: C1r e C1s. Quando la parte
ad ombrello lega due porzioni fc o di un'IgM o di un'IgG, che
nel frattempo è legata all'antigene con la porzione fab, si
verifica un cambio conformazionale che attiva gli zimogeni
C1r e C1s rendendo la proteina C1 una proteasi attiva.
C1 attiva va a degradare due proteine plasmatiche che sono C4
e C2, liberando i frammenti C4b e C2a che si associano tra di
loro, formando la C3 convertasi della via classica (C4b2a),
anch'essa un'idrolasi. La C3 convertasi, pur restando legata
alla superficie del patogeno, taglia la proteina plasmatica C3.
I frammenti C3b opsonizzano il patogeno, ossia lo circondano,
preparandolo alla fagocitosi. I frammenti C3b sono
riconosciuti dai recettori presenti sui fagociti. Altri frammenti
C3b vanno ad associarsi alla stessa C3 convertasi, generando
la C5 convertasi che va a convertire la proteina C5.
Il frammento C5b così generato recluta le proteine del plasma
C6, C7, C8 e C9, creando il MAC (membrane attack
complex). Il MAC crea un buco sulla membrana del patogeno
che a questo punto lisa. La via classica presuppone che ci sia
un antigene legato alle regioni fab dell'anticorpo, per poi si dividono in altre cellule, e i linfociti B anche in cellule della
legare C1 con la porzione fc. memoria.
Ci sono antigeni T-indipendenti, che vengono solamente
Via della lectina riconosciuti dai linfociti B. Questi sono i lipopolisaccaridi
-
La lectina, detta anche MBP (proteina che lega il mannosio), della parete dei batteri Gram . Trattandosi di lipopolisaccaridi
è appunto una proteina del plasma che lega il mannosio ed è sono antigeni che, resistendo alla degradazione, stimolano il
molto simile alla proteina C1 della via classica. Il mannosio è nostro sistema immunitario per molto tempo perché restano
presente soltanto sulla superficie dei patogeni, non è presente per lungo tempo in circolo. Essi reagiscono direttamente con
nelle cellule eucariotiche. Dopo aver interagito con il il grande complesso cellulare che si trova sui linfociti B
mannosio la lectina cambia conformazione e diventa costituito dalle IgM di membrana, IgD e frammenti del
disponibile a legare delle serin-proteasi, dette MASP, complemento. I linfociti B attivati proliferano e attivano la
l'equivalente degli zimogeni C1r e C1s. Le MASP attivate produzione degli anticorpi IgM. Questo processo viene
vanno a tagliare C4 e C2, portando alla cascata di attivato da una cascata di segnali intracellulari che parte dalla
frammentazioni. Da qui la via prosegue con le stesse tappe superficie, dal riconoscimento dell'antigene col suo recettore.
della via classica. La cascata comprende numerose reazioni chimiche, tra cui
molte fosforilazioni, e culmina con la modificazione
dell'espressione genica di quella cellula, cambiando di fatto il
Via alternativa fenotipo cellulare. In questo modo quel linfocita B diventerà
La via alternativa è una via di attivazione del complemento capace di esprimere un'IgM. Questa risposta immunitaria sarà
attivata dalla superficie di alcuni patogeni. La proteina sempre uguale e non è una risposta molto evoluta. Ci vuole
plasmatica C3 lentamente si idrolizza spontaneamente, l'intervento del sistema dei linfociti T per avere un'immunità
generando il frammento C3b che aderisce a tutte le superfici, duratura e più specifica. Nella risposta secondaria, cioè
incluse quelle delle cellule dell'ospite. Tuttavia noi abbiamo quando il nostro corpo incontra l'antigene Tindipendente per
proteine che inibiscono la cascata di eventi che porterebbe alla una seconda volta, vi è lo stesso livello anticorpale di IgM.
lisi cellulare. Quando C3b aderisce alla superficie del Per difenderci dalle vere e proprie infezioni è necessaria una
patogeno parte la via di attivazione alternativa. Arriverà un risposta contro gli antigeni T-dipendenti. In questo caso la
fattore B, un altro fattore plasmatico D toglie un pezzo da B e risposta è attivata da proteine microbiche. Senza questo
si forma la C3 convertasi della via alternativa, una proteina pathway non ci sarebbe né la produzione specifica di anticorpi,
diversa da quella delle altre vie, ma che è sempre in grado di né la memoria immunitaria. I macrofagi inglobano la proteina
degradare C3. La C3 convertasi si lega a una proteina che si microbica (uptake), la frammentano (processing), associano i
chiama properdina, che la blocca in una configurazione frammenti al complesso maggiore di istocompatibilità di
inattiva finché non diventa indispensabile attivare la via classe II, che si organizza nel reticolo endoplasmico,
alternativa. Nell'infezione ci sono molti frammenti C3 in esponendoli sulla sua membrana. A questo punto linfociti T-
circolo, quindi c'è competizione dei vari frammenti per il helper aiutano a fare in modo che si producano anticorpi
legame alla properdina e se ne impedisce il legame. In questo specifici e che si formi la memoria secondaria. La molecola di
modo viene attivata la C3 convertasi, portando all'ottenimento riconoscimento esposta sulla membrana dei linfociti T-helper
della C5 convertasi della via alternativa, che degraderà C5 e si chiama CD4. I linfociti T-helper, possedendo CD4
C5b richiama C6, C7, C8 e C9 per creare il MAC. riconoscono i peptidi che il complesso maggiore di
istocompatibilità di classe II sta esponendo, secernono delle
Sistema immunitario citochine (interleuchine, interferone...) che attivano le cellule
Il sistema immunitario è costituito dagli organi linfatici e dai B, e mediante una serie di segnali intracellulari si arriva a
linfociti T e B. Gli organi linfatici primari sono il midollo modificare l'espressione genica di queste cellule. I linfociti B
osseo, in cui maturano i linfociti B, e il timo, in cui maturano si differenziano in plasmacellule, che iniziano a produrre
i linfociti T. Il timo si trova nella zona del mediastino. Sia i anticorpi specifici e muoiono dopo la loro funzione, ma anche
linfociti B che i linfociti T originano nel midollo osseo rosso. in cellule della memoria, che persistono anche dopo la
Organi linfatici secondari sono la milza, i linfonodi, le tonsille, scomparsa dell'infezione. Le cellule della memoria hanno
l'appendice, le placche di Peyer nell'intestino, che forniscono silenziato dei geni dell'apoptosi e in questo modo sono
la sede in cui linfociti incontrano l'antigene, perché è lì che diventate cellule della lunga vita. La risposta primaria contro
l'antigene viene trasportato. gli antigeni Tdipendenti porta alla produzione di IgM in gran
numero, poco specifiche, ma in attesa che l'organismo si
I linfociti natural killer non sono né linfociti B, né T, e sono
prepari a produrre dopo un paio di giorni le difese più
essenzialmente antivirali. I linfociti B e T che non hanno
specifiche delle IgG. In una seconda esposizione all'antigene
ancora incontrato l'antigene sono quiescenti nella fase G0 del
si innesca la risposta secondaria allo stimolo antigenico,
ciclo cellulare: sono piccoli, hanno un citoplasma scarso,
caratterizzata da una minore produzione di IgM e da
pochi mitocondri e organelli, cromatina condensata. Quando
un'elevatissima quantità di IgG, che vengono prodotte subito,
incontrano l'antigene si attivano entrando in una fase di
senza fase di latenza.
differenziamento, aumentano di volume e sviluppano gli altri
organuli cellulari. Possono differenziarsi in cellule B e T, che

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Riconoscimento cellulare
Le cellule nel nostro organismo interagiscono tra di loro. La
risposta immunitaria esiste perché diversi tipi cellulari
interagiscono e sono in grado di riconoscersi. Il
riconoscimento avviene tramite molecole che sono esposte
sulla superficie delle cellule. I fagociti riconoscono un certo
tipo cellulare e sono riconosciuti da un certo tipo cellulare e
non da un altro. I linfociti B che hanno inglobato e
frammentato un antigene T-dipendente e che l'hanno esposto,
tramite il complesso maggiore di istocompatibilità di classe II,
sulla propria superficie, è in virtù di questo che vengono
riconosciuti dai linfociti T, che a loro volta hanno i propri
recettori.
Le cellule attivano o non attivano la trascrizione di certi geni,
quindi esprimono o non esprimono certe proteine, tipo gli
anticorpi, in dipendenza di questo riconoscimento tra cellule e
in conseguenza di segnali intracellulari che prendono il via
proprio dal riconoscimento dei recettori che avviene sulla
superficie. Le interazioni intracellulari avvengono solitamente
con un meccanismo a cascata che bersaglia il DNA e porta alla
trascrizione o meno di geni che codificano per alcune proteine.
Radioattività
La radioattività è un fenomeno naturale. Essa è stata scoperta
alla fine dell'800 da Henri Becquerel e Pierre e Marie Curie,
che ottennero il Nobel per la fisica nel 1903. Questi studiosi
scoprono che alcuni minerali hanno la proprietà di
impressionare delle lastre fotografiche. Le lastre fotografiche
mostravano delle macchie scure, e questi minerali che erano
in grado di impressionare le lastre (uranio, radio e polonio)
vennero chiamati “attivi”, da cui “radioattivi”. Nel 1911 Curie
ottenne il Nobel per la chimica per gli studi sul radio.
Ogni atomo è formato da un nucleo, che contiene protoni e
neutroni, e dagli elettroni, che orbitano intorno al nucleo. Il
numero degli elettroni è equivalente a quello dei protoni. Il
numero degli elettroni è fisso ed è Z; esso è il numero che
caratterizza l'elemento, detto anche numero atomico. Il
numero di neutroni può essere variabile, per cui vi sono gli
isotopi. Molti isotopi sono stabili, ad esempio il deuterio è
l'isotopo stabile dell'idrogeno. L'isotopo instabile, che si
chiama trizio, è radioattivo. La radioattività è il fenomeno per
cui isotopi instabili (radioisotopi) si trasformano in isotopi di
energia inferiore e maggiore stabilità, emettendo radiazioni o
particelle ionizzanti che possono essere per noi invasive.
Un parametro molto utilizzato per descrivere il decadimento
radioattivo è il tempo di dimezzamento. Il grafico
esponenziale negativo mostra dopo quanto tempo saranno
decaduti un numero di atomi pari alla metà del totale, ossia
l'emivita.
La radioattività è tipica della Terra. L'uomo è esposto alla
radioattività fin dal momento della sua apparizione sulla Terra.
Quella conosciuta come radioattività naturale è dovuta
soprattutto al 222Rn, prodotto dal decadimento dell'238U, che si
trova nelle rocce. A questo tipo di radioattività è possibile far Assorbimento della luce
fronte, dal momento che il Radon evapora diffondendosi La radiazione elettromagnetica consiste in pacchetti di
nell'aria. Accanto al 222Rn, protagonista della radioattività energia, detti quanti.
naturale è anche il 40K, dal tempo di decadimento di 1,3
E = hν
miliardi di anni. Oltre ai radioisotopi naturali, oggi esistono
anche radioisotopi artificiali. Esempi sono il 60Co, utilizzato
nella radioterapia, e il 239Pu, utilizzato come combustibile nelle
centrali nucleari.
Il tipo di radiazione, quindi il modo con il quale il radioisotopo
torna ad uno stato energetico inferiore, varia da elemento a
elemento. Esistono 3 principali tipi di decadimento, ognuno
con proprietà e pericolosità diverse: decadimento α,
decadimento β e decadimento γ. Il decadimento α è quello nel
quale il nucleo emette due protoni e due neutroni (nucleo di
elio), trasformandosi in un nucleo diverso con numero atomico
Z - 2 e un numero di massa A - 4. Esempio è l'238U in Torio
234. Queste sono radiazioni poco penetranti, come quelle del
Radon, e possono essere bloccate da un semplice foglio di
carta.
Nel decadimento β il nucleo emette un elettrone e si trasforma
in un nucleo con numero atomico Z – 1 e stesso numero di
massa. Queste sono radiazioni più penetranti di quelle α ma
ancora, possono essere completamente bloccate da piccoli
spessori di materiali metallici.
Per il decadimento γ non si parla più di radiazioni, ma di
particelle. Al contrario delle radiazioni α e β, quelle γ sono
molto penetranti. Per bloccarle occorrono materiali ad alta
densità come il piombo.
La radioattività si misura in Becquerel (bq). 1 bq corrisponde
ad una disintegrazione al secondo. Per misurare gli effetti
biologici alla dose di radiazione alla quale siamo esposti è
stato introdotto il Sievert (Sv, sottomultiplo mSv). Noi
assorbiamo per effetto della radioattività naturale ogni anno
2,4 mSv. Per legge il limite massimo di dose per ogni persona
è di 1 mSv all'anno al di sopra di questa dose. Una
mammografia è già di 1 mSv, quindi non se ne può fare più di
una all'anno.
L'aspetto deleterio delle radiazioni, causato soprattutto dalle
radiazioni γ, è la produzione dei radicali liberi che vanno ad
alterare gli acidi nucleici e molte altre biomolecole, causando
danni. Il momento in cui le nostre cellule sono più vulnerabili
è quello della duplicazione, in cui il DNA si sta replicando. Le
popolazioni cellulari che si riproducono più rapidamente sono
infatti più vulnerabili rispetto a quelle che si riproducono
lentamente. In virtù di questo gli organi più sensibili alle
radiazioni sono il midollo osseo emopoietico e il sistema
linfatico. A livello dell'intero organismo, sia nell'uomo che
negli animali superiori, si può notare l'invecchiamento precoce
dell'organismo correlato alla dose totale delle radiazioni,
assorbita sia con una forte dose istantanea, sia con
l'esposizione a bassi livelli di radioattività prolungata.
La radioattività si può misurare sfruttando l'interazione della
radiazione con un rivelatore. Si sono messe a punto tecniche
molto diverse di rivelazione, come il contatore Geiger-Muller,
che sfrutta la ionizzazione di un gas, la scintillazione, la
termoluminescenza, ecc.
L'energia si misura in caloria o Joule (1 cal = 4,17 Joule). h è
la costante di Planck e ν è la frequenza, che si misura in hertz.
Al posto di ν si potrebbe anche scrivere velocità della luce
fratto la lunghezza d'onda. La velocità della luce nel vuoto è 3
x 108 m/s. La lunghezza d'onda (λ) è la distanza tra due
massimi consecutivi. Essendo una lunghezza ha le misure di
una lunghezza (m, mm e nm). Energia e frequenza sono
direttamente proporzionali e sono entrambe inversamente
proporzionali alla lunghezza d'onda, che nella definizione di
frequenza si trova al denominatore. Una grande lunghezza
d'onda equivale a poca energia.
Lo spettro di radiazioni va dai raggi γ (frequenza alta) alle
radiazioni radio (frequenza bassa). Per lo mezzo ci sono i raggi
X, la zona UV, il visibile, l'infrarosso e le microonde.
Le molecole che sono in grado di assorbire la luce nel visibile
e nell'UV sono quelle di interesse biochimico e diagnostico. I
cromofori sono quelle molecole che riescono ad assorbire la
luce, passando da stati ad energia minore a stati di energia
maggiore. Tra tutte le biomolecole, sono cromofori quelle
molecole che contengono legami con elettroni di tipo π. Questi
elettroni di legame sono presenti nei legami doppi e tripli degli
anelli aromatici (proteine, DNA, ecc.). Gli orbitali di legame
di tipo π sono costituiti da coppie di elettroni che hanno la loro
maggiore densità al di fuori dell'asse di unione dei nuclei,
quindi sono meno legati e più facilmente eccitabili, rispetto
agli elettroni dei legami sigma presenti nei legami semplici.
Gli elettroni π possono raggiungere un livello energetico
superiore quando ricevono un ΔE tale che si riesca a passare
dallo stato di energia fondamentale a quello eccitato.
Le molecole sfruttate in biochimica nelle analisi qualitative
(indagini sulla natura della molecola ricercata) e nelle analisi
quantitative (indagini sulla concentrazione della molecola
ricercata) assorbono luce nell'UV (100-400 nm) e nel visibile
(400-800 nm). Per quanto riguarda l'ultravioletto, tra i 100 e i
400 nm si distinguono tre zone: gli UV-A, gli UV-B e gli
UVC. Il sole emette radiazioni in tutte le regioni, soprattutto
gli UV-A.
Un cromoforo è una molecola che assorbe una parte della
radiazione. Quando la luce bianca passa attraverso un
cromoforo, una parte di questa miscela di lunghezze d'onda
sarà assorbita, la luce non assorbita assumerà il colore
complementare. Una molecola che assorbe la luce dai 420 e i
430 nm (blu) la vediamo gialla perché il nostro occhio vede
solo quello che il cromoforo non assorbe.
Spettrofotometro
Lo spettrofotometro è lo strumento che consente la misura
dell'assorbimento di cromofori in soluzione.
Uno spettrofotometro è costituito da:
• una sorgente di luce, che potrà essere di luce visibile o luce
UV, costituita da una lampada o una lampada a idrogeno;
• un monocromatore, che consente di ottenere un fascio di
luce composto da una sola lunghezza d'onda partendo da una
sorgente che ha una radiazione policromatica;
• una cella, che contiene il campione da esaminare. Se I0 è
l'intensità della luce incidente e It all'uscita della cella è la
luce trasmessa, It sarà minore di I0 se all'interno della cella vi
è un cromoforo. Se nella cella non vi è un cromoforo It = I0.
Nella maggior parte degli spettrofotometri la cella che
contiene il campione è una cuvetta, una provetta quadrata.
Le cuvette possono essere di vetro o plastica per la lettura
nel visibile o in quarzo per la lettura negli UV. Il cammino
ottico è la distanza tra il raggio incidente e il raggio uscente
(di solito è 1 cm). Una cuvetta ha due facce opposte che non
possono essere attraversate dalla luce, quindi la cuvetta deve
essere posizionata nello spettrofotometro in modo tale che
non vi siano impedimenti all'intensità della luce incidente ad
attraversare il campione.
• un rilevatore, che è un sistema di elaborazione.
Analisi qualitative
Si parla di analisi qualitativa di cromofori quando si analizza
lo spettro di assorbimento per identificare i cromofori presenti
nel campione. Al variare della lunghezza d'onda in nanometri
si misura l'assorbimento del cromoforo. Gli spettrofotometri
moderni hanno un programma con il quale fanno variare la
lunghezza d'onda in un range.
Le proteine e i peptidi assorbono luce nell'ultravioletto per il
contributo del legame peptidico, per questo hanno un grande
picco di assorbimento intorno a 200 nm, e per il contributo
nella zona tra i 270 e i 280 nm dato dagli amminoacidi
aromatici (triptofano, tirosina e fenilalanina). Alcune proteine
sono in grado di assorbire anche nel visibile in virtù della
presenza di gruppi non proteici. L'emoglobina è una proteina:
come tale mostra un picco a 200 per il legame peptidico e tra
i 270 e i 280 per gli amminoacidi aromatici; in più essa, come
anche altre emoproteine, presenta un picco nella regione del
visibile tra i 420 e i 540 nm per la presenza del gruppo eme,
che è quello che conferisce all'emoglobina il colore rosso. Le
proteine che contengono legati covalentemente i gruppi
prostetici FAD (flavina adenin dinucleotide) e FMN (flavina
mononucleotide) sono in grado di assorbire sia a 200 e nella
zona degli aromatici, ma anche a 420, per cui noi le vediamo
gialle.
Anche gli acidi nucleici sono cromofori grazie alla presenza
delle basi azotate, nelle quali vi sono gli anelli aromatici. Gli
acidi nucleici presentano un massimo di assorbimento intorno
a 260 nm. L'assorbimento è maggiore per il single-strand di
DNA perché le basi sono maggiormente capaci di ruotare e
assorbire luce, mentre nelle doppie eliche le basi si trovano
all'interno della doppia elica.
Cromofori naturali sono non solo proteine e acidi nucleici, ma
anche molecole di altra natura come le clorofille e i
carotenoidi, che hanno elettroni di legame π tali che possono
essere cromofori.
Analisi quantitative
Nell'analisi quantitativa il cromoforo da saggiare è noto, ciò
che si vuole conoscere è la sua quantità. Per questo serve la
legge di Lambert-Beer: A = ε C l
laddove C è la concentrazione del cromoforo in molarità, l è il
cammino ottico (1 cm) ed ε, che è il coefficiente di estinzione
molare, costante caratteristica di ogni cromoforo. Il
coefficiente di estinzione coincide con l'assorbimento se C = 1
M e l = 1.
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La legge di Lambert-Beer è l'equazione di una retta che passa
per l'origine degli assi, la cui pendenza è ε x l. La
concentrazione è X e A è Y. In un certo intervallo esisterà
dunque una proporzionalità diretta tra la concentrazione di un
cromoforo e il suo assorbimento, cioè se in soluzione si ha una
quantità 1 di quel cromoforo e si ha assorbimento 1, mettendo
una quantità 2 si osserverà assorbimento 2 e così via. La legge
di Lambert-Beer ci consente di calcolare la concentrazione di
un cromoforo puro in soluzione di cui si conosce il coefficiente
di estinzione.
Se il cromoforo è una proteina pura in soluzione, basta mettere
un po' di questa soluzione in una cuvetta e settare lo
spettrofotometro alla lunghezza d'onda corrispondente al
picco di assorbimento di questa proteina, ossia 280 nm, per
ottenere l'assorbimento che si esprime in densità ottiche (OD).
A/ε = C.
Cromatografia
Ci sono alcuni dosaggi, come il dosaggio della glicemia, che
non presuppongono nessuna separazione delle biomolecole.
Ci sono altri dosaggi invece che richiedono che le biomolecole
debbano essere separate per poter essere quantificate.
Le cromatografie sono tecniche che permettono di separare le
biomolecole. Esistono vari tipi di sistemi cromatografici, ma
in generale una cromatografia presuppone che un campione
venga fatto passare su una fase stazionaria per mezzo diffuso
di una fase mobile o eluente.
Le proteine, che hanno proprietà diverse e tendenza diversa a
stare in una fase piuttosto che in un'altra, si ripartiranno in
maniera diversa tra le due fasi. Se la cromatografia viene fatta
su colonna, la fase stazionaria è una resina contenuta in un
tubo di vetro. Di solito l'eluente è una soluzione tampone. Una
pompa peristaltica mette il tampone sulla resina con flusso
costante. La resina separerà le biomolecole e a seconda di ciò
che contiene darà il nome alla cromatografia. All'uscita della
colonnina di vetro vengono raccolte delle frazioni di campione
eluito.
Esistono tre principali tipi di cromatografie: gel filtrazione,
scambio ionico e per affinità. Il tipo di cromatografia dipende
dal tipo di resina utilizzata nel tubo di vetro.
La cromatografia per gel filtrazione, detta anche gel
filtration o esclusione molecolare, è in grado di separare le
molecole sfruttando le differenze di dimensioni molecolari. La
resina contenuta nella colonna di vetro è costituita da dei
granuli di gel che hanno dei pori di dimensione controllata. Le
molecole che non potranno entrare nei pori del gel non
possono utilizzare il volume interno, ma utilizzeranno solo il
volume V0, il cosiddetto volume morto e ovviamente
usciranno per prime dalla colonna perché faranno meno strada.
Le molecole abbastanza piccole da poter utilizzare anche i
volume dei pori usciranno per ultime. Tra questi due casi vi
sono molecole intermedie che possono anche parzialmente
utilizzare i volumi interni. Con questa logica il volume di
tampone che è necessario per eluire molecole di campione
(volume di eluizione Ve) è regolato da questa formula:
Ve = V0 + Kd x Vi
Una molecola molto grande che non riesce ad utilizzare Vi avrà
Kd uguale a 0, per cui Ve sarà uguale a V0. Questo è il caso
delle molecole così grandi da essere eluite con il volume vuoto
e che fuoriescono per prime dalla colonna. Per contro le
molecole talmente piccole che avranno Kd = 1 avranno volume
di eluizione pari a V0 + Vi, che non è altro che il volume totale.
Tra questi due estremi ci sono molecole che hanno 0 < Kd < 1
con volume di eluizione compreso tra V0 e V0 + Vi.
All'uscita della colonna si raccolgono successivamente
aliquote di volume, che permettono di frazionare l'eluizione.
Di ogni provetta si va a leggere l'assorbimento. Se si stanno
separando con questa cromatografia molecole proteiche
bisogna leggere l'assorbimento a 280 nm di ogni frazione.
Dalla cromatografia si ottiene un cromatogramma, ossia un
grafico sulle cui ascisse vi sono le frazioni che fuoriescono da
una colonna e sulle cui ordinate vi è l'assorbanza a 280 nm
nelle eluizioni di proteine. Il grafico mostrerà tre picchi: il
primo picco contiene tutte le molecole che hanno dimensioni
talmente grandi da non entrare nelle maglie del gel. Il loro
volume di eluizione coincide con V0. Il Ve non è altro che il
massimo del picco. Per contro l'ultimo picco contiene tutte le
molecole che hanno un volume di eluizione uguale al volume
totale perché sono molecole talmente piccole da utilizzare il
V0 e anche il Vi. Il picco al centro corrisponde alle molecole
intermedie.
La cromatografia a scambio ionico non discrimina le
proteine in base alle dimensioni. In questa cromatografia si
osserva se la proteina ha una carica tale che le consenta
l'interazione con la resina.
Questa cromatografia si basa sull'interazione tra un gruppo
funzionale della resina e la molecola di carica opposta del
campione. Esisteranno resine che hanno cariche fisse negative
e legano quindi cationi e resine con cariche fisse positive che
legano gli anioni.
La proteina che si vuole separare deve avere una carica netta.
Per attribuire una carica netta ad una molecola proteica
bisogna variare il pH del tampone. Le proteine sono
caratterizzate da un punto isoelettrico, ossia il valore del pH al
quale le molecole hanno una carica netta 0 (il numero delle
cariche positive eguaglia quello delle cariche negative). pH =
PI → carica 0
Mettendo la proteina in un tampone che abbia un pH superiore
al punto equivalente, la proteina acquisterà una carica netta
negativa, viceversa mettendo la proteina in un tampone che ha
pH inferiore al punto isoelettrico la proteina acquisterà carica
positiva.
pH < PI → carica + → resina con carica – (scambio cationico)
pH > PI → carica - → resina con carica + (scambio anionico)
Nella cromatografia a scambio ionico l'operatore deve
scegliere opportunamente la resina, scegliere il pH di lavoro
per ottenere la carica netta sulla proteina, e solo a questo punto
si può caricare il campione.
Nella nostra miscela di proteine si hanno proteine cariche
positivamente a pH di lavoro e proteine cariche negativamente
perché alcune proteine hanno punto isoelettrico maggiore del
pH di lavoro e altre minore. Inoltre se il pH di lavoro
corrisponde al punto isoelettrico di alcune proteine esse
avranno carica 0. Se la matrice è carica positivamente essa
tratterrà solo le proteine cariche negativamente, mentre quelle
cariche positivamente passano senza legarsi già alla prima
separazione. Queste molecole non legate alla resina possono
essere lavate via facilmente e quindi finiscono nelle prime
frazioni di campione eluito.
Per separare le proteine cariche negativamente dalla matrice
una volta che esse si sono legate bisogna effettuare uno
scambio anionico. Facendo eluire sulla colonna un sale come
l'NaCl che si dissocia completamente, l'eccesso
stechiometrico di Cl- si scambierà con la proteina per il legame
alla carica positiva della matrice ed ecco che dunque le
proteine cariche negativamente saranno eluite e si potranno
raccogliere in una provetta.
In un cromatogramma di uno scambiatore di anioni i picchi
non corrispondono alle dimensioni. Il primo picco contiene le
proteine che non hanno interagito con la resina ossia che
avevano o la stessa carica della resina o carica 0. Dopo
l'eluizione delle proteine che non hanno interagito si aumenta
la forza ionica aggiungendo dell'NaCl e si ottiene l'eluizione
anche delle proteine che si erano legate alla matrice. Al meglio
l'eluizione delle proteine legate si può ottenere utilizzando un
gradiente di forza ionica, cioè facendo variare in maniera
graduale la forza ionica da 0 a
1 M NaCl per poter ottenere una separazione fine delle
proteine. Eluiranno per prime quelle proteine che si sono
legate più debolmente alla matrice. Per ultime saranno eluite
le proteine che hanno interagito in maniera molto più forte con
la resina. Le proteine che interagiscono in maniera più forte
hanno forte carica negativa. Se ad esempio il loro punto
isoelettrico è 5 e si lavora a pH 8, quelle proteine assumono
un'alta carica netta negativa quindi per eluirle serve un'alta
concentrazione di sale.
Il formatore di gradiente di forza ionica è un sistema di vasi
comunicanti costituito da un agitatore magnetico e due
cilindretti. Nel cilindretto più vicino alla colonna vi è
un'ancoretta magnetica e il campione di lavoro. Nell'altro
cilindretto, collegato al primo da un rubinetto, c'è il campione
più il sale che contiene la concentrazione finale da
raggiungere. Aprendo il rubinetto i due cilindretti comunicano
e se si apre anche la comunicazione alla colonna e si avvia
l'ancoretta magnetica, che gira perché è collegata all'agitatore,
in colonna si raggiungeranno tutti i valori di forza ionica da 0
a 1 M, in maniera graduale, a gradiente.
La cromatografia per affinità sfrutta l'affinità tra la
molecola che si vuole separare e un'altra molecola legata
covalentemente alla resina. In questo caso non contano né le
dimensioni, né la carica. Nell'esempio di una proteina si può
sfruttare l'affinità per un ligando legato covalentemente alla
resina. Nella maggior parte dei casi c'è un braccio spaziatore
che si interpone fra la resina e il ligando per favorire
l'interazione. L'operatore deve scegliere la resina con il
ligando giusto.
Se si vogliono separare degli enzimi un ligando adatto è un
quasi-substrato, una molecola simile al substrato per il quale
l'enzima ha un'affinità. Caricato il campione, tutte le molecole
che non hanno affinità per il ligando si troveranno nelle prime
provette di eluizione. In seguito si eluiranno le proteine che
hanno interagito. Esse possono essere eluite o aumentando la
forza ionica, perché l'interazione tra la proteina da separare e
il ligando è di tipo elettrostatico, o in maniera molto più fine
si può eluire la molecola che si è legata aggiungendo una
molecola che spiazza questo legame, cioè una molecola che ha
affinità maggiore per il ligando.
Come ligando di proteine possono essere utilizzati gli
anticorpi. L'anticorpo legato alla resina è specifico per la
proteina che ha l'antigene. Questo metodo è costoso perché
bisogna creare l'anticorpo per la proteina e farlo legare alla
matrice ma è molto specifico e preciso. Gli anticorpi utilizzati
sono le IgG, che legano le proteine con i due siti antigenici.
Questo si esegue a pH 7. Con il lavaggio si elimina dalla
colonna tutto ciò che non si è legato. A questo punto si può
eluire la proteina legata all'anticorpo semplicemente
abbassando il pH a 3.
Centrifugazione
Gli RNA ribosomiali sono classificati in base alle unità
Svedberg. L'unità Svedberg si riferisce al tempo di
sedimentazione di questi RNA.
La centrifugazione si basa sulla forza di sedimentazione,
generalmente un multiplo della forza di gravità. Con questa
tecnica è possibile separare anche organelli e frazioni cellulari.
Nella centrifugazione differenziale varia la forza di
sedimentazione e il tempo per il quale agisce questo multiplo
della forza di gravità. In un omogenato di cellule eucariotiche
sono contenuti tutti gli organelli cellulari e il citoplasma.
Operando opportunamente si possono separare tutte queste
frazioni (frazione nucleare, frazione mitocondriale, frazione
microsomiale) semplicemente applicando delle
centrifugazioni differenziali. Un omogenato centrifugato a
500 x g per 10 minuti farà precipitare i nuclei. Nel
sovranatante ci sarà tutto il resto. Dopo aver separato la
frazione precipitata, aumentando il tempo e aumentando la
forza di sedimentazione si può ottenere un secondo
precipitato, che questa volta conterrà la frazione
mitocondriale. Ancora aumentando la forza di sedimentazione
e il tempo si può ottenere un terzo precipitato, costituito dalla
frazione microsomiale, mentre il sovranatante sarà costituito
dal citosol, contenente tutte le sue proteine.
Elettroforesi
L'elettroforesi separa le molecole dotate di una carica in base
alla loro mobilità in un campo elettrico. L'elettroforesi è stata
applicata per la prima volta da Tiselius, premio Nobel per la
chimica nel 1948.
La mobilità elettroforetica di una molecola carica è
influenzata: dalla sue dimensioni, dalla sua forma, dal
supporto utilizzato e dal campo elettrico applicato.
Molecole cariche sono acidi nucleici (carichi negativamente
per la presenza del gruppo fosfato) e le proteine, la cui carica
varia in base al pH e al punto isoelettrico.
L'elettroforesi si può effettuare su vari supporti. L'elettroforesi
su carta si utilizza solitamente per proteine ed è non
denaturante. L'elettroforesi su gel di agarosio può essere
applicata per separare sia DNA che proteine. L'elettroforesi su
11
gel di acrilammide può essere applicata sia per DNA che per detergente in grado di unfoldare la struttura della molecola
proteine e in questo caso può essere sia denaturante che non proteica ma non è in grado di rompere i legami covalenti della
denaturante. struttura terziaria. Per rompere questi legami (ponti
Un'elettroforesi, che sia su carta, su gel di agarosio o su disolfurici) si usa mercaptoetanolo, un agente riducente, e alta
poliacrilammide, prevede sempre una rilevazione dopo la temperatura. Alla fine tutte le molecole proteiche avranno
corsa. Generalmente sul tracciato di un'elettroforesi si possono forma bastoncellare e carica netta negativa e migreranno solo
visualizzare delle bande. Se abbiamo sottoposto delle proteine in base alle dimensioni verso il polo positivo. Questa tecnica
ad elettroforesi, per visualizzare le bande si possono usare viene utilizzata per determinare il peso molecolare delle
coloranti come il Rosso Ponceau o il Blu di Coomassie. Dopo molecole proteiche. Vi è una relazione inversa tra mobilità e
la separazione di enzimi è possibile effettuare una zimografia, peso molecolare, per cui costruendo opportunamente una retta
ossia visualizzare specificamente l'enzima sottoposto ad di taratura con molecole a peso molecolare noto c'è la
elettroforesi sempre che quell'elettroforesi sia non possibilità di ricavare il peso molecolare incognito di una
denaturante. Se l'elettroforesi fosse stata denaturante l'enzima molecola proteica.
ha perso la funzione. Dopo la separazione elettroforetica di Se il gel di poliacrilammide è preparato in assenza di SDS,
DNA, si può utilizzare il bromuro di etidio, una molecola che mercaptoetanolo e alta temperatura, si effettua
si intercala tra le basi del doppio filamento e che, irradiata con un'elettroforesi nativa, in cui le molecole si spostano in base
raggi UV, fluoresce nell'arancione. alle dimensioni, alla carica e alla forma. Questo gel rispetta la
Alcuni cromofori, cioè molecole che assorbono la luce, struttura nativa delle molecole proteiche e può essere sfruttato
possono anche essere fluorofori. Generalmente, il per separare enzimi da visualizzare mediante zimografia.
decadimento al livello inferiore di energia dopo aver assorbito
la luce per un cromoforo è molto rapido (10-15 sec). Nei
fluorofori, per quella che è l'organizzazione dei legami della
molecola, l'energia passerà ad atomi vicini impiegando un
tempo maggiore (10-8 sec). In questo tempo la molecola emette
luce a una lunghezza d'onda maggiore (associata ad energia
minore) che può essere percepita dai nostri occhi.
Il bromuro di etidio dev'essere illuminato a 300 nm (UV) e
fluoresce a 500 nm (lunghezza d'onda maggiore) che
appartiene al range del visibile, in particolare all'arancione.
L'agarosio è un polisaccaride che deriva dall'agar agar delle
alghe rosse. È solubile nell'acqua bollente, se raffreddato
forma legami idrogeno costituendo un gel. Di solito si lavora
dall'1 al 6% di agarosio. In queste condizioni si può separare
DNA dalle 50 alle 20.000 coppie di basi.
Il gel di poliacrilammide si può utilizzare per separare il DNA
fino a 800 pb, ma è molto utilizzato soprattutto per separare le
proteine. Il gel di poliacrilammide si forma partendo da due
monomeri: il monomero funzionale dell'acrilammide e il
monomero bifunzionale della N-metilen-bisacrilammide in
presenza di un catalizzatore che innesca la reazione di
polimerizzazione. L'ossigeno compete nella reazione per cui i
reagenti vengono mescolati in una beutina nella quale si
applica il vuoto con una pompa a bassa temperatura perché si
deve evitare che la polimerizzazione avvenga prima che il gel
sia messo sul supporto. Il supporto è costituito da due lastrine
di vetro. Se tra le due lastrine viene infilato un pettine, laddove
vi sono i denti del pettine si creano dei buchi in cui non avviene
polimerizzazione, quindi si ottengono i pozzetti per caricare i
campioni. Il gel di poliacrilammide può essere preparato in
condizioni denaturanti o in condizioni non denaturanti.
L'SDS-page (sodium dodecyl-sulphate poly-acrylamide gel
electrophoresis) è un'elettroforesi su poliacrilammide in
presenza di SDS, un denaturante. In questo caso contano
soltanto le dimensioni delle proteine perché la carica netta
della proteina è mascherata dall'SDS, che le conferirà una
carica netta negativa. L'SDS è costituito da sodio (testa
polare), da una catena di 12 atomi di carbonio e da un solfato
avente carica negativa nella testa polare. L'SDS è un
Dosaggi
L'obiettivo delle analisi è quello di dosare alcuni analiti
all'interno di un campione. L'analita è una biomolecola di
interesse diagnostico. I campioni possono essere sangue
intero, plasma, siero o urine. Questo dosaggio deve avere
un'utilità diagnostica e prognostica.
L'obiettivo di ogni laboratorio è quello di scegliere un metodo
adatto al dosaggio. Un metodo adatto è un metodo che dia un
risultato attendibile del dosaggio desiderato. Un metodo
adatto, quale che sia il dosaggio, deve possedere sensibilità e
specificità.
La specificità è la capacità di un metodo di dosare quell'analita
senza interferenze da parte di analiti simili o sostanze esogene.
L'anticoagulante utilizzato per ottenere il plasma potrebbe
dare interferenza, per cui è opportuno sceglierne uno che
permetta una specificità del metodo.
La sensibilità è la capacità di dosare l'analita anche se presente
in quantità esigue. Gli ormoni sono molecole segnale che sono
in grado di modificare anche profondamente il fenotipo di
certe cellule, permettendo o meno la trascrizione di
determinati geni. Per questo motivo essi sono presenti nei
nostri liquidi interni in quantità molto piccole, per cui per
essere dosati richiedono una certa sensibilità del metodo.
Calcolo delle proteine totali
Il calcolo delle proteine consiste nel dosaggio di tutte le
proteine che vi sono in un campione di plasma o urine.
Il plasma contiene moltissime proteine. Le proteine
rappresentano il gruppo più importante di biomolecole dal
punto di vista qualitativo e quantitativo (10 kg in un uomo di
70 kg). Le proteine differiscono per funzioni (proteine di
trasporto, enzimi, proteine strutturali, ormoni proteici, fattori
della coagulazione, anticorpi), per dimensioni molecolari
(piccole, come l'insulina, o gigantesche, come alcuni
anticorpi) e per composizione chimica (proteine semplici o
coniugate). Alcune proteine che ritroviamo nei campioni di
analisi sono costituite solo da amminoacidi, come l'albumina
o la prealbumina. Per contro ci saranno anche proteine
coniugate che accanto agli amminoacidi presentano anche una
parte glucidica o lipidica.
La concentrazione totale delle proteine in un campione di
plasma è la proteinemia. Fisiologicamente il valore deve
essere compreso tra i 6 e gli 8,4 g/100 mL di plasma. Una
proteinemia inferiore ai 6 g/100 mL può essere indice di un
eccessivo metabolismo proteico, uno squilibrio alimentare o
un danno epatico. Una proteinemia superiore agli 8,4 g/dL è
più difficile da osservare, talvolta capita per la produzione di
forti quantità di immunoglobuline anomale a causa di malattie
neoplastiche.
La proteinemia si determina utilizzando un reattivo. Il plasma
è una soluzione eterogenea di proteine, quindi non vi è
possibilità di distinguere le proteine se non con l'utilizzo di un
reattivo che reagisce con le molecole proteiche sviluppando
un colore, la cui intensità, in un certo intervallo, è
proporzionale alla concentrazione proteica stessa. Come
reattivo si utilizza il reattivo di Biureto, che a pH alcalino
reagisce con le proteine dando un colore violetto alla
soluzione. La lettura spettrofotometrica si effettua nel visibile
a 540 nm. La colorazione si ottiene perché gli ioni rameici
presenti nel reattivo legano due o più gruppi -CONH2- presenti
nelle molecole proteiche.
Questo esperimento si effettua costruendo una retta di taratura
o calibrazione. La costruzione della retta di taratura si effettua
prima della determinazione vera e propria. Bisogna allestire 4
provette, ognuna delle quali contiene una quantità nota e
crescente di una proteina nota. Come standard si usa la BSA
(albumina di siero bovino). Nella provetta 1 si mette 1 g, nella
2 si mettono 2 g e così via. In tutte le provette si mette la stessa
quantità di reattivo, si agita, si aspetta un po' di tempo,
lasciando sviluppare il colore. Il colore aumenta di intensità
man mano che aumenta la concentrazione proteica. In seguito
si mette il contenuto di ogni provetta in una cuvetta e si legge
a 540 nm. Maggiore è la concentrazione di BSA nella
provetta, maggiore sarà l'assorbanza a 540 nm. Ottenute le
assorbanze delle varie provette si può costruire la retta di
taratura, un grafico in cui l'assorbanza è in funzione della
concentrazione in grammi della BSA. I 4 punti ottenuti dalle
4 misurazioni spettrofotometriche vengono interpolati da una
retta che passa per l'origine degli assi. Per costruire una retta
di taratura si utilizzano almeno 3 punti.
Sottoponendo una 5 provetta contenente plasma allo stesso
trattamento (reagente e lettura spettrofotometrica) si ottiene
un valore di assorbanza da cui si può estrapolare attraverso la
retta di taratura la concentrazione, che è l'intercetta sulle x.
Non c'è altro modo di determinare una proteinemia tenendo
conto del fatto che il plasma è una soluzione eterogenea di
proteine per le quali varia l'assorbanza specifica. Questo
stesso metodo si può applicare per calcolare la proteinuria,
ossia la concentrazione proteica totale in un campione di
urine. La concentrazione proteica totale in campione di urine
è molto bassa perché le proteine per le loro dimensioni non
passano nel filtro glomerulare. La proteinuria fisiologica è
inferiore a 150 mg in un giorno. Quando è superiore a questo
valore c'è un danno renale per il quale il glomerulo è diventato
più permeabile alle proteine.
L'esperimento si può effettuare con il Biureto, previa
concentrazione del campione. La concentrazione si effettua in
soluzione acida con TCA (acido tricoloroacetico), che fa
precipitare le proteine. Il precipitato si risospende in un
volume minore e si effettua il dosaggio.
Una proteinuria di Bence Jones è dovuta all'aumento della
concentrazione della cosiddetta proteina di Bence Jones, ossia
le catene leggere delle Ig. In questa condizione le catene
leggere delle Ig, per un disordine a carico delle plasmacellule,
vengono sintetizzate in quantità smisurata, per cui vi è un
eccesso di catene leggere rispetto alle catene pesanti. Questa
proteina si dosa con una tecnica immunologica specifica.
Quadro proteico
Il quadro proteico è la percentuale relativa delle proteine
presenti nel plasma. Questa analisi si effettua sul plasma
perché esso è un campione rappresentativo di tutte le proteine
del sangue. E' un'analisi elettroforetica non denaturante. Nella
maggior parte dei laboratori viene ancora eseguito su carta,
cioè su striscette di acetato di cellulosa a pH 8,6. Questo pH è
13
superiore al punto isoelettrico della maggior parte delle
plasma proteine, dunque le plasma proteine acquistano carica
netta negativa e la migrazione avverrà verso il polo positivo.
La lettura si effettua dopo 20 minuti a voltaggio costante a 200
volt.
Come ogni elettroforesi anche questa ha bisogno che le bande
vengano visualizzate al termine della corsa. Un quadro
proteico su carta generalmente viene colorato con Rosso
Ponceau allontanando il colorante in eccesso dopo 15 minuti,
in modo che il colore resti legato solo alle bande proteiche. A
questo punto si ottengono delle macchie rosse, alcune più
intense di altre. Per quantificare queste differenze di intensità
si sottopone la striscia ad un densitometro, uno
spettrofotometro particolare in quanto non legge
l'assorbimento di cromofori in soluzione ma dà la densità
come misura dell'assorbimento della luce su un supporto
solido. Il supporto di carta viene posto in un carrellino, che
avanza di fronte alla cella, la quale è impostata ad una
lunghezza d'onda che consente la quantificazione delle bande
colorate.
Dai risultati si può costruire un grafico che mette sulle
ordinate l'assorbanza e sulle ascisse la posizione delle bande,
che si evidenziano come picchi. Si ottiene un grafico con 5
picchi distinti, ognuno dei quali corrisponde a una frazione
definita di proteine plasmatiche, per questo motivo il quadro
proteico è noto anche come l'elettroforesi delle 5 bande. Il
densitometro, attraverso un'integrazione delle aree, permette
di calcolare la quantità percentuale di ciascuna frazione
rispetto al totale. Il totale di proteine non è altro che la
proteinemia, quindi l'area di ogni picco può essere trasposta a
concentrazione conoscendo la proteinemia.
Un'elettroforesi permette di ottenere delle bande. Questo
grafico è un'elaborazione dell'elettroforesi effettuata dal
densitometro. A migrare per prima è la frazione dell'albumina
perché a pH 8,6, avendo il punto isoelettrico inferiore a tutte
le altre proteine plasmatiche, ha più residui carichi
negativamente e migra più velocemente verso il polo positivo.
Le γglobuline, che sono gli anticorpi, sono quelle che hanno
punto isoelettrico 7-7,5 molto vicino al pH di lavoro, quindi
hanno una piccola carica negativa. Tra l'albumina e le γ-
globuline si trovano le α1, α2 e β-globuline.
Le diverse frazioni di un quadro proteico contengono proteine
che possono avere anche pesi molecolari diversissimi (2000-
80 kDa), eppure fanno parte della stessa frazione perché
condividono lo stesso punto elettrico. La frazione albumina è
la più definita, perché contiene soltanto due proteine: la
transtiretina o prealbumina e l'albumina. Questa frazione non
solo è la più veloce a migrare, ma è anche la più abbondante.
La frazione delle albumine contiene dal 52 al 58% delle
proteine, le altre frazioni sono molto meno espresse rispetto
alla proteinemia. Le altre frazioni possono contenere anche
moltissime proteine.
Questo dosaggio si effettua di default anche se è grossolano,
perché può essere utile per diagnosticare alcune patologie che
portano all'alterazione delle concentrazioni di specifiche
frazioni proteiche del plasma. In condizioni fisiologiche il
rapporto tra la frazione albumina e tutte le altre, che sono
globuline, è compreso tra 1,2 e 2,2. Un quadro proteico in cui
vi è un picco delle γ-globuline molto più alto può essere indice
di infezione cronica. Quando ad aumentare è la frazione β si
può sospettare la presenza di un mieloma β, una neoplasia
delle plasmacellule. Quando si svuota il picco delle γ-
globuline si parla di ipo-γ-globulinemia.
Nel referto delle analisi talvolta è inclusa la striscetta di carta
con le bande, in altre analisi soltanto il risultato del
densitometro.
Vi sono altre tecniche sperimentali che permettono il calcolo
del quadro proteico con maggiore risoluzione, ottenendo 6
bande. In questo metodo la frazione delle β viene divisa in β1
e β2. Per ottenere maggiore risoluzione si può eseguire
l'elettroforesi su gel di poliacrilammide invece che su carta, a
un voltaggio maggiore, utilizzare come supporto dei capillari,
ecc.
Enzimi
Alcuni enzimi, tra cui le transaminasi, la lattico-deidrogenasi,
la creatin-chinasi, la fosfatasi alcalina, presenti nel siero o
plasma sono analiti.
Gli enzimi sono biocatalizzatori di natura proteica. Si
distinguono dai catalizzatori inorganici per alcune
caratteristiche: • sono proteine, con tutte le conseguenze del
caso;
• sono specifici, sono in grado di riconoscere una
molecola tra tutte quante le altre, ovvero il loro substrato;
• hanno un grande potere catalitico, accelerano le
reazioni di moltissime volte;
• possono essere regolati nella loro attività catalitica in
maniera fine e selettiva. In questo modo la velocità della
reazione può essere aumentata o diminuita.
Gli enzimi riconoscono e legano il proprio substrato nel sito
attivo (o sito catalitico), una tasca della struttura proteica. Le
interazioni alla base del legame enzima-substrato sono
interazioni deboli. Il complesso enzima-substrato evolve,
trasformando il substrato in prodotto e rendendo l'enzima
libero, pronto a ricominciare un altro ciclo. L'enzima non
viene modificato dalla reazione. Gli amminoacidi presenti nel
sito attivo e coinvolti nella catalisi vengono definiti essenziali
o gruppi catalitici.
Il modello di Fischer del 1894, definito modello chiave-
serratura, prevedeva che la chiave fosse il substrato e la
serratura fosse l'enzima e ci fosse una interazione
complementare tra enzima e substrato.
Nel 1958 Koshland mette a punto il modello dell'adattamento
indotto (induced fit), cioè il modello per cui il substrato induce
un adattamento nell'enzima. L'enzima cambia conformazione
per adattarsi al substrato, così come il substrato viene indotto
a cambiare conformazione per adattarsi all'enzima.
L'esochinasi è il primo enzima della glicolisi ed ha come
substrato il glucosio. La struttura tridimensionale del
complesso esochinasi-glucosio mostra il cambiamento
conformazionale dell'enzima indotto dal legame del substrato.
Gli enzimi sono importanti perché in una cellula vi possono
essere reazioni termodinamicamente favorite (ΔG < 0,
reazione esoergonica) così come termodinamicamente non
favorite (ΔG > 0, reazione endoergonica). Le reazioni con ΔG
> 0 sono spontanee nel verso opposto.
Sia per le reazioni endoergoniche che per quelle esoergoniche
sono necessari gli enzimi, perché in una cellula anche le
reazioni termodinamicamente favorite avvengono con una
velocità incompatibile con la nostra vita.
La fosforilazione del glucosio a glucosio 6-fosfato è una
reazione che in vivo, spontaneamente, non avviene mai e che
necessita dell'enzima esochinasi. La semplice fosforilazione
del glucosio è una reazione endoergonica,
termodinamicamente sfavorita. Per risolvere questo
problema, l'esochinasi accoppia a questa reazione una
reazione esoergonica che è l'idrolisi dell'ATP. L'idrolisi
dell'ATP non solo dà il gruppo fosfato di cui l'esochinasi ha
bisogno ma porta alla reazione 30,5 kJ per mole di ATP
idrolizzata.
Gli enzimi accelerano anche le reazioni termodinamicamente
favorite perché abbassano l'energia di attivazione. L'energia di
attivazione è l'energia che serve al substrato per raggiungere
lo stato di transizione, una forma che il substrato assume
quando sta per diventare prodotto e alcuni legami si stanno
rompendo mentre altri si stanno formando. Senza un enzima
si potrebbe raggiungere lo stato di transizione in tempi non
compatibili con la vita. L'enzima lega a sé il substrato e facilita
la formazione dello stato di transizione.
L'ATP è una molecola instabile che in vivo esiste in un
complesso con Mg2+, il quale riduce in parte la carica negativa
portata dagli atomi dell'ossigeno, tuttavia vi è sempre una
repulsione tra queste cariche negative. L'ATP presenta due
legami anidridici tra i gruppi fosfato e un legame estere tra il
gruppo fosfato α e il carbonio 5' del ribosio. Se si rompe il
legame anidridico o in γ o in β si ottiene una molecola più
stabile perché si elimina la repulsione tra le cariche e perché
l'anione (gruppo fosfato) che si ottiene si stabilizza molto bene
per risonanza. L'idrolisi del legame estere non porta energia in
quanto la repulsione tra le cariche sussiste. Un enzima come
l'esochinasi, che deve ricavare energia deve idrolizzare l'ATP
o in γ o in β, ottenendo in entrambi casi circa la stessa quantità
di energia (30,5 kJ ogni mole di ATP). Essendo un'idrolisi,
vuol dire che l'acqua partecipa alla reazione come reagente.
L'enzima favorisce l'attacco nucleofilo dell'acqua al fosfato,
che si stacca dal resto della molecola. I prodotti sono ADP e
un fosfato inorganico. Se l'ATP viene idrolizzato in β i
prodotti sono AMP e pirofosfato. In vivo esistono enzimi
chiamati pirofosfatasi inorganiche che sono in grado di
idrolizzare questo legame anidridico tra i due gruppi fosfato e
di ottenere ulteriore energia.
L'ATP è solo una di tante molecole che servono per fornire
energia e far avvenire le reazioni endoergoniche. Il
fosfoenolpiruvato e il 2,3-bisfosfoglicerato sono i due
composti ad alta energia che sono idrolizzati con
trasferimento di un gruppo fosforico nella seconda fase della
glicolisi. Dalla defosforilazione di queste molecole porta al
trasferimento di un gruppo fosfato sull'ADP, portando alla
formazione di ATP in quella che viene chiamata reazione di
fosforilazione a livello del substrato. La fosfocreatina è
un'importantissima molecola ad alta energia e rappresenta la
scorta di energia delle cellule muscolari. La fosfocreatina con
il suo gruppo fosfato rappresenta la scorta di fosfato che una
chinasi può utilizzare per ottenere ATP da ADP. La quantità
di ATP presente nel nostro muscolo consente la contrazione
per pochissimo tempo. Sforzi intensi, di breve durata ma
grande intensità, richiedono più ATP di quanto la
fosforilazione ossidativa sia in grado di fornire. L'acetil-
coenzima A e l'acilCoA possiedono un legame tioestere e la
rottura di questo legame produce un po' di energia.
Tutti gli enzimi possono essere raggruppati in 6 classi:
1. Ossidoriduttasi (deidrogenasi), gli enzimi che
trasferiscono gli elettroni;
2. Transferasi;
3. Idrolasi;
4. Liasi;
5. Isomerasi;
6. Ligasi.
Ogni enzima è caratterizzato da una sigla che comincia con
“EC” (Enzyme Commission) e prosegue con un numero, la cui
prima cifra, seguita da un punto, rappresenta il gruppo a cui
questo enzima appartiene. Un enzima EC1.xxx è una
deidrogenasi.
Alcuni enzimi catalizzano la trasformazione di substrato in
prodotto abbassando l'energia di attivazione o consentendo la
reazione se essa è endoergonica senza cofattori. Altri hanno
bisogno di cofattori per la catalisi. L'enzima con il cofattore si
chiama oloenzima ed è il complesso attivo; l'enzima senza
cofattore è inattivo e si chiama apoenzima. I cofattori degli
enzimi sono molecole non proteiche che derivano spesso dalle
vitamine. Le vitamine non sono nutrienti, che vengono
utilizzati dal nostro organismo per produrre energia; esse
servono in quantità stechiometrica nel nostro organismo a
sufficienza per supportare la sintesi dei cofattori. I cofattori
piridossal fosfato, tiamina pirofosfato, biotina, FAD/FMN,
NAD/NADP e il coenzima A derivano tutti da vitamine del
gruppo B, vitamine idrosolubili che noi non siamo capaci di
sintetizzare. Eccessi di vitamine liposolubili, come vitamina
A ed E, possono essere epatotossici, perché esse vengono
metabolizzate dal fegato per essere rese idrosolubili. I
cofattori solubili che non si legano stabilmente all'enzima
sono anche detti coenzimi. Esempi di coenzimi sono il NAD
e il NADP. Cofattori legati covalentemente all'enzima sono
detti gruppi prostetici. Esempi di gruppi prostetici sono il
FAD e l'FMN (gruppi prostetici delle deidrogenasi e delle
15
reduttasi), la biotina (gruppo prostetico delle carbossilasi),
l'eme, il piridossal fosfato (gruppo prostetico delle transferasi
e delle liasi) e la tiamina pirofosfato (gruppo prostetico delle
decarbossilasi e delle transchetolasi).
Enzimi allosterici
Un enzima non allosterico segue una cinetica con curva a
saturazione. La relazione tra velocità di reazione e
concentrazione di substrato è descritta graficamente da un
ramo di iperbole. La Vmax è la velocità massima di reazione,
che si raggiunge alla concentrazione di substrato saturante.
Km è la concentrazione di substrato alla quale la velocità di
reazione è ½ Vmax. Un enzima non allosterico ha solo un sito
catalitico con il quale reagisce con il substrato.
Un enzima allosterico è un enzima che non segue la cinetica
di Michaelis-Menten e presenta dei siti regolatori oltre ai siti
catalitici di legame del substrato. L'enzima allosterico mostra
il fenomeno della cooperatività e ha una curva a sigmoide.
Bisogna aggiungere un po' di substrato prima che l'enzima
inizi a mostrare un'attività, perché nell'enzima allosterico c'è
cooperatività tra le subunità. Il legame successivo delle
molecole di substrato causa il passaggio dalla conformazione
R alla conformazione T, maggiormente affine al substrato.
Anche qui alla saturazione si raggiunge la Vmax.
Gli effettori che si legano al sito regolatore sono attivatori e
inibitori. Un attivatore si posiziona nel suo sito dedicato e fa
in modo che la transizione R → T sia molto efficace,
spostando l'equilibrio verso T. In questa condizione, la
cinetica enzimatica diventa del tipo Michaelis-Menten, per la
quale c'è nulla interazione tra le subunità.
In presenza di inibitore, la cooperatività tra le subunità si
enfatizza ed è più difficile la transizione dalla conformazione
R alla conformazione T.
La cooperatività tra le subunità non è esclusiva degli enzimi.
L'emoglobina è una proteina allosterica. Caratteristica delle
proteine o degli enzimi allosterici è l'oligomeria, cioè il fatto
di possedere una struttura quaternaria.
Dosaggio enzimatico
Alcuni enzimi presenti nel plasma hanno rilievo diagnostico.
Gli enzimi plasma-specifici sono gli enzimi che esplicano nel
plasma la loro attività, come le proteasi della coagulazione e
le proteasi dell'attivazione del complemento. Gli enzimi non
plasma-specifici non esplicano nel plasma la loro funzione.
Interesse diagnostico è rivolto proprio verso gli enzimi non
plasma-specifici che sono organo o tessuto-specifici, presenti
fisiologicamente solo in piccola quantità nel plasma come
conseguenza del turnover cellulare. Se quell'organo o tessuto
ha un danno, come una necrosi o un'infiammazione, subisce
una lisi cellulare, quindi riverserà nel torrente circolatorio il
proprio contenuto enzimatico.
Dosare una concentrazione elevata di un enzima non
plasmaspecifico non è una conseguenza del fatto che l'organo
da cui l'enzima proviene ne produce di più ma è un indice di
danno dovuto a lisi cellulare.
Le transaminasi sono enzimi che si trovano in tutte le cellule,
abbondanti soprattutto negli epatociti dove sono coinvolte nel
ciclo dell'urea. Esse sono marcatori di danno epatico. Una
piccola quantità di transaminasi nel sangue è fisiologica
perché è una conseguenza del nostro turnover delle cellule.
Quando tuttavia vi è una lisi degli epatociti dovuta a un'epatite
virale, una cirrosi, un'epatopatia qualsiasi, i livelli delle
transaminasi nel sangue aumentano.
Gli enzimi non plasma-specifici possono essere dosati o sul
plasma o sul siero, perché la differenza tra plasma e siero sta
negli enzimi plasma-specifici.
Molti enzimi esistono in forme isoenzimatiche. La differenza
tra gli isoenzimi può essere nella carica netta, nella specificità
al substrato, nella sensibilità a inibitori e nella termostabilità.
L'isoenzima 1 della lattico deidrogenasi è in grado di portare
avanti una particolare reazione. L'isoenzima prostatico della
fosfatasi acida è inibito dal tartrato, quello eritrocitario è
inibito dalla formaldeide. La fosfatasi alcalina placentare è
termostabile. Talvolta è importante dosare un isoenzima
piuttosto che un altro.
Per dosare un enzima bisogna calcolare la velocità di una
reazione catalizzata perché la velocità è direttamente
proporzionale alla concentrazione dell'enzima stesso. Per
calcolare la velocità di una reazione si può misurare la
diminuzione del substrato o l'aumento del prodotto in un'unità
di tempo. La scelta metodica dipende dal tipo di dosaggio. In
entrambi i casi la velocità è il coefficiente angolare della retta
che rappresenta l'andamento del substrato o del prodotto nel
tempo.
La concentrazione di un enzima si misura in unità
enzimatiche. Un'unità enzimatica è la quantità di enzima che
catalizza la formazione di prodotto a partire da 1 μmol di
substrato in 1 min, a temperatura 25°C e condizioni di pH e
forza ionica ottimali per l'enzima.
Per dosare un enzima bisogna fare in modo che non si
denaturi. Dal momento in cui gli enzimi sono prelevati da una
cellula e sono lasciati in una provetta senza stabilizzanti e in
condizioni non ideali possono denaturarsi. Gli enzimi
denaturati sono inattivi e non sono più dosabili perché il
dosaggio si basa sulla velocità di reazione. Per evitare di
inattivare gli enzimi il campione si conserva a freddo e si
utilizzano anticoagulanti che non inibiscono l'enzima.
Al momento del dosaggio bisogna lavorare a temperatura,
forza ionica e pH ottimali per la reazione. Ogni enzima di
solito ha una temperatura ottimale di reazione. La temperatura
ottimale di lavoro dei nostri enzimi va dai 25 ai 30°C.
Molti enzimi lavorano ad un pH preciso e non ad un altro. Il
pH può provocare la ionizzazione delle catene laterali degli
amminoacidi nel sito attivo che non è sempre ottimale per la
catalisi. La pepsina è un'idrolasi che lavora a pH altamente
acido, le amilasi lavorano intorno alla neutralità,
l'acetilcolinesterasi ha invece un'attività in funzione del pH
particolare perché a pH alti presenta un plateau.
Molto spesso nei dosaggi si utilizzano gli stessi substrati che
l'enzima incontra nella cellula. Per il dosaggio delle
transaminasi si utilizza il suo substrato naturale contenuto
nell'epatocita. Questo non è sempre possibile perché in alcuni
casi il substrato è una molecola complessa e seguirne la
trasformazione in prodotto non è vantaggioso dal punto di
vista operativo. Talvolta non è possibile dosare l'enzima con
substrato naturale perché alcuni substrati/prodotti non
permettono di seguire la trasformazione nel tempo. In questo
caso vengono utilizzati substrati sintetici, molecole che non
esistono in natura che sono state creare per dosare
quell'enzima in vitro.
La velocità di tutti gli enzimi dipende dalla concentrazione del
substrato. Questo ha un rilievo anche fisiologico: vi sono vie
metaboliche in cui la disponibilità di substrato è
fondamentale. La citrato sintasi, che è il primo enzima del
ciclo di Krebs, è quell'enzima che mette insieme l'ossalacetato
e l'acetil-coenzima A per formare il citrato. Questo enzima
comincia a lavorare solo i suoi substrati sono disponibili in
una certa concentrazione. Gli enzimi allosterici hanno una
dipendenza tra velocità e concentrazione di substrato molto
più fine. Essi hanno altri siti, oltre ai siti attivi, detti siti
regolatori a cui si legano inibitori e attivatori. La
concentrazione saturante di substrato bisogna calcolarla dalla
curva.
La velocità di una reazione dipende anche dal substrato
secondo la legge di Michaelis-Menten. La velocità di una
reazione in funzione della concentrazione di substrato ha un
andamento sigmoidale per gli enzimi allosterici e un
andamento iperbolico per gli enzimi con cinetica di
MichaelisMenten.
Se è vero che la velocità della reazione dipende dalla
concentrazione di substrato, quando bisogna dosare la
concentrazione di un enzima il substrato non deve limitare tale
reazione, per cui si utilizza substrato in concentrazioni
saturanti. In questo modo si riesce ad ottenere la massima
velocità di reazione per quella concentrazione di enzima e si
fa sì che il fattore limitante sia l'enzima.
Il periodo del dosaggio dev'essere limitato alla fase iniziale
della reazione, in cui la relazione tra concentrazione di enzima
e velocità è lineare. Se l'enzima in provetta nel tempo si
inattiva oppure il prodotto è un inibitore dell'enzima la
velocità della reazione diminuirà. Nel tempo iniziale della
reazione si ha una relazione tra velocità e concentrazione di
enzima ottimale.
Nel caso più semplice, o il substrato o il prodotto sono
cromofori. Questo permette di seguire la velocità della
reazione enzimatica semplicemente seguendo nel tempo o la
scomparsa di assorbimento del substrato o l'aumento di
assorbimento del prodotto.
Se il substrato è colorato, man mano che l'enzima catalizza la
reazione substrato → prodotto il colore diminuisce, quindi
impostando lo spettrofotometro a quella lunghezza d'onda si
registra una diminuzione di assorbanza. Se il substrato è
incolore e il prodotto acquista proprietà cromoforiche si
registra un aumento di assorbanza.
Ciò che si va a misurare è quindi il ΔA al minuto ossia la
variazione di assorbanza del substrato o del prodotto in un
minuto. Il ΔA al minuto diviso per ε dà la variazione di
concentrazione di substrato o prodotto nel tempo, e quindi la
velocità di reazione, da cui si ricava la quantità di enzima.
Enzimi che vengono molto utilizzati nei kit diagnostici sono:
• la perossidasi, che idrolizza i perossidi. In presenza di
un accettore di elettroni, da incolore diventa colorato. La
perossidasi si può dosare in vari modi, ottenendo a seconda
del substrato colorazione blu-verde o arancione nel visibile;
• le deidrogenasi (EC1) sono gli enzimi che catalizzano
le reazioni redox reversibili che richiedono l'intervento di
cofattori in grado di scambiare elettroni e protoni col
substrato. Una molecola che perde elettroni si ossida e una
molecola che li accetta si riduce. I cofattori di questa classe di
enzimi possono essere coenzimi, come NAD e NADP, che
sono molecole solubili che interagiscono con l'enzima al
momento della catalisi, oppure gruppi prostetici, come il
FAD, legati covalentemente all'enzima.
La succinato deidrogenasi è una deidrogenasi che utilizza il
FAD e catalizza la seguente reazione: succinato + FAD ↔
fumarato + FADH2
Il FAD di solito si trova nell'ossidazione di alcani e alcheni,
mentre il NAD e il NADP nell'ossidazione di alcoli, aldeidi e
chetoni.
Le deidrogenasi NAD e NADP dipendenti sono quelle
utilizzate nel laboratorio di diagnostica sanitaria. Il NAD è la
nicotinammide adenina dinucleotide. Il NADP presenta un
gruppo fosfato esterificato all'ossidrile 2' del ribosio, per il
resto è una molecola identica al NAD. La differenza tra
NAD/NADP (ossidato) e NADH/NADPH (ridotto) riguarda
la parte della nicotinammide della molecola. NAD/NADP
accettano due elettroni e uno ione H+ diventando
NADH/NADPH. L'altro ione H+ coinvolto nella reazione
viene liberato, per questo motivo le trasformazioni dovute alle
deidrogenasi nella direzione della riduzione del NAD/NADP
comportano un abbassamento del pH.
Sia il NAD/NADP che il NADH/NADPH sono cromofori che
assorbono nell'ultravioletto. A 260 nm assorbono sia le forme
ossidate che le forme ridotte del coenzima. A 340 nm, verso
la fine dell'ultravioletto, assorbono soltanto le forme ridotte
(NADH e NADPH). 340 nm è la lunghezza d'onda giusta per
eseguire il dosaggio di una reazione catalizzata da una
deidrogenasi.
Dividendo ΔA al minuto per l'ε millimolare del NAD(P)H
(6,22 OD) si ottengono le μmoli di NAD(P)H
formato/scomparso per minuto, ossia la concentrazione
dell'enzima in unità enzimatiche.
La malato deidrogenasi catalizza la reazione: malato
+ NAD+ ↔ ossalacetato + NADH
In questa reazione l'enzima è un cromoforo perché essendo
una proteina assorbe sia tra i 200-220 nm per il legame
peptidico, sia intorno ai 275-280 nm per la presenza di
amminoacidi aromatici (fenilalanina, tirosina e triptofano).
Tuttavia per valutare l'andamento di questa reazione e quindi
la concentrazione dell'enzima bisogna dosare il coenzima,
perché nel plasma vi sono tante altre proteine che assorbono a
280 e 210 nm. Impostando lo spettrofotometro a 340 nm se la
reazione procede verso destra si osserva un aumento di
assorbanza dovuto alla formazione di NADH. Dividendo ΔA
al minuto per l'ε millimolare del NADH (6,22 OD) si
ottengono le μmoli di NADH formato per minuto, ossia le
unità enzimatiche.
17
Fosfatasi alcalina
La fosfatasi alcalina (ALP) è un'idrolasi (EC3). Essa è molto
abbondante negli osteoblasti e in minor concentrazione negli
epatociti e nelle cellule renali.
I livelli plasmatici di questo enzima sono fisiologicamente
molto elevati fino ai 10 anni a causa dell'accrescimento. Vi è
un aumento fisiologico anche nelle donne incinte, in cui si
verifica un aumento in circolo dell'isoenzima placentare che
deriva dall'accrescimento del feto. In un adulto non in
gravidanza alti livelli di fosfatasi alcalina sono invece legati a
problemi.
La fosfatasi alcalina richiede per il suo dosaggio un substrato
sintetico. Il substrato naturale della fosfatasi è una proteina
che è stata fosforilata da una chinasi, quindi è un substrato
complesso. Seguire una reazione del genere è difficile perché
non si può distinguere un cambiamento cromatico prima e
dopo la defosforilazione di una proteina. Il substrato sintetico
utilizzato per dosare le fosfatasi è il p-nitrofenilfosfato.
Questo substrato è incolore. La fosfatasi rimuove il gruppo
fosfato formando il p-nitrofenolo, un composto giallo:
evidentemente il riarrangiamento elettronico dentro
quell'anello fenolico è tale da conferire una caratteristica di
assorbimento della luce al p-nitrofenolo, che risulta dunque
giallo, quindi si tratta di un dosaggio colorimetrico.
Misurando l'assorbanza a 405 nm si osserva nel tempo la
formazione di p-nitrofenolo a partire dal p-nitrofenolfosfato.
L'incremento di assorbimento nel tempo diviso ε millimolare
permette di calcolare le micromoli di prodotto formate
nell'unità di tempo e quindi la concentrazione dell'enzima in
unità enzimatiche.
γ-glutamiltrasferasi
La γ-glutamiltrasferasi è una trasferasi (EC2). E' un indice di
intossicazioni alcoliche; gli alcolisti hanno livelli di γ-
glutamiltrasferasi (γGT) elevati.
In questo caso si utilizzano la glutamil-carbossi-nitroanilide e
la glicilglicina che vengono trasformate in p-nitroanilina, un
cromoforo giallo che assorbe a 405 nm. Anche questo è un
dosaggio colorimetrico.
Transaminasi
Le transaminasi o amminotransferasi sono transferasi (EC2) e
sono gli enzimi che catalizzano il trasferimento di un gruppo
amminico da un amminoacido all'α-chetoglutarato.
L'amminoacido diventa il chetoacido corrispondente e
l'αchetoglutarato diventa glutammato. Esiste una transaminasi
per ogni amminoacido perché tutti gli amminoacidi devono
poter perdere un gruppo amminico per poter essere utilizzati.
Le transaminasi sono diffuse nei tessuti in concentrazioni
diverse. Nel plasma e nel siero se ne trova una piccola
quantità, fisiologicamente accettata conseguenza del
fisiologico turnover delle cellule. Se vi è una necrosi al cuore,
al fegato o a un tessuto tutto il contenuto cellulare viene
riversato nel torrente ematico, incluso le transaminasi. Due
sono le transaminasi dosate di routine in un laboratorio di
diagnostica sanitaria: l'aspartato transaminasi (AST o GOT) e
l'alanina transaminasi (ALT o GPT). In condizioni normali il
rapporto tra la concentrazione della AST fratto quella della
ALT dev'essere maggiore di 1.
Reazione della aspartato transaminasi:
L-aspartato + α-chetoglutarato ←AST→ ossalacetato +
glutammato
Reazione dell'alanina transaminasi:
alanina + α-chetoglutarato ←ASP→ piruvato + glutammato
Nelle reazioni dell'AST e dell'ASP non vi è alcun cromoforo.
Per dosare le transaminasi nei laboratori vi è bisogno di una
reazione accoppiata con una deidrogenasi commerciale. La
deidrogenasi ha come substrato uno dei prodotti della reazione
catalizzata.
Per dosare l'AST si utilizza la malato deidrogenasi che riduce
l'ossalacetato a malato, ossidando il NADH a NAD+. La
reazione si segue come per tutte le deidrogenasi a 340 nm e si
osserva una diminuzione dell'assorbimento nel tempo. La
reazione non parte subito, c'è un tempo di latenza perché si
deve formare un po' di ossalacetato dalla prima reazione prima
che parta la seconda. La miscela di reazione consiste in L-
aspartato a concentrazioni saturanti, α-chetoglutarato a
concentrazioni saturanti, NADH a concentrazioni saturanti e
malato deidrogenasi commerciale a cui viene aggiunto plasma
o siero in una cuvetta.
Per dosare l'ALT si utilizza la lattico deidrogenasi che riduce
il piruvato a lattato a spese di NADH. La miscela di reazione
contiene plasma o siero, alanina, α-chetoglutarato, NADH e
lattato deidrogenasi.
Nella miscela di reazione non vi sono ossalacetato e piruvato
perché essi si devono formare soltanto in seguito all'attività
dell'enzima da dosare. Questo è il motivo per cui vi è la fase
di latenza durante la quale si deve formare l'ossalacetato o il
piruvato, che consentano alle deidrogenasi di lavorare.
Lattico deidrogenasi
La lattico deidrogenasi (LDH) è una deidrogenasi (EC1) che
catalizza la trasformazione reversibile dell'acido piruvico ad
acido lattico. Nel dosaggio della ALT si utilizza una LDH
commerciale, mentre questa da dosare è quella che si trova
all'interno del nostro plasma.
La lattico deidrogenasi esiste in 5 forme isoenzimatiche. La
lattico deidrogenasi è una proteina a struttura quaternaria
formata da 4 subunità diverse H (heart) e M (muscle). L'LDH1
è un omotetramero formato da 4 subunità H ed è
principalmente situata a livello del miocardio. L'isoenzima
LDH5 è formato da 4 subunità di tipo M. Esso è stato scoperto
per la prima volta nel muscolo ma oggi si sa che è
prevalentemente localizzata a livello del fegato. Tra questi due
isoenzimi vi sono LDH2, LDH3 e LDH4 che vengono fuori
dalle varie combinazioni delle subunità H ed M.
Nel plasma sono presenti tutte e 5 le isoforme enzimatiche. Se
dosassimo con uno spettrofotometro, fornendo piruvato e
NADH, si otterrebbe la somma di tutte e 5 le forme. Chi ha un
infarto ha una quantità di LDH1 nel plasma esagerata, mentre
chi ha un'epatite virale ha nel plasma una quantità esagerata
della LDH5. Per capire se vi è un danno e dove esso è
localizzato bisogna quindi trovare un modo per distinguere le
5 isoforme.
Solo per la LDH1 esiste un dosaggio spettrofotometrico Quest'attività si può dosare utilizzando nella miscela di
particolare perché l'isoenzima LDH1 ha una specificità che le reazione ADP e fosfocreatina. L'enzima trasferisce il gruppo
altre non hanno a riconoscere come substrato alternativo fosfato dalla fosfocreatina all'ADP formando ATP e creatina.
l'αchetobutirrato e a trasformarlo. Tuttavia questo non si fa L'ATP reagisce con il glucosio, reazione catalizzata
quasi mai. dall'esochinasi (prima enzima della via glicolitica) formando
Quello che si fa è separare le 5 isoforme con un'elettroforesi glucosio 6-fosfato. A questo punto si accoppia una
ed ottenere una quantitativa solo dopo averle separate. Si deidrogenasi che è in grado di riconoscere il G6P e di
carica un po' di campione (plasma o siero) e si colora con un trasformarlo in 6-fosfogluconato a spese di NADP che diventa
colorante specifico per le 5 isoforme. Questa tecnica viene NADPH. La miscela di reazione comprende ADP,
chiamata anche zimogramma, cioè si fa in modo di ottenere fosfocreatina, glucosio, esochinasi, G6P-deidrogenasi, NADP
uno sviluppo di colore che sia proporzionale alla quantità di e un'aliquota di plasma o siero che è stata preincubata con
enzima presente sulla striscia. La striscia di carta viene anticorpo anti-M. Allo spettrofotometro si registra un
immersa in una soluzione che contiene lattato, NAD, un sale aumento di assorbanza alla lunghezza d'onda di 340 nm. Dal
di tetrazolio (incolore) e un trasportatore di elettroni. Ciascuno ΔA/min si risale alla concentrazione dell'enzima. Molti
dei 5 isoenzimi è ancora attivo perché l'elettroforesi è eseguita spettrofotometri sono standardizzati, quindi danno
in condizioni non denaturanti e trasforma il lattato in piruvato direttamente la quantità di creatin chinasi MB.
e il NAD in NADH. Il NADH che si forma riduce a sua volta
il sale di tetrazolio a formazano che acquista una colorazione Metodi analitici chimici
blu-viola. A questo punto la striscia di carta apparirà con 5 Molti degli analiti non sono enzimi, quindi non si può dosare
macchie blu-viola in cui lo sviluppo di colore, in la loro attività misurando la comparsa di prodotto o la
corrispondenza delle bande, è proporzionale alla quantità. Il scomparsa di substrato nel tempo. Questi analiti vengono
densitometro consente di calcolare la quantità di ciascuna dosati con metodi chimici, enzimatici o metodi immunologici.
isoforma dell'enzima trasformando le bande in picchi e
calcolando l'area sottostante ciascun picco. A pH 8,4 le Un metodo chimico è un metodo che utilizza un reagente
proteine si caricano tutte con carica netta negativa per cui chimico per dosare un analita. L'analita non è un enzima,
migrano verso il polo positivo. La più rapida è la LDH1, la altrimenti verrebbe dosato con l'attività dell'enzima stesso. Il
meno rapida è la LDH5 perché anche se sono isoforme dello reagente reagisce con l'analita, che è una piccola molecola, e
stesso enzima, il fatto che sono formati da subunità ognuna forma un addotto colorato, che può essere dosato
caratterizzata da una sua composizione amminoacidica, fa sì colorimetricamente con costruzione di una retta di taratura.
che avranno una diversa carica netta. Metodi siffatti sono di una realizzazione molto semplice ed
Il densitogramma in caso di danno epatico presenta un picco hanno costi esigui. Per contro però non sono molto sensibili,
molto più alto di LDH5, mentre in caso di infarto del perché è necessario che l'analita sia presente nel campione in
miocardio presenta un picco di LDH1. una quantità sostenuta prima che si riesca ad osservare una
risposta con il reagente e talvolta sono anche poco specifici
perché il reagente non è un enzima, non distingue tra molecole
Creatina chinasi simili tra di loro ma diverse. Questi metodi sono talvolta anche
La creatina chinasi o creatin fosfochinasi (CK o CPK) è una tossici.
trasferasi (EC2). È un dimero formato da due tipi di subunità: Alcuni analiti sono dosati con questo metodo perché non si
M prevalenti nel muscolo e B prevalenti nel cervello. Dalla può fare altrimenti.
diversa associazione dei due monomeri derivano tre isoforme
(MM, MB e BB). L'MM prevale nel muscolo scheletrico, BB
nel cervello, MB nel miocardio. In siero e plasma è presente Corpi chetonici
l'isoenzima MM, la forma MB è presente in piccole quantità, I corpi chetonici sono 4 molecole: acetoacetil-coenzima A,
la forma BB è assente in condizioni fisiologiche. acetoacetato, acetone e 3-idrossibutirrato. Esse derivano dalla
Ha senso fare il dosaggio di creatina chinasi se ha senso poter modifica enzimatica dell'acetil-CoA, che viene attivamente
calcolare la concentrazione della forma MB, perché questa è trasformato in queste molecole quando è in eccesso rispetto
rilevante come indice di danni traumatici, di infiammazione a all'ossalacetato e quindi rispetto alla capacità di ricezione del
un muscolo, di infarto del miocardio o di distrofia muscolare. ciclo di Krebs.
Le persone che fanno molta attività fisica possono avere dei L'acetil-CoA si forma dalla degradazione di glucosio, acidi
livelli aumentati in conseguenza di sforzi muscolari grassi e proteine. L'acetil-CoA è una molecola ad alto
accentuati. contenuto energetico perché contiene un legame tioestere, un
Per determinare esclusivamente la forma MB si usa un legame ad alta energia la cui idrolisi è un evento esoergonico.
anticorpo specifico per il monomero M che inibisce L'acetil-CoA è la forma attivata dell'acetato, costituito da due
completamente l'enzima MM, non ha nessuna attività atomi di carbonio. Il coenzima A è una molecola complessa,
sull'isoenzima BB e inibisce al 50% la forma MB. In seguito costituita da un'adenina, una lunga catena (acido pantotenico)
si determina l'attività residua che è dovuta alla frazione B della e un gruppo sulfidrilico terminale. Un gruppo sulfidrilico (-
forma MB. SH) del CoA può stabilire un legame tioestere (-S-C-) con
l'acetato.
Per il dosaggio si sfrutta l'attività della creatin chinasi, che o
fosforila la creatina o defosforila la fosfocreatina.

19
Il nostro metabolismo è fatto in modo che dalla degradazione tipi di eme: eme A, eme B ed eme C, ma l'eme di nostro
(ossidazione) di acidi grassi, glucosio, anche proteine quando interesse è l'eme B, che si trova nella mioglobina e
non ci sono glucosio e acidi grassi a sufficienza o in nell'emoglobina. L'eme stabilisce un legame non covalente
condizioni di dieta iperproteica si ricavano acetil-CoA e con la mioglobina e con l'emoglobina. L'eme C si trova nel
coenzimi ridotti NADH e FADH2. L'acetile dell'acetil-CoA citocromo C, uno dei componenti della catena respiratoria.
nel ciclo di Krebs si unisce all'ossalacetato (4C) per formare Tra l'eme A, l'eme B e l'eme C ci sono delle differenze
il citrato (C6). L'enzima che catalizza questa reazione è la strutturali. L'eme A e l'eme B sono legati alle proprie proteine
citrato sintasi. in maniera non covalente, ma comunque abbastanza
Se vi è diabete o in seguito a un digiuno prolungato, due stabilmente. L'eme C invece è legato tramite un legame
condizioni nelle quali il corpo non ha a disposizione covalente con delle cisteine al citocromo C. Al di là di queste
carboidrati, l'ossalacetato epatico, invece di essere unito differenze l'eme ha una struttura base comune che è quella
all'acetil-CoA nel ciclo di Krebs, viene indirizzato alla dell'atomo ferroso circondato dall'anello tetrapirrolico.
glucogenesi. In questo caso si forma un eccesso di acetil-CoA L'atomo di ferro centrale deve essere ferroso per legare
rispetto alle capacità ricettive del ciclo di Krebs. Ecco che reversibilmente l'ossigeno nell'emoglobina, mentre nelle altre
questo eccesso di acetil-CoA viene trasformato molecole ha la funzione di trasportare elettroni dal complesso
enzimaticamente dal nostro corpo in corpi chetonici. 3 al complesso 4 della catena di trasporto mitocondriale.
I corpi chetonici possono essere esportati dal fegato negli L'eme B, contenuto in quantità elevata nella nostra
organi che non devono fermarsi, il cervello e il cuore, per emoglobina e mioglobina, è l'eme più rappresentato nel nostro
essere utilizzati come fonti energetiche. Mentre gli acidi grassi corpo. La mioglobina è un monomero, mentre l'emoglobina è
non superano la barriera ematoencefalica i corpi chetonici la un tetramero formato da due monomeri di globina a e due
superano, quindi permettono al cervello di continuare le sue monomeri di globina b ed è una proteina allosterica. La
attività in condizioni di carenza di carboidrati. mioglobina lega stabilmente l'ossigeno e costituisce una fonte
I corpi chetonici sono indice di uno squilibrio dell'omeostasi di riserva dell'ossigeno a differenza dell'emoglobina che può
del glucosio. L'eccesso di corpi chetonici nel plasma o nel legarlo in certe condizioni e deve scaricarlo in altre
siero è noto come chetosi e può dare acidosi metabolica (fino condizioni, fungendo da molecola di trasporto dell'ossigeno.
al coma). Questo può succedere da chetoacidosi diabetica. La La biosintesi dell'eme comincia nel mitocondrio, a partire dal
chetonurìa è l'aumento dei corpi chetonici nell'urina. Tra tutti succinil-CoA, un intermedio del ciclo di Krebs. Il ciclo di
e quattro l'acetone viene eliminato dai polmoni e conferisce Krebs è una via anfibolica: rappresenta sì il catabolismo
all'aria espirata il caratteristico odore. Il dosaggio dei corpi dell'acetil-CoA che proviene dall'ossidazione dei nutrienti, ma
chetonici, messo insieme ad iperglicemia persistente e altri è anche una via anabolica perché molti intermedi delle 8
indicatori, è un indicatore di diabete. reazioni del ciclo possono anche entrare nella via biosintetica
Il dosaggio di corpi chetonici in plasma o urine viene di alcune molecole. Il succinil-CoA subisce delle reazioni nel
effettuato con metodo chimico perché non esiste altro metodo mitocondrio e viene trasformato in acido Δ-amminolevulinico
attualmente. Si utilizzano delle strisce di carta che contengono (ALA), che viene trasportato nel citosol da un carrier. Nel
nitroprussiato di sodio e fosfato bisodico a pH 9. La striscia citosol avvengono ulteriori reazioni che convertono la
viene immersa in un po' di plasma oppure viene versata una molecola in una forma simile a quella finale. Dopo una serie
gocciolina di plasma sulla striscia e se c'è nel plasma una di reazioni l'intermedio viene trasportato nuovamente nel
concentrazione che va dai 5 ai 10 g/100 mL di corpi chetonici mitocondrio da un carrier, dove con le tre ultime reazioni
la striscia si colora di viola tanto più intensamente quanto più viene trasformato nel gruppo eme.
è elevata la concentrazione di acetoacetato e acetone, perché Le porfirine che hanno un rilievo nei laboratori di diagnostica
in realtà i corpi chetonici che vengono dosati sono questi due. sanitaria sono sia quelle della via biosintetica che della via
Questo metodo è poco costoso e facile da applicare, tuttavia degradativa dell'eme. Il gruppo eme B che deriva
ha una sensibilità molto bassa. Se la concentrazione dei corpi dall'emoglobina e dalla mioglobina viene convertito in
chetonici è inferiore ai 5 mg la striscia non si colora e quindi biliverdina per intervento di una eme ossigenasi. La
si ha negatività, ma qualora fosse superiore a 5 mg/100 ml non biliverdina subisce una riduzione a bilirubina da parte di una
si potrebbe conoscere l'effettiva concentrazione perché il reduttasi. La bilirubina è un'importantissima porfirina ed è una
metodo non è sensibile. Del resto non è neanche specifico molecola idrofobica. Il sangue è una soluzione acquosa quindi
perché non fa alcun distinguo tra l'acetoacetato e l'acetone. la bilirubina viene legata all'albumina per poter rimanere in
Inoltre è un metodo tossico perché il nitroprussiato di sodio e circolo. L'albumina è la proteina del siero più abbondante ed
il fosfato bisodico a pH 9 formano una soluzione tossica che è una molecola di trasporto; essa può legare la bilirubina, ma
deve essere smaltita opportunamente. anche molti farmaci lipofilici. La bilirubina viene trasportata
nel fegato dove avvengono ulteriori trasformazioni. La
bilirubina può stare in circolo sia legata all'albumina, sia in
Porfirine forma libera glucuronata. L'enzima UDP-
Le porfirine sono molecole presenti nel metabolismo del glucoroniltransferasi è un enzima che trasferisce due molecole
gruppo eme. Alcune porfirine sono di interesse diagnostico. di acido glucuronico ad una molecola di bilirubina. L'acido
Il gruppo eme è una molecola non proteica costituita da un glucuronico si trova in forma attivata dal legame con l'UDP e
atomo ferroso al centro di un anello tetrapirrolico. Esistono tre quando viene legato alla molecola di bilirubina si perde l'UDP
in una reazione esoergonica. La bilirubina diglucuronide è una Nel metodo enzimatico viene utilizzato un enzima
molecola idrosolubile e questa rappresenta una importante commerciale, il quale riconosce l'analita da dosare come suo
strategia con la quale il nostro organismo rende solubili, e substrato e ne catalizza la trasformazione in prodotto. Ogni
quindi eliminabili con il filtro renale nelle urine, molecole che qualvolta che ci sia stata la possibilità di identificare e mettere
non sono idrosolubili. Anche alcuni ormoni lipofilici devono in commercio un enzima che ha come suo substrato l'analita
essere glucuronati per essere eliminati nelle urine. di nostro interesse un metodo enzimatico ha potuto sostituire
Per i dosaggi di porfirine su plasma o siero si dosa la bilirubina un metodo chimico. Per i corpi chetonici e per le porfirine
totale e la bilirubina diretta. Il campione di analisi può essere ancora non è stato trovato un enzima capace di riconoscerli
plasma o siero indifferentemente, perché la bilirubina non è come substrato.
una proteina. Il dosaggio che viene indicato sui referti di
analisi col termine di bilirubina totale dosa quella coniugata Glucosio
all'acido glucuronico e quella legata all'albumina (la bilirubina
La glicemia e la glicosuria sono rispettivamente la
libera non ci deve stare). La bilirubina diretta dosa solo quelle
concentrazione del glucosio in plasma o siero e nelle urine.
coniugata all'acido glucuronico. La bilirubina indiretta si L'intervallo fisiologico di una glicemia vale 65-110 mg/100
ottiene sottraendo la bilirubina diretta a quella totale. Il mL di plasma o siero.
dosaggio viene eseguito con metodo chimico.
Il glucosio è uno zucchero aldoesoso, che in natura è presente
L'ittero della pelle, della sclera e delle membrane è causato da
in forma ciclica perché la catena lineare spontaneamente
un aumento di bilirubina nel sangue oltre i 3-5 mg/100 mL. Il ciclizza. La chiusura dell'anello è dotata di maggiore stabilità.
metabolismo della bilirubina avviene nel fegato quindi un Nella via glicolitica il carbonio 6 viene fosforilato
danno epatico provoca alti livelli di bilirubina nel sangue. Nei
dall'esochinasi a formare glucosio 6-fosfato.
neonati spesso (60-70%) avviene l'ittero neonatale, dovuto a
La glicemia intesa come concentrazione di glucosio è la
una massiccia degradazione delle catene γ dell'emoglobina
risultante di quattro processi: due che immettono il glucosio
fetale, che è fisiologico.
in circolo e due che lo riducono. I processi che lo immettono
Nelle urine si può ottenere un dosaggio delle porfirine totali in circolo sono la sintesi ex-novo di glucosio (gluconeogenesi)
nel caso si abbia un sentore di un malfunzionamento della via e la glicogenolisi, che permette di ottenere glucosio dalla
degradativa o biosintetica del gruppo eme. Questo è un demolizione del glicogeno. I processi che lo rimuovono sono
dosaggio non di routine, è un dosaggio specifico che deve la glicolisi e glicogenosintesi, cioè la via metabolica di sintesi
essere richiesto dal medico. Le porfirine sono cromofori e del glicogeno, che è la scorta di glucosio negli animali,
fluorofori nel rosso, quindi con lettura spettrofotometrica o equivalente dell'amido nei vegetali. Il glicogeno e l'amido
con lettura fluorimetrica dopo irraggiamento con UV, si può sono polimeri ramificati di α-glucosio. La cellulosa è un
ottenere la quantitativa delle bilirubine totali. Per dosare polimero ramificato di β-glucosio. Questa differenza è
specificamente l'ALA o il fosfobilinogeno (PBG) che importante: noi non digeriamo la cellulosa perché non
appartengono alla via di sintesi del gruppo eme, bisogna abbiamo le cellulasi, delle idrolasi che sono capaci di rompere
separarle da tutto il resto tramite cromatografia a scambio il legame β-glicosidico. Siamo invece capaci di demolire
ionico. Le frazioni che contengono queste due molecole l'amido e il glicogeno.
vengono dosate con reattivo di Herlich
L'omeostasi di questi quattro eventi che mantengono la
(pdimetilamminobenzaldeide in ambiente acido) che dà un
glicemia all'interno dell'intervallo fisiologico si ottiene
cromoforo che assorbe nel rosso.
attivando od inibendo enzimi chiave che sovrintendono alla
Il dosaggio di ALA viene richiesto qualche volta nelle cause regolazione di queste quattro vie metaboliche. La glicemia
di lavoro perché il piombo che può essere presenti in certi può essere modulata in funzione dell'alimentazione. Dopo
lavori inibisce l'attività di un enzima che è responsabile delle
aver mangiato una fetta di torta ricca di zuccheri la
concentrazioni di ALA. Se l'organismo è venuto a contatto gluconeogenesi si deve fermare, mentre saranno attivate
con piombo può avere un dosaggio di ALA molto alto. sicuramente le vie che rimuovono il glucosio dal circolo: la
Le porfirie sono malattie ereditarie, poco frequenti, imputabili
glicolisi, che trasforma il glucosio fino al piruvato, che entra
a un difetto di attività enzimatiche che sono coinvolte nella via
nel ciclo di Krebs come acetil-CoA per subire la fosforilazione
biosintetica del gruppo eme. Se si accumulano precursori ossidativa, e la glicogenosintesi, che parte solo se c'è una
iniziali come ALA e PBG in alte concentrazioni in un grande quantità di glucosio in circolo. Se c'è poco glucosio in
organismo si hanno manifestazioni neuropsichiatriche. Se circolo non viene sintetizzata la glucochinasi, che è il primo
invece sono gli intermedi più distali della via biosintetica adenzima della glicogenosintesi. Un eccesso di glucosio in
accumularsi si ha fotosensibilità cutanea. circolo stimola il pancreas a secernere l'insulina, un ormone
che ha la capacità di controllare l'espressione genica della
Metodo enzimatico glucochinasi. Un eccesso di glucosio blocca la glicolisi perché
se c'è un eccesso di glucosio, il glucosio 6-fosfato, che è il
Molti analiti non enzimatici sono dosati in laboratorio con
prodotto dell'esochinasi, funziona da inibitore competitivo
metodo enzimatico. Quando possibile, i metodi enzimatici
dell'esochinasi stessa, ed ecco che il glucosio in eccesso viene
hanno sostituito i metodi chimici, perché sono più sensibili,
indirizzato alla glicogenosintesi. Un eccesso di glucosio 6-
più specifici e poco tossici per l'ambiente e per l'operatore.
fosfato è un inibitore dell'esochinasi ma non della
glucochinasi, due enzimi che catalizzano la stessa reazione ma

21
che sono profondamente diversi: l'esochinasi è costitutiva
mentre la glucochinasi viene indotta solo quando c'è un
eccesso di glucosio. L'esochinasi viene inibita da un eccesso
del suo prodotto mentre la glucochinasi no perché l'esochinasi
è un enzima dalla cinetica di Michaelis-Menten mentre la
glucochinasi ha una cinetica allosterica in funzione della
concentrazione del substrato glucosio. In un enzima come
l'esochinasi vi sono solo i siti catalitici ai quali si può legare il
substrato o qualcosa che assomigli al substrato e che si
comporti come inibitore competitivo, quale il glucosio 6-
fosfato. La glucochinasi è invece un enzima allosterico che ha
una velocità di reazione in funzione del substrato sigmoidale;
in un enzima del genere oltre ai siti catalitici vi sono anche i
siti regolatori. La regolazione della velocità della glucochinasi
quindi non sta nel prodotto ma in un altro composto. Questo è
il motivo per cui un eccesso di glucosio blocca la glicolisi ma
contestualmente fa partire la glicogenosintesi.
Attivare o inibire un enzima chiave, che regola la velocità di
una via metabolica, non può prescindere dall'intervento di
molecole ormonali. Nel metabolismo del glucosio importanti
ormoni sono l'insulina, ormone ipoglicemizzante, e il
glucagone/adrenalina, ormoni iperglicemizzanti. L'insulina
funziona attivando tutte le vie che rimuovono il glucosio dal
circolo. L'insulina viene secreta dalle cellule β del pancreas in
risposta a un'elevata glicemia e permette alle cellule epatiche
di esprimere i geni della glucochinasi. Dall'altro lato il
glucagone e l'adrenalina, pur se diversi perché uno è un
peptide, l'altro un derivato amminoacidico, entrambi hanno
azione iperglicemizzante. La differenza principale tra il
glucagone e l'adrenalina sta nei tessuti bersaglio: l'adrenalina
ha come tessuto bersaglio il muscolo, mentre il glucagone ha
altri bersagli.
Si parla di ipoglicemia quando la glicemia scende al di sotto
dei 40 mg/100 mL. Può essere dovuta a cause esogene
(digiuno, malnutrizione, troppa attività, assunzione di
ipoglicemizzanti orali in eccesso, alcool, ecc.). Può anche
essere dovuta a problemi endogeni di assorbimento, eccesso
di insulina o difetti enzimatici.
Nell'iperglicemia la concentrazione di glucosio supera i 120
mg/dL. Può essere accettata durante la gravidanza (diabete
gestazionale) purché dopo il parto ritorni ai valori normali. Il
diabete mellito, che causa l'aumento di glicosuria, è la causa
più comune di iperglicemia.
La glicosuria è la quantità di glucosio nelle urine e si parla di
glicosuria quando supera i 160 mg nelle urine delle 24 ore. Il
rene riassorbe il glucosio che arriva nei glomeruli renali,
tuttavia si può ritrovare il glucosio nelle urine quando nel
plasma ce n'è un'alta concentrazione, come nel caso del
diabete mellito. Si è stabilita una soglia di riassorbimento
tubulare pari a 180 mg/dL. Quando il glucosio nel plasma
sorpassa questa soglia di riassorbimento, il glucosio passa
nelle urine.
Dosaggi ambulatoriali del glucosio
La glicemia è un dosaggio che viene determinato sempre. È
un dosaggio ambulatoriale e prevede una misurazione
spettrofotometrica. Il campione è siero o plasma. Se si vuole
usare il plasma bisogna usare come anticoagulante il fluoruro
di sodio che è anche un inibitore dell'enolasi e quindi consente
di conservare nel tempo la concentrazione di glucosio più
veritiera, perché altrimenti potrebbe continuare la via di
demolizione del glucosio e quindi si doserebbe una quantità
inferiore.
Vi sono due tipologie di dosaggi ambulatoriali per il glucosio.
Nel primo dosaggio il glucosio reagisce con ATP in presenza
di esochinasi, formando glucosio 6-P e ADP.
glucosio + ATP -esochinasi→ glucosio 6-P + ADP Nella stessa
provetta il glucosio 6-fosfato reagisce con NADP in presenza
di una glucosio 6-fosfato deidrogenasi, che lo trasforma in 6-
fosfogluconato e NADPH.
glucosio 6-P + NADP -G6P deidrogenasi→ 6-fosfogluconato +
NADPH
Per questo metodo si aggiunge ad un'aliquota di siero o plasma
in cui si vuole dosare l'analita una concentrazione saturante di
ATP, l'esochinasi, il NADP e la glucosio 6-fosfato
deidrogenasi. In questo caso la cuvetta rimane incolore perché
il NADPH è un cromoforo ma non nel visibile. Dopo aver
agitato si inserisce la cuvetta nello spettrofotometro a 340 nm.
Man mano che la reazione procede si osserva un aumento
dell'assorbimento, perché il NADPH è la molecola che
assorbe a 340 e nel tempo viene prodotto.
I risultati ottenuti si possono confrontare con numeri noti per
ottenere la concentrazione di glucosio in plasma o siero.
In un altro dosaggio ambulatoriale, sempre basato su metodo
enzimatico, il glucosio viene convertito insieme ad acqua e
ossigeno presente nell'aria in acido gluconico e perossido di
idrogeno dalla glucosio ossidasi. glucosio + H2O + O2 -glucosio
ossidasi→ acido gluconico + H2O2 L'acqua ossigenata in presenza
di un accettore di elettroni e dell'enzima perossidasi (POD)
forma acqua e un cromoforo. Questo dosaggio presuppone
quindi una misurazione spettrofotometrica. La lunghezza
d'onda alla quale si misura dipende dal tipo di accettore di
elettroni utilizzato e quindi dal cromoforo che si forma.
Alcuni accettori di elettroni sviluppano un colore blu-verde,
come l'ABTS che richiede una misurazione a 700 nm, oppure
altri che sviluppano un colore arancio scuro e richiedono una
misurazione a 492 nm. Il cromoforo è colorato quindi la
lunghezza d'onda sarà sempre nel visibile.
Dosaggi non ambulatoriali del glucosio
Vi sono anche dosaggi del glucosio non ambulatoriali per i
quali si può dosare la glicemia anche al di fuori del laboratorio
qualora non fosse sempre disponibile uno spettrofotometro. Il
dosaggio della glicemia non ambulatoriale è ideale per un
primo orientamento o per un paziente che deve eseguire
ripetutamente dei controlli in maniera costante, come nei
soggetti diabetici. Se vi è un'emergenza non si possono
aspettare i risultati di laboratorio, quindi si utilizza questo
dosaggio non ambulatoriale come primo orientamento.
In questo caso si utilizzano delle strisce reattive che si
vendono in farmacia, delle striscette di carta che nella zona
centrale ha due enzimi immobilizzati. Gli enzimi devono
essere attivi quindi le strisce devono essere conservate in
maniera adeguata, anche se gli enzimi che si utilizzano sono
dotati di una buona stabilità; una proteina stabile è una
proteina che conserva la struttura nativa. La glucosio ossidasi
e la perossidasi sono in effetti due proteine abbastanza stabili.
Bucando il dito e mettendo una gocciolina di sangue intero
sulla zona reattiva della striscia la glucosio ossidasi e la
perossidasi catalizzano le stesse reazioni viste per il dosaggio
ambulatoriale. A questo punto la striscia viene inserita in un
piccolo apparecchio che fornirà la concentrazione del
glucosio.

Molecole azotate non proteiche

Altre molecole che vengono dosate con metodo enzimatico
sono l'urea, l'acido urico e la creatina. Queste sono tre piccole
molecole che contengono l'azoto ma non sono proteiche
(NPN).

Azotemia
Il dosaggio dell'urea in plasma o siero si chiama azotemia.
L'urea è una molecola poco tossica, solubile, che attraversa
facilmente le membrane e può essere allontanata nell'urina.
L'urea in un organismo come il nostro è il risultato di una
sintesi protettiva che ci costa parecchio dal punto di vista
energetico. Il nostro organismo deve risolvere il problema
dell'eccesso dell'ammoniaca per la deamminazione degli
amminoacidi. Il gruppo amminico perso dagli amminoacidi
viene rilasciato come ione ammonio che per noi animali che
non viviamo in acqua è neurotossico. Gli animali
ammoniotelici possono allontanare l'ammoniaca tal quale
diluendola nell'acqua. Noi sintetizziamo l'urea a partire da due
gruppi NH3 che derivano dalla deamminazione degli
amminoacidi e una molecola di CO2 che deriva dal ciclo di
Krebs. La deamminazione degli amminoacidi avviene in tanti
distretti cellulari, dopodiché i gruppi amminici vengono
convogliati su due trasportatori, che sono l'alanina e l'acido
glutammico, arrivano agli epatociti che con l'utilizzo
dell'energia di 4 legami anidridici formano l'urea nel ciclo
dell'urea. Il ciclo dell'urea è una via ciclica, che avviene in
parte nel citoplasma, in parte nella matrice mitocondriale e poi
ritorna nel citoplasma. Danni epatici, quale che sia l'eziologia
di un danno, hanno sempre ripercussioni negative sul nostro
organismo.
L'urea è allontanata per la maggior parte nelle urine, in cui sarà
fisiologicamente presente in grandi quantità. I dosaggi
dell'urea per l'appunto vengono eseguiti sul plasma o siero, in
cui dev'essere presente dagli 8 ai 25 mg/dL. Il dosaggio
presuppone metodo enzimatico. L'ureasi scinde l'urea in
ammoniaca e anidride carbonica. L'ammoniaca interagisce
con NADH e α-chetoglutarato, formando glutammato e NAD,
reazione catalizzata dalla glutammato deidrogenasi. In una
miscela di reazione si mette un po' di plasma o siero nel quale
si vuole dosare l'analita, poi bisogna avere un kit che contiene
ureasi, NADH, α-chetoglutarato e glutammato deidrogenasi.
Dopo aver agitato si misura spettrofotometricamente alla
lunghezza d'onda di 340 nm. Si

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osserverà una diminuzione dell'assorbimento perché questa
volta il cromoforo a 340 nm è un substrato che nel tempo, man
mano che la glutammato deidrogenasi lo trasforma nella
forma ossidata, scompare.
L'azotemia aumenta quando vi è un danno renale. Un'alta
azotemia può anche essere portata da un'elevata carnivoria,
mentre una bassa azotemia si riscontra in un danno epatico o
in gravidanza.
Uricemia
L'uricemia è la concentrazione di acido urico nel sangue.
L'acido urico è un prodotto finale del catabolismo delle basi
puriniche, che derivano dagli acidi nucleici (adenina e
guanina). È una piccola molecola azotata non proteica come
l'urea.
Il dosaggio si effettua con l'uricasi, un enzima che rompe
l'acido urico in allantoina in presenza di acqua e ossigeno,
producendo acqua ossigenata.
acido urico + H2O + O2 -uricasi→ allantoina + H2O2 + CO2
L'acqua ossigenata si fa reagire con una perossidasi:
H2O2 + accettore di elettroni -POD→ H2O + cromoforo
La provetta quindi contiene un'aliquota di plasma o siero,
l'uricasi, l'accettore di elettroni e la perossidasi. La lunghezza
d'onda alla quale si misurerà con lo spettrofotometro dipende
ancora una volta dall'accettore di elettroni scelto e quindi dal
cromoforo sviluppato. Nel tempo si registrerà un aumento di
assorbimento.
L'iperuricemia causa la gotta, un accumulo di sali di acido
urico a livello delle articolazioni e dei tessuti. La gotta può
essere dovuta a un metabolismo alterato delle purine oppure
problemi alimentari. La gotta è sempre stata definita la
“malattia dei ricchi”, che nel passato mangiavano la carne tutti
i giorni.
Creatinina
Altro composto azotato non proteico è la creatinina. La
creatinina deriva dalla creatina per perdita spontanea di una
molecola d'acqua. La creatinina non ha nessun ruolo nel
nostro organismo. Tuttavia dosare la creatininemia in un
laboratorio di analisi è un indice di danno renale. La creatinina
viene eliminata con le urine, con la stessa logica dell'urea. Se
la creatinina e l'urea aumentano nel plasma vuol dire che c'è
un danno renale.
Nel tempo la creatinina è diventata il marcatore più affidabile
di danno renale perché la concentrazione di urea nel sangue
dipende molto dal tipo di alimentazione, mentre la creatinina
non è legata alla dieta, è soltanto proporzionale alla massa
muscolare. Ci sono delle analisi di diagnostica per immagini
(TAC, PET) che non si possono fare se prima non si ha un'idea
della creatininemia perché non si può iniettare un mezzo di
contrasto endovena se poi esso non può essere smaltito
opportunamente dai reni.
La creatina viene ottenuta attraverso l'alimentazione o
attraverso una via di biosintesi endogena a partire dagli
amminoacidi arginina, glicina e metionina. La creatina non è
un peptide, quindi questi tre amminoacidi vengono utilizzati
ma non vengono uniti l'uno all'altro da due legami peptidici.
La prima reazione di sintesi avviene nel rene, in cui arginina
e glicina vengono unite da un enzima, formando l'ornitina.
L'ornitina insieme all'acido guanidinacetico forma la creatina
con l'intervento della S-adenosilmetionina (SAM), che forni
sce la metionina, e di un secondo enzima. Questo secondo
passaggio avviene nel fegato.
La creatina viene integrata attraverso l'alimentazione con la
carne perché il 95% della creatina è immagazzinata nel
muscolo (solo una piccola percentuale nel cervello). È proprio
nel muscolo che la quantità di ATP è insufficiente per
sostenere per lungo tempo l'attività contrattile.
In sé la creatina non contiene energia, ma è la molecola base
dalla quale si forma la fosfocreatina (creatina fosfato), una
molecola di riserva energetica. Nelle cellule muscolari la
creatina che sta nello spazio intermembrana dei mitocondri
viene fosforilata creando la fosfocreatina, che ha un legame
ad alta energia. L'idrolisi di questo legame è una reazione
altamente esoergonica, in cui il prodotto è più stabile del
substrato (ΔG < 0). L'energia ricavata dall'idrolisi della
fosfocreatina nelle cellule muscolari viene utilizzata per
legare il gruppo fosfato all'ADP per creare ATP. Un uomo al
riposo pare che utilizzi 40 kg di ATP al giorno. L'ATP non
viene utilizzato solo nei muscoli, ma in tutte le cellule ad
esempio anche nei sistemi di trasporto attivo attraverso le
membrane, nelle trasduzioni dei messaggi ormonali, nelle
reazioni enzimatiche, infine può essere un attivatore o un
inibitore allosterico. Il muscolo risolve il problema della
richiesta di energia per contrazioni prolungate idrolizzando e
sintetizzando continuamente la fosfocreatina.
La creatinina non ha ruolo biologico perché è un catabolita
non attivo della creatina. Il dosaggio di creatinina si fa quando
si vuole confermare la buona funzionalità renale ad esempio
prima di un accertamento che prevede che i reni debbano
funzionare bene. Il dosaggio è complesso e richiede metodo
enzimatico.
La creatinina amìdoidrolasi converte la creatinina in creatina
con l'aggiunta di H2O. La creatina amidoidrolasi scinde la
creatina in sarcosina e urea con l'aggiunta di H2O. La sarcosina
ossidasi converte sarcosina, H2O e O2 in glicina, formaldeide
e perossido di idrogeno. Il perossido di idrogeno può a questo
punto essere dosato dalla produzione di un cromoforo dopo
aver aggiunto un accettore di elettroni e l'enzima perossidasi.
Per il dosaggio di creatinina all'aliquota di plasma o siero va
aggiunta la creatinina amidoidrolasi, la creatina
amidoidrolasi, la sarcosina ossidasi, l'accettore di elettroni e
la perossidasi. Allo spettrofotometro si legge un aumento di
assorbimento alla lunghezza d'onda che dipende dalla scelta
dell'accettore di elettroni.
L'intervallo fisiologico della creatininemia è di 0,6-1,3
mg/100 mL di plasma o siero.
Per fare una diagnosi corretta si calcola anche la clearance
della creatinina. La clearance renale di una sostanza è la
capacità del rene di ripulire il torrente circolatorio di quella
sostanza e si rappresenta come il volume di plasma che viene
depurato da quella sostanza nell'unità di tempo. La clearance
della creatinina dà un'informazione che insieme alla

creatininemia può servire ad interpretare che tipo di nefropatia
si sta verificando.
Nel corso di una nefropatia la clearance e la creatininemia
sono inversamente correlate tra di loro. Nelle fasi iniziali del
danno renale la clearance è molto sensibile, mentre la
creatininemia è poco sensibile, perché prima che si verifichi
l'aumento della creatinina oltre i valori fisiologici del plasma
ci vuole del tempo. Per contro, quando il danno renale è
avanzato la clearance diventa poco visibile e l'aumento della
creatinina nel plasma diventa il marcatore al quale ci si può
riferire.
La clearance è il volume di plasma depurato di creatinina, per
opera del rene, nell'unità di tempo. Mentre la creatininemia si
misura in mg/100 mL, la clearance ha la misura di una portata
(mL/min). Bisogna calcolare la concentrazione di creatinina
nelle urine delle 24 ore e la concentrazione di creatinina nel
plasma.
ClCr = (creatinina nelle urine x volume delle urine)/creatinina
nel plasma o siero.
Si deve tener conto dell'età perché i valori della clearance della
creatinina tendono a ridursi fisiologicamente con l'età a partire
dai 40 anni. Un settantenne ha una clearance pari al 50%
rispetto a quella di un giovane.
Lipidi
I lipidi sono altri analiti che vengono dosati in laboratorio con
metodo enzimatico. I lipidi che vengono maggiormente dosati
sono gli acidi grassi, i trigliceridi e il colesterolo.
Acidi grassi
Un acido grasso è una catena idrocarburica che presenta un
gruppo carbossilico ad un'estremità e un gruppo metilico
all'estremità opposta. Il carbonio metilico dell'estremità
terminale è anche detto carbonio omega. La maggior parte
degli acidi grassi contenenti nel nostro corpo ha numero pari
di atomi di carbonio e possono arrivare fino a 24-26 atomi di
carbonio.
Gli acidi grassi possono essere a catena corta se il numero di
atomi di carbonio della catena idrocarburica va dai 2 ai 4. Dai
6 ai 10 atomi di carbonio è a catena media. Oltre i 10 atomi di
carbonio si parla di acido grasso a catena lunga.
Un acido grasso può essere saturo, con legami tra un carbonio
e l'altro semplici, oppure insaturo, con doppi legami tra un
carbonio e l'altro. Possono essere monoinsaturi o polinsaturi a
seconda se i doppi legami sono uno o più di uno. Se l'acido
grasso è insaturo potrà esistere in due conformazioni a
seconda della posizione degli atomi di idrogeno coinvolti nel
doppio legame: configurazione trans e configurazione cis. Il
nostro organismo riesce a degradare e ad usare come fonte
energetica gli acidi grassi in cis. La presenza o meno di doppi
legami influenza molto lo stato fisico in cui si trovano gli acidi
grassi ad una determinata temperatura. Gli acidi grassi saturi
sono solidi a temperatura ambiente (grasso animale), quelli
insaturi sono liquidi a temperatura ambiente (oli vegetali). Gli
effetti che hanno sui livelli del colesterolo, sul funzionamento
del cuore e del nostro sistema immunitario fanno sì che ci si
riferisca agli acidi grassi saturi come quelli “cattivi” e agli
-
acidi grassi insaturi come quelli “buoni”. Gli acidi grassi
saturi aumentano l'accumulo di colesterolo nei vasi,
danneggiano il funzionamento del cuore e del sistema
immunitario. Grassi buoni per la nostra vita sono quelli
insaturi in cis.
A partire dagli oli vegetali, che contengono in abbondanza
acidi grassi in cis di diverso tipo, le industrie possono ottenere
grassi saturi effettuando un'idrogenazione catalitica. L'olio
vegetale diventa solido a temperatura ambiente per migliorare
la sua conservazione e il suo utilizzo. Tuttavia durante questa
procedura di idrogenazione catalitica si formano anche gli
isomeri insaturi trans, che sono dannosi. Gli isomeri insaturi
trans non sono degradabili dal nostro organismo, quindi si
accumulano nel nostro sistema vascolare provocando
aterosclerosi. L'aterosclerosi è l'ispessimento della tunica
delle arterie.
Noi non possediamo enzimi che riescono a inserire doppi
legami a livello di atomi di carbonio oltre il C9, da qui la
necessità di introdurre con la dieta degli acidi grassi che
definiamo essenziali: gli omega-3 e gli omega-6; gli omega-3
sono presenti in certi tipi di pesce e nella frutta secca, gli
omega-6 sono presenti negli oli, nella carne, ecc.
L'estremità che contiene il gruppo metilico si chiama anche
estremità omega. Gli omega-3 e gli omega-6 sono
caratterizzati dal fatto di avere il primo doppio legame al C3
e al C6 partendo il conteggio dal carbonio omega. L'acido
linoleico è il precursore degli omega-6, mentre l'acido
linolenico è il precursore degli omega-3. Il rapporto
giornaliero dovrebbe essere omega-3 : omega-6 = 1 : 4; in
realtà eccediamo molto negli omega-6 perché facciamo poco
consumo di pesce in confronto alla carne. È importante che vi
siano i giusti livelli e gli equilibri di acidi grassi per prevenire
e trattare patologie coronariche, ipertensione, diabete di tipo
2, disordini immunitari e infiammatori.
Gli acidi grassi sono fonte di energia perché subiscono
βossidazione nella matrice mitocondriale di tutti i tessuti
tranne il cervello (perché gli acidi grassi non attraversano la
barriera ematoencefalica) producendo acetil-coenzima A, che
entra nel ciclo di Krebs, consentendoci di ottenere NADH e
FADH2 che entrano nella catena respiratoria e quindi nella
fosforilazione ossidativa. Nella matrice mitocondriale la
citrato sintasi condensa l'acetil-coenzima A con l'ossalacetato
e si forma il citrato. Se l'ossalacetato è impiegato nella
gluconeogenesi e non ve n'è a sufficienza, l'eccesso di
acetilcoenzima A viene convertito in corpi chetonici. Questo
è quello che succede quando facciamo digiuno o nelle persone
diabetiche, che hanno una grande esigenza di gluconeogenesi.
Trigliceridi
Il trigliceride o triacilglicerolo è un estere del glicerolo, una
molecola di tre atomi di carbonio che presenta tre gruppi
alcolici. Ogni gruppo alcolico viene condensato ad un gruppo
carbossilico di un acido grasso in una reazione di
esterificazione catalizzata da un enzima liberando una
molecola d'acqua. Le tre catene di acidi grassi di un
trigliceride possono essere anche molto diverse tra di loro.
Attraverso la dieta noi assumiamo soprattutto trigliceridi.
Alcune esterasi (idrolasi), chiamate lipasi, idrolizzano il
25
legame esterico tra il glicerolo e l'acido grasso, liberando 3
acidi grassi da ogni trigliceride. Questo avviene sia
nell'intestino, quando bisogna idrolizzare i trigliceridi
alimentari, che nel tessuto adiposo. La lipasi intestinale
idrolizza i trigliceridi prodotti strettamente con gli alimenti
senza bisogno di alcun segnale. La lipasi del tessuto adiposo
è un enzima ormonesensibile e comincia a idrolizzare
trigliceridi solo se riceve il segnale dall'adrenalina.
L'adrenalina è un ormone che non sovrintende solo al
metabolismo del glucosio. In realtà insulina, glucagone e
adrenalina sovrintendono a tanti metabolismi.
Il residuo di glicerolo può contribuire alla sintesi di glucosio
extra.
Colesterolo
Il colesterolo è un alcol policiclico complesso costituito da 27
atomi di carbonio. Il colesterolo è una molecola aromatica,
con quattro anelli condensati, una catena laterale alchilica che
parte dal carbonio 17 e una testa polare caratterizzata da un -
OH, che può essere anche esterificato da un acido grasso. Il
colesterolo serve in quantità di circa 1 g al giorno.
Il colesterolo è essenziale per il nostro organismo:
• Un precursore del colesterolo è convertito nella forma
attiva della vitamina D.
• Il colesterolo sta nel bilayer lipidico delle nostre
membrane biologiche, fungendo da buffer (tampone) di
fluidità.
• È il precursore per la sintesi di tutti gli ormoni
steroidei, inclusi gli ormoni sessuali (androgeni ed estrogeni)
e gli ormoni delle ghiandole surrenali (cortisolo e
aldosterone).
• È il precursore dei sali biliari, che ci consentono di
digerire i grassi.
La dieta contribuisce per 1/3 al fabbisogno del colesterolo, che
si aggira intorno a 1 g. Il fabbisogno di colesterolo deriva
soprattutto dalla via biosintetica che avviene nel fegato,
dunque non è l'alimentazione la principale causa di
ipercolesterolemia. Spesso si trova ipercolesterolemia in
soggetti di età avanzata o che hanno problemi ereditari della
via biosintetica.
Il colesterolo deriva dall'acetil-coenzima A e
dall'acetoacetilcoenzima A e nella via biosintetica del
colesterolo è coinvolto un importante enzima chiamato
idrossimetilglutaril-CoA reduttasi (HMG CoA reduttasi).
Dopo reazioni di condensazione la sintesi aumenta di
complessità fino ad ottenere la molecola finale.
A questa via biosintetica va imputata la maggior parte dei
problemi di ipercolesterolemia. Se vi è un problema di
ipercolesterolemia familiare il colesterolo è alto anche se si
segue una dieta strettissima; in tal caso non si può intervenire
se non sulla via di biosintesi del colesterolo con un inibitore
dell'HMG CoA reduttasi.
Le statine, che sono i farmaci che assume chi ha eccessi di
colesterolo, sono inibitori di questo enzima. La statina
assomiglia strutturalmente molto al substrato della reduttasi,
comportandosi da inibitore competitivo. Nell'inibizione
competitiva l'inibitore ha una struttura simile al substrato
dell'enzima e si lega reversibilmente al sito attivo dell'enzima;
la velocità massima di reazione può sempre essere raggiunta
aggiungendo substrato in eccesso.
Le statine vengono vendute a differenti dosaggi, ma anche il
dosaggio massimo non è in grado di bloccare totalmente
l'enzima reduttasi. L'obiettivo è inibire l'enzima parzialmente
per avere un po' meno colesterolo in circolo. Tuttavia il
trattamento farmacologico non può essere interrotto, deve
essere continuato per tutta la vita.
Le statine hanno effetti collaterali, per cui bisogna assumere
soltanto la dose necessaria. Per l'assunzione si parte dal
dosaggio minimo efficace di 10 mg. Se la dose minima
efficace è sufficiente, non si utilizza una dose superiore. Le
statine sono anche inibitori di enzimi di altre vie metaboliche.
Un dosaggio eccessivo può portare a rabdomiolisi, ossia la
rottu ra delle cellule muscolari. Considerando che il cuore è
un muscolo, questo può avere effetti anche molto gravi sulla
salute dell'individuo.
Lipoproteine
I lipidi sono idrofobici, non possono stare in una soluzione
acquosa come il nostro sangue. I lipidi vengono trasportati nel
sangue sotto forma di lipoproteine, macromolecole formate da
un nucleo idrofobico e un intorno idrofilico. Le apoproteine
sono la parte proteica della lipoproteina e consentono al lipide
di stare in una soluzione acquosa come il sangue e consentono
il riconoscimento con i recettori.
Le principali lipoproteine sono: chilomicroni, VLDL, LDL e
HDL.
I chilomicroni sono lipoproteine giganti costituite da molti
lipidi (86% di trigliceridi) e poche proteine (2%). Se si
eseguisse un prelievo ematico dopo un pasto si vedrebbero
galleggiare sul campione ematico delle gocce di grasso, che
sono i chilomicroni. Nel nostro intestino i chilomicroni
vengono immediatamente idrolizzati e quindi scompaiono
quando il pasto è lontano.
All'opposto vi sono le HDL (High Density Lipoprotein). Esse
sono molto più dense dei chilomicroni tuttavia sono anche
molto più piccole. Le HDL sono costituite per il 50% di
proteine e per solo il 4% di trigliceridi. Le HDL sono note
comunemente come “colesterolo buono”. In questo caso
quando si parla di colesterolo buono ci si riferisce al ruolo
positivo sul metabolismo del colesterolo che hanno le
lipoproteine che lo contengono. Le HDL sono le cosiddette
lipoproteine del colesterolo buono perché il loro ruolo
biologico è quello di raccogliere l'eccesso di colesterolo e di
riportarlo al fegato.
Le LDL sono il “colesterolo cattivo” e sono lipoproteine che
distribuiscono il colesterolo nei vari tessuti. Sarebbe bene che
il rapporto HDL/LDL nel plasma pendesse quindi a favore
delle HDL.
Le VLDL sono le Very Low Density Lipoprotein.

Dosaggio di acidi grassi
Nel nostro sangue dovrebbero esserci pochi acidi grassi liberi
perché essi dovrebbero stare dentro le lipoproteine o legati ai
trigliceridi, sempre contenuti nelle lipoproteine. Gli acidi
grassi liberi, detti anche NEFA (Not Esterified Fatty Acids) o
FFA (Free Fatty Acids) devono essere presenti in
concentrazione dagli 11 ai 23 mg/100 mL.
Nel metodo enzimatico si utilizzano tre enzimi, l'ultimo dei
quali è la perossidasi, quindi ancora una volta si ha la
produzione di un cromoforo che può essere dosato
spettrofotometricamente.
Dosaggio di trigliceridi
Per il dosaggio dei trigliceridi (TG) si usa una lipasi che libera
il glicerolo e gli acidi grassi come nel nostro corpo. Il glicerolo
viene dosato con un dosaggio complesso, utilizzando ATP,
una chinasi, un'ossidasi e una perossidasi. Anche qui si ha la
produzione di un cromoforo che può essere dosato
spettrofotometricamente.
Dosaggio del colesterolo
Nel laboratorio si fanno tre tipi di dosaggi del colesterolo.
Dosare il colesterolo totale non ha senso se non si dosa quanto
colesterolo si trova nelle LDL e quanto si trova nelle HDL. A
parità di colesterolemia totale ci possono essere persone che
hanno un diverso rischio aterosclerotico. Per la
colesterolemia bisogna tener conto dell'età e del sesso. Una
colesterolemia totale di 280-300 mg/100 mL è altissima.
Tuttavia l'entità del rischio del singolo individuo è data solo
dal calcolo separato di colesterolo HDL e di colesterolo LDL.
Per questo è importante considerare il rapporto colesterolo
totale/HDL. Anche una colesterolemia totale può essere
compensata se c'è alto colesterolo HDL. Se le HDL sono
un'alta percentuale rispetto a tutte le alte lipoproteine si è quasi
al sicuro. Il rapporto dev'essere nei maschi inferiore o al
massimo uguale a 5, nelle donne inferiore o uguale a 4,5.
Se in un referto analitico si riscontra un rapporto maggiore dei
livelli consentiti bisogna ripetere il dosaggio, perché i dosaggi
dei lipidi dipendono molto dall'alimentazione, talvolta anche
di alcuni giorni precedenti all'analisi. In particolare il dosaggio
dei lipidi ha dei requisiti: • Dieta equilibrata per due
settimane.
• Astensione dalle bevande alcoliche nelle 24 ore
precedenti il prelievo.
• Sospensione di terapia con farmaci che interferiscono
con il dosaggio. Molecole che possono dare interferenza con
il dosaggio sono corticosteroidi, contraccettivi orali,
estrogeni, eparina e vitamina C.
Se ad una ripetizione dell'analisi il colesterolo è risultato alto
e le HDL non abbastanza da riportare il numero entro i valori
fisiologici, si prescrive la statina.
Dislipidemie
Le dislipidemie sono disordini della quantità di lipidi che sono immunologici si utilizzano in particolare per dosare analiti
presenti nel sangue. Una dislipidemia può essere presenti in quantità esigua nei liquidi biologici. Questo
un'alterazione di colesterolo, come anche un'alterazione di avviene per molecole come gli ormoni, le droghe o farmaci.
trigliceridi. In alcuni casi una dislipidemia può essere Queste molecole sono spesso anche molto simili tra di loro.
un'alterazione di entrambi.
-
Si ha una dislipidemia quando la dieta non è responsabile
dell'eccesso di colesterolo in circolo. Le dislipidemie possono
o essere dovute a un difetto nella sintesi o a un difetto nei
recettori per il colesterolo e sono malattie genetiche. Oltre a
cause genetiche ci possono anche essere cause secondarie ad
altre patologie, come un malfunzionamento della tiroide.
Dislipidemie primitive sono quelle che derivano da difetti
genetici mentre quelle secondarie sono causate da patologie.
Una conseguenza di un difetto negli ormoni tiroidei è la
dislipidemia. Anche gli ormoni steroidei possono interferire
nel metabolismo dei lipidi. I metabolismi sono tutti legati:
l'insulina, l'adrenalina e il glucagone sovrintendono anche al
metabolismo dei lipidi oltre che a quello del glucosio. Il
tessuto adiposo può avere sia recettori per l'adrenalina che per
il glucagone, mentre i muscoli hanno solo recettori per
l'adrenalina.
Un problema ormonale come può essere un ipotiroidismo può
dare un'ipercolesterolemia di tipo 2A (secondo la OMS) in cui
la classe di lipoproteine in eccesso sono le LDL.
Nella diagnosi di una dislipidemia non basta semplicemente
dosare il colesterolo totale, l'HDL, i trigliceridi o gli acidi
grassi. Bisogna valutare la quantità relativa delle varie
lipoproteine.
Per calcolare le quantità relative di lipoproteine bisogna prima
separarle. Un'ultracentrifugazione permette di separare le
molecole in base alla densità. In tal caso le HDL si troveranno
più in basso mentre i chilomicroni più in alto.
Alternativamente si può anche effettuare una tecnica
elettroforetica per separarle. Un campione di plasma viene
sottoposto ad elettroforesi su gel di agarosio usando un
tampone a pH basico. Il colorante più comune che si usa per
discriminare i lipidi è il Nero Sudan. In questo caso le HDL,
che nell'ultracentrifugazione erano le più dense, sono quelle a
migrare di più (banda α) perché contengono maggiore
frazione proteica, che al pH dell'elettroforesi sarà carica
negativamente in misura maggiore. Dopo le HDL vi sono le
VLDL (banda pre-β) e poi le LDL (banda β). Vi è
un'inversione rispetto all'ultracentrifugazione in cui l'ordine
per densità è: chilocromi, VLDL, LDL e HDL. I chilomicroni
si fermano per primi, perché contengono poche proteine e
quindi sono quasi per niente carichi.
Si può confrontare l'elettroforesi di un paziente con un pattern
di normalità per evidenziare un'eventuale dislipidemia. Se si
evidenzia una banda β molto più abbondante mentre è quasi
scomparsa quella delle HDL c'è una dislipidemia,
probabilmente un'ipercolesterolemia familiare.
Metodi immunologici
I metodi immunologici, basati sull'interazione antigene-
anticorpo, ci garantiscono specificità e sensibilità altissime
quando questo serve.
Un metodo molto sensibile è capace di dosare anche quantità
picomolari di un analita all'interno di un campione. I metodi
27
Gli ormoni steroidei hanno struttura molto simile, per questo
hanno bisogno di un'altissima specificità. Inoltre non esiste un
enzima specifico per dosare ogni ormone steroideo, quindi si
ricorre agli anticorpi.
L'anticorpo si produce immunizzando un coniglio contro
l'antigene e selezionando l'anticorpo monoclonale.
I metodi immunologici possono comprendere diverse
tecniche, tra cui il RIA e l'ELISA.
Marker tumorali
I marker tumorali sono dosati in laboratorio non per la
diagnosi della neoplasia, ma nel follow-up, per seguire il
decorso della malattia dopo che c'è stato già il riconoscimento,
dopo che il paziente ha subito un intervento chirurgico oppure
durante il trattamento terapeutico, che può essere la radio o la
chemioterapia.
Marcatori tumorali possono apparire nel sangue anche in
seguito ad altre patologie, quindi si avrebbero numerosi falsi
positivi se si volesse diagnosticare una neoplasia dosando i
marcatori.
I marker tumorali sono analiti che possono essere dosati con
metodo immunologico. Queste molecole vengono prodotte o
dalle cellule tumorali o dal nostro organismo in risposta
all'attacco della cellula tumorale.
Alcuni marker sono caratteristici di una neoplasia piuttosto
che di un'altra:
CEA: antigene oncofetale. Un antigene oncofetale è una
proteina che viene espressa fino all'età fetale e poi regredisce
nell'età post-natale. Il CEA è una proteina il cui gene viene
nuovamente trascritto e tradotto in caso di tumori
gastrointestinali.
PSA: marker del tumore prostatico.
CA15.3: marker del tumore della mammella. CA125:
marker del tumore ovarico.
Ormoni
Gli ormoni sono quegli analiti presenti in quantità così
piccola, e così simili tra di loro, che richiedono
obbligatoriamente il dosaggio di tipo immunologico. Gli
ormoni sono messaggeri chimici. Gli ormoni sono definiti
funzionalmente, più che strutturalmente, dal momento che
sono molecole di natura completamente diversa ma che
svolgono tutti la funzione di mediatori chimici.
Gli ormoni vengono sintetizzati e secreti da cellule
specializzate, come quelle delle ghiandole, e sono presenti in
piccola quantità nel sangue (10-5-10-9 M). L'insulina e il
glucagone sono ormoni pancreatici. T3 e T4 sono ormoni
tiroidei. Gli ormoni legano i recettori, che sono delle proteine,
nelle cellule bersaglio.
Gli ormoni, per svolgere la loro funzione, hanno bisogno di
legare una proteina, che è un recettore situato nella cellula
bersaglio. Le modalità con cui un ormone lega il proprio
recettore dipendono dalla natura chimica dell'ormone. Ogni
cellula ha un set di recettori, che sono specifici per quegli
ormoni di cui la cellula ha bisogno per controllare le sue
funzioni. Epatociti e adipociti hanno recettori per il
glucagone, mentre il muscolo non ha i recettori per il
glucagone, ma ha i recettori per l'adrenalina.
Un ormone deve poter modificare profondamente una via
metabolica per svolgere la sua funzione. Le persone che hanno
disfunzioni ormonali hanno alcune vie metaboliche
completamente stravolte dalla disfunzione. Visto che la sua
presenza o assenza determina un cambiamento di stato di
salute così importante, deve essere una molecola di cui la
sintesi e la secrezione sono controllate finemente. Il pancreas
non secerne sempre glucagone e adrenalina, ma solo sotto un
controllo.
Nel controllo della sintesi e della secrezione degli ormoni da
parte di queste cellule specializzate, talvolta organizzate in
ghiandole, gioca un ruolo fondamentale l'asse ipotalamo-
ipofisi. L'asse ipotalamo-ipofisario è una gerarchia ormonale
e collega il nostro sistema nervoso al sistema endocrino. Il
sistema nervoso centrale stimola l'ipotalamo, situato alla base
del cervello, che a sua volta controlla la secrezione da parte
dell'ipofisi anteriore, anche nota come adenoipofisi, e
dell'ipofisi posteriore, nota anche come neuroipofisi, di quegli
ormoni che andranno a stimolare i secondi bersagli.
L'insulina, il glucagone e la somatostatina sono sintetizzati e
secreti dalle cellule del pancreas.
La midollare del surrene secerne adrenalina e noradrenalina.
La tiroide sintetizza e secerne tiroxina (T4) e triiodotironina
(T3) solo se riceve il comando dall'adenoipofisi. Il comando è
portato dalla tireotropina o tireotropo, una molecola protei ca.
L'adenoipofisi secerne tireotropina solo se riceve il comando
dall'ipotalamo. Se l'ipotalamo rilascia il TRH, un fattore di
rilascio, che è un peptide, l'adenoipofisi produce tireotropina.
La tireotropina a sua volta stimola la tiroide a produrre gli
ormoni tiroidei.
La concentrazione dell'ormone in circolo è regolata da un
circolo. Se vi è molta tiroxina e T3 in circolo, la sintesi dei
messaggeri da parte dell'ipotalamo e dell'adenoipofisi viene
inibita.
Pur non potendo essere conclusivi sulla struttura ormonale, gli
ormoni possono essere divisi in lipofilici e idrofilici.
Ormoni lipofilici
Gli ormoni lipofilici hanno tutti piccole dimensioni (dai 300
agli 800 Da). Hanno un'emivita in circolo abbastanza lunga
(ore o giorni). Per emivita si intende il tempo di
dimezzamento, ossia le ore richieste a dimezzare la
concentrazione della sostanza nel sangue.
Siccome sono lipofilici devono essere veicolati nel sangue da
proteine carrier, anche se l'azione ormonale è esplicata in
forma libera. Per molti ormoni esiste la forma “bound”, legata
al suo carrier proteico, e la forma “free”, che è quella che lega
il recettore ed è responsabile della trasduzione del messaggio
ormonale. Questi ormoni in quanto lipofilici sono in grado di
attraversare le membrane cellulari, quindi il recettore di questi
ormoni si trova nel citoplasma o nel nucleo della cellula.
Gli ormoni lipofilici, dopo un certo tempo, vengono
profondamente modificati nel fegato per poter essere
eliminati. La proteina carrier viene idrolizzata e l'ormone

viene spesso coniugato con una molecola polare, come l'acido
glucuronico, per poter essere eliminato attraverso le urine.
Ormoni lipofilici sono i tiroidei e gli steroidei. T3 e T4 sono
sintetizzati e secreti dalla tiroide, mentre gli steroidei sono
sintetizzati e secreti nelle ghiandole surrenali, nell'ovaio, nella
placenta, nei testicoli e nel tessuto adiposo.
Questi ormoni, in virtù della loro natura lipofilica, incontrano
il loro recettore all'interno della cellula bersaglio. I tiroidei
incontrano il proprio recettore nel nucleo, mentre gli steroidei
nel citoplasma della cellula bersaglio. Un ormone lipofilico
non ha bisogno di un secondo messaggero.
Ormoni tiroidei
Gli ormoni tiroidei sono la T4 (tiroxina o tetraiodotironina) e
la T3 (triiodotironina). Il precursore di T3 e T4 nella tiroide è
la tirosina. Oltre alla tirosina è richiesto anche lo iodio. Il
numero di atomi di iodio che modificano le due molecole di
tirosina dà il nome alla molecola. Nella tetraiodotironina gli
atomi di iodio sono quattro, nella triiodotironina ce ne sono
tre.
Gli ormoni tiroidei accelerano il metabolismo basale,
aumentano il consumo di ossigeno, stimolano la termogenesi.
Gli ormoni tiroidei sono in grado di disaccoppiare la catena di
trasporto degli elettroni della fosforilazione ossidativa. Il
disaccoppiamento tra catena di trasporto degli elettroni e
fosforilazione ossidativa ha come risultato che non si produce
ATP, perché la fosforilazione ossidativa è spenta per assenza
di gradiente protonico tra i due lati della membrana
mitocondriale interna, mentre vi è termogenesi.
Disordini del metabolismo dei tiroidei sono gravi e devono
essere risolti farmacologicamente.
Queste molecole vengono sintetizzate nella tiroide, una
ghiandola che fa stoccaggio di questi ormoni grazie
all'abbondanza nella colloide di una proteina che si chiama
tireoglobulina, molto ricca di tirosine. La tirosina è un
amminoacido aromatico. Lo iodio entra nel nostro organismo
per via alimentare o respiratoria e viene captato dalle cellule
della tiroide, dove viene ossidato a iodio molecolare per
azione di una perossidasi. Lo iodio viene legato ai
numerosissimi residui di tirosina che si trovano nella
tireoglobulina. La tireoglobulina conserva lo iodio e produce
T3 e T4 se c'è il comando dell'ipotalamo, che rilascia il fattore
di rilascio (THR), un peptide, che raggiunge l'adenoipofisi.
L'adenoipofisi produce la tireotropina (TSH) che va alla
tiroide e stimola la produzione di T3 e T4. La TSH o tireotropo
è un dimero proteico di 28 kDa.
Il TSH induce l'attivazione di proteasi che demoliscono la
tireoglobulina, liberando MIT (monoiodotirosina) e DIT
(diiodotirosina). Dalla condensazione enzimatica di un MIT e
un DIT, e dalla condensazione enzimatica di due DIT, si
formano rispettivamente la triiodotironina e la
tetraiodotironina. La tiroide produce molto più T4 rispetto a
T3, perché T4 è la forma inattiva, che deve diventare T3 nei
tessuti, dove vi sono le desiodasi. Le desiodasi sono enzimi
che tolgono l'atomo di iodio a T4, convertendolo a T3.
Se c'è in circolo un'alta quantità di T3 e T4 si attiva il
meccanismo a feedback per il quale l'adenoipofisi interrompe
la produzione di TSH.
-
Il gozzo tiroideo è una iperplasia compensatoria, dovuta
all'ipotiroidismo. Nell'ipotiroidismo i livelli ematici di T3 e
T4 sono fisiologicamente sempre bassi.
Ormoni steroidei
Gli ormoni steroidei derivano tutti dal colesterolo, che ha 27
atomi di carbonio, ma sono tutti a un numero inferiore di 27
atomi di carbonio, perché la catena laterale tipica della
molecola del colesterolo viene accorciata.
Le cinque principali classi di ormoni steroidei sono:
1. Glucocorticoidi (21 C)
2. Mineralcorticoidi (21 C)
3. Progestinici (21 C)
4. Androgeni (19 C)
5. Estrogeni (18 C)
Glucocorticoidi e mineralcorticoidi sono tutti a 21 atomi di
carbonio e vengono sintetizzati e secreti dalla corteccia del
surrene. I glucocorticoidi vengono secreti dalla zona
fascicolata della corteccia surrenale, e il più importante è il
cortisolo, che è la forma attiva del cortisone. Disturbi nel
livello dei glucocorticoidi portano a problemi di produzione
del glucosio.
I mineralcorticoidi sono secreti dalla zona glomerulare della
corteccia surrenale. Il più importante è l'aldosterone, l'ormone
che regola l'uptake del sodio. Disturbi a livello dei
mineralcorticoidi si possono facilmente rilevare perché vi
sono problemi di urine. I mineralcorticoidi, regolando l'uptake
del sodio, regolano anche la pressione sanguigna. Chi ha
problemi di ipertensione deve ridurre i propri introiti di sodio.
Il sodio è presente abbondantemente in tutti gli alimenti che
consumiamo.
Glucocorticoidi e mineralcorticoidi derivano dai progestinici
per modificazioni della molecola.
I principali androgeni sono il testosterone e l'androsterone.
I principali estrogeni sono il progesterone e l'estrone.
Gli ormoni steroidei sono tutti molto simili tra loro, per cui è
necessario un metodo immunologico per effettuare un
dosaggio.
Ormoni idrofilici
Gli ormoni idrofilici non hanno bisogno di carrier per essere
presenti in circolo nel sangue. Tutti gli ormoni proteici e i
peptidi sono ormoni idrofilici. Oltre agli ormoni proteici e agli
ormoni peptidici, sono ormoni idrofilici anche le
catecolamine, che comprendono adrenalina e noradrenalina.
Gli ormoni idrofilici sono sintetizzati da:
• Pancreas (insulina e glucagone)
• Placenta (gonadotropina corionica)
• Adenoipofisi e neuroipofisi
• Ipotalamo
• Midollare del surrene (adrenalina e noradrenalina)
L'insulina e il glucagone sono grossi peptidi, quindi sono
ormoni idrofilici. Un ormone come l'insulina e il glucagone
incontra il suo recettore sulla membrana, perché a differenza
degli ormoni lipofilici, gli ormoni idrofilici sono incapaci di
29
 attraversare il bilayer lipidico. Il loro recettore è una
proteina integrale di membrana, nella quale può essere
distinta una parte interna e esterna la molecola.
Gli ormoni idrofilici sono di dimensioni medio-grandi. I più
piccoli sono le catecolamine, che pesano non più di 200 Da.
Gli ormoni idrofilici più grandi comprendono proteine
giganti, come la gonadotropina corionica. Gli ormoni
idrofilici incontrano il proprio recettore sulla membrana della
cellula bersaglio. Per esplicare la propria funzione, esiste un
secondo messaggero.
Alcuni ormoni proteici, come l'insulina e il glucagone, gli
ormoni secreti dall'ipotalamo e quelli secreti dall'ipofisi, sono
sintetizzati come zimogeni, cioè dei precursori inattivi di
dimensioni maggiori rispetto a quelle dell'ormone maturo. Gli
zimogeni maturano con la rimozione di una parte della
molecola mediante un taglio proteolitico. A differenza degli
ormoni lipofilici, questi ormoni hanno un'emivita breve
perché vengono rapidamente degradati dalle proteasi.
L'inattivazione fa parte della regolazione dell'attività di questi
ormoni. Subito dopo che è esplicata l'attività, gli ormoni
idrofilici devono essere degradati.

Trasduzione del messaggio ormonale

Ogni ormone incontra il proprio recettore con modalità che
dipendono dalla natura chimica dell'ormone. Il recettore è
sempre una proteina. Se l'ormone è lipofilico il legame tra
ormone e recettore avviene all'interno della cellula, se
l'ormone è idrofilico il legame avviene sulla membrana della
cellula bersaglio. Con l'incontro tra il recettore e l'ormone
inizia la trasduzione del messaggio ormonale.
Ogni volta che un ormone incontra il suo recettore, il recettore
subisce un cambio conformazionale. Le molecole
proteiche possono relazionarsi tra loro mediante cambi
conformazionali: la modifica di una proteina può renderla più
affine per una molecola piuttosto che ad un'altra.
Un messaggio ormonale si concretizza o in un controllo
dell'espressione genica a livello della trascrizione, o nella
regolazione dell'attività di alcuni degli enzimi chiave di vie
metaboliche attraverso fosforilazioni o defosforilazioni. Questi
enzimi sono i punti di controllo delle vie metaboliche. L'ormone
non è un enzima, quindi non può fosforilare o defosforilare una
proteina, ma può mediare la fosforilazione o la defosforilazione
mediante l'attivazione di specifici enzimi.
La regolazione della trascrizione è una risposta lenta al messaggio
ormonale. Richiede che si mettano in moto tutti i meccanismi che
presiedono alla trascrizione e alla traduzione di un gene. La
modificazione di proteine è una risposta più veloce.
Vi sono ormoni che effettuano la propria attività di regolazione in
entrambi i modi. L'insulina e il glucagone esplicano il loro potente
effetto sulla regolazione del metabolismo del glucosio e dei lipidi
sia controllando l'espressione genica a livello della trascrizione, sia
regolando l'attività di enzimi importanti di quelle vie metaboliche
mediante la fosforilazione e la defosforilazione.
Il controllo dell'espressione genica è la modalità con cui esplicano
la loro funzione tutti gli ormoni lipofilici. Gli steroidei incontrano
il proprio recettore nel citoplasma, mentre i tiroidei incontrano il
proprio recettore nel nucleo. In entrambi i casi, il complesso
ormone-recettore entra nel nucleo, dove interagisce con delle
sequenze nucleotidiche specifiche che controllano gli enhancer
della trascrizione.
Anche gli ormoni idrofilici possono modificare la trascrizione
genica. Per fare ciò hanno bisogno di secondi messaggeri perché
non entrano nella cellula.
Molti ormoni possono esplicare la propria funzione direttamente
sugli enzimi che controllano le vie metaboliche mediando la
fosforilazione o la defosforilazione di quegli enzimi. Ormoni che
fanno questo sono glucagone e adrenalina da un lato, e insulina
dall'altro lato. Questi ormoni mediano rispettivamente la
fosforilazione e la defosforilazione di importanti enzimi del
metabolismo del glucosio e dei lipidi.
Glucagone, insulina e adrenalina
Il glucagone è un peptide di 3 kDa prodotto dalle cellule α delle
isole del Langerhans pancreatiche. Questo ormone ha come organo
bersaglio principale il fegato.
Il suo antagonista è l'insulina, formata da due catene polipeptidiche.
È quindi un peptide con una struttura quaternaria. L'insulina viene
prodotta dalle cellule β delle isole del Langerhans. I principali
organi bersaglio sono il fegato e il tessuto adiposo.
L'adrenalina o epinefrina (183 Da), che condivide con il glucagone
la modalità di trasduzione del messaggio ormonale, è una
catecolamina. Anche le catecolamine, come gli ormoni tiroidei,
derivano dalla tirosina. L'adrenalina viene secreta nella midollare
del surrene in risposta a uno stimolo del sistema nervoso centrale.
Il nostro corpo produce adrenalina sotto stress, per via di
un'emozione o anche per sforzo fisico. L'adrenalina modifica le
nostre vie metaboliche in maniera tale che avremo più glucosio
disponibile. Alcune delle vie metaboliche attivate dall'adrenalina
sono la glicogenolisi e la neoglucogenesi. Degradare il polimero
ramificato glicogeno mette a nostra disposizione glucosio. Una via
che l'adrenalina spegne è ad esempio la glicogenosintesi.
Adrenalina e glucagone differiscono per organo bersaglio ma
svolgono la stessa funzione.
Una fosforilazione e una defosforilazione sono modifiche covalenti
reversibili di un enzima. Fosforilare o defosforilare un enzima
dietro comando di un ormone significa regolare la sua attività.
Glucagone e adrenalina attivano una protein chinasi. La chinasi
utilizza l'energia che deriva dall'idrolisi di un legame anidridico in
γ o in β di un ATP, e utilizza anche il gruppo fosfato che si libera,
per fosforilare determinati residui amminoacidici di un enzima.
Soltanto i residui che terminano con un ossidrile possono essere
fosforilati (serina, treonina, tirosina). La defosforilazione è operata
da una fosfatasi, attivata dall'insulina. La fosfatasi, essendo
un'idrolasi, rimuove un gruppo fosfato addizionato
precedentemente da una chinasi, utilizzando l'acqua come reagente
nella reazione di idrolisi. Con la rimozione del gruppo fosfato si
ritorna alla situazione dell'enzima defosforilato.
Una fosforilazione sul residuo giusto di un enzima può indurre
nell'enzima un cambio conformazionale. Il gruppo fosfato porta
due cariche negative, che possono fare legami idrogeno con altri
residui amminoacidici lontani nella catena. La formazione di questi
nuovi legami idrogeno può forzare un cambio conformazionale che
porta l'enzima ad essere più affine o meno affine al suo substrato.
Regolazione delle vie metaboliche
Generalmente c'è complementarietà nella regolazione di vie
metaboliche opposte. La fosforilazione, comandata da glucagone e
adrenalina, rende meno attiva la glicogeno sintasi, ma attiva molto
la glicogeno fosforilasi, per cui questi ormoni sono detti
iperglicemizzanti. La glicogeno fosforilasi è l'enzima chiave della
glicogenolisi.
L'insulina è l'enzima ipoglicemizzante, il cui difetto causa il
diabete, che mediando delle defosforilazioni, attiva la glicogeno
sintasi e inattiva la glicogeno fosforilasi. Alcune vie metaboliche,
come il ciclo di Krebs e la β-ossidazione degli acidi grassi,
avvengono nella matrice mitocondriale. Altre vie, come la glicolisi,
avvengono nel citosol.
La fosforilazione mediata dal glucagone della piruvato chinasi
(tappa 10 della glicolisi) la inattiva, mentre la defosforilazione
mediata dall'insulina la attiva. La piruvato chinasi è un enzima
allosterico inibito dall'ATP.
L'acetil-CoA carbossilasi e la citrato liasi, che funzionano nella
sintesi degli acidi grassi, sono inattivate dalla fosforilazione e
attivate dalla defosforilazione.
La piruvato deidrogenasi sintetizza l'acetil-CoA a partire dal
piruvato. La piruvato deidrogenasi non fa parte di nessuna via
metabolica, ma è un enzima nodale. L'acetil-CoA è il prosieguo
della glicolisi, perché il piruvato dal citoplasma passa nel
mitocondrio e la piruvato deidrogenasi lo trasforma in acetil-CoA,
che entrerà nel ciclo di Krebs. L'acetil-CoA è anche un'importante
molecola nel metabolismo degli acidi grassi, perché l'acetil-CoA è
il substrato per la sintesi degli acidi grassi. La piruvato
deidrogenasi è un enzima che viene controllato profondamente
dagli ormoni, oltre alla sua regolazione allosterica. La piruvato
deidrogenasi è inibita dall'ATP e dall'acetil-CoA.
31
La glucosio 6-fosfato deidrogenasi è l'enzima che catalizza la tappa
1 della via del pentoso fosfato.
La lipasi ormone-sensibile idrolizza i trigliceridi, liberando gli acidi
grassi, che possono essere degradati. La lipasi viene attivata dalla
fosforilazione e inattivata dalla defosforilazione.
La coordinazione tra le vie metaboliche, che porta al fatto che vie
contrapposte non avvengano mai in contemporanea, è dovuta alla
regolazione ormonale.
Oltre a indurre la fosforilazione e la defosforilazione, il glucagone
e l'insulina regolano anche la trascrizione di geni che codificano
per alcuni enzimi di queste vie metaboliche. Il glucagone induce la
trascrizione degli enzimi chiave delle vie che mantengono alti i
livelli di glucosio nel circolo, mentre reprime la trascrizione degli
enzimi che sottraggono il glucosio dal circolo.
Trasduzione del messaggio del glucagone
La trasduzione del messaggio ormonale del glucagone è un ottimo
esempio di come un ormone idrofilico esercita la propria funzione.
Il glucagone non entra nelle cellule, ma deve incontrare il suo
recettore sulla membrana plasmatica. La cellula bersaglio è
l'epatocita, sulla quale è presente il recettore del glucagone, una
proteina integrale di membrana. Il recettore, dopo aver legato il
glucagone, cambia conformazione. Il cambio conformazionale
subito dalla proteina recettore si concretizza in una diversa affinità
del recettore stesso per la proteina Gs. La proteina Gs è un trimero
formato dalle tre subunità α, β e γ. Dopo il legame recettore-
proteina Gs, la subunità α diventa più affine ad un'altra proteina,
l'adenilato ciclasi, e si stacca dalla proteina Gs. La subunità α attiva
l'adenilato ciclasi, che è inattiva senza il contatto della subunità α.
L'adenilato ciclasi è in grado di trasformare l'ATP in AMP ciclico,
che è il secondo messaggero del glucagone. L'adenilato ciclasi resta
attiva fintanto ha la subunità α legata a sé. La subunità α è una
GTPasi lenta e resta legata all'adenilato ciclasi fin quando non ha
terminato l'idrolisi di GTP a GDP. Quando la subunità α ha
idrolizzato il GTP, si stacca dall'adenilato ciclasi e torna alla
proteina Gs.
L'AMP ciclico, prodotto dall'adenilato ciclasi, è un regolatore
allosterico di una proteina chinasi A (PKA), un enzima allosterico
formato da più subunità, che contiene oltre ai siti catalitici, anche i
siti allosterici, ai quali non si lega il substrato, ma si legano
attivatori e inibitori. Per ogni sito allosterico si legano due AMP
ciclici.
Gli enzimi allosterici esistono in due conformazioni allosteriche, la
T e la R, che hanno una diversa affinità per il substrato. La
conformazione T è la meno affine, mentre la R è la più affine. La
conformazione R ha una Km minore rispetto alla conformazione T.
Questo equilibrio T-R è controllato dalle concentrazioni di
substrato e da altri fattori. Il legame dell'attivatore allosterico
induce questo cambio conformazionale.
Il cambio conformazionale nella PKA si traduce nel distacco delle
subunità regolatorie e nell'esposizione dei siti catalitici, che erano
nascosti dalle subunità regolatorie. Questa è la conformazione
attiva della PKA.
La PKA idrolizza ATP per ricavare energia e il gruppo fosfato che
utilizza per fosforilare diversi substrati, attivandoli o inattivandoli.
La fosforilazione della glicogeno fosforilasi attiva questo enzima,
perché evidentemente la fosforilazione della glicogeno fosforilasi
32
induce un cambio conformazionale tale che l'enzima diventa più
affine al glicogeno. La stessa fosforilazione spegne la glicogeno
sintasi, perché la nuova conformazione è meno affine al substrato
dell'enzima.
L'insulina, a parte attivare la fosfatasi, che defosforila gli enzimi,
attiva una fosfodiesterasi che trasforma l'AMP ciclico in AMP,
spegnendo l'attivazione della PKA. Alcaloidi, come la caffeina, la
teofillina e la teobromina, sono molecole che inibiscono la
fosfodiesterasi e quindi fanno durare più a lungo gli effetti
dell'AMP ciclico.
Adrenalina nel tessuto adiposo
L'adrenalina, che ha come principale organo bersaglio il tessuto
adiposo, mobilita i trigliceridi nel tessuto adiposo.
I trigliceridi si trovano nelle gocce lipidiche presenti negli
adipociti. L'adrenalina è idrofilica, quindi agisce su un recettore di
membrana inviando un messaggio, che ha come risultato la
mobilitazione dei trigliceridi, la loro fuoriuscita e la loro idrolisi in
acidi grassi e glicerolo. Gli acidi grassi vanno nel flusso sanguigno
e raggiungono le cellule, dove avviene la β-ossidazione.
In condizioni basali la perilipina circonda la superficie delle gocce
lipidiche degli adipociti e ne favorisce la conservazione. Se c'è uno
stimolo, la proteina chinasi A fosforila la lipasi ormone-sensibile e
la perilipina. La lipasi ormone-sensibile è un'esterasi che taglia il
trigliceride in glicerolo e acidi grassi quando viene fosforilata. La
perilipina, una volta fosforilata, consente l'apertura della goccia
lipidica.
Il meccanismo di trasduzione del messaggio dell'adrenalina è
analogo a quello del glucagone e coinvolge il cAMP che si forma
sempre grazie all'adenilato ciclasi attivata dalla subunità α che si è
liberata dalla proteina Gs, che a sua volta è stata stimolata dal
recettore che aveva legato l'ormone.
Dosaggi ormonali
Per diagnosticare la funzionalità di una ghiandola, il modo migliore
è il dosaggio ormonale.
Alcuni ormoni hanno una secrezione ormonale pulsatile, quindi
hanno un ritmo circadiano. È importante conoscere il momento del
giorno in cui si effettua il dosaggio perché questi ormoni hanno
diversi livelli fisiologici a diversi momenti della giornata.
La sintesi di molti ormoni è influenzata da fattori non sempre
controllabili (ad es. l'ansia o lo stress). Il cortisolo è l'ormone dello
stress. Essendo un glucocorticoide, esso potenzia la glucogenesi.
A volte, l'aumento repentino di glicemia, può essere quindi dovuto
allo stress.
I dosaggi ormonali possono essere eseguiti su plasma e urine,
tenendo conto che nelle urine vengono dosati i prodotti terminali
del metabolismo dell'ormone. L'ormone viene spesso modificato
per poter attraversare il filtro renale ed essere espulso nelle urine.
Degli ormoni steroidei, nelle urine vengono dosati gli esteri.
Spesso, essendo i livelli ormonali bassi, nonostante il metodo
immunologico sia molto sensibile, non consentono di discriminare
una situazione fisiologica da una situazione patologica. Livelli
ormonali incerti sono anche detti borderline. Quando questo
succede, si esegue un test dinamico, cioè si somministra al paziente
un'altra molecola, che può essere un farmaco o un altro ormone,
che stimola o inibisce la secrezione dell'ormone di cui si vuole
effettuare il dosaggio. In seguito si può confrontare l'analisi con un
profilo di normalità per evidenziare una patologia o meno.
Se ad un dosaggio di insulinemia è risultato un valore basso di
insulina, esso può essere dovuto sia a fluttuazioni fisiologiche della
quantità in circolo dell'ormone, sia al diabete. A questo punto si
somministra un farmaco che stimola il pancreas a produrre insulina.
Se non vi è risposta, c'è la patologia.
RIA
La RIA (Radio Immuno Assay) è il metodo immunologico che
viene eseguito solo nei laboratori che possiedono i dispositivi
opportuni, per dosare analiti che non sono anticorpi. L'analita è
l'antigene dell'anticorpo utilizzato nel RIA.
Nel kit diagnostico utilizzato per eseguire un RIA ci sono dei tubi
rivestiti con un numero limitato di anticorpi specifici per l'antigene,
che è l'analita da dosare. Nel kit vi sono soluzioni a concentrazione
nota di antigene freddo (Ag) e antigene marcato radioattivamente
(Ag*). Questo dosaggio si esegue costruendo una retta di taratura,
incubando quantità note di antigene freddo e quantità fissa di
antigene marcato. La retta di taratura esprime la radioattività in
funzione della quantità di antigene freddo utilizzata. Il tempo e la
temperatura dipendono dal kit utilizzato. Il tempo serve agli
antigeni, che siano marcati o freddi, di andare a legarsi al loro
anticorpo adeso alle pareti della provetta. Dopo il tempo giusto,
vengono allontanati con un lavaggio tutti gli antigeni liberi, che
siano marcati o freddi. Dopo il lavaggio si esegue un conteggio
della radioattività che rispecchia quanti antigeni marcati si sono
legati agli anticorpi. Il numero degli antigeni marcati legati agli
anticorpi dipende dalla concentrazione con cui gli antigeni marcati
sono presenti in soluzione rispetto agli antigeni liberi.
Il RIA è un saggio a competizione. Antigeni freddi e antigeni
marcati competono tra di loro per il legame all'anticorpo. Entrambi
hanno la stessa affinità per l'anticorpo. La competizione viene vinta
da quello presente in maggiore quantità. La radioattività sarà
funzione inversa della quantità di antigene freddo, perché antigene
freddo e marcato competono con la stessa affinità per un numero
limitato di anticorpi immobilizzati. Questo è il motivo per cui la
retta di taratura ha una pendenza negativa, perché se la quantità di
antigene freddo è bassa, a vincere la competizione è l'antigene
marcato. Man mano che la quantità di antigene freddo aumenta, la
radioattività è più bassa.
Tutti i dosaggi che si basano sulla competizione hanno una
rappresentazione grafica che è una retta a pendenza negativa. Dopo
aver costruito la retta di taratura, si può dosare l'analita incognito
nelle stesse condizioni. Dal dosaggio si ottiene un valore di
radioattività. Intercettando la taratura, si può per estrapolazione
calcolare la concentrazione incognita.
La marcatura radioattiva si può ottenere o sostituendo un isotopo
stabile con uno radioattivo, o aggiungendo un isotopo radioattivo.
La marcatura si effettua nelle industrie che producono i kit, nel
laboratorio si effettua solo il dosaggio.
Nei RIA, molto utilizzato è lo iodio 125, un γ emettitore. Con lo 125I
sono marcati soprattutto proteine e ormoni tiroidei, perché può
essere legato dall'industria facilmente alle istidine o alle tirosine.
Spesso si utilizza anche il trizio, l'isotopo pesante dell'idrogeno. Il
trizio emette radiazioni in β, sicuramente meno invasive di quelle
in γ, e viene utilizzato soprattutto per marcare steroidi e farmaci.
Il RIA possiede una grande sensibilità. Tuttavia è radioattivo,
quindi presenta tossicità per l'ambiente e pericolosità per
l'operatore. Il costo dei kit è molto elevato, nonché anche
l'apparecchiatura per il conteggio di radioattività, ad esempio il γ
counter, non è presente in tutti i laboratori per il costo elevato.
ELISA
L'ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) è un saggio non
radioattivo basato su un enzima. L'ELISA può essere utilizzato per
dosare sia antigeni che anticorpi. Nell'ELISA, un enzima è
coniugato all'antigene o all'anticorpo che si vuole dosare. Ogni
volta che si vuole verificare la produzione degli anticorpi contro un
antigene virale si effettua un ELISA.
Il fatto che un enzima debba essere legato covalentemente
all'antigene o all'anticorpo non deve interferire né con la capacità
dell'enzima di catalizzare la reazione, né con la formazione del
complesso antigene-anticorpo.
Gli enzimi che si utilizzano per l'ELISA sono enzimi con una buona
stabilità, un elevato numero di turnover, che catalizzano la
trasformazione di parecchie molecole di substrato nell'unità di
tempo, e che generano un prodotto colorato. Gli enzimi più
utilizzati sono fosfatasi alcalina, perossidasi e βgalattosidasi.
L'ELISA non comporta rischi per l'operatore e non ha tossicità per
l'ambiente perché è un metodo non radioattivo.
In un kit di ELISA ci sono delle micropiastre con dei pozzetti
(multiwell) rivestite con l'antigene o con l'anticorpo. Se si deve
dosare un antigene il pozzetto è rivestito con l'anticorpo, se si deve
dosare un anticorpo il pozzetto è rivestito con l'antigene. Il kit è
fornito di standard di antigeni o anticorpi liberi e coniugati con
l'enzima, a seconda di cosa bisogna fare. Anche in questo caso
bisogna costruire una retta di taratura. Sottoponendo il campione
incognito alle stesse condizioni sperimentali, si può ricavare la sua
concentrazione.
L'ELISA può essere eseguito in tre modalità diverse. Se l'analita da
dosare è l'antigene, si possono usare l'ELISA competitivo o
l'ELISA del doppio anticorpo o “sandwich”. Nell'ELISA esiste un
caso in cui l'attività enzimatica e la quantità di antigene da dosare
sono inversamente proporzionali, e due casi in cui l'attività
enzimatica e la quantità di antigene sono direttamente
proporzionali.
L'ELISA competitivo ha l'anticorpo legato alla fase solida, quindi
viene utilizzato per dosare l'antigene. L'ELISA competitivo è
speculare al RIA perché l'attività enzimatica dosata e la quantità di
antigene sono inversamente proporzionali. La retta di taratura di un
ELISA competitivo ha una pendenza negativa. Nella retta di
taratura dell'ELISA, sull'asse delle ordinate si mette l'attività
enzimatica in funzione della concentrazione dell'antigene.
Nell'ELISA a doppio anticorpo si utilizzano due anticorpi. Il primo
anticorpo è immobilizzato sul pozzetto e si lega all'antigene. Anche
il secondo anticorpo, coniugato all'enzima, si lega all'antigene.
Perché questo avvenga, è importante che gli anticorpi riconoscano
due epitopi diversi dell'antigene. Se gli anticorpi fossero uguali,
dopo che il primo anticorpo è stato legato all'antigene, il secondo
non avrebbe posto. In questo caso non è importante che il primo
33
anticorpo sia in quantità limitante, perché la base del metodo non è
la competizione. In questo caso il grafico è una retta a pendenza
positiva, e l'attività enzimatica e la quantità di antigene sono
direttamente proporzionali, perché non vi è competizione.
Se l'analita è un anticorpo, si effettua un ELISA indiretto. Il
pozzetto è ricoperto di antigene. L'anticorpo presente nel campione
si lega all'antigene e si aggiunge l'anticorpo legato all'enzima, che
si legherà all'anticorpo del campione. A questo punto si aggiunge
il substrato dell'enzima si effettua il dosaggio colorimetrico.
L'attività enzimatica è proporzionale a quella dell'anticorpo.
Immunoprecipitazione
L'immunoprecipitazione è un evento che succede non sempre e non
in tutte le condizioni. La reazione tra un anticorpo policlonale e un
antigene, che dev'essere una macromolecola, di solito una proteina,
può produrre un precipitato insolubile nella zona di equivalenza.
La zona di equivalenza è la zona in cui antigene e anticorpo si
equivalgono.
L'antigene dev'essere una proteina. Se l'antigene è una piccola
molecola, non si forma un aggregato molecolare che precipita.
Se i rapporti stechiometrici tra l'antigene e l'anticorpo non sono
ottimali la precipitazione non avviene. Sul grafico, la zona in cui
avviene la formazione di immunoprecipitato è la zona di
equivalenza.
Il fatto che antigene e anticorpo possono dare un
immunoprecipitato, può essere sfruttato per fare dei dosaggi.
Questo dosaggio non è diffuso quanto il RIA e l'ELISA perché non
si può applicare sempre. Esso non può essere utilizzato ad esempio
per farmaci o ormoni non proteici.
Alcune proteine possono essere dosate sfruttando questa
precipitazione con una lettura turbidimetrica allo spettrofotometro.
Un precipitato è presente in aggregati che opacizzano in qualche
modo la soluzione acquosa. Leggendo a 400 nm (fine dell'UV, non
ancora nel visibile), l'assorbimento è proporzionale alla quantità di
aggregati in soluzione.
L'immunoprecipitazione può anche essere fatta avvenire in gel di
agarosio. Alta precipitazione significa poca solubilità. Se la
precipitazione si fa avvenire in gel di agarosio, si può ottenere una
quantitativa. L'immunoprecipitazione in gel di agarosio può
avvenire per immunodiffusione radiale semplice e immuno
elettrodiffusione. In entrambi i casi la precipitazione avviene in un
gel di agarosio. Le due specie si incontrano nella zona di
equivalenza e danno un precipitato. Con un colorante, come il
Coomassie, che è il colorante tipico delle proteine, si può colorare
di blu il precipitato. Maggiore è la colorazione, minore è la quantità
di precipitato. Nell'immuno elettrodiffusione viene effettuata una
corsa elettroforetica. Anche in questo caso ci sono restrizioni
nell'applicazione di queste metodiche.
Anticorpi
Un aptene è una molecola che può legare un anticorpo senza
scatenare una reazione immunogenica. Apteni sono gli acidi
nic gonadotropin), una proteina dimerica. La subunità β è
specifica dell'HCG, la subunità α invece è simile a quella di
tante altre tropine ipofisarie. Se non ci fosse un anticorpo
monoclonale specifico contro la subunità β il test non avrebbe
alcuna specificità, perché l'anticorpo policlonale riconosce
34
nucleici e i lipidi. L'aptene non scatena risposta immunitaria perché
è una molecola di dimensioni troppo piccole o con una poca
complessità chimica. Per dosare un aptene, bisogna prima renderlo
immunogenico, coniugandolo a un carrier proteico. Una volta che
viene reso immunogenico, viene iniettato nell'animale che produrrà
gli anticorpi. Gli anticorpi che vengono utilizzati nelle varie
tecniche immunologiche sono le IgG. Le IgG possono essere
policlonali o monoclonali.
Un anticorpo policlonale è una miscela di IgG geneticamente
diverse, prodotte da plasmacellule diverse e che riconoscono
diversi epitopi di uno stesso antigene. Talvolta, in alcuni dosaggi è
importantissimo avere un anticorpo monoclonale (mAb), che
riconosce un solo determinante antigenico. Questa importante
caratteristica rende gli anticorpi monoclonali uno strumento
efficace in diagnostica.
Anticorpi monoclonali, in virtù della loro estrema specificità, sono
utilizzati anche nella terapia di rigetto dei trapianti, tumori
(soprattutto quello al seno), linfomi, leucemie, ecc.
Per l'insulina si può anche utilizzare un anticorpo policlonale. Per
produrre un anticorpo contro l'insulina si può immunizzare un
coniglio iniettando l'insulina. L'immunizzazione generalmente
viene effettuata in presenza di un adiuvante, cioè qualcosa che
induce la risposta infiammatoria. Di solito l'insulina viene iniettata
in presenza dell'adiuvante di Freund, una miscela di acqua ed oli
minerali. Gli oli minerali non sono metabolizzabili e aiutano a
scatenare la risposta infiammatoria. L'adiuvante di Freund è un
adiuvante incompleto. L'insulina può anche essere iniettata insieme
a M. tuberculosis inattivato, che è l'adiuvante completo, con cui c'è
una buona induzione della risposta infiammatoria locale.
Nei giorni successivi il coniglio produce gli anticorpi. Dopo 14
giorni si fa un richiamo senza adiuvante per stimolare ulteriormente
la produzione di anticorpi.
Dopo 14 giorni si effettua il salasso, ossia il prelievo del sangue.
Dal sangue si ottiene il siero, che contiene gli anticorpi contro
l'insulina. Per isolare e purificare gli anticorpi da tutte le altre
molecole proteiche e non che stanno nel siero, si applica una
cromatografia per affinità. La cromatografia per affinità ha come
ligando la proteina A dello stafilococco, che ha una forte affinità
per la regione Fc dell'IgG. Per separare la proteina A dalla regione
Fc si eluisce con un tampone acido, perché a pH basso l'affinità tra
questi due elementi si riduce.
L'eluato della cromatografia viene sottoposto a una seconda
cromatografia per affinità, in cui il ligando è proprio l'antigene di
nostro interesse, cioè l'insulina.
Con la prima cromatografia si isolano tutte le IgG. Con la seconda
si purificano tra tutte solo quelle specifiche per l'antigene
d'interesse.
Il test di gravidanza non si può eseguire se non con l'uso di un
anticorpo monoclonale. L'ormone coinvolto nel test di gravidanza
è la gonadotropina corionica (HCG, human corio-
tanti epitopi presenti su tutte le altre tropine ipofisarie e i
fattori di rilascio ipotalamici.
Nel 1984 Milstein e Kohler vincono il Nobel per la Medicina
dopo aver messo a punto un protocollo sperimentale per
produrre gli anticorpi monoclonali.
Per produrre anticorpi monoclonali bisogna mantenere in
coltura in vitro un clone di linfociti B. I linfociti B tendono a
morire per apoptosi, quindi non possono essere considerate
fonti a lungo termine per la produzione di anticorpi. Per
rendere immortali i linfociti B si possono fondere con una
cellula tumorale.
Un topo viene immunizzato con lo stesso protocollo delle
cellule policlonali. Dalla milza viene isolato un linfocita B che
viene fatto fondere con delle cellule di mieloma murino in
presenza di PEG (poli etilen glicol). Le cellule di mieloma
portano l'immortalità, perché non sono sottoposte ad apoptosi.
Inoltre, non producono anticorpi, e sono deficienti di un
enzima coinvolto nella sintesi delle purine e delle pirimidine
(HPRT).
Dopo la fusione, bisogna selezionare le cellule che si sono
fuse, dette ibridomi, che hanno materiale genetico sia delle
cellule B della milza, sia del mieloma. Per selezionare gli
ibridomi si utilizza un terreno selettivo che contiene
l'ipoxantina, l'aminoptirina e la timidina (HAT).
L'aminoptirina è un inibitore dell'idrofolato reduttasi e
impedisce che la cellula riesca a sintetizzare purine e
pirimidine, quindi sopravvivono quelle cellule che utilizzano
l'ipoxantina e la timidina in una via di recupero, che coinvolge
l'enzima HPRT. Questo enzima non c'è nelle cellule di
mieloma, quindi sopravviveranno a questa selezione solo gli
ibridi, che hanno l'enzima che viene dalle cellule B e che
hanno l'immortalità delle cellule tumorali.

Diagnosi in laboratorio
• Diagnosi di ipotiroidismo primario o secondario;
• Diagnosi e monitoraggio della gravidanza;

35
• Diagnosi di un danno cardiaco. Una sofferenza cardiaca
(infarto, angina pectoris) si può diagnosticare attraverso la
ricerca di marker di danno cardiaco. L'elettrocardiogramma
è un'indagine strumentale, mentre il dosaggio dei marker è
una diagnosi biochimica clinica.
• Diagnosi dell'infiammazione. Gli analiti da dosare sono i
marker dell'infiammazione.
• Dosaggio dell'emoglobina totale e diagnosi della prenatale
dell'anemia falciforme; • Diagnosi di stress ossidativo;
• Diagnosi del diabete mellito. Responsabile del diabete
mellito è il deficit di insulina.
Marcatore
I marcatori sono molecole che danno delle indicazioni sullo
stato di salute.
La creatinina è un marcatore di funzionalità renale. Livelli
elevati di creatinina nel plasma segnalano che il nostro
apparato renale non sta filtrando bene.
L'LDH è presente in cinque forme isoenzimatiche. L'LDH1 è
l'isoenzima presente abbondante nel muscolo cardiaco. Esso è
un marcatore di funzionalità cardiaca. Dopo una lisi, le cellule
riversano nel torrente circolatorio il proprio contenuto, incluso
il corredo enzimatico. Se in circolo c'è una grande quantità di
LDH1, vuol dire che il cuore ha avuto un evento necrotico a
causa di un infarto, di un'angina o di una sofferenza cardiaca.
Un marcatore ideale dovrebbe essere:
• specifico: dev'essere presente esclusivamente nel
tessuto o nell'organo di cui deve evidenziare lo stato
di benessere;
• precoce: dev'essere rilasciato in circolo appena il
danno succede, e in maniera proporzionale al danno;
• dall'emivita lunga: deve avere il tempo di
dimezzamento della sua concentrazione nel campione
di analisi che consenta una finestra diagnostica;
• dal dosaggio facile, rapido e non costoso.
Diagnosi di ipotiroidismo primario e secondario
L'ipotiroidismo è la condizione patologica in cui i livelli
plasmatici di T3 e T4 sono bassi. Un ipotiroidismo può essere
primario o secondario.
Se T3 e T4 sono bassi, bisogna partire con la richiesta del
dosaggio del tireotropo (TSH), l'ormone che viene secreto
dall'adenoipofisi, che agisce sulla tiroide regolando la sintesi
di T3 e T4. Essendo un ormone, esso richiede il metodo
immunologico, come l'ELISA o il RIA.
Se il TSH è alto, vuol dire che la tiroide non risponde alla
richiesta del TSH, quindi vi è danno tiroideo. In tal caso si
parla di ipotiroidismo primario.
• garantisce la secrezione dell'endometrio;
Se il TSH è basso, vuol dire che l'ipotiroidismo è di tipo
secondario. L'ipotiroidismo secondario può riguardare o • blocca la risposta immunitaria materna, che porterebbe a
l'ipofisi, o l'ipotalamo. Per capire se l'ipotiroidismo è dovuto disconoscere il feto;
a un problema all'ipotalamo o un problema all'ipofisi si esegue • inibisce le contrazioni del miometrio durante i 9 mesi prima
un test dinamico con il TRH, un fattore peptidico secreto del parto.
dall'ipotalamo che stimola l'ipofisi a rilasciare il TSH.
Vengono iniettati endovena 200 μg di TRH e si dosa il TSH.
36
Se il TSH aumenta vuol dire che la patologia è ipotalamica
(anche detta diencefalica). Se non c'è risposta, l'ipotiroidismo
è secondario alla patologia ipofisaria.
Diagnosi e monitoraggio di gravidanza
La gravidanza è una condizione fisiologica che fa lavorare
molto il laboratorio. La gravidanza va innanzitutto
diagnosticata, poi monitorata. Il monitoraggio è volto a vedere
se le cose procedono bene o se ci sono rischi di aborto. I test
di gravidanza sono dei test ormonali. Gli ormoni principali
che vengono dosati sono la gonadotropina corionica (HCG),
la prolattina, il progesterone e l'estriolo. Alcuni si dosano per
la diagnosi, altri per il monitoraggio. L'HCG e la prolattina
sono ormoni proteici, mentre il progesterone e l'estriolo sono
ormoni steroidei. I livelli plasmatici di questi ormoni variano
in funzione delle settimane di gestazione.
L'HCG subisce un'impennata all'inizio per poi subire una
brusca discesa. Per contro, gli altri ormoni aumentano fino alla
fine della gravidanza.
L'HCG è prodotta dalla blastocisti ed è stimolata dalla
produzione di progesterone. È un dimero di 39 kDa, composto
dalla subunità α, simile a quella di molte proteine ipofisarie, e
dalla subunità β, specifica dell'HCG. Non è bene utilizzare un
anticorpo policlonale per fare una diagnosi di gravidanza,
bisogna utilizzare un monoclonale diretto specificamente
contro la subunità β, perché è quella specifica dell'HCG. Se si
usasse un anticorpo policlonale con un metodo immunologico
si doserebbero anche tanti altri ormoni presenti in circolo.
I livelli di gonadotropina corionica variano. Fino alla
decimaundicesima settimana, un aumento di HCG è
fisiologico ed è indice del fatto che la gravidanza procede
bene. Se si trova un valore al di sotto del livello fisiologico,
significa che la gravidanza è ectopica, cioè extrauterina, o c'è
una minaccia di aborto.
La prolattina è un monomero di 22 kDa, secreto
dall'adenoipofisi. La prolattina è l'unico ormone che dopo il
parto continua a salire per favorire la montata lattea.
Sia l'estriolo che il progesterone sono ormoni steroidei, e come
tali, derivano dal colesterolo, che ha 27 atomi di carbonio.
L'estriolo è l'estrogeno plasmatico, o anche urinario, più
abbondante durante la gravidanza, perché deriva dalla
trasformazione che avviene nella placenta di precursori che
provengono dalla corteccia surrenale del feto. Il dosaggio di
questa molecola serve per osservare se vi è una buona
circolazione materno-fetale. Quando c'è una sofferenza fetale
o un aborto, i livelli di estriolo crollano.
Il progesterone viene prodotto in grande quantità durante la
gravidanza. Il progesterone:
• impedisce l'ovulazione durante il parto;
Test di gravidanza
Il dosaggio dell'HCG in laboratorio viene eseguito su plasma
o urine applicando un metodo immunologico. Il dosaggio non
ambulatoriale, cioè quello dei test di gravidanza delle
farmacie, può essere fatto anche da casa.
Il test di gravidanza non ambulatoriale è un test molto
efficiente e accurato. Il metodo che viene utilizzato nello stick
per il test di gravidanza si chiama EMIT, una variante
dell'ELISA. Il dosaggio si basa sul complesso anticorpo-
antigene legato all'enzima. L'enzima è inattivato per
cambiamenti conformazionali indotti dal legame con
l'anticorpo. Quando vi è l'urina sulla striscia, l'antigene vero,
ossia la gonadotropina corionica, scalza l'antigene legato
all'enzima per il legame con l'anticorpo, formando antigene
legato all'enzima libero in soluzione, quindi l'enzima si attiva.
La striscia dev'essere conservata bene, altrimenti l'enzima si
inattiva. Per avere la testimonianza che l'enzima è attivo,
insieme al test c'è un controllo.
Funzionalità cardiaca
L'infarto del miocardio è sicuramente tra le cause di morte più
frequenti in soggetti di età media ed anziana. A provocare
l'infarto è una riduzione dell'apporto di sangue, quindi di
ossigeno, tramite le coronarie, che causa danno alle cellule
miocardiche. Un elettrocardiogramma (ECG) è uno strumento
clinico importantissimo per prevenire o diagnosticare l'infarto
del miocardio. Tuttavia, anche oltre il 50% degli infarti non
mostra un ECG modificato. Dunque, risulta importante la
ricerca dei marcatori di funzionalità cardiaca in laboratori di
analisi diagnostiche.
Quando c'è una sofferenza cardiaca, il miocardio subisce un
disfacimento necrotico, che determina un aumento nel sangue
di alcune proteine enzimatiche di cui il miocita è ricco. I
marcatori della funzionalità cardiaca sono l'aspartato
amminotrasferasi (AST), la lattico deidrogenasi 1 (LDH1) e
la creatin chinasi (CK). Questi catalizzatori sono abbondanti
nella cellula cardiaca, quindi se la cellula cardiaca va in
necrosi, si possono ritrovare nel plasma o nel siero. Questi
enzimi però sono poco specifici. Questi sono i marcatori
classici del dosaggio, che vengono dosati tutt'ora, tenendo
conto del fatto che non sono altamente specifici. Possono
infatti aumentare in circolo non solo, e non sempre, quando
c'è un infarto. La creatin chinasi è tipica anche del muscolo
scheletrico e può essere presente in circolo anche per miopatie
o sforzi muscolari eccessivi.
Marcatori più specifici sono i marcatori non enzimatici, quali
la mioglobina e la troponina.
La mioglobina viene liberata nel torrente circolatorio da parte
di cellule miocardiche lese. Si può evidenziare nel plasma
entro poche ore dall'inizio dell'infarto. La mioglobina non è
specifica, perché si trova anche nei muscoli scheletrici e ha
una finestra diagnostica molto breve. Tuttavia è un marcatore
precoce.
Il complesso delle troponine (Tn) è un complesso della
porzione actinica del meccanismo contrattile del muscolo in
cui ci sono la troponina I, T e C. La troponina I è una proteina
di 24 kDa molto simile in tutte le specie animali. Ci sono tre
forme diverse della troponina I. C'è un isomero della
troponina I che è tipico del cuore, cioè la cTnI. Questa è
abbondante nel cuore, non c'è nel muscolo liscio ed è presente
pochissimo nel muscolo scheletrico. La cTnI è un marcatore
specifico, ha un'ampia finestra diagnostica, cioè non si inattiva
rapidamente, ma purtroppo non è un marcatore precoce.
Il peptide BNP è fatto da 32 amminoacidi. Il BNP appartiene
alla famiglia dei peptidi natriuretici, ormoni con funzione
cardioprotettiva. Essi hanno azione vasodilatatrice, diuretica e
natriuretica. Questi ormoni condividono un anello di 17
residui amminoacidici chiuso da un ponte disolfurico tra due
cisteine. Il BNP è quello caratteristico dei ventricoli ed è un
marcatore specifico del cuore. La sua sintesi da parte dei
miociti è regolata a livello di trascrizione in risposta
all'ischemia (deficit di ossigeno) e a stimoli endocrini.
Questo ormone viene sintetizzato nel miocita del ventricolo in
forma di precursore, il pre-proBNP, di 134 residui
amminoacidici. Il pre- si riferisce al fatto che vi è una
sequenza segnale, che dirige lo spostamento di questa
molecola all'interno della cellula. Il pro- è una parte reattiva,
che dev'essere rimossa per liberare l'ormone fisiologicamente
funzionante. Il meccanismo è simile a quello dell'insulina e
del glucagone. Molti ormoni proteici vengono sintetizzati in
forma di zimogeni, che hanno dimensioni più elevate e che
vengono maturati attraverso tagli proteolitici operati da
proteasi specializzate.
In circolo si trova sia il BNP (32 aa) che l'Nt-proBNP, cioè la
parte terminale (76 aa). Liberato il peptide segnale, resta il
proBNP, costituito dall'Nt-proBNP e dal BNP. Da un ulteriore
taglio proteolitico si ottiene il frammento Nt-proBNP
sprovvisto di attività ormonale e il BNP, che è l'ormone. In
laboratorio si può dosare sia l'ormone attivo BNP, sia
l'NtproBNP. Si preferisce dosare l'Nt-proBNP, con metodo
immunologico, perché è più stabile e ha una finestra
diagnostica più ampia.
Mettendo insieme i risultati ottenuti dai diversi dosaggi si può
avere un'idea ben precisa. Attualmente si ritiene che la
mioglobina e la troponina I siano marcatori del danno
ischemico grave, cioè infarto acuto del miocardio, mentre
l'NtproBNP è un buon marcatore di scompenso cardiaco,
quindi non si è ancora nel danno grave. La scelta dei marcatori
aiuta anche a fare una diagnosi più fine. L'angina pectoris non
è un infarto, è più vicina a ciò che viene definito uno
scompenso cardiaco.
Il dosaggio del precursore del peptide natriuretico ha anche
valore prognostico, per osservare il decorso della malattia nel
follow-up. Si può mettere in relazione la percentuale di
sopravvivenza con la quantità dei marcatori nel plasma.
Marcatori dell'infiammazione
L'infiammazione si riferisce sia alla risposta del nostro corpo
a un danno meccanico, sia a un attacco batterico o virale. Se
l'agente è un agente batterico vi è una risposta diversa rispetto
al caso in cui l'agente è un virus. L'infiammazione acuta ha
inoltre una risposta diversa dall'infiammazione cronica.
La diagnosi e il monitoraggio di un processo infiammatorio si
esegue in laboratorio contando innanzitutto i leucociti ed
37
esaminando la formula leucocitaria per sapere come sono
distribuiti. In seguito si procede con la determinazione della
VES. Infine si effettua l'analisi delle proteine della fase acuta
(PFA).
Le proteine della fase acuta sono i veri marcatori
dell'infiammazione. Durante la fase acuta dell'infiammazione
molti organi rispondono con una risposta sistemica diversa: la
febbre, la leucocitosi, variazioni ormonali dell'ipotalamo,
dell'ipofisi, ecc. Anche il fegato risponde alla parte acuta
dell'infiammazione modificando l'assetto trascrizionale di
molte proteine della fase acuta dietro stimolo delle citochine.
Si parla di aumento o diminuzione di queste proteine quando
la variazione è uguale o superiore al 25%.
Il quadro proteico talvolta risulta profondamente modificato
durante l'infiammazione proprio perché il fegato aumenta o
diminuisce molto la sintesi di alcune proteine. Alcune plasma-
proteine, come l'albumina, la prealbumina, la transferrina, la
APO1, la proteina che lega i corticosteroidi e quella che lega
il retinolo diminuiscono perché c'è un blocco trascrizionale
indotto dalle citochine. L'albumina diminuisce anche perché
fuoriesce con l'essudato dell'infiammazione.
Queste sono le proteine negative della fase acuta. Si pensa che
l'organismo sfrutti il blocco della trascrizione e traduzione di
queste proteine per utilizzare amminoacidi per la sintesi di le
proteine positive della fase acuta.
Le proteine positive della fase acuta sono quelle che
aumentano durante l'infiammazione, perché la loro
trascrizione è stimolata dalle citochine. Sono le proteine
dell'immunità innata e hanno un ruolo variabile, quindi sono
comprese in più categorie. Le proteine positive sono:
• il fibrinogeno ha un picco dopo 24-48 ore, con un aumento
di 2-3 volte rispetto al normale;
• la celluloplasmina;
• le proteine del complemento C3 e C4;
• anti-proteasi, come l'α1 anti-chimotripsina e l'α1
antipepsina. L'anti-chimotripsina aumenta il suo livello di
10 volte in risposta all'infiammazione;
• la proteina C reattiva (PCR), che è quella che ci dà la
misura dell'evento infiammatorio e compare molto
precocemente. Il livello di proteina C reattiva nel plasma
aumenta di 10-1000 volte in risposta a un'infiammazione;
• la proteina sierica dell'amiloide A (SAA), anch'essa molto
precoce.
La proteina C reattiva è il vero marcatore dell'evento
infiammatorio. Appartiene alla famiglia delle pentrassine,
formate da 5 subunità identiche, ha un peso di 23 kDa e ha una
struttura anulare pentagonale. Ha tante funzioni diverse. La
proteina C reattiva è un'opsonina, perché riveste molti
substrati (cromatina che deriva dal disfacimento degli agenti
patogeni, istoni, particelle lipoproteiche, gli stessi batteri)
preparandoli per la fagocitosi da parte dei macrofagi. In
questo modo ci aiuta ad uscire dalla fase dell'infiammazione.
Sono anche capaci di attivare la via classica del complemento.
La proteina C-reattiva si dosa con metodica ELISA o con
immunoturbidimetria, con i limiti che questa tecnica ha. Il
limite di detezione è 5 mg/L. L'immunoturbidimetria è un
38
metodo immunologico che sfrutta l'immunoprecipitazione,
che si verifica quando l'antigene è una proteina e quando le
concentrazioni di antigene e anticorpo sono ottimali per
ottenere il precipitato.
I livelli fisiologici del plasma, che aumentano con l'età, si
aggirano proprio attorno ai 5-6 mg/L, quindi se si usa
l'immunoturbidimetria e se non si osserva risposta è perché
non è aumentata la concentrazione.
La PCR aumenta soprattutto in seguito a infezione batterica e
artriti reumatoidi, anche su base batterica. Le endotossine
batteriche e i metalli pesanti sono i più potenti stimolatori
della produzione della PCR.
Se si dosano dai 10 ai 50 mg/L c'è una leggera infiammazione
localizzata, come una gengivite, una cistite o una piccola
infezione virale.
Se l'infezione è sostenuta da batteri gram+ i livelli di proteina
C-reattiva possono arrivare anche a 50-100 mg/L.
Oltre i 100 mg/L ci sono infezioni batteriche di gram-, come
le polmoniti.
VES
In condizioni normale la propensione degli eritrociti di
aggregarsi è contrastata dalle cariche negative presenti sulla
membrana cellulare degli eritrociti stessi. L'aggregazione
aumenta se ci sono delle emoglobinopatie che alterano la
forma, o anche la quantità dei globuli rossi (ematocrito). La
VES aumenta anche quando nel sangue aumentano il
fibrinogeno e le globuline, proteine cariche positivamente, che
andando a neutralizzare la carica negativa sulla superficie
degli eritrociti, diventano più disponibili all'aggregazione.
La VES non è specifica nella diagnosi di infiammazione,
perché è anche correlata alle emoglobinopatie e dipende
dall'ematocrito. Tuttavia, è sicuramente un indicatore
sensibile. La VES varia entro le prime 24 ore dall'inizio del
processo infiammatorio.
La determinazione della VES si effettua raccogliendo in una
pipetta graduata di 20 cm il sangue intero in sodio citrato. La
pipetta viene mantenuta in posizione verticale da degli
agganci e si attende la sedimentazione. La sedimentazione non
si misura più dopo due ore, visto che i risultati non solo non
cambiano, ma spesso si ottengono valori alterati, basta un'ora.
I valori fisiologici sono < 20 nelle donne e < 15 nei maschi.
Aumentano fisiologicamente con l'età e durante la
gravidanza.
Emoglobina
I dosaggi che riguardano l'emoglobina sono il dosaggio
dell'emoglobina totale e la diagnosi prenatale dell'anemia
falciforme. Per diagnosticare il diabete si può anche dosare
l'emoglobina glicata.
L'emoglobina (HB) è la proteina caratteristica dei globuli
rossi. I globuli rossi non hanno nucleo e mitocondri e hanno
una forma discoidale biconcava e un diametro di 7-8 μm. Sulle
loro membrane espongono gli antigeni che determinano il
gruppo sanguigno. I globuli rossi anucleati sono risultato di
una maturazione. Il nucleo e gli organelli citoplasmatici sono
presenti ancora nei proeritroblasti e negli eritroblasti. Dagli
eritroblasti si ha la perdita del nucleo per generare i
reticolociti. Dal reticolocita si perdono gli organelli plasmatici
e si ha la maturazione a eritrocita. La vita media di un globulo
rosso maturo si aggira sui 120 giorni, cui segue l'emolisi.
L'emolisi dei globuli rossi avviene per il 90% nella milza ad
opera dei macrofagi e per il restante 10% anche in circolo.
L'eritropoietina è un ormone proteico prodotto dal rene,
soprattutto in condizioni di ipossia, che stimola il
differenziamento degli eritroblasti.
Nel 1957 Ingram identifica la prima patologia molecolare, che
è l'anemia falciforme. Nel 1962 Max Perutz risolve la struttura
a raggi X dell'emoglobina. L'emoglobina non è un enzima, ma
una proteina di trasporto. L'emoglobina è una proteina
allosterica che esiste in due conformazioni, la R e la T,
caratterizzate da una diversa affinità per il ligando. Come per
tutte le proteine allosteriche, anche l'emoglobina è un
oligomero, cioè è formata da più di una catena polipeptidica.
L'emoglobina ha degli effettori allosterici positivi e degli
effettori allosterici negativi del suo legame all'ossigeno.
La solubilità dell'ossigeno in una soluzione acquosa è talmente
bassa (9 mg/L) da essere incompatibile con le nostre necessità
di vita. L'emoglobina è un sistema indispensabile per
aumentare la fornitura di ossigeno ai tessuti. Una volta che è
legato all'emoglobina, la solubilità dell'ossigeno aumenta fino
a 360 mg/L, che corrispondono a 1,8 g di ossigeno nei 5 L di
sangue di un adulto. La combustione di 2000 Kcal richiede
572 g di O2, quindi sono necessari numerosi cicli di
ossigenazione dell'emoglobina.
Un adulto che non è affetto da emoglobinopatie contiene nel
proprio sangue diversi tipi di emoglobina. La più abbondante
è la HBA1, un eterotetramero formato da due subunità α e due
subunità di tipo β. Il peso molecolare nativo delle quattro
subunità è 65 kDa. Le subunità dell'emoglobina si chiamano
globine e si dispongono a racchiudere una cavità centrale
occupata da molecole d'acqua. Ci sono contatti tra le subunità
α e le β, mentre pochi sono i contatti tra le due α e le due β.
L'HBA1 tiene conto del 95-98% dell'emoglobina totale.
Le conformazioni R e T sono completamente diverse. In
assenza di ossigeno la proteina assume la conformazione T
(tense), quando arriva l'ossigeno la proteina assume un cambio
conformazionale che la porta alla conformazione R (relaxed).
La conformazione T è resa rigida dalla presenza di numerosi
ponti salini, mentre nella conformazione R, questi ponti salini
che irrigidiscono l'emoglobina si perdono.
In un grafico in cui sulle ordinate vi è la saturazione frazionale
del gas e sulle ascisse la quantità di ossigeno, la curva è di tipo
sigmoide, caratteristica degli eventi cooperativi. Il cambio
conformazionale da T ad R in una subunità si trasmette alle
altre e il legame con l'ossigeno diventa più facile.
Nella conformazione T, l'emoglobina ha una bassa affinità per
l'ossigeno ed è stabilizzata in questa conformazione dal 2,3-
bisfosfoglicerato, dall'anidride carbonica e dai protoni.
Il 2,3-bisfosfoglicerato è un glicerato con due gruppi fosfato
situati in posizione 2 e 3. Una molecola così fatta ha cinque
cariche negative e per le sue caratteristiche, si incunea nella
cavità centrale dell'emoglobina ricca di cariche positive,
stabilizzando la conformazione T. Le cariche positive sono
portate dalle catene laterali degli amminoacidi che
costituiscono l'emoglobina, in particolare i residui
dell'istidina-143, la lisina-82 e la valina-1 provenienti da
ciascuna catena β. Il 2,3-bisfosfoglicerato occupa la cavità
centrale della molecola finché non c'è il legame con
l'ossigeno. Nel cambio conformazionale che la molecola
subisce passando da T ad R la cavità centrale si restringerà, al
punto che il 2,3-bisfosfoglicerato non vi si può più inserire.
Il 2,3-bisfosfoglicerato è un intermedio di una reazione della
glicolisi, per cui è fisiologicamente presente in tutte le cellule.
La fosfoglicerato mutasi converte il 3-fosfoglicerato in
2fosfoglicerato. Il 2,3-bisfosfoglicerato è un intermedio di
questa reazione. La quantità di cui hanno bisogno gli eritrociti
per mantenere stabile la conformazione T è 5 mM, che è una
quantità molto più grande di quella che è presente
fisiologicamente nelle cellule. Negli eritrociti questa molecola
è presente in quantità così elevate perché parte dell'1,3-
bisfosfoglicerato viene convertito da una mutasi in
2,3bisfosfoglicerato. Negli eritrociti avviene una deviazione
(shunt) della glicolisi per cui si ottiene un ATP in meno per
mantenere alta la concentrazione di questa molecola.
La CO2 è un prodotto del ciclo di Krebs (matrice
mitocondriale), della sintesi degli acidi grassi (citoplasma),
della via dei pentosi fosfati (citoplasma). La CO2 può
diffondere liberamente fuori dalle cellule ed andare nel
sangue, dove può entrare nei globuli rossi. Dentro i globuli
rossi, la maggior parte della CO2 viene trasformata
dall'anidrasi carbonica in acido carbonico, che si dissocia a
bicarbonato e un protone. Nei polmoni il bicarbonato viene
riconvertito da un'anidrasi carbonica a CO2, che viene
eliminata attraverso l'espirazione. Un po' di CO2 derivante dal
metabolismo cellulare viene utilizzata dall'emoglobina come
ligando per stabilizzare la conformazione T. L'anidride
carbonica reagisce reversibilmente con i quattro gruppi N-
terminali dell'emoglobina e li converte in carbammato con
cariche negative con liberazione di un protone. L'emoglobina
con cariche negative può effettuare molte più interazioni
elettrostatiche tra i residui che prima non poteva effettuare.
Queste interazioni stabilizzano la forma T.
In una condizione in cui la concentrazione dei protoni è alta
viene stabilizzata la conformazione T. I protoni si liberano
nella reazione catalizzata dall'anidrasi carbonica eritrocitaria
e nella reazione di carbammilazione. I protoni stabilizzano la
conformazione T perché protonano catene laterali
permettendo interazioni che in assenza di protoni non ci sono.
Il ponte salino che si crea tra l'His146 e l'Asp94, che è
importante per stabilizzare la conformazione T, dipende dalla
protonazione dell'His146. L'effetto stabilizzante dei protoni
sulla forma T viene chiamato effetto Bohr.
La conformazione T viene mantenuta stabile solo se c'è una
buona quantità di 2,3-bisfosfoglicerato insieme ai protoni e
alla CO2. Protoni e CO2 da soli non bastano per mantenere
stabile la conformazione T. È importante che la
conformazione T rimanga stabile, perché l'unico ligando che
deve poter modulare il passaggio dalla conformazione T alla
conformazione R dev'essere l'ossigeno.
39
Gruppo eme
Il gruppo eme è la parte della molecola di emoglobina a cui si
lega l'ossigeno. Ognuna delle quattro globine che
costituiscono l'emoglobina lega non covalentemente un eme
di tipo B. Questo eme si trova all'interno di una tasca
idrofobica di ciascuna globina. Questa tasca presenta l'His64
(istidina distale), una valina e una fenilalanina che le
conferiscono il carattere idrofobico.
L'eme è una protoporfirina IX, formata da quattro anelli
pirrolici. È un cromoforo nel visibile e dà il colore rosso al
nostro sangue. Al centro dell'eme un atomo di ferro ferroso
(Fe2+) stabilisce quattro legami covalenti con quattro atomi di
azoto, un legame idrogeno con l'azoto dell'His93 (istidina
prossimale) e il sesto legame di coordinazione può essere fatto
con l'ossigeno.
In assenza di ossigeno il ferro ferroso dell'eme è ad alto spin
(i suoi elettroni occupano tutti i livelli) ed è voluminoso. Esso
si trova un po' fuori rispetto al piano dell'eme, di circa 0,6
Angstrom.
Quando il ferro ferroso si lega all'ossigeno, la sua
configurazione elettronica viene modificata. Il ferro diventa a
basso spin perché l'ossigeno è elettronegativo, quindi il ferro
viene ad essere ristretto. Il ferro a spin più basso, di
dimensioni minori, può spostarsi bene dentro la cavità della
porfirina, e facendo ciò, trascina con sé la molecola. Questo
comporta il passaggio alla conformazione R.
L'ossigeno si lega reversibilmente al ferro ma non lo ossida.
Se l'emoglobina fosse ossidata, il ferro da ferroso diverrebbe
ferrico e l'emoglobina non sarebbe più capace di legare
l'ossigeno. L'emoglobina con il ferro ossidato è detta
metaemoglobina, forma di emoglobina inattiva. Nel nostro
torrente circolatorio le quantità di metaemoglobina devono
essere basse.
Al livello del mare la pressione atmosferica è 760 mmHg.
L'atmosfera contiene azoto per il 79% e ossigeno per il 21%.
La pressione parziale dell'ossigeno nell'aria è quindi 160
mmHg. Nei nostri polmoni la pressione parziale dell'ossigeno
diventa 100 mmHg, e si riduce ulteriormente nel sangue
venoso (30 mmHg). Nei diversi tessuti la saturazione
dell'emoglobina con l'ossigeno dipende da quanto ossigeno
c'è, e da quanta CO2 c'è, che di fatto influenza il pH. Nei
polmoni vi è un'alta pressione di ossigeno, vi è poca CO2 e un
pH 7,4, quindi la conformazione favorita in queste condizioni
è la conformazione R. L'emoglobina si satura al 97%.
Ad alta quota la pressione atmosferica diminuisce. A 3000 m
sul mare la pressione atmosferica è circa 500 mmHg. Dopo
qualche giorno, l'organismo si adatta alla bassa pressione
parziale dell'ossigeno. In condizioni di ipossia, il rene secerne
l'eritropoietina e si aumenta la sintesi di emoglobina e
aumenta anche la concentrazione del 2,3-bisfosfoglicerato.
Emoglobina e 2,3-bisfosfoglicerato aumentano fino a 8 mM
per mantenere il giusto apporto di ossigeno ai tessuti.
Quando arriva nel muscolo, trova poco ossigeno, CO2 alta e
pH acidico. Questo favorisce il ritorno alla conformazione T
e il rilascio dell'ossigeno.
L'eme deve stare legato alla globina perché se l'eme fosse
libero in soluzione, l'ossigeno elettronegativo strapperebbe
40
definitivamente un elettrone al Fe2+, generando un Fe3+ e
diventando una specie reattiva dell'ossigeno (ROS). La parte
proteica ha un ruolo importante nel legame dell'ossigeno al
ferro ferroso, perché l'istidina-64 rende non così facile
all'ossigeno l'accesso perché stabilisce un legame idrogeno
con l'ossigeno, riducendone l'elettronegatività. Grazie alla
protezione della globina la possibilità di ossidazione del ferro
ferroso è ridotta e il legame dell'ossigeno al ferro ferroso è
reversibile.
Nonostante la protezione della globina può succedere che
l'emoglobina diventi ossidata. La percentuale di
metaemoglobina non dev'essere superiore al 1,5%. Vi sono
dei sistemi enzimatici deputati a riparare il danno. Il sistema
che permette di ridurre il ferro ferrico necessita degli elettroni
del NADH, del NADPH e del glutatione. Problemi possono
insorgere quando è deficitaria una via metabolica che fornisce
il NADPH a questi sistemi di riparo del danno. La via del
pentoso fosfato è una via che ha come obiettivo sia quello di
produrre il ribosio 5-fosfato per sintetizzare i nucleotidi, ma
anche quello di fornire il NADPH che serve sia alla sintesi
degli acidi grassi e degli steroli, sia ai meccanismi che ci
riparano dallo stress ossidativo. Quando per motivo genetico
si è affetti da deficit del primo enzima di questa via, che è la
glucosio 6-fosfato deidrogenasi e vi è l'esposizione a un forte
stress ossidativo (per alimenti, farmaci e altri ossidanti) questa
via funziona male, non c'è NADPH a sufficienza per riparare
il danno e la percentuale di metaemoglobina in circolo supera
il 2%. Questa condizione patologica è definita favismo perché
le fave la scatenano. Si formano ponti disolfurici tra le
molecole di metaemoglobina e si formano dei corpi di Heinz
sulla membrana degli eritrociti. Gli eritrociti che contengono
emoglobina danneggiata vengono sequestrati dalla milza,
dove i macrofagi rimuovono alcuni frammenti contenenti i
corpi di Heinz. Gli eritrociti danneggiati così prodotti
prendono il nome di bite cells.
Il monossido di carbonio (CO) è una molecola che si forma
fisiologicamente nel nostro organismo in una quantità
talmente piccola che non danneggia l'emoglobina, ma anzi
funge da neurotrasmettitore. Nella stessa via della
degradazione dell'eme tra i prodotti vi è CO. Quantità elevate
di CO sono per noi letali perché il CO compete per l'ossigeno
nel legame con l'eme. Per come è fatta, la CO ha un'affinità
più alta dell'ossigeno per l'eme. Il CO forma con il ferro un
complesso più stabile di quello formato con l'ossigeno perché
mette a disposizione un numero maggiore di elettroni.
L'istidina-64, per quanto è possibile, sfavorisce la formazione
di carbossiemoglobina, ma se la quantità di CO è molto alta,
il monossido di carbonio riesce a legarsi. La concentrazione
di carbossiemoglobina nel nostro circolo dev'essere pari al
massimo al 2-3% di quella totale.
Mioglobina
La mioglobina è abbondante nei muscoli a fibre rosse ed è
quella che dà il colore rosso ai nostri muscoli. È formata da
una sola catena che assomiglia molto alle subunità β
dell'emoglobina. Questa catena contiene un solo gruppo eme.
La mioglobina non può trasportare l'ossigeno perché non è
allosterica. La mioglobina immagazzina l'ossigeno e lo
fornisce solo ai tessuti muscolari. La sua curva di saturazione
con l'ossigeno è un'iperbole. Già a concentrazioni basse
dell'ossigeno, la mioglobina inizia a saturarsi, perché lega
l'ossigeno in maniera troppo forte. Quando l'emoglobina nei
capillari è satura al 50%, la mioglobina si satura già al 100%.
Tipi di emoglobina
L'HBA1 è presente nel nostro sangue dal 95 al 98%. L'HBA2
può essere presente dal 2 fino al 3,3%. L'HBF (emoglobina
fetale) è presente dallo 0,1 all'1,2%.
HBA2 è un tetramero formato da due subunità α e due
subunità δ. L'HBA2 aumenta nella β-talassemia e
nell'ipertiroidismo, mentre diminuisce nell'α e nella γ-
talassemia. Essa può essere un marcatore di queste condizioni.
HBF è formata da due subunità α e due subunità γ. Nella vita
fetale la situazione diventa più complessa perché l'HBF
rappresenta quasi il 100% dell'emoglobina totale. Dopo la
nascita il livello delle α e delle β aumenta. Le catene γ
diminuiscono stabilizzandosi a livelli basali, che permangono
nell'adulto. Nell'HBF le catene γ hanno una serina invece che
una istidina in posizione 143. Hanno quindi due cariche
positive in meno e il legame con il 2,3-bisfosfoglicerato è più
debole. Con l'indebolimento del legame con il 2,3-
bisfosfoglicerato la conformazione T diventa meno stabile e
l'emoglobina è un po' più affine all'ossigeno rispetto
all'emoglobina dell'adulto. Nel feto, la maggiore affinità
dell'emoglobina per l'ossigeno è responsabile del fatto che
l'ossigeno può essere trasferito dalla mamma al bambino.
L'emoglobina formata da due subunità α e due ε è l'HBE
(emoglobina embrionale) e non è presente nell'adulto.
Dosaggio dell'emoglobina
L'emoglobina si misura in g/dL. L'emoglobina totale si dosa
con il metodo Drabkin e il campione è il sangue intero.
L'emoglobina non si può dosare su plasma o siero perché non
bisogna eliminare le cellule dal campione. Al sangue intero,
capillare o venoso, viene aggiunto l'anticoagulante e si
provoca l'emolisi dei globuli rossi, perché c'è bisogno di far
liberare l'emoglobina. L'emolisi si ottiene incubando
brevemente il campione in una soluzione ipotonica.
Se due soluzioni che contengono lo stesso solvente ma con
concentrazioni diverse di soluto sono separate da una
membrana semipermeabile, che lascia passare il solvente ma
non il soluto, le molecole del solvente si sposteranno dalla
soluzione con minore concentrazione di soluto a quella con
maggiore concentrazione in modo che le concentrazioni si
eguaglino. La tonicità dipende dai soluti. Una cellula in una
soluzione ipertonica, cioè con una concentrazione di soluti
maggiore di quella intracellulare, vedrà i suoi fluidi uscire
all'esterno e raggrinzirà. Una cellula in una soluzione
isotonica è in condizioni di equilibrio, il flusso di acqua in
uscita è pari a quello in entrata. Se una cellula è posta in
soluzione ipotonica, l'acqua entra nella cellula provocando
uno swelling. Se la soluzione è eccessivamente ipotonica la
cellula lisa.
La soluzione fisiologica 0,9% NaCl (0,9 g ogni 100 mL di
acqua) è leggermente ipertonica rispetto al sangue.
Il reattivo di Drabkin è un reattivo molto tossico, che contiene
potassio ferricianuro e potassio cianuro. Il dosaggio si esegue
aggiungendo 5 mL di reattivo a 20 mL di campione a
temperatura ambiente. Dopo 20 min si va a leggere allo
spettrofotometro a 540 nm.
Il potassio ferricianuro è un reagente ossidante. In presenza di
potassio ferricianuro tutte le emoglobine presenti nel
campione vengono convertite in metaemoglobina, cioè il loro
Fe² viene ossidato a Fe³ . La metaemoglobina reagisce con⁺ ⁺
il potassio cianuro formando la cianometaemoglobina, un
composto molto stabile che assorbe a 540 nm. Si crea una retta
di taratura con concentrazioni note di cianometaemoglobina,
dalla quale si possono estrapolare le concentrazioni di
emoglobina totale in g/dL. I valori dipendono da età e sesso.
Diagnosi prenatale dell'anemia falciforme
L'emoglobina è una proteina presente in circa 300 varianti
genetiche. Moltissime di queste varianti non hanno nessun
effetto strutturale o funzionale, sono cioè le cosiddette
mutazioni silenti. Poche sono effettivamente quelle che
cambiano la struttura, e quindi la funzione della proteina.
La mutazione alla base della patologia ereditaria nota come
anemia falciforme non è una mutazione silente. Nell'anemia
falciforme a mutare è il sesto dei 146 amminoacidi della
catena β, che si trova nella struttura terziaria sulla superficie
della molecola. In questa mutazione, il sesto amminoacido
della catena β è una valina invece di un glutammico. La valina
è codificata dalla tripletta GTG, il glutammico è codificato da
GAG, quindi si tratta di una transizione A → T. L'emoglobina
che presenta questa mutazione è chiamata HBS, dove S sta per
sickle (falce), perché il globulo rosso che contiene emoglobina
così fatta assume una forma a falce. Siccome è una malattia
genetica, si possono avere omozigoti e eterozigoti. Negli
omozigoti per la mutazione il 100% dell'emoglobina è nella
forma HBS. Durante sforzi anaerobi, l'HBS, proprio grazie
alle interazioni idrofobiche rese possibili dai residui di valina
al posto del glutammico, l'emoglobina polimerizza, formando
degli aggregati che precipitano. Ciò distorce la membrana del
globulo rosso, formando la falce. Questi individui hanno
anemie gravissime perché i globuli rossi vengono
immediatamente distrutti, e la speranza di vita non supera i 25
anni.
In eterozigosi la malattia è asintomatica. Il 50%
dell'emoglobina è a forma di falce. Portatori eterozigoti di
anemia falciforme sono presenti in grande percentuale tra le
popolazioni africane affette da malaria, come se l'organismo
si proteggesse dalla malaria. Il plasmodium non riesce a
completare il suo ciclo perché i globuli rossi vengono subito
distrutti.
L'HBS ha una carica netta diversa dall'emoglobina normale,
soprattutto considerando che quel residuo si trova sulla
superficie. L'HBS ha due cariche negative in meno, perché il
glutammico è un amminoacido carico negativamente. Con
un'elettroforesi a pH 8,6, l'HBS migra più lentamente verso il
polo positivo rispetto all'emoglobina normale.
Quest'elettroforesi si può effettuare sull'emoglobina di un
individuo adulto.
41
La diagnosi prenatale si fa utilizzando il DNA che viene
estratto da cellule fetali, situate o nei villi coriali o
nell'amniocentesi, che contiene un po' di cellule fetali. Per
questa diagnosi non si può fare l'elettroforesi. Le cellule dei
villi coriali o del liquido amniotico vengono fatte crescere su
coltura per alcuni giorni prima di estrarre il loro DNA.
La diagnosi prenatale si avvale delle tecniche della biologia
molecolare che attualmente consentono la diagnosi di molte
malattie genetiche come questa, e anche di molte infezioni
sostenute da batteri, protozoi, funghi e virus. La diagnosi della
prenatale dell'anemia falciforme richiede:
1. amplificazione del campione di DNA
attraverso PCR;
2. taglio con enzimi di restrizione; 3. corsa
elettroforetica.
PCR
Il DNA dev'essere anzitutto amplificato con PCR. La PCR
(polymerase chain reaction) di Kary Mullis è una tecnica della
biologia molecolare che consente di amplificare frammenti di
DNA dei quali si conoscono le sequenze nucleotidiche iniziali
e finali. Questa tecnica consente di ottenere in vitro la quantità
di materiale genetico necessaria per le successive
applicazioni.
Per preparare un campione per la PCR bisogna anzitutto
conservarlo bene, estrarre il DNA facendo attenzione a
eliminare gli inibitori della reazione e purificare l'acido
nucleico.
La PCR è una reazione che richiede una polimerasi
termostabile, detta taq, polimerasi estratta dal batterio
termofilo estremo Thermus aquaticus. È importante che la
polimerasi sia termostabile perché la reazione prevede l'alta
temperatura, quindi non si possono utilizzare enzimi che si
inattivano ad alte temperature.
La miscela di reazione per una PCR contiene:
• sequenze di DNA target da amplificare;
• un eccesso di due oligo di 20-30 bp a singolo
filamento (primer) che devono ibridizzare col giusto
orientamento con le estremità della sequenza target;
• un eccesso dei quattro desossiribonucleotidi;
• una polimerasi termostabile, come la taq;
• un buffer opportuno, col pH giusto e il magnesio. Le
tre fasi per la PCR sono:
1. Denaturazione della doppia elica. 1 minuto a 94°C denatura
il DNA. Se nella stessa provetta non ci fosse una polimerasi
termostabile, dopo un minuto a 94°C la polimerasi di
qualunque essere vivente mesofilo sarebbe inattivata. La
provetta della PCR ha pareti sottili per garantire il rapido
raggiungimento della temperatura. La provettina viene
inserita nel termociclatore, un apparecchio che mantiene la
temperatura desiderata per il tempo desiderato.
2. Ibridazione dei primer (annealing). La temperatura viene
abbassata a 54°C per permettere l'ibridazione dei primer. I
primer devono ibridizzare alla temperatura ideale: non
42
dev'essere troppo alta, altrimenti non si formano i legami
idrogeno tra le basi, ma non dev'essere bassa per non
permettere la formazione di appaiamenti errati e poco
specifici.
3. Sintesi del DNA. La taq polimerasi allunga il filamento a
partire dal 3'-OH di ogni primer, lavorando ad una
temperatura ottimale di 72°C.
La reazione si ottimizza modulando i tempi e le temperature
per ottenere i risultati desiderati. Generalmente i cicli sono
tutti identici, tranne il primo e l'ultimo. Il primo dura un po' di
più per consentire una buona denaturazione del DNA e anche
l'ultimo è lungo 2 minuti. I cicli di annealing sono più rapidi.
Dopo l'amplificazione, il campione viene sottoposto a una
corsa elettroforetica su gel di agarosio o poliacrilammide. Il
filamento migrerà in maniera inversamente proporzionale alla
propria lunghezza. Per visualizzare gli acidi nucleici dopo
corsa elettroforetica si utilizza l'etidio bromuro, che si
intercala tra le basi del DNA e acquista fluorescenza se
illuminato con raggi UV. Con i raggi UV si crea una
delocalizzazione e il ritorno a livello base è più lungo rispetto
all'evento dell'assorbimento, tant'è vero che una parte di
quell'energia nel tempo più lungo viene emessa con frequenza
minore, come colore.
Enzimi di restrizione
Gli enzimi di restrizione sono endonucleasi batteriche che
catalizzano l'idrolisi di quei pezzi di DNA che sono estranei
al genoma batterico, quindi sono una forma di difesa. Gli
enzimi di restrizione sono endonucleasi di tipo II, non
necessitano di ATP, non hanno attività metilasica e il taglio
avviene in corrispondenza di sequenze molto specifiche. Le
endonucleasi batteriche di tipo I e III richiedono ATP, hanno
attività metilasica e non sono specifiche nel sito di taglio, per
cui non vengono utilizzate in laboratorio per le diagnosi.
Un enzima di restrizione di tipo II ha per sequenza consenso
sequenze palindromiche dalle 4 alle 8 coppie di basi. Gli
enzimi di restrizione possono operare due tipi di taglio: un
taglio sfalsato che produce le estremità coesive (sticky ends)
o un taglio netto che produce estremità piatte (blunt ends).
Alcuni enzimi hanno siti meno frequenti nel nostro genoma,
altri hanno siti più frequenti.
Questi enzimi di restrizione vengono purificati dalle cellule
batteriche per essere utilizzati in tecniche di biologia
molecolare, inclusa la diagnosi dell'anemia falciforme.
Per fare la diagnosi dell'anemia falciforme si usa il metodo
RFLP (restriction fragment length polymorphism). Questa
tecnica si avvale del fatto che una mutazione può eliminare un
sito di taglio di un enzima di restrizione o introdurre un nuovo
sito.
La sequenza amplificata con PCR, viene digerita con l'enzima
di restrizione MstII. Il cambiamento di base A → T nel sesto
codone della sequenza che codifica per la β-globina comporta
la perdita della sequenza di consenso dell'enzima MstII.
Questo polimorfismo può essere rilevato utilizzando un
pattern di restrizione che si ottiene trattando questa regione
genomica con questo enzima. Nel genotipo omozigote wild
type, la digestione produce due frammenti. Nell'omozigote
per la mutazione, la digestione produce un solo frammento.
Nell'eterozigote, la digestione ne produce tre.
Dopo la digestione con l'enzima specifico, questa
modificazione del sito riconosciuto dall'enzima di restrizione,
si può mettere in evidenza facilmente mediante elettroforesi
del
DNA.
A rendere lunga l'attesa dei risultati per la diagnosi prenatale
dell'anemia falciforme non è l'elettroforesi o la PCR, ma la
crescita delle cellule prelevate dal liquido amniotico o dai villi
coriali.
Stress ossidativo
Lo stress ossidativo è uno stress che il nostro corpo subisce
come conseguenza di abitudini sbagliate di vita, come il fumo
di sigaretta o l'esposizione prolungata ai raggi UV, ma anche
da fattori ambientali, come l'inquinamento e le radiazioni, o
l'invecchiamento. In seguito all'esposizione a queste
condizioni si formano nel nostro organismo le specie reattive
dell'ossigeno (ROS), che sono la causa principe dello stress
ossidativo. I ROS hanno un elettrone spaiato nell'orbitale
esterno e si aggirano nel nostro corpo in cerca di elettroni per
completare il proprio ottetto, perché sono molecole ossidanti.
Togliendo un elettrone a tutte le nostre biomolecole,
danneggiano le nostre cellule. I ROS possono causare buchi
nelle nostre membrane lipidiche. Molta della nostra salute si
sta scoprendo recentemente essere legata all'integrità delle
nostre membrane lipidiche. I ROS strappano elettroni anche a
proteine e DNA. Modificare una proteina spesso significa
inattivarne la funzione, mentre modificare il DNA può voler
spesso dire creare una mutazione.
Malattie gravi come l'Alzheimer, il Parkinson, alcuni tumori e
l'aterosclerosi si ritiene abbiano come causa l'eccesso di ROS
in circolo.
I ROS vengono anche prodotti dal nostro stesso metabolismo
cellulare. Se così non fosse, non ci sarebbero sistemi di difesa
contro i ROS.
Nonostante ci sia l'istidina guardiana della tasca idrofobica
dell'eme, può succedere che un po' di emoglobina subisca una
pressione dell'ossigeno per cui il Fe² viene ossidato a⁺ Fe³ e
l'emoglobina diventa metaemoglobina. In questo pas⁺
saggio, l'ossigeno diventa anione superossido (O₂-).
I leucociti neutrofili producono perossido d'idrogeno per
ottenere la morte dei batteri fagocitati.
Durante il trasporto degli elettroni nella catena di trasporto
mitocondriale può accadere che si formino dei ROS. Quando
tutto va bene, l'O che è l'accettore terminale di elettroni, su₂
bisce una riduzione tetravalente e si forma l'H O.
Talvolta,₂ soprattutto quando si fa uno sforzo fisico
anaerobico, può accadere che si formino dei ROS.
I radicali liberi vengono eliminati dai nostri sistemi di difesa.
Se non c'è un equilibrio tra i radicali liberi prodotti e i nostri
sistemi di difesa si ha lo stress ossidativo. La nostra difesa è
affidata a molecole antiossidanti (donatori di elettroni) che
possono essere endogene, prodotte dal nostro organismo,
oppure esogene, introdotte con gli alimenti o con integratori,
e sistemi enzimatici, che oltre a eliminare i ROS talvolta
possono anche riparare i danni.
Gli antiossidanti endogeni sono: la bilirubina, l'acido lipoico,
la melatonina, l'acido urico, l'ubichinone (Q10), carnosina e
anserina. La melatonina produce la pelle dagli UV. Il Q10 si
trova soprattutto nelle creme per la pelle.
Gli antiossidanti esogeni sono quelli che vengono soltanto
integrati dall'esterno, attraverso gli alimenti o gli integratori.
Essi comprendono: il retinolo (vitamina A), l'α-tocoferolo
(vitamina E), l'acido ascorbico, la vitamina C, il resveratrolo
e i flavonoidi.
Possediamo sistemi enzimatici per eliminare i ROS e anche
per limitare il danno. Questi sistemi enzimatici coinvolgono il
glutatione ridotto (GSH), col suo gruppo sulfidrilico portato
dalla cisteina, e ossidato (GS-SG), due molecole di GSH unite
tramite un ponte disolfurico tra l'SH portato da una molecola
e l'SH portato dall'altra.
Uno di questi sistemi enzimatici sfrutta il glutatione ridotto e
la forma ossidata per eliminare radicali superossido e il
perossido di idrogeno. La superossido dismutasi trasforma i
radicali superossido in H O e la glutatione perossidasi elimi₂
₂ na gli H O . Questo sistema necessita di NADPH, che
è₂ ₂ formato nella via del pentoso fosfato.
C'è anche il sistema di riparo della metaemoglobina che
mantiene i livelli della metaemoglobina al di sotto dell'1,5%
ed elimina i radicali superossido. Questo sistema necessita di
NADPH, NADH e glutatione e coinvolge la metaemoglobina
riduttasi.
Test per lo stress ossidativo
A richiesta, nei laboratori c'è la possibilità di avere la misura
dei nostri sistemi di difesa e la misura dell'attacco da parte
degli ossidanti. Questi dosaggi sono chimici.
Il BAP test (biological antioxidant potential) è la misura della
nostra difesa, ossia della capacità antiossidante del plasma. La
capacità antiossidante del plasma viene valutata in base alla
capacità che il plasma ha di ridurre ioni Fe³ a ioni Fe² .⁺ ⁺ Gli
ioni Fe³ si legano a una molecola colorata, di solito ros⁺ sa,
che quando il ferro si riduce si decolora. Con uno
spettrofotometro si può valutare questa variazione di colore
confrontando i risultati con una retta di taratura. Il d-ROM test
(reactive oxygen metabolites) è la misura dell'attacco da parte
degli ossidanti. Si valuta quanti ROS ci sono nel nostro plasma
sulla base degli idroperossidi, che sono un marcatore
dell'attacco ossidante. Lipidi, proteine e DNA, in seguito
all'attacco dei ROS producono idroperossidi in circolo. In
condizioni di pH basso si libera ferro dalle proteine
plasmatiche, che produce radicale alcossile e radicale
idroperossilico a partire dagli idroperossidi. La reazione è
chiamata reazione di Fenton. Anche in questo caso vi è la
variazione di colore di una molecola, che da incolore diventa
rosa dopo essere stata ossidata dai radicali derivati dagli
idroperossidi, e che va misurata con tecnica
spettrofotometrica e retta di taratura.
43
Diabete mellito
Il diabete mellito è stato chiamato così perché nell'antichità si
notò che le urine dei soggetti affetti da questa patologia erano
dolci. Lo zucchero glucosio non può entrare nelle cellule
quindi rimane in circolo, e l'eccesso supera la soglia renale
riversandosi nelle urine.
Il diabete mellito è la causa più comune dell'iperglicemia
persistente a digiuno. Talvolta la glicemia può aumentare
durante la gravidanza, a causa di diabete gestazionale, che
però rientra dopo il parto. Una persistente iperglicemia a
digiuno è causata dall'esistenza di un deficit del
funzionamento dell'insulina. Il diabete mellito è definito una
malattia sociale, in quanto è talmente diffusa da gravare
sull'efficienza di una società. Nel mondo ad oggi vi sono 246
milioni di diabetici e si prevede ne siano 380 milioni nel 2025.
Questa malattia può presentarsi in forme lievi, talvolta in
forme anche molto più pesanti, in cui si verificano cancrena
degli arti inferiori, retinopatie, infarti e ictus.
Esistono due tipi di diabete mellito. Il diabete mellito di tipo I
riguarda il 10% dei casi. Nel diabete mellito di tipo I sono
inclusi i casi idiopatici (ad eziologia ignota) e quelli attribuiti
a un evento autoimmune, in cui il nostro stesso corpo produce
anticorpi contro il tessuto pancreatico. Siccome l'insulina è
sintetizzata dal pancreas, non si verifica più produzione di
insulina. Un tempo si credeva che questo fosse il diabete degli
adolescenti, mentre ora si è capito che può colpire a tutte le
età.
Il diabete mellito di tipo II riguarda il 90% dei casi. Questa
forma è tipicamente quella dell'età adulta ed è imputabile ad
un'inadeguata secrezione dell'insulina, una bassa espressione
per il recettore dell'insulina o un mancato riconoscimento tra
il recettore e l'insulina. Tra le concause vi sono anche le
abitudini di vita come l'alimentazione eccessiva, lo stress e
ereditarietà.
Fino agli anni 80 ai diabetici si somministrava l'insulina suina,
che differisce da quella umana per un solo amminoacido.
Attualmente esistono moltissimi tipi di insulina umana in
commercio, ottenuta con la ricombinazione batterica in
laboratorio, utilizzando gli enzimi di restrizione. Il farmaco
non è quasi mai identico alla molecola originaria, esso è
spesso modificato per migliorare l'efficacia terapeutica.
Soprattutto nel diabete di tipo II vi è un'eterogeneità nelle
forme in cui esso si manifesta, per cui il diabetologo deve
studiare il caso e cercare l'insulina più adatta per il paziente,
dal momento che ogni insulina ricombinante ha le sue
caratteristiche.
La quantità di insulina da somministrare dipende dal tipo di
insulina, dal peso, dall'età del paziente e da eventuali
patologie. A tutt'oggi l'insulina si somministra con una siringa
o una penna e va conservata a 2-8°C. L'iniezione viene fatta
solitamente sulla parete dell'addome o sul deltoide. È
recentissima la possibilità perché si compia la
somministrazione dell'insulina in compresse. Il problema da
affrontare in questo campo è che i succhi gastrici attaccano
l'insulina degradandola.
44
Diagnosi del diabete
La diagnostica del diabete prevede in ordine: il carico orale di
glucosio, il Rastinon test, il dosaggio di acidi grassi e corpi
chetonici, il dosaggio del peptide C e dell'insulina, il dosaggio
di anticorpi specifici per diagnosticare il diabete di tipo I e il
dosaggio dell'emoglobina glicata.
Il carico orale di glucosio è un test noto come OGTT (oral
glucose tolerance test) e non si può eseguire se la persona in
questione ha una glicemia in quel momento superiore ai 130
mg/100 mL, quindi si dosa prima la glicemia di base con
metodo enzimatico. Dopo aver bevuto per os 75 g di glucosio,
il soggetto deve restare in laboratorio per alcune ore. Per il
bambino si somministrano 1,75 g di glucosio per ogni Kg di
peso corporeo. In un individuo normoglicemico la glicemia
aumenta entro i primi 30 minuti, poi entro due ore la glicemia
rientra nei livelli iniziali, perché l'insulina provvede a far
entrare il glucosio nelle cellule. Se c'è un difetto insulinico
quel glucosio rimarrà in circolo per un tempo più elevato.
Dopo il carico orale si dosa la glicemia a intervalli di tempo.
Il Rastinon test prevede la somministrazione endovena di 1 g
di tolbutamide, un farmaco di sintesi che stimola la
produzione di insulina dal pancreas. Il Rastinon test ci dà
un'idea della possibilità che il pancreas ha di produrre
insulina. Dopo 20 minuti si dosa la glicemia. Se il pancreas ha
reagito e ha prodotto l'insulina, si ha un calo dell'80%. Questa
risposta è assente o meno evidente nel diabetico. Questo è
soprattutto il test per il diabete di tipo I.
Il dosaggio degli acidi grassi liberi si esegue con metodo
enzimatico mentre quello dei corpi chetonici con metodo
chimico. In un individuo diabetico variano i livelli in circolo
degli acidi grassi liberi perché il diabetico non può utilizzare
il glucosio come fonte energetica. L'individuo diabetico
degrada massicciamente i trigliceridi come fonte di energia,
per cui si trovano molti acidi grassi liberi in circolo che
normalmente dovrebbero trovarsi legati al glicerolo. I corpi
chetonici derivano dal metabolismo dell'acetil-CoA, quella
molecola che insieme all'ossalacetato dà il via al ciclo di
Krebs. Un diabetico che non riesce a recuperare il glucosio dai
nutrienti inizia a produrre molto glucosio attivando la
gluconeogenesi. L'ossalacetato è uno dei precursori della
glucogenesi, quindi ci sarà acetil-CoA in eccesso
stechiometrico, che viene trasformato dal nostro corpo in
corpi chetonici. Il diabete provoca quindi chetosi, cioè
l'abbassamento del pH con acidosi metabolica fino al coma,
l'aumento nelle urine dei corpi chetonici (chetonuria) e
l'eliminazione dell'acetone dai polmoni.
L'insulina è un peptide fatto da una catena A e una catena B
tenute insieme da ponti disolfurici. L'insulina viene
sintetizzata nel pancreas come un'unica catena più grande,
detta preproinsulina, in cui tra la catena A e la catena B vi è la
catena C. La maturazione dell'insulina prevede la rimozione
proteolitica da parte di proteasi specializzate del peptide C.
Nella pre-proinsulina vi è anche una sequenza N-terminale
segnale, che serve per veicolare l'insulina nel posto giusto
dove deve avvenire la maturazione. La maturazione prevede
anche la rimozione del peptide segnale. Dosare l'insulinemia
e il peptide C ci dà un'idea se vi è produzione di insulina o
meno.
Se non vi è produzione di insulina si tratta di diabete di tipo
I.
Per la diagnosi del diabete di tipo I si possono dosare ancor
prima della comparsa dei sintomi, durante la fase pre-clinica,
gli anticorpi contro il pancreas in plasma o siero.
La glicazione è la reazione covalente non enzimatica con la
quale il glucosio o il fruttosio si vanno a legare a una proteina.
La glicosilazione è la stessa reazione catalizzata
specificamente da un enzima. Se c'è molto zucchero in circolo,
probabilisticamente molte proteine saranno glicate, tra cui
anche l'emoglobina. Talvolta, la glicazione può
compromettere la funzionalità della proteina. La glicazione a
livello di collagene e elastina del derma causa perdita di
elasticità e compattezza della pelle. La glicazione avviene in
due stadi: prima si forma una base di Schiff (aldimmina), che
è labile e tende a riarrangiarsi in un prodotto di Amadori
(chetoimmina), che è stabile. L'emoglobina glicata (HbA1c) è
un'emoglobina in cui i residui di valina all'N-terminale della
catena β sono glicati. La quantità di emoglobina glicata in
circolo è anche correlata alla vita media degli eritrociti, quindi
l'emoglobina glicata in circolo diventa un marcatore della
disponibilità di glucosio in circolo negli ultimi 120 giorni. Il
dosaggio dell'emoglobina glicata assume quindi importanza
soprattutto nel monitoraggio del diabete. Questo è un
parametro molto affidabile per la diagnosi del diabete perché
non è un'istantanea come il dosaggio della glicemia. Negli
ultimi tempi l'emoglobina glicata viene espressa in mmol di
emoglobina glicata per moli di emoglobina totale, mentre
prima si misurava in percentuale. Le mmol/mol è un'unità di
misura che meglio consente di apprezzare i cambiamenti.
Un'emoglobina glicata al 4% (20 mmol/mol di emoglobina
totale) corrisponde a una glicemia di 60 mg/100 mL. Si pensa
che una persona che abbia un'emoglobina glicata compresa tra
le 20 e le 39 mmol/mol di emoglobina totale non ha il diabete.
Un valore compreso tra i 40 e i 47 rappresenta una condizione
di rischio da monitorare. Valori sempre superiori a 47 sono
indicativi di diabete mellito. Il dosaggio di emoglobina glicata
non è un esame di routine come la glicemia. L'emoglobina
glicata viene richiesta solo se ci sono altri segni e se i risultati
delle altre diagnosi sono risultati positivi o se il diabete è già
stato diagnosticato.
L'emoglobina glicata può essere dosata con una cromatografia
a scambio ionico sfruttando il fatto che questa molecola ha
una carica diversa rispetto all'emoglobina totale. Il sangue
intero emolizzato viene sottoposto a cromatografia a scambio
ionico per separare l'emoglobina glicata dalle altre
emoglobine confrontando il tracciato ottenuto con un tracciato
di controllo. L'HPLC (high pressure liquid chromatography)
è uno strumento molto sofisticato che consente di effettuare
una cromatografia ad alta pressione in tempi molto brevi (180
sec).
Recentemente è stato messo in commercio un test enzimatico.
Il sangue intero emolizzato viene sottoposto a digestione
enzimatica con delle proteasi di Bacillus sp. Questo processo
libera amminoacidi, tra cui la valina glicata dell'emoglobina,
che diventa substrato della fructosil-valina ossidasi di E. coli,
che produce il perossido di idrogeno tra i prodotti di reazione.
Dal perossido di idrogeno, grazie a una perossidasi e un
cromogeno si può osservare la reazione con lo
spettrofotometro.
Trasduzione del messaggio dell'insulina
L'insulina è un ormone peptidico sintetizzato dalle cellule β
del pancreas endocrino come pre-proinsulina. In seguito
subisce una maturazione per cui si arriva all'insulina matura
biologicamente attiva. L'insulina viene conservata in granuli
di deposito nelle cellule β del pancreas fin quando non è
necessario il rilascio di insulina. Il rilascio è necessario
quando la glicemia è alta. Il comando si realizza in un alta
concentrazione di ATP che deriva dalla demolizione
ossidativa del glucosio. L'alta concentrazione intracellulare di
ATP chiude un canale del K . Il K si accumula nella cellula
causando la⁺ ⁺ depolarizzazione della membrana. La
depolarizzazione apre i canali del Ca² voltaggio-dipendenti,
provocando l'ingresso⁺ del Ca² , che a sua volta promuove la
fusione dei granuli di⁺ deposito di insulina con la membrana.
L'insulina circola nel sangue libera, in parte anche legata alle
β-globuline.
La tolbutamide è un farmaco, appartenente al gruppo delle
sulfaniluree, comunemente utilizzato per stimolare la
secrezione di insulina dal pancreas perché causa la chiusura
dei canali K . I diabetici che hanno diabete di tipo II
assumono⁺ sulfaniluree come la tolbutamide.
Una volta che l'insulina è libera nel sangue deve incontrare il
suo recettore sulla membrana dell'epatocita per esplicare la
propria attività. Il recettore per l'insulina è un recettore di tipo
tirosin-chinasico formato da quattro catene polipeptidiche:
due catene α e due catene β. Le due catene α sono
completamente extracellulari, mentre le due catene β sono
formate da tre domini: un dominio extracellulare, un dominio
transmembrana e un dominio citoplasmatico. Nel dominio
citoplasmatico ci sono i siti attivi dell'enzima e i residui di
tirosina che devono essere fosforilati affinché il recettore
diventi attivo. Solo il legame con l'insulina causa un cambio
conformazionale che determina l'avvicinamento delle
subunità β e l'autofosforilazione dei residui di tirosina. Il
recettore autofosforilato diventa al tempo stesso capace di
fosforilare il suo primo substrato, IRS-1. Una volta fosforilato,
IRS-1 è riconosciuto da proteine che hanno dei domini SH-2,
delle regioni della molecola deputate a riconoscere tirosine
fosforilate in una certa conformazione. Le proteine che
riconoscono IRS-1 sono di fatto Grb2 e la fosfatidilinositolo
3-chinasi. Le due vie che partono dalla fosforilazione di IRS-
1 sono entrambe caratterizzate da cascate di fosforilazioni.
Grb2 porta nel complesso anche la proteina Sos. Quando IRS-
1 viene riconosciuto da Grb2, la proteina Sos causa nella
proteina Ras la sostituzione di GDP con GTP. La proteina Ras
legata a GTP fosforila Raf-1, che fosforila MEK, che fosforila
MAPK. MAP chinasi entra nel nucleo e fosforila i fattori di
trascrizione nucleari che controllano l'espressione di geni
necessari al differenziamento, alla sopravvivenza e alla
divisione cellulare. Questa via punta a modifiche profonde
nella vita della cellula che vanno ben oltre il metabolismo del
glucosio.
45
Nella via che parte con la fosfatidilinositolo 3-chinasi, questo
enzima riconosce IRS-1 fosforilato e lo lega. Una volta che
l'ha legato, può convertire il fosfatidilinositolo, un lipide di
membrana, dalla forma 4,5-bifosfato alla forma 3,4,5-
trifosfato (PIP3). Il fosfatidilinositolo 3,4,5-trifosfato è il
secondo messaggero dell'insulina e può legarsi a domini di
certe chinasi, tra cui la PDK. La PDK viene attivata e fosforila
AKT, attivandola. AKT è l'equivalente della PKA del
glucagone, perché va a fosforilare, inattivandola, la GSK3,
una chinasi che a sua volta rende inattiva la glicogeno sintasi.
L'insulina è quindi in grado di mettere in attivo la glicogeno
sintesi inattivando, grazie ad AKT, questa chinasi. AKT
fosforila anche altre proteine, come la caspasi-9, FOXO e
mTOR, coinvolte negli eventi apoptotici, contrastando così
l'apoptosi. Oltre a questo, l'insulina incrementa anche la
sintesi proteica, risultando pertanto l'ormone anabolizzante.
Nei riguardi del metabolismo del glucosio, AKT promuove
l'ingresso del glucosio nei tessuti insulino-dipendenti. In tutti
i tessuti il glucosio entra nelle cellule attraverso dei
trasportatori chiamati GLUT, dei trasportatori costituiti da 12
segmenti transmembrana che creano un canale rivestito
internamente da amminoacidi idrofilici. In questo modo il
passaggio del glucosio all'interno delle cellule avviene in
maniera passiva senza il consumo di ATP. Questo
meccanismo di trasporto passivo è chiamato trasporto
facilitato, perché è mediato da canali. Esistono diverse classi
di GLUT situate su diversi tessuti. Alcune di queste classi
dipendono dall'insulina, altre sono insulino-indipendenti.
L'ingresso del glucosio nei tessuti intestinale, pancreatico,
epatico, cerebrale, nei globuli rossi e nel rene è
completamente indipendente dall'insulina, quindi il trasporto
dipende soltanto dalla concentrazione di glucosio. Nel
muscolo scheletrico e cardiaco a riposo e nel tessuto adiposo
si trovano i trasportatori GLUT-4 dipendenti dall'insulina. In
questi tessuti GLUT-4 si trova immagazzinato in vescicole
dentro al citoplasma. Con l'arrivo dell'insulina, quindi in
presenza di alte quantità di glucosio, nel muscolo scheletrico
e cardiaco a riposo e nel tessuto adiposo AKT provoca la
fusione delle vescicole di GLUT-4 con la membrana. Il
tessuto adiposo è sempre dipendente dall'insulina, mentre il
muscolo scheletrico e cardiaco la situazione cambia a seconda
se questi tessuti siano a riposo oppure in esercizio. Nel
muscolo scheletrico e cardiaco in esercizio l'ingresso del
glucosio diventa insulino-indipendente perché GLUT-4
subiscono una modifica e vengono liberati dalle vescicole che
li tenevano sequestrati nel citoplasma anche in assenza di
insulina. Questo è il motivo per cui le persone diabetiche o
insulino-resistenti devono fare attività fisica, perché solo con
l'esercizio riusciranno a far entrare il glucosio nei propri
tessuti.
L'insulina è in grado di attivare una fosfodiesterasi che
trasforma il cAMP, che è il secondo messaggero del
glucagone, in AMP. Questo è un altro meccanismo col quale
l'insulina spegne tutti gli eventi accesi dal glucagone.
Gli alcaloidi, come la caffeina, la teobromina, la teofillina,
sono inibitori competitivi della fosfodiesterasi che
assomigliano molto all'AMP ciclico. L'AMP ciclico,
rimanendo in circolo, prolunga gli effetti iperglicemizzanti del
46
glucagone. Il cAMP è anche un secondo messaggero
dell'adrenalina, che ha come bersaglio il muscolo cardiaco,
quindi eccedere con gli alcaloidi può avere effetti negativi.
L'insulina attiva una fosfatasi che defosforila tutte le proteine
che erano state fosforilate dalla PKA. La citrato liasi,
coinvolta nella sintesi degli acidi grassi, è fosforilata e
inattivata dal glucagone ed è defosforilata e attivata
dall'insulina. Viceversa, gli enzimi che sono attivati mediante
fosforilazione dal glucagone vengono inattivati mediante
defosforilazione dall'insulina.
Glucagone e insulina sono anche in grado di indurre o
reprimere la trascrizione di importanti enzimi che
sovrintendono alle vie del metabolismo del glucosio. La
glucosio 6-fosfatasi è indotta dal glucagone e repressa
dall'insulina. Per contro, la piruvato chinasi è indotta
dall'insulina e repressa dal glucagone. La glucochinasi,
responsabile della sintesi del glicogeno, viene indotta
dall'insulina e viene repressa dal glucagone.
L'esochinasi è l'enzima della glicolisi. La glucochinasi è
invece responsabile della glicogenosintesi. Sono due enzimi
che catalizzano la stessa reazione, cioè la fosforilazione del
carbonio 6 del glucosio. L'esochinasi è un enzima costitutivo,
sempre espresso in tutte le cellule, con una cinetica del tipo
Michaelis-Menten. La glucochinasi è un enzima inducibile,
che viene indotto dall'insulina, ed è presente solo negli
epatociti. Se non c'è un'alta glicemia il gene della glucochinasi
è spento. La glucochinasi è un enzima allosterico: quando la
concentrazione del glucosio aumenta, passa ad una
conformazione che ha una maggiore affinità per il substrato.
Questa cooperatività tiene conto del fatto che mentre
l'esochinasi ha una piccola Km per il glucosio, la glucochinasi
ha un'alta Km per il glucosio. La Km è la concentrazione di
substrato a cui la velocità è ½ Vmax. L'esochinasi si satura già
a piccole concentrazioni di glucosio, inoltre viene inibita dal
glucosio 6fosfato stesso. La glucochinasi ha un'affinità minore
dell'esochinasi e non viene inibita dal suo prodotto, quindi ad
alte concentrazioni di glucosio la glicolisi si spegne e si
accende la glicogenosintesi.
L'enzima responsabile della glicogenolisi epatica è la
glicogeno fosforilasi. La glicogeno fosforilasi subisce sia una
regolazione ormonale che allosterica. La glicogeno fosforilasi
viene fosforilata su una serina dalla PKA ed assume la
conformazione a (attiva). Il glucosio è un inibitore allosterico
dell'enzima. Quando vi è il glucosio, l'enzima subisce un
cambio conformazionale tale che espone il gruppo fosforilato
all'attività di una fosfatasi comandata dall'insulina che lo
defosforila. La glicogeno fosforilasi passa così in una
conformazione b (meno attiva). Di conseguenza la
glicogenolisi epatica rallenta se la glicemia è elevata.
Anche la glicolisi e la glucogenesi sono regolate dall'insulina
e dal glucagone. Il fruttosio 2,6-bisfosfato è il regolatore
allosterico di queste due vie metaboliche e non è un
intermedio di nessuna via metabolica. Questo regolatore si
comporta da attivatore per la fosfofruttochinasi, un enzima
chiave della glicolisi, e da inibitore allosterico della fruttosio
1,6-bisfosfatasi, un enzima che regola la glucogenesi.
Siccome glicolisi e glucogenesi avvengono nello stesso
citoplasma, le concentrazioni intracellulare del fruttosio 2,6-
bisfosfato determinano la prevalenza dell'una o dell'altra via.
Se c'è molto fruttosio 2,6bisfosfato viene spinta la glicolisi,
mentre viene inibita la glucogenesi. Le concentrazioni di
questa molecola vengono decretate da un enzima
bifunzionale, un enzima tandem. Questo enzima è un'unica
catena polipeptidica composta da due domini: un dominio
chinasico e un dominio fosfatasico. L'enzima tandem funziona
come fosfatasi se la PKA lo fosforila. Come fosfatasi è capace
di convertire il regolatore in fruttosio 6-fosfato. Se questo
succede la glucogenesi sarà più attiva e la glicolisi meno
attiva. Al contrario, il dominio chinasico si attiva quando
l'insulina ne comanda la defosforilazione. Quando viene
attivato il dominio chinasico, si riforma il fruttosio 2,6-
bisfosfato a partire dal fruttosio 6fosfato.
Dopo un pasto, l'insulina prende il sopravvento e la
glucogenesi viene spenta. Lontano dal pasto, nel nostro
sangue prevale il glucagone, perché la glucogenesi dev'essere
attivata. L'attivazione e l'inattivazione della glucogenesi da
parte del glucagone e dell'insulina avvengono anche a livello
genico. Il glucagone aumenta la concentrazione del glucosio
del sangue fosforilando la glicogeno fosforilasi e quindi
attivando la glicogenolisi, defosforilando il fruttosio 2,6-
bisfosfato e quindi attivando la glucogenesi, e attivando la
trascrizione della fosfoenolpiruvato carbossichinasi e la
glucosio 6-fosfatasi. La regolazione genica è una regolazione
a lungo termine. Nell'epatocita, PKA fosforila e inattiva SIK2,
mentre fosforila e attiva CREB su ser-133. CREB fosforilata,
CBP e il suo paralogo p300 e CRTC2 vanno nel nucleo,
formando un complesso che si lega a CRE, un enhancer della
trascrizione, attivando la trascrizione del gene della
fosfoenolpiruvato carbossichinasi. L'insulina contrasta il
glucagone attraverso AKT, che fosforila altri residui di SIK2
attivandola. SIK2 fosforila CBP/p300 e CRTC2. CRTC2
fosforilata viene ubiquitinata e indirizzata alla degradazione
da parte del proteosoma. L'ubiquitina è un'etichetta che
indirizza le proteine alla degradazione proteosomica. Il
proteosoma è un enzima proteolitico formato da molte
subunità, che ha una parte interna dove ci sono molti residui
proteolitici. Se CRTC2 viene degradata non si forma il
complesso che porta alla trascrizione del gene della
fosfoenolpiruvato carbossichinasi, quindi viene inattivata la
glucogenesi.
Variabilità
La variabilità in un laboratorio di analisi può alterare il
risultato di un'analisi. La variabilità totale (Vt) di un risultato
di laboratorio deriva dalla somma di tre tipi di variabilità:
• Variabilità pre-analitica: si riferisce a tutti gli errori
effettuati prima del dosaggio. Primissimo fattore importante
di variabilità pre-analitica è un campionamento sbagliato.
Nella maggior parte delle analisi di laboratorio bisogna evitare
l'emolisi, solo in alcuni casi bisogna emolizzare il campione
per provocare la fuoriuscita del contenuto dei globuli rossi
nella provetta, come quando bisogna dosare l'emoglobina
totale o l'emoglobina glicata. Se il prelievo viene effettuato
troppo in fretta o con un ago troppo sottile può avvenire
l'emolisi. Nei casi in cui è avvenuta emolisi elevata il siero
assume un colore rosso intenso. L'emoglobina altera il
risultato della proteinemia e fa interferenza con alcuni
dosaggi.
Un'altra causa di variabilità pre-analitica può essere
l'interferenza da farmaco. Se il paziente sta assumendo
farmaci per qualche altra patologia di cui è affetto, si può
avere interferenza e ottenere un risultato non attendibile. Il
laboratorio ha una banca dati, che presenta anche la storia
clinica sulla salute e sulle abitudini di vita di ciascun paziente.
Alcuni analiti sono influenzati dalla dieta. L'ananas ad
esempio è un tipico frutto che può interferire con i dosaggi.
Ulteriori fattori, come lo stress, le emozioni, il digiuno,
l'attività fisica, la gravidanza, possono determinare alterazioni
che sono alla base della variabilità pre-analitica.
Dopo il prelievo, ma ancora prima del dosaggio, possono
ancora avvenire alterazioni che dipendono:
dall'accettazione dei materiali, nel caso in cui viene accettato
un campione (plasma, siero, urine) non idoneo;
dal trasporto, nel caso in cui vengono effettuati prelievi a
domicilio oppure nel caso in cui il campione dev'essere
trasportato da una parte all'altra della struttura ospedaliera. Il
trasporto intramurale, quando il campione dev'essere
trasportato dal sito di prelievo al sito di analisi nella stessa
struttura, viene effettuato da un infermiere o da personale
specializzato, con un contenitore in un alloggiamento idoneo.
Nel caso dei trasporti extramurali, quando bisogna trasportare
il campione dal luogo del prelievo al luogo di analisi in
un'altra struttura, bisogna utilizzare preucazioni particolari,
quali ghiaccio sintetico o azoto liquido e contenitori schermati
per i prodotti radioattivi. L'emolisi può avvenire anche nel
momento del trasporto;
dalla conservazione, nel caso in cui passa del tempo tra il
prelievo e il dosaggio;
dalla manipolazione, nel caso in cui bisogna eseguire attività
particolari sul campione prima di effettuare il dosaggio.
Per arginare la variabilità pre-analitica il personale addetto ai
prelievi e al trasporto deve prestare attenzione, bisogna
osservare le regole di manipolazione e di conservazione dei
campioni, e il paziente stesso deve osservare regole, quali il
digiuno la mattina del prelievo. Nel caso in cui il prelievo non
è stato effettuato in maniera corretta bisogna scartare il
campione. La variabilità pre-analitica non ha valore numerico.
• Variabilità biologica: è una fonte ineliminabile di
variabilità e dipende dal metabolismo del paziente. La
variabilità intraindividuale dipende dal metabolismo
individuale del paziente, ossia dalle fluttuazioni casuali
attorno al valore omeostatico dei parametri biochimici. Per
alcuni analiti la variabilità biologica intraindividuale è molto
ampia. Nel caso dei trigliceridi, in media vi è il 20% di
variabilità intraindividuale. Il glucosio è una molecola la cui
omeostasi è mantenuta maggiormente sotto controllo (4-6% di
variabilità intraindividuale).
La variabilità interindividuale è la variabilità di un parametro
biochimico che vi può essere tra due persone, ed è dovuta a
fattori quali il sesso, l'età e l'etnia.
47
• Variabilità analitica: la variabilità analitica interessa metodo che sia preciso e accurato, ossia che i risultati siano
gli errori effettuati al momento del dosaggio. Una certa raggruppati e che lo siano intorno al valore “vero”.
variabilità analitica è sempre ammessa ed è casuale. L'accuratezza è legata al tipo di metodo scelto. Se il metodo
non è specifico, il risultato non sarà mai accurato.
Misura della variabilità
Per la variabilità biologica e la variabilità analitica vi è un Errore
valore numerico. Allontanati i campioni prelevati in maniera Qualsiasi misura sperimentale è affetta da errore. Tuttavia si
non corretta e arginata la possibilità di variabilità pre- distinguono vari tipi di errore.
analitica, la variabilità totale di un risultato in un laboratorio è Un errore grossolano è un errore caratterizzato da uno
legata la variabilità analitica e quella biologica. sbaglio accidentale, come utilizzare una soluzione al posto di
_______ un'altra, ed è un errore che non dovrebbe mai succedere.
Vt = √Va + Vb
2 2
Un errore sistematico è un errore che ha una causa
Siccome la variabilità biologica è ineliminabile, per abbassare conosciuta o ricavabile e si presenta ogni qualvolta si esegue
la variabilità totale bisogna agire sulla variabilità analitica. Lo la misurazione. Esso può dipendere ad esempio dalla bontà
scopo principale di un laboratorio di diagnostica sanitaria è della preparazione delle soluzioni che si stanno utilizzando.
quello di rendere quanto più possibile ininfluenti gli errori che Se la soluzione di una molecola si è denaturata o ha subito
si fanno al momento del dosaggio. delle alterazioni l'errore sarà sempre lo stesso.
Si ammette come buon traguardo analitico quello di avere una Un errore casuale è l'unico errore ammissibile in un
variabilità analitica che sia al massimo uguale alla metà della laboratorio. Per casualità in laboratorio si intende quel minimo
variabilità biologica, cioè che la variabilità analitica di variabilità ammessa che tiene conto della deviazione
contribuisca a meno del 12% della variabilità totale. standard.
Per arginare la possibilità di variabilità analitica bisogna
scegliere metodi adatti. I metodi nei laboratori sono Controllo di qualità
caratterizzati da sensibilità, specificità e accuratezza, e devono
La qualità in un laboratorio bisogna essere garantita e
essere scelti in maniera tale da garantire un risultato quanto
mantenuta sotto controllo. La qualità si crea sicuramente
più attendibile.
formando personale competente e scegliendo metodi analitici
La precisione ci dà la misura della bontà di un metodo. Un adeguati. La qualità creata dev'essere mantenuta sotto
metodo è preciso quando i risultati si distribuiscono vicino al controllo. Il controllo di qualità è d'obbligo in tutti i laboratori.
valore medio. La misura grafica e quantitativa della precisione
Il controllo di qualità mantiene sotto controllo la variabilità
di un metodo è la curva gaussiana, caratterizzata da media e
pre-analitica. Ci sono due tipi di controllo di qualità: il
deviazione standard. La curva di Gauss non è un grafico
controllo di qualità interno ed esterno.
caratterizzato da ascissa e ordinata, ma è un istogramma di
frequenze. L'istogramma si ottiene calcolando la differenza tra controllo di qualità interno (CQI) è intralaboratoriale ed è
Il
il valore massimo e il valore minimo e dividendo per il richiesto per legge.
numero di classi imposte (di solito cinque), ottenendo Decreto legge 14 gennaio 1997: Tutti i laboratori, pena
l'ampiezza di ogni classe. Per ogni classe si annota poi la chiusura, devono attivare un sistema di controllo di qualità
frequenza, che sarebbe il numero di misure che ricade interno (CQI).
nell'intervallo della classe considerata. La curva di Gauss si Per eseguire un CQI bisogna disporre di sieri certificati
traccia poi unendo i punti medi dell'istogramma di frequenze. calibranti, che per composizione fisica e chimica sono il più
La deviazione standard (σ) è la radice quadrata della possibile vicini a quelli dei campioni in esame. Questi valori
sommatoria delle determinazioni meno la media al quadrato, teorici devono coprire l'ambito dei valori di concentrazione sia
fratto i gradi di libertà, che sono il numero delle normali che patologici. I risultati ottenuti dal CQI devono
determinazioni meno 1. La deviazione standard è la distanza essere presentati all'autorità regionale. La carta di controllo
media dei dati dalla media. La media aritmetica è la è un tipo di CQI. Per ogni analisi, a intervalli di tempo, si
sommatoria delle determinazioni fratto il numero delle esegue un dosaggio su un siero di controllo, per almeno 20
determinazioni. La variabilità analitica può essere espressa giorni lavorativi consecutivi. Il risultato deve avere anzitutto
come coefficiente di variabilità analitica: una distribuzione gaussiana, poi bisogna calcolare M e σ e
riportarli su un grafico. Su questo grafico si rappresenta la
CV = σ/M · 100
media come una linea orizzontale, e si disegnano altre quattro
Una buona gaussiana è indice di un metodo preciso ed è una righe a +2 σ, +3 σ, -2 σ e -3 σ. Le linee +2 σ e -2 σ sono i limiti
curva stretta, con tutti i risultati raggruppati intorno alla fiduciali. Se le determinazioni ricadono all'interno
media. Con la gaussiana si dimostra la precisione del metodo, dell'intervallo rappresentato dai limiti fiduciali, il metodo è
con la rappresentazione “a bersaglio” si dimostra se i valori sotto controllo e l'unica variabilità del metodo è quella
sono vicini al valore vero, e quindi l'accuratezza del metodo. casuale. Questo intervallo è chiamato intervallo di controllo.
Se i valori sono raggruppati il metodo è preciso. Se però sono Se i valori ricadono nell'intervallo di controllo, ma sono tutti
raggruppati, ma non sono vicini al valore vero, il metodo è progressivamente crescenti o decrescenti il metodo non è sotto
preciso ma inaccurato. Nei laboratori si auspica l'utilizzo di un controllo perché vuol dire che sta accadendo qualcosa

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nell'arco delle misurazioni. Se i valori ricadono tutti
consecutivamente sopra o sotto alla media il metodo non è
sotto controllo perché non vi è alcuna variabilità casuale.
La valutazione esterna di qualità (VEQ) è interlaboratoriale
ed è appannaggio dei laboratori migliori. I migliori laboratori
decidono di sottoporsi a un programma di controllo di qualità
esterno a livello regionale o nazionale per ricevere
un'accreditazione (o accreditamento).

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