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Meiosi

• Le uniche cellule che possono andare incontro a meiosi sono le cellule germinali
• Produce i gameti aploidi contenenti 23 cromosomi

• Per prima cosa la cellula germinale diploide duplica il proprio genoma e si prepara al processo di meiosi presenta 46
cromosomi, ognuno raddoppiato in due cromatici fratelli che portano gli stessi alleli

• Al termine della prima divisione meiotica si generano due cellule aploidi duplicate;

• Queste cellule vanno incontro ad una seconda divisione meiotica che genera, in totale, quattro gameti aploidi

• Gli eventi importanti sono:

◦Assortimento indipendente: i gameti di origine materna e paterna vengono assortiti in modo casuale nei gameti
anche senza crossing-over si generano gameti con composizione allelica diversa

◦Crossing-over: avviene durante la profase della meiosi I e consiste in scambi di regioni di DNA tra cromatidi non fratelli
di cromosomi omologhi
pachitene

possibili Gameti
Struttura dei cromosomi
• I due cromatidi fratelli sono uniti nel centromero dove è presente il complesso proteico del cinetocore al quale si legano i
microtubuli delle fibre del cinetocore

• A livello del centromero sono presenti le coesine che tengono uniti i cromatidi fratelli; esse vengono tagliate durante la
segregazione mediante la separasi

Gametogenesi maschile Gametogenesi maschile

Spermatogoni (1)
diplomi Oogonio (1)
diploide

v
Spermatocita primario (1)
diploid Oocita primario (1)
diploide

prima divisione meiotica prima divisione meiotica

Spermatociti secondari (2) aploide



duplicati Oocita secondario (1)
aploide duplicato

Globulo polare (1) eliminato

seconda divisione meiotica

seconda divisione meiotica


Spermatidi (4)
Arnold

i
Ovulo maturo (1)
APLOIDE
Spermatozoi maturi (4)
aploide

1Secondo globulo polare (1) eliminato

!!! Gli oociti primari rimangono fermi al diplotene della prima profase meiotica, dopo la pubertà raggiungono la metà fase
seconda e se non c’è fecondazione viene eliminato la meiosi viene completata solo dopo la fecondazione

Errori di non disgiunzione


Possono essere:

Mitotici

◦A carico di un eterosoma

45 mononomica cariotipo a mosaico

46 XX 47 xxx trinomica cecene Aneuploidi

◦A carico di un autosoma

‣ Le linee monosomiche vengono eliminate si riscontra solo la linea trisomica

‣ Se avviene durante la seconda divisione di segmentazione si generano due linee cellulari euploidi (dalla cellula che
non ha avuto errori nella disgiunzione, una trisomica ed una monosomica che viene eliminata

Meiotici

A carico di un autosoma.

2 gameti meccanici 2 zigotemanosomici

I divisione maiolica 2 gonna anomia 2 zagaretrescamici

I divisione monetica metà euploidi normali 2 zigoli normali

un
gamete di sonico 1 zigote insonnia

un gamete Nuccisonico 1 zigote monosomico

A carico di un eterosoma

‣ Nella gametogenesi femminile se avviene durante la seconda divisione meiotica si può generare una cellula uovo
disomica per X (se tutte e due rimangono nella cellula uovo) oppure una nullisomica per X (se tutte e due
rimangono nel globulo polare)

‣ Nella gametogenesi maschile se la non disgiunzione avviene alla prima divisione meiotica si ottengono

• Due gameti con nessun cromosoma sessuale quando fecondano uovo daranno zigote 45, X0

• Due gameti con tutti e due i cromosomi sessuali quando fecondano uovo daranno zigote con tre eterosomi

Le non disgiunzioni meiotiche a livello della gametogenesi maschile o femminile possono portare a cariotipi patologici
aneuploidi come:

◦Cariotipi aneuploidi maschili 47,XXY (Klinefelter)

◦Cariotipi aneuploidi femminili 47,XXX (tripla X), 45,X0 (Turner), 47,XYY (Jacobs), 48,XXYY (Klinefelter-simile)

I soggetti derivati da monosomia dell’Y non nascono

Osservazione del cariotipo


1. Prelievo di sangue intero

2. Coltura in vitro a breve termine proliferazione dei globuli bianchi che di solito sono in fase G0

3. Aggiunta di terreno di coltura e di fitoemoagglutinina proliferazione mitotica del maggior numero di cellule possibile. Si
parla di coltura asincrona perché i globuli bianchi rispondono al mitogeno con tempi diversi

4. Dopo 2-3 giorni si blocca in metafase mitotica tramite colchicina


5. Lavaggio e centrifugazione

6. Trattamento con soluzione ipotonica per fare uscire i cromosomi dalle cellule

7. Seminazione sul vetrino di una parte del volume della soluzione e colorazione con Giemsa

Si ottiene in questo modo uno schiacciato metafisico mitotico che permette, grazie alla colorazione di distinguere:

◦Bande scure ricche di Adenina e Timina (2 ponti a idrogeno)

◦Bande chiare ricche di Guanina e Citosina (3 ponti a idrogeno)

Si ordinavano poi i cromosomi in ordine di grandezza dall’1 (il più grande) al 22 (che in realtà non è il più piccolo in quanto è il
21) si è evidenziato che sono presenti 22 coppie di autosomi e una coppia di eterosomi.

!! Il profilo di bandeggio, che ha risoluzione di 5-10 Mb, per uno stesso cromosoma sarà lo stesso tra individui diversi in quanto
questa risoluzione non permette di vedere le differenze tra gli individui che sono a livello di sequenza di basi

Morfologia dei cromosomi dell’uomo


Ogni cromosoma presenta un braccio corto (p) e un bracco lungo q; a seconda della posizione del centromero ogni
cromosoma ha una morfologia specifica e si possono distinguere:

◦Cromosomi metacentrici (1, 2, 3) i due bracci sono quasi uguali


◦Cromosomi submetacentrici (4,5) braccio corto e braccio lungo
◦Cromosomi acrocentrici (13,14,15,21,22, Y) il braccio corto è molto esiguo in dimensioni

Mutazioni cromosomiche e anomalie cromosomiche


◦Traslocazione reciproca passaggio di DNA da un cromosoma all’altro (non cromosomi omologhi)

‣ Se una traslocazione reciproca avviene tra cromosomi acrocentrici si parla di fusione centrica e si origina un
cromosoma con entrambi i bracci lunghi e l’altro non viene rilevato

◦Inserzione spostamento di una regione di un cromosoma su un’altro, determina quindi un cromosoma più corto ed
uno più lungo del normale

◦Delezione se avviene a livello delle regioni telomeriche porta ad un cromosoma ad anello (es. cromosoma 20
attacchi epilettici); può essere terminale o anche interstiziale (all’interno dei due bracci

◦Inversione:

‣ Pericentrica: spostamento di una regione di un braccio che va poi ad attaccarsi in maniera invertita sull’altro
braccio

‣ Paracentrica: la regione si sposta all’interno dello stesso braccio

◦Isocromosomi: quando i cromatidi fratelli si dividono in senso orizzontale al posto che verticale in un gamete vanno
i due bracci corti nell’altro i due bracci lunghi

Gametogenesi con inversione e crossing over.

• Inversione paracentrica:

◦ Ad esempio, i due cromatidi fratelli contengono rispettivamente gli alleli

Q bc d e 7,9 A BeD C F G

no inversione per inversione


in seguito a crossing over si originano i seguenti gameti:

◦Uno con cromatidio normale


perché contare sia A B ma a b
◦Uno dicentrico con duplicazione e delezione
per
gli aerei e G
◦Uno con inversione

◦Un frammento acentrico

Il cromatidio normale e il cromatidio con inversione possono portare sviluppo di embrione, mentre quello dicentrico e
acrocentrico daranno origine ad aborto spontaneo. Un individuo che porta un’inversione potrà avere una patologia se
essa avviene su determinati geni importanti, altrimenti può anche essere sana.

• Inversione pericentrica:

◦ Porta ai seguenti gameti:

‣ Uno con cromatidio normale la gravidanza procede


‣ Due con cromatidio anormale che porta delezione e duplicazione aborto spontaneo

‣ Uno con inversione come prima dipende dal gene

Trisomie del 13, 18 e del 21


• Nella maggior parte dei casi un cariotipo trisomico per un autosoma non è compatibile con lo sviluppo dell’embrione
aborto spontaneo.

• Nel caso del 13, 18 e 21 invece è compatibile in quanto essi sono cromosomi molto piccoli e non ci sono quindi tantissimi
geni.

• I bambini hanno comunque un ritardo mentale perché il SNC possiede geni per il suo sviluppo in tutti i cromosomi

• In particolare abbiamo:

◦Trisomia del 21: sindrome di Down 11700


◦Trisomia del 18: sindrome di Edwards
116000 1110000 ne mancano molto pochi
◦Trisomia del 13: sindrome di Patau 1112500 1121.700
La sindrome di Down può avvenire:

◦Per una non disgiunzione meiotica durante le gametogenesi di madre e padre

◦Per una non disgiunzione mitotica cariotipo a mosaico, prima avviene durante la gestazione maggiore sarà la
percentuale di cellule con la trisomia; ci sono soggetti con trisomia del 21 che sono sani in quanto la percentuale di
cellule aneuploidi è molto bassa

Traslocazione robertsoniana (fusione centrica)


• Le traslocazioni che coinvolgono i cromosomi acrocentrici (13,14,15,21,22) sono dette robertsoniane.

• È possibile distinguere cromosomi del gruppo D (13,14,15) e del gruppo G (21,22)

• Come dicevamo prima, si forma un cromosoma con entrambi i bracci lunghi e uno scompare

• L’individuo con una traslocazione di questo tipo può essere sano e portare un cromosoma 21 normale e uno con due bracci
lunghi (uno del cromosoma 21 e uno di un altro cromosoma del gruppo G o D) avrà 45 cromosomi e non 46 perché uno
non viene rilevato in seguito all’inversione

• I gameti prodotti da un genitore con 45 cromosomi possono essere:

◦Normali zigote si sviluppa correttamente

◦Può portare il cromosoma con i due bracci lunghi, uno del 21 e uno di un altro cromosoma l’individuo sarà portatore
bilanciato (come il genitore)

◦Può essere diploide per il braccio lungo del 21 porterà a trisomia del 21

◦Può mancare completamente il cromosoma 21 aborto spontaneo

Ricapitolando, quando uno dei due partner ha una traslocazione bilanciata del cromosoma 21:

◦25% bambini con cariotipo normale

◦25% bambini portatori bilanciati

◦25% bambini Down (46 cromosomi, ma tre copie del braccio lungo)

◦25 % aborto spontaneo per monosomia

Quando invece la traslocazione avviene tra cromosomi acrocentrici uguali:

• Se avviene a livello del cromosoma 21 il soggetto avrà un cromosoma 21 costituito da due bracci lunghi del 21

• Esso può produrre solamente gameti non corretti:

◦Gamete con un numero corretto di cromosomi (23), ma dato che contiene due bracci lunghi del 21 è come se fosse
disomico per il 21 si crea uno zigote trisomico per il 21 bambino Down

◦Gamete senza copie del 21 si crea zigote nullisomico per il 21 aborto spontaneo

Riassunto casistiche della sindrome di Down


• Nella maggior parte è dovuto a non disgiunzione meiotica nella mamma

• 1/4 deriva da non disgiunzione meiotica del papà

• 4% deriva da traslocazione dovuta a traslocazione trasmessa da un genitore portatore bilanciato

• 1% ha cariotipo a mosaico dovuto a errori di non disgiunzione mitotica.

Sindrome cri du chat


• È una sindrome cromosomica dovuta ad una delezione del braccio corto del 5

• Colpisce 1/50.000 nati

• Grave ritardo mentale e ritardo nello sviluppo psicomotorio

Citogenetica.

Ibridazione molecolare (FISH)


• Sfrutta l’ibridazione, ovvero l’appaiamento tra due filamenti di acido nucleico che determina annealing (=legare). Se in una
provetta iene inserita una sequenza di RNA complementare ad un tratto di DNA in determinate condizione si lega.

• Si compie in diverse fasi:

◦Denaturazione dovuta ad alta temperatura o variazioni di pH filamenti singoli di DNA

◦Sintesi di una sonda complementare ed antiparallela marcata con isotopi (in passato) o sostanze fluorofore

◦Si aggiunge la sonda marcata nella provetta ed essa che si lega con la sequenza complementare ed antiparallela

• Può essere usata per cercare un gene di cui conosco la sequenza, per localizzare una delezione oppure un’inserzione
cromosomica (se la sonda non si lega nella posizione giusta) oppure per mappare i geni sui cromosomi

• Si può realizzare anche in interfase, non solo nello schiacciato metafasico utile per diagnosi prenatale

• Fa utilizzo di differenti sonde:

◦LSI: specifica per un determinato locus/gene

◦CEP: centromeric probes per riconoscere una coppia di cromosomi identificando il centromero

◦T-probe: si ibridano con una regione subtelomerica e sono specifiche per il braccio p o q di ogni cromosoma

Approfondimento: regioni subtelomeriche


Il cromosoma è formato da una regione telomerica con:

◦20-30 kB con sequenza telomerica ripetuta

◦100-300 kB di unità ripetute associate al telo ero

◦Regione subtelomerica posta verso il centromero, viene riconosciuta dalla sonda

La regione subtelomerica può essere associata a casi di ritardo mentale non evidenziabile con analisi di cariotipo

Indagine citogenetica
Può essere sia analisi prenatale, sia caratterizzazione post-natale; quella prenatale è effettuata su campioni di villi coriali
attorno alle 8-10 settimane di gestazione oppure su cellule del liquido amniotico prelevato attorno alle 15-16 settimane. In
quest’ultimo caso si parla di cellule di sfaldamento che vengono coltivate e bloccate in metafase.
nooooo io io
Il surnatante (il liquido) non viene buttato, ma usato per test biochimici su determinati ormoni.

Citogenetica tumorale
Alcuni tumori sono caratterizzati da un assetto cromosomico anormale:
• Leucemia mieloide cronica:

◦caratterizzata da traslocazione 9-22 presentano un cromosoma 22 molto corto detto cromosoma Philadelphia

◦La regione terminale del braccio lungo del cromosoma 9 contiene il gene ABL (Abelson) che codifica per
proteinchinasi; quando questa si sposta sul braccio lungo del 22 va sotto il controllo del promotore del gene BCR che
è molto forte e determina una over espressione del gene della tirosinchinasi che determina lo sviluppo di questo tumore

• Linfoma di Burkitt:
◦Dovuto a traslocazione 8-14

◦Il gene MIC (braccio lungo del cromosoma 8) si sposta vicino al gene IgH che codifica la catena pesante delle
immunoglobuline (braccio lungo del cromosoma 14) MIC viene controllato dal promotore forte dell’IGH e causa
iperproliferazione

Cromosomi sessuali

• Cromosoma X 250 milioni di coppie di basi (uno dei più grandi)

• Cromosoma Y 50 milioni di coppie di basi (uno dei più piccoli)

• I due eterosomi in realtà non sono totalmente diversi, presentano nelle porzioni terminali dei bracci le regioni pseudo
autosomiche, in prossimità delle quali c’è il gene AMGX (per il cromosoma X) e AMGY (per il cromosoma Y) che codificano
entrambi per amelogenina (proteine smalto dei denti) hanno delle similitudini

Inattivazione della X
• Il maschio esprime sia i geni della X sia quelli della Y; la femmina esprime solo i geni di una X perché l’altra viene inattivata

• A livello della inner cell mass della blastocisti, ovvero le cellule che originano il feto, si ha un silenziamento casuale di uno
dei due cromosomi X

• Avviene tramite la produzione di RNA non codificante XIST che determina l’inattivazione; questo è seguito dalla metilazione
del DNA dipende da meccanismi epigenetici di regolazione dell’espressione genica.

• XIST è un long non-coding RNA di circa 17 kB che viene prodotto dal cromosoma X stesso e si lega ad altre regioni del
cromosoma

• A livello del cromosoma X che non viene silenziato delle proteine si legano a XIC (il centro di inattivazione del cromosoma X)
e fanno in modo che non venga inattivato.

• Casi particolari:

◦Nei cariotipi 47,XXY (Klinefelter) e 47,XXX (tripla X) viene comunque mantenuto un solo cromosoma X attivo.

◦Se si ha un cromosoma X strutturalmente anormale viene di solito inattivato lasciando attivo quello normale

◦Nel caso di una traslocazione di una porzione di un cromosoma X su un altro cromosoma si inattiva il cromosoma X
integro perché altrimenti si silenzierebbe anche l’autosoma al quale si è legato si avrebbero effetti gravi.

Genetica mendeliana

• Locus: è la posizione del gene sul cromosoma


• Gene: porzione di DNA che codifica per un prodotto
• Allele: una delle due forme alternative del gene all’interno di uno stesso locus
• Omozigote: quando porta due alleli uguali
• Eterozigote: quando porta due alleli diversi
• Caratteri monofattoriali: determinati da un singolo fattore, ovvero da un singolo gene

OSSERVAZIONI di MENDEL

Pianta pura Pianta pura F1 tuned alla seconda generazione prevale sempre
alto un fenotipo ma compare anche l'altro

stelo alto stelo basso stelo trono con rapporto 3 1

percapire se una pianta con fenotipo dominante è OMOZIGOTE AA oppureETEROZIGOTE Aa

incrocio con Recessivo e QQ

A a A A se

a Aa aa
se eterozigote 50
a Aa Aa
omozigote tutti

con un fenotipo e 50
e
fagli con lo stesso

a Aa aa con l'altro a Aa Aa fenotipo

Eredità autosomica recessiva

• I soggetti affetti possono essere sia maschi sia femmine

• Maschi e femmine possono trasmettere il gene (a meno che non porti a morte prima dell’età riproduttiva)

• ll carattere può saltare le generazioni

• I genitori dell’individuo o sono affetti o sono eterozigoti per il carattere

• Esempi di malattie autosomiche recessive


◦Anemia falciforme
‣ In genere i genitori sono portatori sani eterozigoti

‣ Mutazione a livello del gene che codifica per la catena β dell’emoglobina nel 6° codone del 5° esone GAG
(acido glutammico) è sostituito con GTG (valina)

◦Albinismo
‣ Autosomica recessiva dovuta ad un enzima che non viene prodotto bene

◦Fibrosi cistica (CF)


‣ I bambini oggi riescono a raggiungere l’età adulta anche se non arrivano a 40 anni

‣ Il gene della malattia è il gene CFTR il cui locus si trova sul braccio lungo del cromosoma 7 e codifica per una
proteina che ha una funzione importante negli epiteli di rivestimenti i bambini producono molto muco che deve
essere aspirato

Eredità autosomica dominante

• Colpisce sia i maschi sia le femmine, che trasmettono il carattere con la stessa frequenza

• Le generazioni successive sono affette

• La trasmissione si interrompe quando nessuno della generazione prima è affetto

• Un esempio è la sindrome di Marfan


◦Il gene malattia si chiama Fbn1, è localizzato sul braccio lungo del cromosoma 15 e codifica per la fibrillina
◦Ha espressività variabile a livello fenotipico può dare problemi cardiaci, al sistema muscolare scheletrico,
delocalizzazione del cristallino ecc.. a seconda di dove si ha la mancanza della fibrillina

◦Si può effettuare una biopsia cutanea dei soggetti e mettere in coltura i fibroblasti per effettuare analisi di immuno-
fluorescenza se si rileva fluorescenza i fibroblasti producono fibrillina, altrimenti l’individuo è malato

Espressione genica sui cromosomi sessuali


Non sono ancora state individuate malattie legate all’Y, ma sono state individuate caratteristiche fenotipiche legate ad esso
come ad esempio le orecchie pelose (dovute ad una mutazione di un gene che si trova sull’Y).

Malattie genetiche X-Linked recessive

• Il carattere è sempre espresso nel maschio perché ha una sola X

• Nelle femmine è espresso in omozigosi

• È trasmesso da madre (eterozigote o omozigote) al figlio affetto

• Una femmina affetta ha un padre affetto ed una madre affetta o eterozigote

Tra esse troviamo:

◦Emofilia:
‣ Causata da una mutazione del gene che codifica per il fattore della coagulazione

‣ Di solito è trasmessa da una donna portatrice alle figlie (che non saranno malate, ma portatrici) o ai figli (che
saranno invece malati); un padre malato invece non trasmette la malattia a nessun figlio, ma tutte le figlie saranno
portatrici sane

◦Distrofia muscolare di Becker e di Duchenne


‣ Sono entrambe dovute ad una mutazione del gene che codifica per la distrofina, una proteina dimerica la cui
porzione ammino-terminale interagisce con l’actina e quella carbossi-terminale con complessi proteici a ridosso
della membrana plasmatica

‣ Se le mutazioni sono relative alle porzioni terminali C e N si ha la Duchenne con fenotipo più grave

‣ Se le mutazioni sono relative alla parte intermedia della catena si ha la Becker con fenotipo meno grave

Malattie genetiche X-Linked dominanti

• Il carattere è espresso nelle donne in singola copia

• Nei maschi ha effetti molto più gravi

• Alti tassi di aborto spontaneo a causa di mortalità precoce nei maschi

• Trasmessi dal maschio a tutte le figlie ma non ai figli

• Un esempio è l’ipertricosi generalizzata

Assortimento indipendente.

Secondo tale principio due fattori (geni) responsabili di due diversi caratteri assortiscono indipendentemente l’uno dall’altro
geni localizzati su cromosomi diversi si comportano indipendentemente in meiosi durante la formazione dei gameti.

La conseguenza dell’assortimento indipendente è la possibilità di ottenere nella progenie combinazioni di fenotipi diverse da
quelle presenti nella generazione parentale.

Due caratteri sono indipendenti quando si trovano su cromosomi diversi perché se risiedono sullo stesso cromosoma
segregano insieme e non si può quindi avere combinazioni alternative rispetto ai fenotipi parentali (senza considerare crossing
over)

Osservazioni di Mendel

Mendel notò che incrociando piante con caratteristiche fenotipiche differenti (seme liscio dominante, rugoso recessivo e seme
giallo dominante, verde recessivo) la maggior parte dei figli esprimerà i due caratteri dominanti, in quantità minore uno
dominante e uno recessivo e infine le piante doppio recessivo sono quelle in numero minore il rapporto è 9:3:3:1 per
quanto riguarda AB:Ab:aB:ab

Inoltre:

◦incrociando il doppio diibrido (AaBb) con un doppio omozigote recessivo si realizza un test cross 4 fenotipi, ma in
percentuale uguale.

◦Incrociando un altro test cross con un doppio diibrido per altre 2 caratteristiche alla F2 si ottengono solo due fenotipi
75% dominante e 25% recessivo; incrociando poi il doppio diibrido che dava questo incrocio con un doppio recessivo
ottenne 2 classi fenotipiche in proporzioni uguali

Mendel comprese che se il doppio diibrido dà due classi fenotipiche in proporzione 3:1 le classi fenotipiche sono 1:2:1

Caratteri associati

I caratteri sono associati quando sono posti in loci appartenenti allo stesso cromosoma. L’associazione può essere:

◦In CIS sullo stesso cromosoma si trovano l’allele dominante di A e di B

◦In TRANS sullo stesso cromosoma ci sono sia l’allele dominante sia quello recessivo (Ab e aB)

Incrociando un doppio diibrido con un omozigote recessivo si ottengono tre classi fenotipiche: 200 AB, 100 Ab, 100 aB
facendo il test cross notava due classi che al 50% presentavano un carattere dominante e uno recessivo e il restante 50% il
contrario.

Quando due caratteri sono associati in cis si ottengono classi fenotipiche in proporzioni 3:1 e al test cross 2 classi fenotipiche
presenti nella stessa percentuale (50% doppio dominante, 50% doppio recessivo)

Quando due caratteri sono associati in trans si ottengono tre classi fenotipiche (2 AB, 1 Ab, 1 aB)

Tra due caratteri associati può avvenire crossing over se due caratteri sono associati in cis e c’è CO si possono ottenere i
gameti parentali AB e ab ma anche i gameti ricombinati aB e Ab, se in trans i gameti parentali sono Ab e aB e i ricombinanti
AB e ab. Il crossing over non avviene tra caratteri completamente associati in genere, ma tra caratteri sufficientemente distanti
perché possa avvenire CO.

per ogni processo di meiosi si formano 4 gameti e per ogni crossing over 2 gameti parentali e 2 ricombinanti.

UTILE PER ESAME:


◦Quando un incrocio viene fatto tra un doppio diibrido e l’omozigote recessivo il risultato del test cross dà quattro classi
7 fenotipiche in percentuale uguale i due caratteri sono indipendenti

a
◦Se si imposta un test cross tra un doppio diibrido e l’omozigote recessivo e da ciò si ottengono 2 classi fenotipiche O
presenti nella stessa percentuale si deduce che sono associati in cis

Combinazioni alleliche letali


Si ha aborto spontaneo nel caso delle monosomie autosomiche (non compatibili con lo sviluppo embrionale), mentre quelle
degli eterosomi a volte sono compatibili con la vita.

Un esempio è il nanismo acondroplasico (MIM 100800):

◦Acondroplasia vuol dire che i soggetti affetti nascono come nani perché un tipo di cartilagine non si è sviluppato
correttamente

◦È una patologia ereditaria, autosomica dominante e a penetranza completa

◦I soggetti nati non sono mai omozigoti perché l’omozigosi (AA) è letale

◦È una malattia rara (1/25000) in cui il gene malattia si trova sul braccio corto del cromosoma 4 e subisce una mutazione
puntiforme (glicina sostituita con arginina) che codifica per un recettore espresso sulle cellule del connettivo e che
inibisce la crescita ossea

◦Spesso è dovuta a mutazioni de novo

Alleli multipli

Possono produrre variazioni del fenotipo un gene Può presentare diverse varianti in una popolazione e non si può
prevedere il numero totale di forme alleliche di un gene di una popolazione.

Ad esempio la fibrosi cistica può presentare 1500 mutazioni diverse e non tutte provocano gli stessi sintomi

Rapporto tra alleli di uno stesso locus

◦Dominanza incompleta: quando i soggetti con fenotipo eterozigote hanno fenotipo indistinguibile da quello di un
omozigote per l’allele dominante

◦Dominanza incompleta: un allele è dominante sull’altro ma non completamente i soggetti eterozigoti hanno
fenotipo intermedio tra quello dei due omozigoti

◦Codominanza: due alleli di un locus si esprimono contemporaneamente negli eterozigoti, il cui genotipo presenta
entrambi i caratteri


es gruppoSANGUIGNO Iata Io A Ia I AB
Io O

IBI IB B

Genotipo e penetranza

Il fenotipo non dipende solo dal genotipo, ma anche da influenze ambientali interne ed esterne.

La percentuale di individui con un certo genotipo che mostra il fenotipo corrispondente è detta penetranza. Si parla di
penetranza completa quando è pari al 100%, di penetranza incompleta quando è inferiore al 100%.

La penetranza dipende anche dalle etnie.

Es. Brachidattilia (disordine che riguarda le dita delle mani e dei piedi; è dominante e ha una penetranza del 50-80%)

Polidattilia (disordine dove il soggetto ha un numero diverso di dita delle mani o dei piedi; penetranza dell’80%)

Eterogeneità genetica
Mutazioni di geni diversi possono determinare lo stesso fenotipo malattia quando una malattia monogenica è caratterizzata
dalla mutazione di un singolo gene che però può variare tra gli individui

Es. Agenesia dentale quando i soggetti nascono senza qualche dente; può essere dovuta ad una mutazione del gene
MSX1 oppure del gene PAX9
Amelogenesi imperfecta manca lo smalto del dente dovuto alla mutazione di uno dei geni che lo produce; se è mutata
l’amelogenina si parla di trasmissione X linked

Geni mitocondriali
Il DNA mitocondriale è più piccolo di quello nucleare (circa 16600 coppie di basi), è circolare e ili numero di copie è variabile in
ogni cellule. Esso non presenta istoni né introni, non effettua crossing over, ha un’elevata esposizione ai radicali liberi
dell’ossigeno ed è meno capace a correggere gli errori.

Esso contiene 37 geni: 22 per tRNA, 12 per proteine della catena respiratoria, 2 per rRNA.

Il DNA mitocondriale è ereditato esclusivamente per via materna in quanto lo spermatozoo contribuisce allo zigote solo con il
patrimonio genetico le malattie associate al DNA mitocondriale sono ereditate solo dalla madre.

Dato che la segregazione dei mitocondri avviene in modo casuale si hanno effetti fenotipici differenti in base a dove giungono i
mitocondri malati (particolarmente dannosi a livello nervoso e muscolare)

Genetica del cancro

Una cellula somatica diventa una cellula tumorale quando subisce una serie di mutazioni a livello dei geni importanti per la
proliferazione la cellula perde il controllo del proprio ciclo proliferando in modo non controllato. La formazione della massa è
un processo multistep.

I geni tipici coinvolti sono i geni che intervengono nel controllo del ciclo cellulare della cellula somatica. Prendendo l’esempio
dei fibroblasti, essi sono in genere fermi in fase G0 e vengono mantenuti in questa fase mediante regolatori negativi della
proliferazione. Quando essi devono proliferare, ricevono un segnale che consente il passaggio in G1 e poi in S dovuto
all’ativazione dei regolatori positivi della proliferazione.

Quando in una cellula si ha una mutazione su uno dei regolatori positivi c’è una mutazione che genera un aumento di funzione
di essi (gain of function); essi sono chiamati protoncogeni e quando mutano prendono il nome di oncogeni.

Quando invece si ha una perdita della funzione dei geni soppressori tumorali (regolatori negativi) si parla di loss of function.

Esempi di protooncogeni da ricordare sono: il gene per il recettore di EGF, il gene che codifica per PDGF-β, i geni JUN, MYC
e FOS (geni della proliferazione), il gene che codifica HRAS, il gene che codifica la tirosin-chinasi Abelson1.

Alcune tipologie di mutazione possono essere:

◦Amplificazione genica: ER2 viene amplificato portando alla formazione del carcinoma mammario o ovarico;
l’amplificazione di MYCN è associato al neuroblastoma

◦Mutazione puntiforme: colpisce il protooncogene HRAS con formazione del carcinoma del polmone, della vescica
ecc; il protoncogene KIT è associato ad un tumore gastrointestinale

◦Traslocazione (riarrangiamenti cromosomici): esempi sono il linfoma di Burkit (traslocazione di MYC) e la leucemia
mieloide cronica (9-22; è stato trovato un farmaco chiamato Glivec che inibisce l’attività della tirosin-chinasi che
determina questa malattia)

Un tumore può essere ereditato (circa il 5% dei casi) oppure può essere una forma sporadica. Per quanto riguarda quello
ereditato può essere che un soggetto nasca con un allele mutato a carico di un gene oncosoppressore e basta che nella vita
accumuli una seconda mutazione somatica sull’altro allele di quel gene per sviluppare il tumore si parla di teoria del
doppio colpo di Knudson.

Esempi di tumori con predisposizione ereditaria sono:

• Il retinoblastoma:

◦È un tumore pediatrico che colpisce la retina

◦È coinvolto il gene Rb1 che in genere rimane legato al fattore di trascrizione E2F delle cellule e le mantiene in fase G0.
Quando arriva uno stimolo esterno Rb1 viene fosforilata, si stacca da E2F e la cellula prolifera

◦I bambini affetti usualmente nascono già con una mutazione a livello di Rb1 (forma ereditaria) e basta che accumulino
un’altra mutazione a livello dell’altro allele di Rb1 nella retina per originare questo tumore

• Sindrome di Lynch: un soggetto nasce eterozigote per uno dei geni MSH2 o MLH1 codificano per le proteine che
mantengono l’integrità del genoma (regolatori negativi della trascrizione)

• Sindrome di Li-fraumeni: mutazione di p53


• Tumore di Willis

Carcinoma mammario
◦È molto frequente nella donna, ma può essere anche presente nell’uomo

◦È dovuto a modificazioni a livello dei geni tumor suppressor BRCA1 e BRCA2; i soggetti portatori costituzionali hanno
più probabilità di ammalarsi

◦Quando il medico vede una mutazione anche di un solo allele di questi geni può considerare anche la mastectomia per
evitare il problema

Approfondimenti
Cromosomi X e Y

• Il crossing-over avviene solo a livello delle regioni pseudo-autosomiche in quanto molto siili (tra X e Y)

• Nella gametogenesi maschile gli eterosomi vengono silenziati per evitare errori MSCI Meiotic Sex Chromosome
Inactivation. Avviene mediante modificazioni epigenetiche degli istoni che vengono man mano sostituiti dalle protamine,
ovvero proteine basiche ricche di arginia e cisteina che favoriscono la condensazione della cromatina necessaria per il
passaggio da spermatiche a spermatozoo

Gemelli

• Monozigoti un solo ovocita fecondato da un solo spermatozoo si separa prima di raggiungere l’utero e dà quindi origine a
due individui con le stesse sequenze di DNA, gli stessi alleli, lo stesso genoma e lo stesso cariotipo

• Dizigoti uno spermatozoo feconda un oocita e un altro spermatozoo feconda un altro oocita e dà quindi origine a due
fratelli diversi con diverso cariotipo, genoma e sequenze di DNA

Anomalie dello sviluppo


• Quando un ovulo fecondato contiene solo due genomi femminili e nessun genoma maschile si origina teratoma ovvero una
massa di tessuti differenziati in maniera casuale tumore embrionale

• Quando un ovulo fecondato contiene 46 cromosomi, ma tutti paterni si forma la mola idatiforme; essa è unìiperplasia del
trofoblasto associata ad una degenerazione dei villi coriali ed ha un’influenza di 0,5/1000 gravidanze. I fattori di rischio sono
l’età troppo giovane o troppo vecchia della madre e l’età troppo vecchia del padre. Essa può essere di diversi tipi:

◦Mola completa (60-80% dei casi)

‣ 46 cromosomi tutti del padre; può essere dovuto ad una degenerazione di quelli della madre con conseguente
duplicazione di quelli del padre oppure dalla fecondazione di due spermatozoi di uno stesso uovo

‣ Non porta ad embrione perché mancano quelli della mamma

◦Mola parziale (20-40% dei casi)

‣ Cariotipo triploide con 46 cromosomi del padre e 23 della madre 69,XXX 69,XXY 69,XYY

‣ Il blocco della polispermia non ha funzionato

‣ L’embrione si forma parzialmente

◦Mola ricorrente il cariotipo dellla mola è normale ed è infatti dovuto all’omozigosi della madre per i geni NLRP7
oppure KHDC3L
Genomica

• Heterochromia Iridis individui che presentano differente colorazione degli iridi; può essere dovuta ad una mutazione
somatica di uno dei geni responsabili del colore degli occhi

• Gene dell’avventura variante del gene dopamine receptor D4 presente in una persona su quattro; le persone sono più
avventurose proprio per la presenza della variante DRD4-7R

• Malattia multifattoriale quando intervengono più fattori (genetico+ambientale)

• I gemelli monozigoti presentano lo stesso patrimonio genetico, tuttavia possono avvenire mutazioni postzigotiche che
determinano condizioni patologiche in un gemello e non nell’altro

• OGM sono organismi vieneti che possiedono patrimonio genetico modificato mediante la tecnologia del DNA
ricombinante; esempi sono:

◦Flavr Savr Tomato pomodoro con guscio più duro che ne permette il trasporto anche da maturo

◦Arctic Apple mela che non si ossida

◦Soia resistente agli erbicidi

◦Granturco che sintetizza insetticida naturale

◦Golden rice lo si rende in grado di produrre β-carotene, un precursore della vitamina A

◦Sweet Potato fare produrre le vitamine alle patate

• Diagnosi molecolare:

◦Permette di identificare individuare le mutazioni che causano determinate patologie. La mutazione si identifica mediante
l’elettroferogramma sul quale si osserva una traccia del DNA e si evidenziano eventuali mutazioni mediante il
confronto con individui sani.

◦Per identificare riarrangiamenti cromosomici si utilizza la multicolor FISH (fluorescence in situ ibridation) che permette
di ottenere un’immagine nella quale i diversi cromosomi acquisiscono un colore differente

◦L’identificazione dei geni malati è possibile mediante la Next Generation Sequency ce permette di ottenere le sequenze
di basi di una porzione di Genoma

• Acondroplasia nanismo congenito dovuto a mutazione a livello del cromosoma 4 che permette la produzione di FGFR3
(recettore del fattore di crescita dei fibroblasti)

• Modelli animali
◦Gene BRCA1 (tumore al seno) è studiato nei topi

◦Aniridia (malformazione congenita dell’occhio che determina ipoplasia dell’iride) è dovuta ad una mutazione del gene
PAX6. Per il suo studio è utile il topo small eye (che porta mutazione per questo gene) e la drosophila si è scoperto
che PAX6 è un master gene

• Green fluorescent protein


◦È prodotta naturalmente da una medusa ed è è stata inserita in alcuni animali per farli diventare fluorescenti (Alba
Rabbit e Zebra Fish)

◦È utile per seguire la localizzazione di una proteina codificata da un gene malattia all’interno della cellula in quanto si
può unire alla regione codificante della proteina la regione codificante per GFP e in questo modo la proteine sarà
marcata proteina di fusione (o chimerica)

◦È utile per verificare la buona riuscita di un trasferimento genico

• Clonazione
◦Permette a partire dalla cellula somatica di un organismo di ottenerne uno geneticamente identico

◦Prelievo nucleo da cellula somatica impianto in cellula uovo non fecondato impianto in utero di madre surrogata
che porta avanti la gravidanza

• Gatto calico
◦È quasi sempre una femmina perché presenta sia colore arancione sia nero, questo avviene quando si ha eterozigosi
del carattere che è legato al cromosoma X. Ne consegue che i maschi potranno presentare uno solo dei due colori
(hanno una sola X), mentre nelle femmine si una un mosaico (meta delle cellule esprime una X materna, mentre metà
una X paterna nelle varie zone a seconda della X si esprimerà un dato colore.

◦Infatti, copy cat non è calico come la gatta donatrice perché l’inattivazione avviene in modo casuale e lui è uscito grigio

• Genome editing tecniche come la Crispr-CAS9 permettono virtualmente di modificare qualsiasi punto del genoma (es.
mutazioni di un nucleotide, invertire una sequenza da mutata a wild type); è tuttavia difficile da applicare dopo la nascita in
quanto la mutazione è localizzata nelle cellule dell’organismo e non solo in una

• Synthetic Genomic si può sintetizzare in laboratorio il genoma di alcuni batteri per poterne creare nuove tipologie utili
all’uomo (es. batteri che degradano la plastica ecc..).

Le tecnologie del DNA ricombinante

Ottenere frammenti di DNA


• Si effettua un prelievo di sangue attraverso il quale si isolano i linfociti e si isola il DNA genomico dell’individuo; quando
basta poco DNA si può prelevare da mucosa boccale o cellule della saliva

• Per spezzettare il DNA si possono utilizzare metodi meccanici (es. ultrasuoni, stress meccanici ecc.) oppure gli enzimi di
restrizione. Essi vengono prodotti dalle cellule batteriche come mezzo di protezione contro l’attacco dei virus e sono in
grado di tagliare il DNA in corrispondenza di determinate sequenze palindromiche. Tra gli enzimi di restrizione troviamo:

◦EcoR1 (escherichia coli) estremità protrudenti 5’, riconosce GAATCC

6 bp taglia quindiogni 46 basi


◦HE3 estremità piatte, riconosce GGCC
in media ogni 4 basi
◦PST1 estremità che protrudono in 3’
taglia

Elettroforesi
• Si allestisce gel di agarosio che funge da maglia molecolare durante la migrazione delle molecole

• Si praticano dei pozzetti nell’agarosio nel quale si inserisce il DNA tagliato

• Si ripone il tutto in una vaschetta di plexiglass con soluzione tampone contenente elettrodi di platino le molecole di DNA
cariche negativamente si spostano verso il polo positivo

• Viene utilizzato del colorante (bromuro di etilio) che emette fluorescenza per vedere dove si trovano le varie parti di DNA

DNA ricombinante
• Si pongono in una provetta due molecole di DNA trattate con gli stessi enzimi di restrizione che, tagliando le stesse
sequenze palindromiche, determinano la formazione di estremità protudenti complementari queste estremità si appaiano

• Si inserisce una DNA-ligasi per fare in modo che si formi un legame forte tra le basi

• In questo modo si genera una molecola di DNA formata da porzioni provenienti da individui differenti

1980 Berg vinse il premio nobel per questo

Plasmide
• Il vettore utilizzato per la produzione di DNA ricombinante è il plasmide, ovvero la molecola accessoria di DNA circolare
posta nei batteri

• Esso possiede resistenza a determinati antibiotici disperdendo nell’ambiente l’antibiotico solo le cellule che hanno
ottenuto il plasmide resistono; possiede inoltre sequenze palindromiche che possano venire tagliate dagli enzimi di
restrizione

• I plasmidi possono essere della fertilità (conferiscono capacità di coniugazione), che codificano per sostanze tossiche,
degradativi verso alcune molecole, virulenza (conferiscono la patogenicità al ceppo), resistenza (conferiscono resistenza agli
antibiotici)

Con le tecniche di trasformazione batterica i batteri in natura ottengono molecole di DNA esogeno; trattando il batterio con
soluzioni saline di cloruro di calcio si rende maggiormente permeabile il batterio alle molecole di DNA.

Generando molti cloni ricombinanti, ognuno con una differente porzione di DNA si può creare una libreria genomica
metodo utilizzato per ill Progetto Genoma Umano (è stato prima digerito, poi si sono creati decine di migliaia di cloni
ricombinanti e infine ognuno di essi è stato sequenziato).

Clonazione di RNA
• Non è possibile clonare RNA come tale ma è possibile trasformarlo in DNA e clonare questa copia.

• Per la clonazione è preferibile usare RNA perché il sesso rispetto al DNA non contiene sequenze non codificanti ha
dimensioni minori, ma la stessa informazione genetica. L’RNA viene purificato e si ottengono molecole di RNA
poliadenilate, caratteristica sfruttata per farla legare ad una seguenza oligo-T.
• Vengono poi aggiunti i 4 desossiribonucleotidi e la trascrittasi inversa molecola di cDNA a singolo filamento; questo
filamento in genere tende a ripiegarsi ad un’estremita e ciò rende più facile la trascrizione ma rende più difficile un
successivo clonaggio si deve rimuove il pin con nucleasi S1 (e si ha quindi perdita di informazioni). Oggi in realtà sono
stati creati metodi più efficienti che non prevedono l’utilizzo di nucleasi, ma permettono la sintesi discontinua del secondo
filamento.

PCR (polimerase chain reaction)


1985
• Inventata da Kary B. Mullis che per questo vinse il premio Nobel nel 1993

• Vengono sintetizzati in laboratorio i primer, ovvero delle sequenze di 18-25 nucleotidi che sono complementari alle porzioni
terminali del frammento da duplicare

• Si porta la temperatura a 100° i due filamenti si separano

• Si porta la temperatura a 50° per fare appaiare i primer al filamento

• Si porta la temperatura a quella di azione della DNA polimerasi termofila si lega e inizia la sintesi della porzione
complementare al frammento

• Le copie che si possono ottenere sono moltissime circa un miliardo ogni 30 cicli circa

• Per vedere se è stata effettuata correttamente si compie elettroforesi su gel di Agarosio

• Limiti:

◦Funziona in condizioni ottimali per frammenti da 3/4mila fino a 10mila nucleotidi

◦La polimerasi utilizzata non è così fedele come le altre

◦Ci possono essere contaminazioni

• Tramite PCR si possono amplificare le regioni codificanti di un gene, ad esempio per andare a produrre la proteina
codificata in determinati organismi; inoltre amplificando le regioni geniche di un individuo che si pensa abbia avuto una
delezione o un’inserzione si amplifica con PCR e si fa correre su gel di agarosio (anche se di solito le mutazioni sono
puntiformi ed è quindi necessario sequenziare per vederle)

RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR)


È una tecnica che al posto di utilizzare DNA utilizza RNA che viene poi convertito in cDNA e infine amplificato. In questo modo
vengono considerati solamente le sequenze codificanti si può quantificare il livello di trascrizione del gene interessato.

I livelli di trascrizione di un gene possono anche variare nei vari momenti dello sviluppo, come accade ad esempio per il gene
DSCAM (molecola di adesione importante durante la migrazione neuronale)

Studio dei genomi di organismi estinti

La PCR permette di amplificare delle piccole porzioni di DNA ritrovate su organismi estinti sintetizzando in vitro dei
polinucleotidici complementari che si attaccano alle estremità dei frammenti. In questo modo si può arrivare anche al
sequenziamento completo del DNA di un organismo estinto (es. Neanderthal). L’organismo più antico è un progenitore del
cavallo, ma ci sono moltissimi buchi.

Sequenziamento del DNA


1977
• Walter Gilbert e Fredrick Sanger ricevono il premio Nobel nel 1980 per la scoperta dei metodi di sequenziamento del DNA.

• Sequenziare vuol dire determinare la sequenza nucleotidica di un frammento di DNA.

• Il metodo di Gilbert è il metodo chimico, ma fu abbandonato pochi anni dopo in quanto poco efficente e prevedeva l’ultilizzo
di sostanze dannose per il ricercatore

• Il metodo di Sanger invece è il metodo enzimatico e prevede l’utilizzo di terminatori che impediscono alla DNApol di
allungare la catena; i terminatori sono specifici per ogni base si fanno correre con elettroforesi i frammenti che si formano
e si legge il risultato a partire dal basso

• Dal 1986 in poi è tutto al computer, si ha una lettura automatizzata delle sequenze di DNA e si usano molecole fluorescenti e
non più radiottive; il risultato è un elettroferogramma con picchi colorati che corrispondono alla presenza di un determinato
nucleotide

Indurre cellule a produrre proteine

• Grande rilevanza in campo medico, ma anche per la ricerca

• I farmaci ottenuti da DNA ricombinante sono in circolazione a partire dagli anni ‘80 e a partire dal 2015 circa 350 milioni di
pazienti ne hanno fatto uso per tumori, malattie immunologiche e cardiovascolari 63 miliardi di giro di affari

• Per fare in modo che un batterio produca la proteina di interesse bisogna clonare la regione codificante per la proteina e
inserirla in un vettore plasmidico che dovrà presentare necessariamente una sequenza promotrice a monte del gene di
interesse. Il vettore viene poi inserito nella cellula batterica che produrrà la proteina codificata dalla regione inserita. La
clonazione avviene mediante RT-PCR.

• Nelle cellule eucariote è più complicato, ma anche in questo caso si inserisce il DNA esogeno mediante trattamento con
soluzioni di calcio. Sono necessarie le eucariote a volte per le modificazioni post-traduzionali che esse effettuano

Inserire geni in un organismo complesso


• I geni possono essere inseriti anche in organismi complessi es. topo.

• Si clona il gene di interesse tramite vettori in batteri e una volta ottenuta la molecola di DNA ricombinante la si inserisce nel
nucleo dello spermatozoo prima che si unisca a quello dell’oocita fecondato; si impianta poi questo zigote in una madre
surrogata e si genera quindi un topolino che conterrà in tutte le cellule il gene di interesse

• In questo modo è possibile ottenere topi knock-out, ovvero in cui viene annullata la funzione di uno dei suoi geni per
capirne il funzionamento. Ad esempio Mario Capecchi ha vinto il nobel nel 2007 per questa tecnica e ha scoperto che
modificando entrambi i geni WWOX del topo si genera un ceppo che ha incontro ad epilessia se stimolato da determinate
frequenze sonore.

Introduzione alla genomica

La genomica può essere suddivisa in genomica comparativa (che si occupa del confronto tra genomi di organismi diversi per
trovare regioni conservate), genomica funzionale (identificazione dei geni e analisi globale delle loro funzioni) e epigenomica
(riguarda lo studio delle modificazioni ereditabili che non alterano la sequenza del DNA)

In ogni cellula umana sono presenti 23 coppie di cromosomi, una coppia ereditata dalla mamma e una dal papa, per un totale
di 2 x 3,3 miliardi di nucleotidi e di questi solo l’1% corrisponde a regioni codificanti 19.986 geni codificanti per proteine.
Questi geni possono produrre tutte le proteine necessarie al nostro organismo in quanto circa il 90% del nostro genoma è in
grado di produrre tramite splicing alternativo differenti isoforme di una stessa proteina.Al giorno d’oggi si parla di circa
20.000 geni, 280.544 trascritti e 267.226 proteine.

Un altro metodo per generare molti trascritti maturi diversi è quello dei promotori alternativi, che può avvenire
contemporaneamente allo splicing

Date importanti:

◦1953: Watson e Crick scoprono la doppia elica

◦1977: sequenziamento del DNA (Sanger e Gilbert)

◦1985: Kary Mullis inventa la PCR

◦1986: Dulbecco e Hood lanciano l’idea di sequenziare l’intero genoma

◦1990: nasce ufficialmente lo Human Genome Project (HGP) sotto la guida di James Watson

◦2000: Craig Venter e Francis Collins annunciano congiuntamente di are completato la bozza del genoma umano

◦2003: completamente ufficiale la sequenza completa del genoma umano

Struttura dei geni eucariotici


• Il gene più grande è DMD (2.4 MB), il più piccolo tRNA-Glu (69 bp)

• Normalmente hanno una struttura discontinua formata da un’alternanza di esoni ed introni. Il numero degli esoni può variare
da 1 a 363 (nel gene per la titina una proteina con dimensioni enormi)

• La dimensione degli esoni in genere è indipendente dalla lunghezza del gene e si aggira intorno a 100-200 nucleotidi;
l’esone più grande è nel gene APOB (7.6 kB)

• Le dimensioni degli introni dipendono invece dalla lunghezza del gene e possono andare da pochi nucleotidi fino a 1.1 Mb
(introne 5 del gene KCNIP4)

Proteoma e famiglie geniche


Il maggior numero di proteine prodotte dal nostro organismo non sono quelle coinvolte nel metabolismo, ma quella che
interagiscono con il materiale genetico.

Una famiglia genetica è costituita da due o più geni simili per sequenza (o per funzione) originatosi dalla duplicazione di un
singolo gene originale avvenuta nell’evoluzione di un organismo ancestore; in altri casi può raggruppare due o più geni
dissimili ma che partecipano allo stesso processo biologico.

Tra le famiglie geniche più conosciute ci sono:

◦Famiglia genica dei canali del cloro: include tutti i geni e le corrispondenti proteine che regolano il flusso del cloro
nelle membrane cellulari

◦Famiglia genica dell’emoglobina: 10 geni organizzati in due cluster cluster della subunità α (cromosoma 16),
cluster della subunità β (cromosoma 11)

◦Famiglia genica degli ormoni della crescita

A partire da un singolo gene si possono originare differenti membri di una famiglia genica; ciò può avvenire per crossing over
ineguale.

Pseudogeni
Oltre ai 20k geni che codificano che proteina sono anche presenti circa 14.700 pseudogeni, ovvero copie non funzionali di un
gene geni ancestrali che hanno perso la capacita di essere espressi.

Essi rispetto ai geni d’origine presentano mutazioni quali la perdita di un codone di inizio, di segnali di stop nella sequenza
codificante o assenza di regioni regolatorie incapaci di produrre proteine funzionanti.

Pseudogeni processati (10.700)


‣ Privi di introni

‣ No regione regolatoria a monte no promotore no traduzione vengono solo accumulati

‣ Al 3’ hanno un Poli-A

‣ Sono localizzati su cromosomi differenti da quelli in cui è il gene attivo

‣ Sono prodotti grazie a retrotrasposizione: un mRNA non viene tradotto, ma retrotrascritto in cDNA alcuni enzimi
si legano a tale copia per sbaglio e lo inseriscono in un punto a caso del genoma

Pseudogeni non processati (3000)


‣ Si trovano di solito sullo stesso cromosoma del gene funzionante

‣ Hanno origine da un crossing-over ineguale e accumulano una serie di mutazioni che lo rendono inattivo pur
possedendo regioni introniche e avendo a monte un promotore non generano alcuna proteina

RICAPITOLANDO i geni in totale sono circa 60k di cui:

◦20k codificano per proteine

◦15k sono pseudogeni

◦16k codificano per long non-coding RNA (>200 basi)

◦7,6k codificano per small non coding RNA (<200 basi)

Tipologie di RNA
I geni che producono RNA sono di più rispetto ai geni che codificano per proteine; tra essi ci sono:

◦rRNA: vanno a costituire i ribosomi e sono prodotti da circa 600 geni


◦tRNA: sono coinvolti nel trasporto degli amminoacidi durante la traduzione; prodotti da circa 500 geni
◦snRNA e snoRNA: sono classi di piccoli RNA nucleari e nucleolari coinvolti nello splicing e nella maturazione degli
rRNA; sono prodotti rispettivamente da 1900 e 940 geni
◦miRNA: sono piccoli RNA formati da circa 20-22 nucleotidi a singolo filamento con la funzione di regolare la
trascrizione dei mRNA legandosi al loro 3’; sono codificati da 1800 geni
◦Long ncRNA: alcuni hanno funzione nota come XIST (inattivazione cromosoma X) oppure NAT (Natural Antisense
Transcripts distribuiti lungo tutto il genoma e hanno la funzione di nella regolazione dell’espressione genica); più di
16k geni.

Andando a studiare il genoma ci si può imbattere nei geni sovrapposti, ovvero geni che al loro interno contengono altri geni;
sono piuttosto frequenti, circa presenti nel 10% dei geni codificanti proteine.

Sequenze intergeniche

Dal momento che solamente l’1.5% del DNA corrisponde agli esoni, il restante 98,5% è costituito da:

◦Sequenze intrageniche introni

◦Sequenze intergeniche sequenze non codificanti che separano un gene da quello successivo

Tutte queste porzioni non codificanti non sono Junk DNA, ma ha una funzione strutturale e/o regolatoria.

Inoltre, il DNA può essere così ripartito:

◦50% sequenze uniche

◦50% sequenze ripetute, suddivisibili in:

‣ DNA ripetuto in tandem: unità ripetute n volte fino a forme porzioni di diverse kB; tra esse è presente il DNA
satellite (centromero), minisatellite (telomeri) e microsatellite

‣ DNA ripetitivo intertrasverso comprende gli elementi mobili:

• Trasposoni: possono essere sia autonomi, ovvero in grado di muoversi indipendentemente, sia non autonomi
meccanismo taglia e incolla

• Retrotrasposoni: meccanismo copia e incolla

• Sequenze Alu: fanno parte della famiglia dei SINE (short interspersed nuclear elements) e sono sequenze di
circa 300 nucleotidi che si trovano ogni 3000 nucleotidi costituiscono circa il 10.7% del genoma e
permettono una plasticità del genoma

Genoma mitocondriale
Il genoma mitocondriale contiene circa 16.569 nucleotidi e forma una singola doppia elica circolare con circa 2-10 copie.
Esso è per il 93% codificante, non contiene introni ed è formato da 37 geni:

◦22 tRNA

◦13 proteine mitocondriali sono solo una piccola parte di ielle che servono al mitocondrio, vengono sintetizzate
tramite un codice genetico leggermente diverso da quello nucleare (es. UGA non è stop, ma triptofano)

◦2 rRNA

Genomica personale

• Si intende il confronto dei genomi di diversi individui

• È importante distinguere i termini di:

◦Variazioni di sequenza: è il più corretto e generico da utilizzare ogni qual volta, confrontando tra loro diversi genomi,
vengono riscontrate delle variazioni tra essi. Possono essere:

‣ Variazioni di sequenza a singolo nucleotide (SNP): presenza su uno dei due genomi di un particolare nucleotide
e la presenza sul genoma dell’altro genitore di un nucleotide diverso. Sono circa 3 milioni, quindi in media una ogni
1000 nucleotidi.

‣ Variazioni di sequenza dovute a piccole inserzione o delezioni: sono circa 1 milione e quando cadono in regioni
codificanti proteine determinano frame shift

‣ Variazioni che hanno a che fare con regioni più grandi del genoma: si tratta di copy-number variations e
structural variations; comprendono solitamente almeno 1000 nucleotidi, anche se il numero è stato ora
abbassato a 50 sono regioni di almeno 50 nucleotidi presenti in un numero di copie diverso in genomi aploidi
diversi; il numero di copie può essere qualsiasi, incluso lo zero. È la variazione che contribuisce maggiormente alla
diversità tra due genomi circa 10 milioni di nucleotidi. Le conseguenze fenotipiche dipendono dai geni coinvolti.

◦Mutazioni: sono differenze identificate raramente nella popolazione che si sta analizzando (sotto l’1% della
popolazione)

◦Polimorfismi: differenze identificate più frequentemente nella popolazione (in almeno l’1% della popolazione)

• La maggior parte delle variazioni di sequenza cade nelle regioni non codificanti (circa il 90% del genoma), ma possono
anche cadere in regioni codificanti e in questo caso possono dare o meno problemi a seconda del tipo di variazione;

Progetto 1000 genomi


INREALTA2504
• Il progetto 1000 genomi ha identificato circa 80 milioni di variazioni µSNP rispetto la sequenza di riferimento tra le quali:

◦Nella maggior parte dei casi le mutazioni sono rare (frequenza minore dello 0.5%)

◦Circa 12 milioni hanno frequenza compresa tra 0,5% e 5% polimorfismi

◦8 milioni hanno frequenza piuttosto elevata nell’ora popolazione, ovvero sopra al 5%

• Oltre alle variazioni di sequenza ha fatto anche un catalogo delle copy-number variations:

◦In un individuo sono circa 2300, di cui mille sono delezioni di dimensioni considerevoli

◦Due persone non imparentate differiscono circa per lo 0,4% in virtù proprio delle CNV

• Conseguenze fenotipiche legate al CNV:

◦Gruppo sanguigno Rh- negli individui di origine caucasica è dovuta alla presenza di un antigene sulla superficie dei
globuli rossi che è codificato in una regione che si comporta come CNV se si hanno due copie della regione
(omozigote) l’individuo è Rh+; se si ha una copia (eterozigote) l’individuo è Rh+; se non si hanno copie l’individuo è Rh-

◦Gene amilasi I: è deputato alla degradazione degli amidi presenti nella nostra alimentazione alcuni hanno dino a 15
copie del gene, altri ne presentano solo due; in particolare nelle popolazioni che consumano tanti amidi ci sono
maggiori copie del gene.

◦Possono anche essere responsabili di alcune malattie, in particolare due neuropatie periferiche:

‣ Charcot-Marie-Tooth: determina debolezza muscolare in particolare per quanto riguarda i piedi, hanno quindi una
camminata strana tipo orso Yogi.
‣ HNPP formicolii e insensibilità soprattutto nelle mani e negli arti superiori

Derivano entrambe dallo stesso evento mutazionale: non avviene appaiamento corretto durante la meiosi, in seguito a
CO si ha un quindi un gamete in cui si ha la regione duplicata (e determina Charcot-Marie-Tooth), mentre nell’altro
gamete la regione è deleta e determina HNPP

Malattie poligeniche multifattoriali


L’insorgenza di queste malattie è dovuta sia ad una base genetica sia ad una base ambientale; la base genetica corrisponde
alla presenza di variazioni di un certo numero di geni, mentre la base ambientale è dovuta all’alimentazione, allo stile di vita e
all’esposizione a sostanze tossiche.

Molte patologie differiscono tra loro in base al peso dell’incidenza ambientale rispetto alla base genetica vengono condotti
degli studi che prendono il nome di Genome-wide association study (GWAS) che cercano trovare in soggetti con
determinate patologie o che presentano un certo tratto delle variazioni di sequenza maggiori rispetto agli individui di controllo.

Come metodo viene sfruttata l’ibridazione di alcuni oligonucleotidi su microarray in silicio è possibile dire quale variante
presenta l’individuo per ogni locus; se questa variazione è statistica vuol dire che è correlata alla patologia.

In alcuni casi, la variazione statistica significativa non è la variazione causale, ma è posta in regioni non codificanti poste in
prossimità della variazione causale (che è in regioni codificanti).

Un esempio è la variante del gene APOE che è correlata con l’insorgenza del morbo di Alzheimer; esso codifica per una
proteina coinvolta del metabolismo delle proteine ricche in trigliceridi. Esistono 4 varianti e gli individui che presentano la
variante IV hanno un rischio aumentato da 10 a 30 volte di sviluppare Alzheimer entro i 75 anni.

Metodi di sequenziamento tradizionali e Next Generation Sequency


Le tecnologie di sequenziamento si sono molto evolute a partire dallo Human Genome Project: esso richiese 13 anni di lavoro
da parte di 3k ricercatori per un costo di circa 3 miliardi di dollari.

Da allora l’obiettivo è stato quello di riuscire a sequenziare il genoma molto più in fretta e a costi molto più accessibili. Nel
2007 Craig Venter, sempre con il metodo Sanger, in quattro anni e con l’aiuto di 31 ricercatori riesce a sequenziare il proprio
genoma al prezzo di 100 milioni di dollari.

Come obiettivi la NIH, il principale ente di finanziamento delle ricerche in ambito accademico, fissò come obiettivi 100k dollari
entro il 2009 e 1k dollari o meno entro il 2014.

Il sequenziamento mediante il metodo Sanger meramente di sequenziare sia frammenti di DNA ottenuti da PCR sia clonati e
inseriti come vettori in cellule batteriche fino a 96 frammenti di DNA alla volta tramite sequenziatori automatici.

Successivamente sono state sviluppate delle tecnologie di NGS (Next Generation Sequence) o MPS (Massive Parallel
Sequence massive fa riferimento alle quantità enormi di dati analizzati in parallelo).

Queste nuove metodologie prevedono l’estrazione del DNA che viene frammentato (di solito nell’ordine di poche centinaia di
nucleotidi) e si sequenziamento in parallelo ciascuno dei frammenti generati non è necessario il clonaggio genico.

Dato che i dati sono tanti e la probabilità di sbagliare è ampia si sequenziamento ogni regione circa 30 volte.

La ridondanza è importante perché garantisce di riuscire a sequenziare sia gli alleli di origine materna sia quelli di origine
paterna

Dal 2005 sono state sviluppate diverse tecnologie di MPS, il primo è stato lanciato da Jonathan Rothberg in grado di
generare 25 milioni di basi di microorganismi (produttività 100 volte superiore a Sanger); sequenzia anche il DNA dell’uomo di
Neanderthal e perfino di James Watson.

Ricapitolando:

• Venter Metodo Sanger, 4 anni, 100 milioni $

• Watson MPS, 4 mesi, 1,5 milioni $

II IÌ
• Quando si accende una macchina Sanger vengono sequenziati 96 frammenti alla volta
• Quando si accende una macchina NGS/MPS vengono sequenziato 400 mila frammenti in parallelo

I costi si sono abbassati in modo drastico dal 2007 nel 2015 si giunge a 1000 dollari per sequenziare

Carico mutazionale individuale

Ogni individuo ha circa:

• 10k mutazioni missenso proteine con almeno la variazione di un amminoacido rispetto alla sequenza di riferimento

• 10k variazioni di tipo sinonimo cambia il codone ma non l’amminoacido

• 100 mutazioni del tipo loss of function di solito coinvolgono solo un allele e quindi in genere rimane una copia
funzionante

• 10-50 geni mutati in entrambi gli alleli che sono in grado di arrivare ad una patologia di tipo autosomico recessivo po
avere conseguenze se facciamo figli con una persona che a sua volta ha le stesse mutazioni di DNA a carico degli stessi
geni in cui è presente la stessa mutazione nel nostro genoma

• 33 mutazioni de novo di cui in genere solo una cade in una regione codificante

Nel 2010 James Lupski ha effettuata il sequenziamento del proprio genoma ed ha identificato mutazioni in entrambi gli alleli
del suo genoma su loci genici importanti per la regolazione della mielina infatti aveva una neuropatia periferica

Sequenziamento dell’esoma

• L’esoma è l’insieme degli esoni che codificano per le proteine codificate dal nostro genoma circa 180k frammenti di esoni

• Sequenziare solo l’esoma può essere più comodo sia in termini di costi sia in termini di quantità di dati ottenuti

• Per isolare gli esoni essi si possono catturare con sonde specifiche; un metodo alternativo è stato fornito da un’azienda che
ha sintetizzato 294k copie di primer e in questo modo isola il genoma mediante PCR.

Mutazioni del genoma e incidental findings


• Ognuno di noi porta circa 10k variazioni di sequenza che modificano un amminoacido quando devo individuare la
mutazione che causa una malattia dovrò andare a capire quale sarà tra tutte queste. Per fare questo posso osservare i
genomi di più pazienti, in modo da trovare le variazioni comuni, ma anche utilizzare un filtro biologico, ovvero individuare la
mutazione anche in base alla proteina che quel gene produce. In circa il 30-50% dei casi si riesce a trovare il gene malattia.

• Il paziente firma un consenso informato e sceglie anche se vuole venire a sapere di eventuali incidental findings, ovvero di
variazioni di sequenza che potrebbero influire sulla loro salute. Esempi sono :

◦BRCA1 e BRCA2 tumore seno/ovaio

◦APOE Alzheimer

◦LRRK2 Parkinson

Altre informazioni

• Craig Venter fece anche uno studio per identificare come il viso sia influenzato dal genoma ed è riuscito a generare il volto di
una persona a partire solamente dal genoma

• Nello studio dei tumori le NGS sono importanti perché permettono di comprendere i meccanismi molecolari alla base
dell’insorgenza e della metastasi del tumore

• Medicina di precisione tiene conto sia la sequenza genomica dell’individuo sia l’ambiente, ovvero le scelte di vita che
influenzano la salute.

• Progetto UK100thousand sequenziato il genoma di 100k persone in UK

• Progetto All of Us negli US si prevede di sequenziare il genoma di 1 milione di soggetti

• Più che andare a sequenziare l’intero genoma è più utile concentrarsi sui 130 geni che possono presentare mutazioni
mendeliane si amplificano questi geni con PCR e vengono sequenziati sempre tramite NGS ma con macchinari molto più
economici. Questo è utile anche con i tumori perché si può in questo modo fornire al paziente una cura indicata sulla base
della mutazione che ha e non comune a tutti gli altri.

• Sono stati inventati strumenti che utilizzano nanopori su una membrana artificiale all’interno del quale passa un solo
filamento si può analizzare il segnale elettrico proveniente dalle basi e quindi sequenziare in questo modo utile perché
portatili.

Genetica molecolare e medica

Introduzione

• La genetica studia varie diagnosi delle malattie genetiche cioè stati patologici dovuti all’alterazione di tratti di DNA; le
malattie possono essere:

◦Monofattoriali (o monogeniche, mendeliane) manifestano quando un singolo gene è alterato, solitamente per una
mutazione (variante patogenetica)

◦Mitocondriali dovute a leggere mutazioni del DNA mitocondriale

◦Dinamiche (o da espansione) la base mutazionale è particolare

◦Multifattoriali (o multigeniche, complesse) presenza di varianti patogenetiche su più geni

• Le alterazioni possono colpire tutte le nostre cellule; le mutazioni somatiche non vengono ereditate, quelle germinali si

• Malattia congenita presente sin dalla nascita (errata morfogenesi, problematiche durante il parto, trasmissione di un
carattere materno)

• Occorre distinguere:

◦Malattia colpisce un organo o un intero sistema pur avendo effetto sull’intero organismo

◦Sindrome coinvolge più organi a causa dell’espressione del gene alterato

Malattie genetiche monofattoriali


• Sono circa 8k disordini su base mendeliana ma non tutti sono conosciuti

• Possono essere:

◦Frequenti: 1 affetto ogni meno di 2000 individui

◦Rare: 1 affetto ogni più di 2000 individui

◦Molto rare: 1 individuo su 100k/200k

◦Ultra rare: ad esempio se ci sono cinque casi al mondo

Siti scientifici
• OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man): permette di accedere alla banca dati del sapere biomedico mondiale;
digitando una malattia specifica vengono fornite informazioni sul gene mutato, l’impatto fenotipico ecc..

• Orphanet: contiene informazioni sulle malattie orfane, ovvero quelle rare; consultando il sito è possibile risalire al nome di
specialisti cinici o molecolari sia in Italia sia all’estero. È inoltre presente anche un elenco dei famaci orfani, ovvero quelli
creati per le malattie rari, e le linee guida diagnostiche.

Incidenza
• Ogni malattia ha un’incidenza differente sulla popolazione, la sindrome di Down è un di quelle più comuni.

• Tutti noi abbiamo geni potenzialmente pericolosi o danneggiati che possono essere trasmessi e dare luogo alla nascita di
individui affetti

• Alcuni geni sono potenzialmente dannosi, ma solo se vengono a contatto con trigger ambientali (es. Favismo anche se
si ha il gene predisposto la crisi emolitica non si manifesta fino a quando non si circola in campi di legumi in fiore)

• Alcune malattie hanno un onset tardivo, ovvero l’attivazione può avvenire a qualsiasi età.

• Alcuni disturbi hanno poi incidenza diversa a seconda del gruppo etnico, ad esempio l’anemia falciforme negli africani e la
fibrosi cistica negli europei

Tipologie di mutazione
• Le mutazioni possono essere distinte in alterazioni che colpiscono un singolo gene oppure alterazioni che colpiscono il
cromosoma:

◦Le più note sono le mutazioni puntiformi dovute ad alterazioni di uno o pochi nucleotidi all’interno di un gene.

◦Esistono poi mutazioni da espansione, anche dette dinamiche, che determina l’aumento di un frammento di DNA
all’interno di un gene; se l’espansione aumenta la funzione del gene viene perduta.

◦Ci sono poi alterazioni classificate come grossi riarrangiamenti cromosomici e coinvolgono tratti estesi di sequenza
genica (delezioni, duplicazioni, inversioni ecc..) possono anche coinvolgere numerosi geni

• Mutazioni puntiformi
◦Possono essere sostituzione, inserzione/delezione, duplicazione, inversione.

‣ La sostituzione nucleotidica è lo sostituzione di un nucleotide con uno diverso; il suo impatto dipende da dove
cade la mutazione e se altera oppure no un codone all’interno della sequenza codificante

‣ Se un nucleotide viene perso si ha una delezione che determina frame shift se avviene in una regione codificante

‣ L’aggiunta di un nuovo nucleotide prende il nome di inserzione


‣ Quando si aggiunge un nuovo nucleotide uguale ad uno adiacente si parla di duplicazione
◦Sono la causa più frequente i malattie monofattoriali e possono colpire tutte le regioni di un gene sono impattanti se
cadono nelle sequenze codificanti, nelle giunzioni di splicing e nelle sequenze regolatrici (circa 80% dei casi)

◦Se non si trovano mutazioni nella sequenza codificante, è possibile la mutazione sia posta negli introni mutazioni
introniche profonde. Esse si manifestano nell’mRNA del gene se si riscontra mutazione a livello dell’RNA vuo dire
che si ha una mutazione intronica profonda. Molto spesso non tutte le proteine sono presenti nel sangue periferico si
effettua un prelievo cutaneo oppure epatico

◦Grazie alla ridondanza del codice genetico, è possibile che una mutazione di un nucleotide porti comunque ad un
codone che codifica per la stessa proteina mutazione silente in quanto non cambia la proteina. Tuttavia, se ciò
avviene nei siti di splicing può determinare errori a livello della sequenza nucleotidica, e quindi avrebbe un impatto
importante sulla proteina

◦Se un nucleotide viene sostituito e il codone cambia di significato, si parla di mutazione missenso e determina nella
catena proteica la presenza di un altro amminoacido. I polipeptidi in natura possono tollerare un certo grado di
variazione gli effetti possono variare a seconda del gene, della posizione e dell’amminoacido con il quale è sostituito.

◦Se con la sostituzione si genera un codone di stop (UAA, UAG, UGA) si parla di mutazione non senso. Viene generato
un mRNA più corto del previsto e se cade nella sequenza codificante o nelle giunzioni di splicing è sicuramente
patogenetico. Non è detto che vengano create delle proteine tronche in quanto le cellule hanno un meccanismo di
nonsense mediated decay (NMD) che si occupa della degradazione specifica dei messaggeri aberranti si evitano
sforzi biosintetici inutili

◦Il frameshift, ovvero l’alterazione della sequenza di lettura, può essere causato dall’inserzione o dalla delezione di uno
o due nucleotidi; se venissero inseriti/eliminati tre nucleotidi l’effetto dipende dal tipo di amminoacido rimosso/inserito,
ma in genere la proteina perde funzionalità. Inserendo/eliminando amminoacidi si può formare PTC (premature
termination codon of translation) determina o proteina tronca o attivazione di NMD. L’allele mutato è quindi un
allele nullo che porta alla cosiddetta aploinsufficienza funzionale uno dei due alleli non funziona, ma si avrà
comunque un’espressione dell’altro allele.

◦Se una mutazione colpisce il dinucleotide all’inizio o alla fine degli introni determina un errore di splicing ha
sicuramente impatto sull’RNA

◦Mutazioni nelle sequenze regolatrici del promotore


‣ Se colpiscono una zona sul promotore (di 6 nucleotidi) che presenta il sito di legame del fattore di trascrizione Sp1
il gene non si trascrive; pur essendo il gene wild-type l’allele si considera nullo perché non trascrive nulla

‣ Se colpiscono il nucleotide successivo a questa zona il gene si trascrive parzialmente e il fenotipo è molto più lieve

Come insorgono le mutazioni.

1) Tautomeria
• I nucleotidi si possono trovare in diverso stato:

◦Stato frequente: amminico o chetonico

◦Stato raro: imminico o enolico

• Il passaggio da uno stato all’altro prende il nome di tautomeria delle basi ed è dovuto alla cattura di elettroni quando le
basi sono esposte per essere copiate:

◦Un gruppo NH3 può andare a scindere un H dall’azoto transizione amino-imminica

◦Un gruppo chetonico ruba l’idrogeno ad un gruppo imminico e diventa un gruppo alcolico transizione cheto-enolica

• Lo stato raro non è quello confacente per far avvenire l’appaiamento delle basi perché sono cambiati i gruppi reattivi se la
cellula non riconosce il mismatch la mutazione si consolida nel DNA

• Ricapitolando, quando in una duplicazione si ha tautomeria delle basi e il mismatch non viene riconosciuto, quand la cellula
effettua un’altra duplicazione trasmette la mutazione alle due cellule figlie e la mutazione diventa quindi fissata.

• Può essere dovuta anche a fattori ambientali

2) Crossing over è tra le cause endogene di variabilità del DNA

3) Espansione da parte del DNA di tratti già espansi

4) Cause esogene agenti chimici e fisici che alterano la catena di DNA e le basi, ma anche nutrienti e farmaci che
influenzano l’espressione genica mediante cambi epigenetici

Geni malattia
• Solitamente si parla di geni malattia per indicare quei geni che, se alterati da mutazioni di vario tipo, possono generare
fenotipo patologico oggi si parla più spesso di varianti patogenetiche più che di geni malattia.

• Nelle malattie genetiche rare non c’è una mutazione che causa la stessa malattia in tutti gli individui, ma i malati genetici
molto rari hanno quasi sempre delle mutazioni private insorte de novo si parla di eterogeneità allelica per indicare il fatto
che mutazioni in loci diversi possono determinare gli stessi effetti fenotipici.

• Eterozigosi composta: è data dalla presenta di due differenti alleli mutanti nello stesso locus è come se avessi in
eterozigosi due mutazioni diverse che messe insieme causano l’alterazione della funzione di entrambi gli alleli del figlio che
le ha ereditate tutte e due; un esempio è l’anemia falciforme

• Una stessa malattia può essere causata da mutazioni in geni diversi che partecipano alla stessa funzione proteica si parla
di geni relati
• Uno stesso gene può causare l’insorgenza di molteplici malattie completamente diverse in quanto hanno numerosi domini.

Nomenclatura delle mutazioni (esempi a pag 142)

• Il nome del gene può essere sia un acronimo del suo nome sia derivato dal nome dello scopritore

• “c.” definisce la posizione della mutazione sulla sequenza codificante del gene

• “p.” fa riferimento alla posizione dell’effetto della mutazione sulla proteina

• “>” indica una sostituzione nucleotidica es. T>G indica sostituzione di T con G

• “+” indica una mutazione a livello del sito donatore di splicing

• “-” indica una mutazione a livello del sito accettare di splicing


• “fs” indica un frame shift

• “*” indica un codone non senso


• “_” indica da a

Varianti patogenetiche

Polimorfismi a singolo nucleotide (SNP)

• Varianti con frequenza superiore all’1%

• Una banca data per i SNP è dbSNP


• Se invece si tratta di polimorfismi rari o privati si parla di SNV (Single Nucleotide Variation)

• Si pensa che non abbiano impatto patogenetico sul fenotipo; in generale genera il fenotipo malattia in modo non
significativo, ma quando tante variazioni SNP si accumulano possono causare effetti patogenici

• I SNP inoltre possono andare ad impattare su geni mutati aumentando il loro effetto dannoso si parla di geni modulatori
in quanto si ha un gene che contiene varianti non patogeniche che va ad aumentare l’effetto di una mutazione patogenetica
reale

◦Un esempio è la cardiomiopatia ipertrofica che determina ipertrofia della parete del muscolo caridiaco e riduzione di
atri e ventricoli; se a livello del gene che codifica per l’ACE (angiotensin converter enzyme) sono presenti degli SNP la
malattia è molto più grave ACE è un gene modulatura della cardiomiopatia ipertrofica

• Gli SNP hanno impatto anche dal punto di vista farmacogenetico, perché possono influenzare l’affinità di legame del
farmaco con il suo recettore, e nutrigenetico, in quanto influenzano la diversa percezione dei sapori, la preferenza a certi
cibi e anche l’olfatto i geni del gusto e dell’olfatto sono polimorfici in quanto possono essere molto differenti tra gli
individui.

Copy Number Variations (CNVs)


• Grandi riarrangiamenti non casuali del DNA

• Sono circa 58k, costituiscono l’11-12% del nostro genoma e la loro dimensione varia a 1 Kb a 2,5 Mb di lunghezza

• Si generano per eventi di delezione e duplicazione in numero di copie diverse per ogni persona

• Possono trovarsi sia al di fuori dei geni sia dentro i geni stessi

• Un CNV può portare a duplicazione di un gene con conseguente formazione di un nuovo gene es. emoglobina deriva da
mioglobina
• Sono coinvolti sia nell’insorgenza di malattie complesse, sia di malattie mendeliane

!! Una mutazione sopra 50bp viene classificata come CNV, una sotto 50bp rientra invece nelle mutazioni puntiformi

Trasmissione dei caratteri monofattoriali nell’uomo

Malattie autosomiche dominanti

• Causata dall’alterazione di un singolo allele

• Ogni individuo affetto ha genitori affetti a meno che la malattia sia insorta a causa di mutazioni de novo a livello della linea
germinale materna o paterna

• La trasmissione è verticale si manifesta da una generazione alla successiva

• Ogni individuo ha il 50% di probabilità di avere figli malati e il 50% di avere figli sani

• Figli sani di un genitore affetto avranno tutti figli sani

• Individui affetti (maschi e femmine) hanno la stessa probabilità di trasmettere la malattia a figli maschi e femmine

La presenza di una variante patogenetica può portare a due possibili conseguenze:

◦Autoinsufficienza funzionale del gene

◦Alterazione strutturale della proteina

In ogni caso si ha la diminuzione del 50% della produzione della proteina e si possono aggiungere varianti non patogeniche
relate che determinano un fenotipo più o meno severo espressione fenotipica variabile sia intrafamiliare sia interfamiliare
(in questo caso la variabilità è più evidente).

DI fronte a figli affetti e genitori sani si possono essere verificate tre cose:

◦Uno dei due genitori ha la malattia ma non presenta effetti fenotipici (perché espressività molto bassa) penetranza
incompleta

◦Uno dei due genitori ha mosaicismo germinale essendo la mutazione in un clone tutti i figli che nascono da un
gamete che si origina in quel clone saranno affetti

◦Mutazione de novo molto rara, quasi impossibile che avvenga in più figli

!! Può esserci sovrapposizione fenotipica (se variazioni di più geni danno gli stessi effetti fenotipici) e insorgenza tardiva

Un esempio di espressività variabile è la sindrome di Marfan (una connettivopatia ereditaria):

◦Frequenza di 1/35000 nati (anche se è considerata rara)

◦È una patologia multiorgano che determina:

‣ Dislocazione del cristallino

‣ Note dismorfiche del viso

‣ Arti molto lunghi può raggiungere anche l’altezza di 1m

‣ Problemi strutturali scheletrici

◦È dovuta ad una mutazione del gene della fibrillina 1 (FBN1) che si deposita nelle zone di accrescimento dell’osso, nel
cristallino e nei vasi sanguigni. Dato che manca del 50% di fibrillina l’individuo presenta una dilatazione a livello del
seno di Valsava (inserimento dell’Aorta nel cuore) e l’aorta ascendente può dilatarsi a tal punto da disseccarsi e portare
a morte improvvisa

◦In una stessa famiglia si possono presentare molti fenotipi diversi a seconda di quali dei sintomi si mostrano

Il gene della fibrillina ha molti domini, un’altra mutazione può portare a displasia scheletrica acromicrica/geleofisica (una
forma di nanismo) avviene esclusivamente a carico degli esoni 41-42; se avviene sull’ultimo amminoacido di questi esoni si
ha Marfan, fino a quello prima causa displasia.

Un esempio di penetranza incompleta è l’eritermalgia autosomica dominante:

◦Molto rara, ma non severa con stati febbrili transitori

◦Ha espressività così variabile che si può avere la mutazione del gene senza mostrare fenotipo patologico

◦Come le altre patologie a penetranza incompleta è difficile appellarsi all’albero genealogico, si guardano quindi
piuttosto i sintomi

individui con noi completa


Penetranza sintomi

unanime incompleta

portatori
Una delle caratteristiche delle malattie autosomiche dominanti è la sovrapposizione fenotipica, come avviene per le
connetivopatie ereditarie tra le quali troviamo:

◦Sindrome di Marfan

◦Sindrome di Loews-Dietz

◦Sindrome delle arterie tortuose

◦Sindromi di Ehler-Danos

Esse interessano i tessuti connettivi, in particolar modo la cute, la cartilagine, l’osso e i vasi sanguigni; si ritiene che circa il
50% dei pazienti non si possano inquadrare in nessuna delle forme descritte e, dato che spesso non vengono riconosciute, la
loro frequenza sia molto più alta.

Un’altra caratteristica delle malattie autosomiche dominanti è l’insorgenza tardiva del fenotipo, mentre ciò non avviene nelle
malattie recessive sono in genere congenite.

Un esempio è la Corea di Huntington, una malattia neurodegenerativa autosomica dominante che porta a demenza
progressiva: circa il 50% dei pazienti inizia a sviluppare il fenotipo intorno ai 35 anni di età. Questo dipende dall’entità della
mutazione, ovvero dall’espansione dei tratti di DNA del gene se è più espanso si manifesta prima, se è meno espanso si
manifesta dopo.

Inoltre, le malattie possono avere un’insorgenza diversa in base all’area geografica per quanto riguarda la Corea di
Huntington in Giappone 1/333k, negli USA e UK 1/8k.

L’insorgenza tardiva è influenzata anche dall’ambiente e dallo stile di vita il fenotipo è sempre la sommatoria tra fattori
genetici ed ambientali.

Le malattie a trasmissione autosomica dominante quindi sono:

◦Corea di Huntington

◦Sindrome di Marfan

◦Acondroplasia

◦Sindromi di Ehler-Danlos

◦Ipercolesterolemia familiare

◦Sclerosi tuberosa

◦Rene policistico nell’adulto

Malattie autosomiche recessive

• Tra esse sono presenti:

◦Albinismo

◦Emocromatosi

◦Anemia falciforme

◦α- e β- talassemia

◦Fibrosi cistica: è una malattia che colpisce i canali del cloro e determina fenotipi differenti tra i quali troviamo accumulo
di muco a livello del polmone e portare ad infertilità (colpisce i canali seminali maschili); è la seconda malattia
mendeliana più diffusa

◦Sordità: è la malattia mendeliana più frequente a livello mondiale

◦Fenilchetonuria: molto diffusa a livello pediatrico, determina incapacità di sintetizzare fenilanilina si accumula a
livello del nervoso determinando ritardo mentale. Può essere curata tramite dieta povera di fenilanilina ma solo entro il
primo mese di vita

◦Epidermolisi bollosa distrofica: malattia dermatologica molto diffusa

• Caratteristiche delle malattie autosomiche recessive:

◦Sia maschi che femmine possono presentare uguali proporzioni nell’albero genealogico

◦La malattia si trasmette orizzontalmente e si ha in genere salto di generazione


◦I genitori di un paziente malato sono in genere sani in quanto portatori in singola dose del gene

◦Se due individui portatori sani si incrociano hanno 1/4 di probabilità di ottenere individui malati; se un portatore sano si
incrocia con un individui affetto la probabilità è 1/2

◦Sono in genere rare e si manifestano fin dalla nascita

• Sono presenti casi in cui un portatore sano, pur presentando un solo allele recessivo manifesta fenotipo riconoscibile dovuto
alla mancanza del 50% del prodotto funzionale dell’allele. Un esempio è la β-talassemia, una malattia recessiva che si
manifesta quando entrambi i geni della globina β portano mutazioni che li inattivano; tuttavia un portatore sano ad alta quota
oppure durante in immersione subacquea può comunque avere crisi emolitiche in quanto i suoi globuli rosso hanno
dimensione inferiore alla norma.

• Una malattia autosomica recessiva è l’epidermolisi bollosa che comprende 34 tipi di malattie dell’adesione epitelio-
mesenchimale che è costituita da numerose strutture, tra le quali le fibrille ancoranti, codificate da 54 geni possono
essere di molti tipi differenti:

◦EB semplice: lisi a livello dei cheratinociti dell’epidermide


ÈÈÈÈÈfÌÈpo
◦EB giunzionale: lisi alla giunzione tra epidermide e membrana basale

◦EB distrofica: mutazione del gene che codifica per il collagene VII no fibrille ancoranti più severa delle altre

‣ Può essere di 14 tipi, sia autosomica dominante (fenotipo più leggero), sia autosomica recessiva (più severa)

‣ Determina la formazione di bolle e di bolle sulle bolle si forma una cute cicatriziale ritraente che tende ad
inglobare anche le dita delle mani e dei piedi; si ha continua fuoriuscita di siero devono vivere bendati

‣ Processo di cicatrizzazione continuo utilizzo di molte cellule staminali può portare a carcinomi

◦Alcune forme di epidermlisi sono solo transitorie e scompaiono dopo qualche tempo

Malattie X-linked recessive

• Tra esse sono presenti:

◦Emofilia A

◦Deficit di G6PDH (glucosio 6-fosfato deidrogenasi) favismo: crisi emolitiche transitorie quando l’individuo viene a
contatto con le fave o con i pollini

◦Distrofia muscolare di Duchenne

◦Cecità ai colori

◦Malattia di Fabry

◦Albinismo oculare

• Circa un centinaio di malattie legate al cromosoma X cromosoma di dimensione medio-grosse.

• Caratteristiche delle malattie X-linked recessive:

◦È trasmessa obliquamente nelle varie generazioni

◦In genere colpisce il maschio perché essendo XY manifesta sempre un carattere se presente, mentre le femmine no

◦Genitori maschi affetti non trasmettono a figli maschi

◦Genitori maschi affetti trasmettono alle figlie che sono portatrici obbligate

◦Maschi non affetti non trasmettono la malattia ai figli (perché non hanno la mutazione)

◦Figli maschi di donne affette (quindi con due X mutate) hanno il 100% di probabilità di essere affetti

◦Femmine affette possono derivare solo da padre affetto e madre almeno portatrice

◦L’incrocio più comune che genera maschi affetti è tra padri sani e femmina portatrice: i maschi hanno 50% di
probabilità di essere affetti, le femmine 50% di essere portatrici sani

◦Un incrocio tra un maschio affetto e una femmina non affetta produrrà tutti maschi sani e tutte femmine portatrici
obbligate

• Un esempio è la distrofia muscolare di Duchenne (DMD):

◦Assenza di distrofina dovuta a mutazione del gene DYS non è presente collegamento tra endoscheletro,
esoscheletro e fibroscheletro.

◦Onset non tardivo intorno ai 2-4 anni

◦Debolezza nei muscoli prossimali con degradazione progressiva della fibra muscolare che viene rimpiazzata da tessuto
adiposo o connettivo fibroso

◦In genere porta a morte intorno alla terza decade

• Distrofia muscolare di Becker (BMD)

◦Causata come la DMD dalla presenza di distrofina in quantità/qualità differente dal normale

◦Onset variabile

◦Manifestazioni meno severe di DMD e ha bassa progressione

Malattie X-linked dominanti

• Tra esse sono presenti:

◦Sindrome di Rett

◦Sindrome dell’X fragile

◦Rachitismo ipofosfatemico

◦Sindrome di Alport

◦Incontinentia pigmenti

◦Sindrome di Goltz

◦Sindrome di Aicardi

• Sono tutte patologie poco frequenti, più rare di quelle recessive legate all’X

• Caratteristiche delle malattie X dominanti:

◦Se il padre è affetto tutte le figlie femmine sono affette

◦Nessun figlio maschio di un padre affetto manifesta il carattere

◦Donne affette hanno probabilità di avere 50% dei figli maschi e femmine affetti

◦La sintomatologia è più grave nei maschi emizigoti che nelle femmine eterozigote affette

◦La trasmissione della malattia nel pedigree è verticale perché il gene malattia è trasmesso e si manifesta in tutte le
generazioni

Malattie/caratteri a trasmissione legata all’Y

• Vengono anche chiamata oloandriche e non sono considerate vere e proprie malattie in quanto non ne sono ancora state
individuate si preferisce parlare di caratteri oppure di tratti

• Due esempi di caratteri sono l’orecchio peloso e la calvizie sono caratteri trasmessi in modo mendeliana la cui
manifestazione è influenzata anche dagli ormoni maschili

• Osservando un albero si può notare che:

◦Solo i maschi sono affetti

◦Le mutazioni vengono trasmesse dal padre a tutti i figli maschi

◦I figli maschi affetti hanno tutti un padre affetto

• Si stima che il cromosoma Y contenga 90 geni molti dei quali localizzati nella regione MSY con 15 unità trascrizionali delle
quali 78 codificanti e 78 non codificanti produce 32 proteine. Dato che produce poche proteine le mutazioni a livello
dell’Y determinano solo caratteri o tratti alterati e non vere e proprie malattie

• Il cromosoma Y presenta

◦Regioni pseudoatosomiche PAR sia sul braccio lungo sia corto

◦Regione eterocromatinica non contenente geni

◦Regione MSY (male specific region of Y) contiene i geni per il differenziamento sessuale

◦Regione SRY (sex determining region) sviluppo delle gonadi

• Il maschio ha più geni della femmina pur avendo meno contenuto genetico (perché femmina non ha Y)

• Alla determinazione del sesso sono coinvolti anche i geni autosomici

• L’unica vera patologia legata all’Y è la disgenesia testicolare che è causata da una delezione o mutazione di SRY
fenotipicamente sono femmine, genotipicamente sono maschi

Trasmissione non di tipo mendeliano

Eredità digenica
Sono le malattie genetiche che interessano due caratteri e non seguono le regole della trasmissione mendeliana

Può essere suddivisa in:

◦Eredità digenica con effetto sinergico: sono dovute alla mutazione di due geni; se la mutazione colpisce uno solo dei
due geni il fenotipo malattia non si manifesta. Tra esse troviamo:

‣ Retinite pigmentosa: mutazione dei geni RDS e ROM1 che determina progressiva degenerazione dei fotorecettori
perdita progressiva della visione notturna e del campo visivo periferico

‣ Malattia di Hirshprung: causata da mutazioni del gene RET e EDNRB e si manifesta con difficoltà
nell’evacuazione e stipsi (stitichezza)

◦Eredità digenica con effetto additivo: la mutazione di uno dei due geni determina la comparsa del fenotipo, una
mutazione dell’altro agisce da modulatore e va ad aggravare il fenotipo malattia. Un esempio è il glaucoma ad esordio
precoce: se si ha una mutazione del gene MYOC si ha glaucoma ad esordio precoce con insorgenza in età giovanile,
mentre se si ha mutazione anche del gene CYP1B1Y allora si ha glaucoma congenito presente dalla nascita

Malattie a trasmissione mitocondriale


I mitocondri vengono trasmessi dalla madre sia ai figli maschi sia alle figlie femmine ereditarietà materna.

Essi contengono mtDNA circolare a doppio filamento e in una cellule ci possono essere da 20 a 100 molecole. Il genoma
mitocondriale contiene 16.569bp e non contiene introni

All’interno dei 37 geni è possibile trovare:

◦Sito di origine della replicazione

◦13 regioni con proteine per la fosforilazione ossidativa

◦22 regioni codificanti per tRNA

◦2 regioni codificanti per rRNA

Necessita anche di proteine codificate dal DNA nucleare, come le DNApol e RNApol e i fattori che intervengono nella sintesi di
DNA, RNA e proteine.

La presenza di una mutazione in una molecola di DNA non implica che essa sia presente in tutte le molecole, ma la mutazione
aumenta ogni volta che il mtDNA si replica. La fase in cui il DNA non è mutato in tutte le cellule prende il nome di
eteroplasmia. Essendoci una certa tolleranza mutazionale il fenotipo patologico si mostra quando si supera una certa soglia
di DNA mutato o si raggiunge il 100% si parla di omoplasmia. Il grado di severità della malattia dipende dal numero di
mitocondri mutati.

Il mtDNA è particolarmente soggetto a fissare mutazioni in quanto non ha meccanismi di riparo (quindi ogni mutazione
rimane e si accumula ) e si ha la produzione continua di radicali dell’ossigeno (ROS), cioè molecole altamente reattive che
determinano mutazioni del DNA sono importanti i meccanismi apoptotici del mitocondrio.

È importante sottolineare che tutti i figli di madre affetta sono affetti e la trasmissione è matrilineare.

Le malattie genetiche mitocondriali sono per lo più encefalomiopatie (cardiopatie e miopatie) in quanto il malfunzionamento
dei mitocondri si fa sentire soprattutto nelle zone che richiedono molta energia (cervello, cuore, reni, muscoli) multiorgano e
multisistemiche

La maggior parte non seguono le regole mendeliane, ma vengono considerate malattie mitocondriale anche le patologie
associate a mutazioni di geni nucleari codificanti per processi mitocondriali e, in questo caso, rientrano nell’eredità
mendeliana; tra queste troviamo:

◦Mutazioni di geni codificanti per subunità della catena respiratoria

◦Mutazioni di geni per proteine che regolano il funzionamento della catena respiratoria

◦Mutazioni di geni necessari per la stabilizzazione del mtDNA

Mutazioni dinamiche da espansione del DNA


Sono malattie autosomiche dominanti oppure recessive X-linked dovute ad eventi di espansione; pur avendo una causa
mutazionale e una modalità di trasmissione non mendeliane vengono considerate malattie mendeliane. Sono dovute a eventi
mutazionale che tendono a far aumentare brevi sequenze che sono in genere contenute nei geni dell’uomo.

Normalmente, sono presenti geni che contengono un’espansione di una tripletta di DNA (sia nelle sequenze non codificanti)
che serve a mantenere la funzionalità della proteina entro un determinato limite soglia di espansione la sequenza può
trasmettersi in forma amplificata alla progenie.

Sono presenti in tre stati:

◦Stato sano: presenta fenotipo wild-type e brevi sequenze ripetute funzionali all’attività della cellula

◦Stato di pre-mutazione: cominciano ad espandere le brevi sequenze ma sono sani fino a quando non superano un
valore soglia

◦Stato di mutazione: il valore soglia viene superato e si ha espansione incontrollata fenotipo patologico

Una caratteristica che rende queste patologie non strettamente mendeliane è l’anticipazione genica: l’amplificazione è
sempre maggiore ad ogni generazione successiva; questo può accadere sia perché un genitore è a mosaico e il figlio presenta
la mutazione completa oppure perché il numero di ripetizioni aumenta in ciascuna generazione.

L’espansione può essere maggiore quando viene trasmessa da un genitore piuttosto che da un altro.

Sono circa 30 le malattie di questo tipo e sono principalmente neurologiche.

Ci sono due ipotesi riguardo alle modalità di espansione: sintesi reiterata di DNA (mediata da mismatched hairpins) e
replication slippage. La seconda è la più accreditata e prevede:

1. Si apre la forca replicati a livello di un gene con numerose triplette CAG che si ripetono

2. Sul filamento ritardato si hanno errori di reiterazione per un lungo tratto si generano sempre gli stessi nucleotidi

3. Si genera un tratto di filamento con tanti GTC che non si appaiono e formano un loop

Se invece il loop si forma sul filamento stampo viene rimosso dai meccanismi di riparo

Quando si forma sul filamento di nuova sintesi e non viene rimosso intervengono dei meccanismi di riparo aberranti che
fanno sì che sul filamento parentale si generino basi complementari a quelle espanse sul filamento nuovo si ha sempre
espansione e mai riduzione (neanche nel caso in cui venga rimosso il loop).

Se si vanno a formare più loop si parla di espansione massiva.

In totale sono 36 e possono essere suddivise in 3 gruppi.

Gruppo I : grandi espansioni fuori da sequenze codificanti

Come suggerisce il nome, sono accomunate dall’aereo dei geni che presentano grandi espansioni fuori da sequenze
codificanti e sono malattie che colpiscono prevalentemente il SNC (in particolare il cervelletto) ritardo mentale e problemi
nel movimento

Questo gruppo comprende:

◦Atassie spinocerebellari (SCA)

‣ Disfunzione del cervelletto mancanza di coordinazione motoria

‣ Quasi tutte ad onset tardivo

‣ Possono essere di tipo differente a seconda del tratto espanso es. SCA8 (CTG), SCA10 (ATTCT), SCA12 (CAG)

◦Distrofia miotonica 1 e 2
‣ Sono accomunate dal fenomeno miotonico si contraggono i muscoli, ma non si riesce a rilassarli facilmente

‣ Sono autosomiche dominati con incidenza rara/ultrarara

‣ Possono riguardare sia il SNC sia il SNP

‣ La distrofia miotonica 1 è dovuta ad espansione del gene ZNF9 la cui proteina omonima è un fattore di trascrizione
ed esso può raggiungere gradi di espansione moto grandi fino a 11k volte negli alleli patologici

◦Epilessia mioclonica progressiva CCCCGCCCCGCG

◦Sindrome dell’X fragile (o malattia di Martin Bell)

‣ È la seconda causa di ritardo mentale dopo la sindrome di Down

‣ Il gene malattia è localizzato sulla porzione distale del braccio lungo del cromosoma X; è uno dei siti fragili ovvero
qui siti in cui il DNA si rompe più facilmente

‣ Frequenza 1/4k nei maschi 1/600 nelle femmine

‣ I pazienti mostrano testicoli ingrossati, grandi orecchie a sventola, faccia allungata con mandibola larga, ritardo
mentale grave

‣ Adulti scemi del villaggio e aspetto frankensteiniano

‣ È dovuto ad un’espansione della tripletta CGG nella 5’UTR del gene FMR1:
• Da 6 a 55 volte le persone sono sane, da 56 a 200 si ha uno stato di premutazione, oltre 200 volte si ha full
mutation

• Questo determina una metilazione delle citosine nel promoter e nei repeat stessi non si produce la
proteina corrispondente (una RNA-binding protein che facilita la traduzione in proteine di mRNA specifici che
servono a livello delle sinapsi)

• In alcuni casi si ha mosaicismo di lunghezza in quanto la mutazione non è avvenuta a livello gametico, ma
zigotico una parte può essere in premutazione e una in mutazione completa fenotipo meno severo

• Ci può essere anche mosaicismo di metilazione

• Questo gene può anche essere soggetto a mutazioni puntiformi e delezioni intrageniche

Gruppo II : poli-Q-glutammina
Accomunate dal fatto che la tripletta espansa è sempre CAG che codifica per glutammina e viene sempre colpita una
sequenza codificante (cade sempre in un esone).

Sono tutte malattie autosomiche dominanti, tranne la malattia di Kennedy che è X-Linked; oltre a questa sono presenti le
atassie spinocerebellari e l’atrofia dentato-rubro-pallido-luysiana

Il livello di espansione della full mutation è molto più basso rispetto al gruppo I

A questo gruppo appartiene la Corea di Huntington:

◦Demenza, rigidità, disturbi del movimento

◦Onset tardivo e decorso progressivo

◦Frequenza 1/20k nati

◦L’espressione è preferenziale nelle trasmissioni paterne ed è favorita da età paterna avanzata

◦Il gene responsabile è IT5 che si trova sul braccio corto del cromosoma 4 e codifica huntingtina si crea una proteina
con sequenza di glutammine in eccesso

Gruppo III : poli-alanina

È un gruppo di malattie molto rare accomunate da espansioni in sequenze codificanti GCN che codifica alanina espansione
di poli-alanine ma di dimensioni minori rispetto alle poli-glutammine, i geni hanno quindi tolleranza ancora più bassa

Colpisce principalmente i geni omeotici codificano per fattori fondamentali per il corretto sviluppo della malattia fanno
parte di questa famiglia le sindromi malformative

Esempi sono:

◦Sinpolidattilia di tipo II più dita o fusione di dita dovuta alla mutazione del gene HOXD13

◦Hand-foot-genital syndrome alterazioni a mani, piedi e genitali dovuta a mutazione di HOXA13

◦Oloprosencefalia:

‣ Malformazione cerebrale complessa da separazione incompleta degli emisferi cerebrali

‣ Mutazione del gene ZIC2


◦Displasia cleidocranica
‣ Mutazione del gene RUNX2 responsabile del differenziamento degli osteoblasti ritardo sviluppo osseo e dentale

LEZIONE SUI TEST GENETICI NON RIPORTATA

Tecniche di ingegneria genetica


Inizialmente è necessario un campione biologico da cui isolare gli acidi nucleici e si compiono una serie di reazione per
amplificare le sequenze di interesse. Successivamente si sequenzia tramite il metodo Sanger che permette di ottenere
un’enorme quantità di dati necessari bioinformatici per leggerli.

Prelievo e purificazione del materiale genetico


• Usualmente è un prelievo di sangue venoso periferico: metà viene utilizzato e metà conservato

• È necessario fare uscire il DNA dalla cellula:

1. Si prelevano le cellule, di solito i globuli bianchi, ma dipende dal tipo di prelievo

2. Si rompe la cellula tramite detergenti, rompendosi la membrana nucleare il dna esce

• Successivamente è necessario purificare il materiale genetico ad proteine, grassi e qualsiasi residuo cellulare. Le tecniche
si sono via via innovate e in ordine sono state:

1. Soluzione di fenolo e cloroformio con successiva centrifugazione

2. Sale ed etanolo al 99% il DNA precipita

3. Membrana di silice sulla quale, in seguito a lavaggio tramite tampone, rimane fissato solo il DNA

4. Estrattori di DNA automatici che attirano il DNA con biglie magnetiche e lo isolano in altre provette

Conservazione dell’acido nucleico


• In frigorifero a 4°C per non più di qualche settimana

• Crioconservazione a -20°C per conservarlo più a lungo o in banche criogenetiche a -80°C con azoto liquido

PCR vedi Borsani/pag 191, sono le solite cose

Multiplex PCR

• Meccanismo messo a punto per diagnosticare la distrofia muscolare di Duchenne mutazione del gene della distrofina,
uno dei più grandi del nostro genoma (quasi 1 cm, 2,4 milioni bp)) che può quindi andare incontro a delezioni intrageniche
durante il crossing over

• Dato che contiene 60 esoni, per questo gene si disegnano coppie di primer che coprono tutti gli esoni vengono eseguite
più PCR nella stessa provetta contemporaneamente

• Facendo correre su gel di agarosio si nota ad occhio nudo quale porzione del gene manca (gli esoni si dispongono in
maniera differente sul gel perché hanno dimensioni differenti)

Sequenziamento di Sanger

Permette di individuare la sequenza nucleotidica di un tratto di DNA. Richiede l’utilizzo di quattro provette nelle quali sono
inseriti:

◦Un primer

◦DNA a singolo filamento amplificato

◦Grande quantità di dNTP ovvero di deossinucleotidi normali

◦Grande quantità di ddNTP ovvero dideossinucleotidi, nucleotidi modificati che non presentano in posizione 3’ il gruppo
ossidrilico impediscono che un altro nucleotide si leghi ad esso e vengono quindi chiamati terminatori di catena

In ogni provetta viene inserita una sola tipologia di ddNTP (o ddATP, o ddCTP ecc..) che nel momento in cui si lega al suo
complementare termina la sequenza della catena che si sta sintetizzando si ottiene una miscela di frammenti con
incorporati i ddNTP marcati in ogni possibile posizione.

Tutti i frammenti vengono fatti correre su poliacrilammide (maglie più piccole dell’agarosio) e in base alle dimensioni del
frammento ordina la posizione dei nucleotidi; leggendo in ordine dal basso verso l’alto si ottiene la sequenza dei nucleotidi.

Oggi è tutto computerizzato e si ottengono elettroferogrammi.


ANALISI non in schema cuz 111

Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification (MLPA)

Agisce nei casi in cui la Sanger non funziona (ad esempio per riscontrare delezioni o duplicazioni intrageniche)

Per vedere se il paziente possiede una certa porzione di DNA bersaglio si crea una prima sonda complementare ad un tratto di
quell’esone e un’altra sonda complementare al tratto di esone immediatamente successivo tra le due sonde c’è un nick
dato che manca un legame fosfodiesterico.

Se il tratto è presente le due sonde si appaiano e vengono unite da una DNA ligasi, se invece anche una sola delle due non si
appaia correttamente la ligasi non le unisce.

Sono poi presenti delle code che sono necessarie per effettuare la PCR e gli stuffer, di dimensione differente per ogni sonda,
che ne permette il riconoscimento (sempre più lungo man mano si procede nel gene).

Si esegue poi corsa elettroforetica (che riordina i vari frammenti amplificati grazie alla diversa dimensione dello stuffer)

Per l’analisi delle informazioni si utilizza un software di decodifica che, in base alla quantità di DNA che si è ibridato, crea un
grafico con dei picchi; se il picco è 1 vuol dire che è stata ibridata la porzione cercata su entrambi gli alleli, 0.5 solo su un allele
e 1.5 vuol dire che la sequenza è presente tre volte. Quando questo non è visibile ad occhio umano sono di aiuto dei software
che confrontano con sequenze di controllo.

L’utilizzo i MLPA piuttosto che di Sanger dipende dal tipo di malattia che si sta cercando: se riguarda un gene che va molto
spesso incontro a delezioni e duplicazioni allora uso MLPA, mentre se devo ricercare una singola mutazione è meglio utilizzare
Sanger. Inoltre, MLPA non è prodotta per tutti i geni, ma solo per i casi più comuni.

Interpretazione della patogenicità di una malattia

Alcune mutazioni, soprattutto quelle missenso, danno origine ad un fenotipo non facilmente prevedibile devo servirmi di
software di predizione della malattia.

Quando rilevo una mutazione SNP o SNV:

◦Controllo nelle anche dati se è descritta come patogenetica se c’è e coincide con il fenotipo patologico allora
abbiamo trovato la causa

◦Se non è presente nei database, ma è già stata riscontrata in un altro paziente con la stessa malattia probabilmente è
patogenetica e vado quindi a guadare il genoma dei genitori

◦Quando una mutazione è de novo, ovvero non è mai stata riscontrata, vado ad fare prove funzionali vedere come la
proteina si esprime nelle cellule del paziente, correggere la mutazione tramite CRISPR o creare animali transgenici ecc..
per provare che sia patogenetica

◦In tutto questo è continuamente necessario consultare i software che fanno riferimento ai databank che presentano
anche tutti i genomi sequenziati fino ad ora.

Alamut

Raggruppa tutti i software e gli algoritmi utilizzati per integrare le informazioni delle varie banche dati biotecnologiche. I
software sono moltissimi e dipende da cosa voglio trovare:

◦PolyPhen-2: consente di valutare l’impatto funzionale di SNP su proteine

◦SIFT: correla la funzione di una proteina con il suo grado evolutivo

◦Mutation tester: valuta la patogenicità di una mutazione

◦Software che valutano l’effetto di mutazioni poste nelle giunzioni esone/introne

◦Software che valutano l’alterazione in sequenze ESE (quelle che possono fare avvenire splicing con elevata efficienza)

Le varianti possono essere classificate come:

◦Disease causing: varianti che causano malattie, sono quelle frequenti e conosciute

◦Likely disease causing: probabilmente causano la malattia data la natura della mutazione (es. vicina a mutazioni
disease causing)
◦Possibly disease causing: potrebbe causare la malattia, ma con una probabilità un po’ inferiore rispetto alle likely
◦Likely not disease causing: probabilmente non causano la malattia
◦Not disease causing: descritte come varianti neutrali
◦Variant of unknown clinical significance: nono sono mai state descritte, né sono attese come causative

Next Generation Sequencing

A differenza del metodo di Sanger, ovvero sequenziamento a sintesi interrotta, il NGS è a sintesi continua può proseguire
fino a quando nel chip ci sono tutti i reagenti necessari.

Per verificare l’inserimento di un nucleotide in uno stampo si possono usare differenti metodi:

◦Metodo illumina: sfrutta l’eliminazione di gruppi fluorescenti dal DNA (un gruppo per ogni nucleotide simile a Sanger)

◦Un altro metodo sfrutta il gatto che quando si incorpora un nucleotide monofosfato a partire da un trinucleotide viene
eliminato pirofosfato si rileva leminazione di pirofosfato

◦Oppure si puo monitorare il rilascio di un idrogenione (protone H+)

Quando si usano gli ultimi due metodi viene eliminato un pirofosfato/idrogenione per ogni nucleotide è necessario un
sistema per riconoscere i nucleotidi, cosa che invece si può fare direttamente con il metodo illumina

Passaggi:

◦Si frammenta il DNA in molti pezzi mediante nebulizzazione passando attraverso un forellino viene spezzato

◦Si crea in questo modo una library contenente tutti i frammenti (dimensioni ideali 300-500 bp)

◦Si fa una legazione degli adattatori alle estremità di tutti i frammenti ottenuti in maniera casuale sono tratti di DNA a
doppio filamento

◦Multiplex PCR forzata: nel metodo illumina tutti i frammenti vengono messi su un chip (vetrino+supporto di silice) si
ha attacco random dei frammenti al vetrino e quando si attaccano fanno PCR. Si parla di generation of polony array in
quanto sto polimerizzando i frammenti creando una colonia per ogni frammento; si parla anche di amplificazione a
ponte.

◦Il chip costellato di colonie viene poi inserito in una macchina che effettua il sequenziamento ciclico si effettua una
sintesi di DNA:

‣ Sono necessario una coppia di primer per gli adattatori alle due estremità del filamento

‣ Viene utilizzata TaqPolimerasi e dNTP fluorescenti

‣ Ogni volta che un nucleotide fluorescente viene attaccato la macchina rileva la luce emessa, i gruppi fluorescenti si
staccano e si attacca un nuovo dNTP

‣ I segnali che arrivano al computer sono milioni nello stesso momento deve essere molto potente

In realtà in genetica medica non serve a molto il sequenziamento dell’intero genoma perché al genetista medico interessano gli
esoni, non il resto di DNA non codificante è più utile alla genomica comparativa e funzionale

Infine, bisogna riconoscere a analizzare i dati:

◦Primary analysis: allineamento di tutte le letture fatte sui genomi di riferimento e ordine di tutti essi in un BAMfile dove
vengono riportate tutte le varie letture di un frammento

◦Secondary analysis: avviene il variant calling, ovvero il software costruisce un Excel (VCF) in cui ci presenta un
filtraggio di variante anche in base ai dati presenti nella banca dati indica il tipo di mutazione, dove si trova, le
possibili patologie al quale è legato ecc..
◦Tertiary analysis i genetisti devono controllare l’esattezza dei dati, interpreta clinicamente il fenotipo del paziente e fa
una diagnosi finali

Identificata la variante, il genetista può anche fare un sequenziamento Sanger per verificare con sicurezza la mutazione.

Ricapitolando, ci sono due possibilità:

◦Se non si comprende nulla sul fenotipo del paziente si effettua un sequenziamento dell’intero esoma; l’esoma può
essere isolato mediante la cattura di essi mediante sonde specifiche, oppure si possono creare dai primer per ogni
esone ed effettuare multiplex PCR

◦Se invece il fenotipo permette di indirizzare verso determinati geni probabili, si sequenzia solo quel pacchetto di geni

Diagnostica in genetica medica


Introduzione
• Equilibrio di Hardy-Weinberg se io conosco uno dei dati posso risalire agli altri dato che l’equazione è sempre uguale a 1

AA p

Aa Zpqphzpqtqa 1 cp qf 1

ae q2
• Quando si raggiunge una probabilità, essa si deve confrontare con un fattore di riferimento per comprendere se è una
probabilità alta oppure bassa in questo caso il rischio che ogni gravidanza abbia qualche problema (0,2%)

• Quando ho un figlio malato con genitori malati potrebbe essere:

◦Autosomica recessiva

◦X-linked recessiva

◦Autosomica dominante, ma casi particolari di:

‣ Mutazione de novo

‣ Penetranza incompleta

‣ Espressività variabile

‣ Mosaicismo germinale o gonadco

‣ Non paternità

• Ricordiamo che il modello genetico mendeliano diventa più complesso quando è applicato ai singoli casi in quanto bisogna
tenere conto anche della penetranza incompleta e dell’espressività variabile.

Malattie neuromuscolari
Comprendono le distrofie muscolari, le miopatie congenite, le atassie ereditarie e le neuropatie ereditarie sensitivo-motorio
(elenco completo pag 213)

Distrofie muscolari

• Dalla biopsia si possono notare necrosi, rigenerazione parziale e infiltrazione di connettivo e tessuto adiposo

• Sintomi: debolezza muscolare, alterazioni in postura e nelle masse muscolari

• Tra esse possiamo distinguere, sulla base dello scopritore o dei muscoli che coinvolge, differenti tipologie:

◦Duchenne e Becker

◦Emery-Dreifuss

◦Cingoli

◦Fascio scapolo-omerale

◦Distale

◦Oculo-faringea

• Duchenne e Becker (distrofinopatie)


◦Sono date da una mutazione nel cromosoma X X-linked recessive

◦La DMD ha una frequenza di 1:3500 nati maschi, è molto grave ed ha un’aspettativa di vita bassa, difficoltà cardiache
e respiratorio e coinvolge anche lo sviluppo psico-motorio con problemi mentali

◦La Becker è più blanda e ha una frequenza di 1:30k


◦Per fare diagnosi nei bambini si può osservare il segno di Gowers il bambino per alzarsi prima distende le gambe
dietro e poi si appoggia sulle gambe

◦In 1/3 dei casi la mutazione avviene de novo e quindi non ci sono soggetti affetti nella famiglia

◦Il gene implicato è quello della distrofina che ha quattro domini di cui uno ad una estremità e si lega al citoscheletro e
uno all’altra estremità e si lega alla membrana della cellula muscolare;

◦Entrambe le malattie sono causate da una delezione nel gene della distrofina (rilevabile mediante multiplex PCR):

‣ Se la mutazione è frame-shift determina un codone di stop la distrofina non ha tutti e due i “ganci” alle due
estremità e quindi non può svolgere la sua funzione DMD

‣ Se la mutazione è in-frame i ganci alle estremità si salvan BDM

◦È stato proposto un meccanismo di correzione del frameshift nei pazienti di Duchenne che funziona nell’8-9% dei
pazienti

• Altri tipi di distrofie sono le distrofie dei cingoli (associate a varie mutazioni eterogeneità allelica), le distrofie
autosomiche (recessive, associate ai sarcoglicani e alla teletonina).

• Distrofia miotonica

◦Per miotonia si intende un segno localizzato in cui persiste una contrazione muscolare anche dopo che è cessato lo
stimolo

◦Presenta tre fenotipi che variano in base alla gravità della malattia:

‣ Nessun danno muscolare, debolezza facciale, calvizie frontale e cataratta, poca miotonia

‣ Miotonia e debolezza distale con implicazione anche di altri organi (disfunzione gonadica, alterazioni EKG, ritardo
mentale lieve, cataratta, intolleranza al glucosio)

‣ Debolezza prossimale, difficoltà deambulatoria, cardiomiopatie, ritardo mentale e cataratta

◦Si è visto che il gene della distrofina contiene all’interno delle espansioni del DNA dovute a triplette CTG ripetute:

‣ Fino a 50 ripetizioni nessun fenotipo

‣ Intorno a 300 ripetizioni forma lieve

‣ Intorno a 500 ripetizioni forma intermedia

‣ Più di 1000 ripetizioni forma grave

Malattie da triplette ripetute

Le malattie da triplette ripetute sono:

◦X fragile

◦XE fragile

◦Distrofia miotonica di tipo 1

◦Distrofia miotonica di tipo 2 espansione tetra-nucleotide CCUG

◦Corea di Huntington malattia da tripletta CAG ripetuta (che codifica per poliglutammina)

◦Atassie cerebellari

◦Atrofia spino-bulbare muscolare (sindrome di Kennedy)

Ha fatto tutto lo stesso discorso della Colombi da pagina 217 a pag 219 aggiunto cose in matita a quella parte

Malattie complesse multifattoriali


Caratteri non patologici
Spesso i fenotipi non vengono determinati solo da fattori genetici, ma anche da influenze ambientali si introduce il
fenomeno epigenetico che sono stabili e trasmissibili. Inoltre, quando il carattere è multifattoriale si hanno molti fenotipi
differenti posti tra i due estremi (tutti alleli dominanti, tutti alleli recessivi) es. altezza, colore della pelle; in generale il fenotipo
prevalente è quello intermedio.

Una variazione multifattoriale può essere:

• Continua: classi fenotipiche che si distribuiscono da un estremo all’altro con tutta una serie di gradazioni
• Discontinua: presenta classi fenotipiche ben distinte e non sovrapposte

Caratteri patologici

Esempi di malattie ad eredità multifattoriale sono:

◦Difetti congeniti: cardiopatie, difetti del tubo neurale, lussazione congenita dell’ansia
◦Malattie nell’adulto: asma, diabete mellito, tumori, malattie neurodegenerative, epilessia, glaucoma, ipertensione,
schizofrenia

Per le malattie multifattoriali è necessario considerare che non basta la componente genetica, ma ci deve essere anche una
componente ambientale per avere una manifestazione del fenotipo.

Molte di queste malattie possono essere curate o stabilizzate cambiando lo stile di vita e esistono dei trattamenti farmacologici
che sono in grado di stabilizzare/ridurre gli effetti migliorando le qualità di vita

Alcuni fattori ambientali sono:

◦Assunzione gastrointestinale

◦Funzione immunologica

◦Funzionalità epatica (come vengono metabolizzati diversi cibi/farmaci)

◦Funzionalità renale

◦Stress

◦Nutrizione

◦Assunzione di sostanze più o meno lecite

◦Il sesso

◦L’età

◦L’esercizio fisico

Anche le modificazioni climatiche possono alterare i nostri meccanismi biologici

Fattori di rischio
Ognuno di noi ha un certo numero di rischi dovuto a fattori genetici e ambientali, ma quando questo numero supera una certa
soglia iniziano a manifestarsi i sintomi della patologia modello multifattoriale a soglia.

I fattori di rischio sono elementi che aumentano il rischio di ricorrenza di patologie multifattoriali a soglia. Tra essi sono
presenti:

◦Grado di consanguineità
◦Gravità del fenotipo dopo aver contratto una malattia ci possono essere diverse forme di gravità; più è grave la
malattia più è probabile che venga trasmessa ai figli

◦Numero di persone affette nella famiglia più è alto più è alta la probabilità di contrarre una malattia

◦Frequenza più la malattia è rara, più sono i fattori necessari per superare la soglia

◦Sesso a volte in uno dei due sessi servono meno fattori per superare la soglia della patologia

Così come esistono fattori di rischi genetici e ambientali ci sono anche fattori protettivi genetici e ambientali

Ereditabilità

La variazione fenotipica determinata dalla presenza di genotipi diversi è chiamata varianza genetica, mentre se esiste una
variazione fenotipica tra individui che hanno lo stesso genotipo (quindi gemelli) si parla di varianza ambientale.

L’ereditabilità è la frazione della variazione fenotipica totale causata dalle differenze genetica se l’ereditabilità è alta la
variazione fenotipica è essenzialmente genetica, mentre il contributo ambientale è basso, se il valore dell’ereditabilità è basso il
contributo genetico è minimo mentre è altro quello ambientale.

Per quanto riguarda lo studio dei gemelli monozigoti ed eterozigoti, i MZ presenteranno comune principalmente la
componente genetica, mentre quelli DZ la componente ambientale. Si può parlare di concordanza (come prima, se la
concordanza è al 100% la componente ambientale è nulla).

Percentuali di ereditabilità:

◦Schizofrenia 45-80%

◦Disturbo bipolare 60-80%

◦Depressione maggiore 40%

◦Disturbo d’ansia generalizzato 30%

◦Panico 40%

◦Fobia 35%

◦Alcolismo 30-60%

Correlazione genotipo/fenotipo
Consideriamo diversi passaggi: geni proteine cellule sistemi fenotipo

Già nel passaggio da gene a proteina l’efficienza è circa del 50% a causa di mutazioni, polimorfismi, degradazione dell’mRNA
o errato trasporto di esso. Inoltre le proteine interagiscono tra loro, con ormoni e fattori di crescita ecc.. queste migliaia di
variabili determinano il fatto che non ci sia sempre un effetto uguale del genotipo sul fenotipo.

Geni/alleli di suscettibilità
È molto probabile che un allele di suscettibilità, ovvero la componente genetica alla base di una malattia multifattoriale sia un
polimorfismo. Esso può avere un effetto funzionale:

◦Se cade in una regione regolatoria

◦Se è missenso, ma anche se è sinonimo perché può ad esempio legare tRNA di cui non c’è una sufficiente riserva

◦Se crea una nuovo sito di splicing

Il fatto che il gene di suscettibilità abbia polimorfismo funzionale spiegherebbe sia la diffusione sia l’effetto additivo dovuto a
diversi polimorfismi.

Malattia di Alzheimer (AD)

• È una malattia neurodegenerativa il cui sintomo principale è la perdita della memoria prima a breve poi a lungo termine

• Atrofia corticale dovuta all’accumolo di placche neuro-fibrillari (proteina β-amiloide) interferisce in particolare con i
neuroni colinergici I farmaci che riescono a ritardare leggermente la malattia operano inibendo gli enzimi che distruggono
l’aceticolina

• Può essere di due tipi:

◦Late onset AD: multifattoriale non mendeliano

◦Early onset AD: mendeliana autosomica dominante (<1% di tutti gli AD)

• I fattori che influenzano la patologia sono:

◦Fattori genetici:

‣ Deterministici geni APP (codifica per β-amiloide, cromosoma 21) , PSEN1, PSEN2
‣ Di suscettibilità variante ε4 del gene APO-E (apolipoproteina E) codificante per il trasportatore del colesterolo

◦Fattori ambientali:

‣ Di suscettibilità traumi cranici, ipercolesterolemia, ipertensione, infezioni virali

‣ Protettivi scolarità e alta istruzione sono correlati ad un ritardo dell’insorgenza

‣ Si è ipotizzato che contribuissero anche gli agenti antinfiammatori ma l’evidenza non è ancora stata dimostrata

• Il gene dell’apolipoproteina-E (APO-E) è determinato da almeno tre varianti alleliche che sono dovute a due sostituzioni
nucleotidiche che nel gene determinano in base a come sono combinate ε2, ε3, ε4 ε4 è un sistema biallelico che prende
il nome di aplotipo. Esso è un gene importante per il meccanismo di riaggregazione patologico dei gomitoli neurofibrillari

• I gruppi di popolazione con omozigosi di ε4 dopo i 55 anni ha possibilità di ammalarsi 4 volte superiore agli altri

• Per quanto riguarda la protezione, i portatori di ε2 sono immuni

Altre forme di demenza

◦Demenze vascolari

◦Demenze frontotemporali (FTD)

◦Sclerosi laterale amiotrofica (SLA o ALS)

La FTD e la SLA sono entrambe legate al gene C9ORF72: espansioni più lunghe sono associate alla ALS, espansioni più
corte sono associate alla FTD.

Geni suscettibilità

• Malattie cardiovascolari

◦10 alleli suscettibilità

◦Se il gene α1 antitripsina presenta un certo polimorfismo enfisema polmonare

• Malattie psichiatriche depressione maggiore


◦Patologia multifattoriale complessa con bassa ereditarietà dovuta prevalentemente a fattori ambientali (es. traumi)

◦Collegato alla depressione è presente il sistema serotoninergico:

‣ Un gene che codifica per un trasportatore della serotonina può avere una variante allelica che determina la
formazione di un allele corto e di un allele lungo; i soggetti portatori dell’allele corto hanno un rischio più elevato di
presentare depressione maggiore

‣ I farmaci come il Prozac vanno ad agire a livello del sistema serotoninergico

• Strategie per l’individuazione di geni suscettibilità:

◦Individuare aberrazioni cromosomine es. le malattie psicotiche possono essere causate da una traslocazione che
va a rompere un gene detto gene distruttore della schizofrenia (DS1)

◦Analisi linkage basate su famiglie affetti in quasi tutte le generazioni, si basano sul fatto che se due geni. Marcatori
sono vicini nel cromosoma allora segregheranno insieme si stima la probabilità che siano linked o meno

◦Studi di associazione che confrontano la frequenza di un polimorfismo tra un gruppo di casi e un gruppo di controllo

• In generale tutti i fattori di suscettibilità hanno un odds ratio <2 (2 volte in più rispetto alla popolazione generale), l’APOE è
quello che ce l’ha più alto

Genome wide association approach (G-WAS)


Consiste nel studiare tutti i polimorfismi presenti nel gruppo di pazienti rispetto a tutti i polimorfisi presenti nel gruppo di
controllo fa capire i geni e i meccanismi riguardanti la patologia

Con questo metodo, ad esempio, si è scoperto il ruolo del gene HLA sul cromosoma 6 nella schizofrenia esso causa una
funzionalità alterata della capacità di arborizzazione dendritica

Dato che spesso si possono trovare sottocategorie che sono malattie diverse (dovute all’eterogeneità fenotipica) è possibile
suddividere la popolazione in sottofenotipi (endofenotipi) stratificazione della popolazione.

Gli endotipi si definiscono in base a caratteristiche morfologiche evidenziabili con neuroimaging, marcatori biologici e
parametri neurofisiologici

Per fare questi studi si prendono i SNP che hanno una frequenza dell’allele almeno superiore al 5%.

Farmacogenetica e farmacogenomica

I termini furono coniati da Vogel e Motulski e si intende:

◦Farmacogenetica: studia come le differenze genetiche influenzano la variabilità della risposta farmacologica

◦Farmacogenomica: identifica le differenze genetiche utili per lo studio di nuovi farmaci e il loro sviluppo

Per ogni farmaco si può parlare di:

◦Farmacocinetica: come viene assimilato, trasportato, eliminato

◦Farmacodinamica: come agisce sul recettore e sulle sue forme alternative

Risposta ai farmaci

• Certi farmaci funzionano meglio su alcuni gruppi etnici rispetto ad altri perché c’è un background genetico diverso

• La risposta ad un farmaco è un fenotipo complesso

• Si creano 4 categorie dando un farmaco ad una popolazione di pazienti: + benefici, no tossicità; no benefici, no tossicità;
+benefici, +tossicità; no benefici, +tossicità. Sapendo in che categoria si trova il soggetto si può effettuare medicina
personalizzata

• Nella ricerca non si può attuare G-WAS perché non si hanno così tante persone con la stessa patologia che prendono lo
stesso farmaco

Farmacocinetica

• I farmaci devono essere metabolizzati attraverso due fasi: attivazione e coniugazione. Nel metabolismo svolgono un ruolo
importante gli isoenzimi epatici del sistema del citocromo P450.

• C2D6 è un enzima del metabolismo della cisteina 15 SNP che in base alla combinazione determinano una risposta
differente ai farmaci; si possono individuare 4 classi:

◦Metabolizzatori lenti il farmaco non viene metabolizzato e può avere effetti tossici a causa dell’accumulo

◦Metabolizzatori intermedi ed estesi normali

◦Metabolizzatori ultrarapidi metabolizzato talmente velocemente che non ha l’effetto desiderato dosi maggiori

• Alcuni farmaci richiedono genotipizzazione perché possono essere letali in presenza di determinate omozigosi

• Carbamazepina farmaco antiepilettico, se lo utilizza con un paziente con un determinato allele HLA si ha la sindrome di
Steven-Johnson.

L’efficacia dei farmaci è variabile a causa della variabilità genetica dovuta ai polimorfismi. In alcune persone, ad esempio,
determinati farmaci possono portare a granulocitomielia oppure aumento di peso.

Gli anticoagulanti sono farmaci molto utili per mantenere basso il rischio di determinate patologie, tuttavia possono portare a
sanguinamento eccessivo bisogna monitorare il tempo di protrombina (INR) in modo da capire se il dosaggio è quello
giusto. In questo processo intervengono:

◦CYP2C9 isoenzima del citocromo p450 (visto prima)

◦VKORC1 ruolo nel metabolismo della vitamina K

Test genetici in farmacogenetica


• Grazie ai test genetica è possibile arrivare a capire l’interazione che determinati geni hanno tra di loro per stabilire la dose
del farmaco; in questo bisogna tenere conto anche al peso corporeo, combinazione con altri farmaci ecc..

• È stato creato un algoritmo che tenesse conto della presenza/assenza di determinati geni oltre che di età, etnia, peso,
altezza, stile di vita ecc.. per dare una stima del dosaggio in realtà non si sa se funziona davvero.

• Per molti farmaci il test farmacogenetico è raccomandato, per altri è obbligatorio come per l’Abacavir usato per l’HIV. Per i
tumori non è obbligatorio, ma è consigliato perché si rischia di fare terapie costosissime e inutili

• La farmacogenetica potrebbe quindi diventare uno strumento per avere disponibili farmaci efficaci per qualche profilo
genetico individuando chi non è compatibile e proponendolo a chi ne può giovare

• L’individuazione di un percorso personalizzato può richiedere molto tempo e di conseguenza, per certe patologie, portare
ad un peggioramento della situazione.

• L’approccio non si deve basare solo sulla variabilità genomica ma necessita anche di dati trascrittomici, epigenomici,
miRNAomici, genomici ecc.. per ottenere eidenze di tipo farmacogenetico credo sia tutto un discorso al futuro

Trattamento delle malattie genetiche

Metodologie utilizzate per la terapia:

◦Terapia genetica: introduzione di un gene che compensa una deficienza o bloccarne uno con effetto tossico

◦Approcci aspecifici: modificazione della concentrazione di una proteina che è tossica o assente

◦Genome editing e ricombinazione omologa approcci specifici sulla mutazione

◦Uso di molecole che influiscono sull’mRNA.

• Per variare l’azione di un gene si può:

◦Agire sui fattori di trascrizione per influenzare l’accensione o lo spegnimento di un gene

◦Riattivare uno splicing alternativo che risulta alterato

◦Agire sugli enzimi della trascrizione e traduzione

◦Impedire stericamnete la trascrizione mediante oligonucleotidi (aODN)

• Due casi in cui la terapia genica si è mostrata efficace sono l’atrofia muscolare spinale e la fibrosi cistica

• Atrofia muscolare spinale (SMA)

◦Malattia ereditaria neurodegenerativa autosomica recessiva

◦Grave difficoltà motoria, debolezza muscolare che porta ad ipotonia

◦Esistono tre forme:

‣ SMA1 (sindrome di Werding-Offman): acuta o grave, si presenta dalla nascita, morte prima dei due anni per
insufficienza respiratoria

‣ SMA2: meno grave, ma sempre con sopravvivenza limitata

‣ SMA3: lieve, esordio alla fine della seconda decade, limitata capacità motoria

‣ SMA4: intorno ai 35 anni, progressione più lieve

◦Il gene responsabile si trova sul cromosoma 5 e prende il nome di SMN due forme SMN1 (verso telomero) e SMN2
(più centromerico):

‣ Delezione di entrambi gli SMN1 SMA di tipo I

‣ Una delezione di SMN1 e un sostituzione di SMN2 SMA di tipo II

‣ Entrambe sostituzioni di SMN2 SMA di tipo III

◦Terapie

‣ Terapia genica prevede l’uso di vettori virali all’interno dei quali si introduce un copia funzionante di SMN1 oppure
di oligonucleotidi anti senso nel SNC somministrato una sola volta

‣ Spinraza: rimuove la condizione che impedisce lo splicing dell’esone 7 di SMN2 proteina funzionante. Deve
essere continuamente somministrato

• Fibrosi cistica

◦Malattia multisistemica che colpisce principalmente i polmoni (tessuto target) accumulo di muco denso che
determina insufficienza respiratoria

◦È dovuta a problema nell’omeostasi degli ioni alterazioni del metabolismo pancreatico, problemi intestinali, difficoltà
respiratorie

◦La causa è una mutazione del gene CFTR che codifica un canale regolatore del cloro, ha funzione antibatterica,
interviene nell’equilibrio idrico e nella spermatogenesi e risposta infiammatoria

◦Diagnosi:

‣ Alla nascita per ileo da meconio si blocca tutto il muco nell’ileo

‣ Successivamente tramite tripsina immunoreattiva. Se per due volte il test è positivo si fa il test del sudore.

‣ Se è necessario sequenziare si studia inizialmente un pannello delle mutazioni più comuni, se non si hanno risultati
positivi si comincia a sequenziare prima dagli hotspot fino alle altre regioni con NGS

◦È autosomica recessiva e ha una frequenza di 1/2k-1/3k.

◦CFTR ha tre domini e puo andare incontro ad un numero enorme di mutazioni a seconda del tipo di mutazione s ha
correlazione genotipo/fenotipo molecolare.

◦Terapia:

‣ Trattamenti nutrizionali, per evitare denutrizione, oppure meccanici per rimuovere il muco

‣ Ivacaftor, detto Kalydeco modulatore CFTR, funziona nel 10% dei pazienti ma non per le mutazioni più
comuni, incremento della funzionalità respiratoria

‣ Lumacaftor, detto Orkambi necessita di continuo monitoraggio e pare funzioni anche sulle mutazioni più
frequenti

Malattia Tipologia Genotipo Fenotipo/conseguenze Frequenza Altro

Cause:

• >> non disgiunzione


meiotica della mamma

• 1/4 non disgiunzione


Problemi al SNC → meiotica papà

Sindrome di Down Trisomia 21 1:700


ritardo mentale
• 4% genitore portatore
Errori di non bilanciato

disgiunzione →
• 1% non disgiunzione
Nel caso di Edwards e
trisomie mitotica → cariotipo a
Patau sono molto pochi i
bambini che nascono mosaico

Sindrome di Edwards Trisomia 18 1:6k - 1:10k

Sindrome di Patau Trisomia 13 1:12'500 - 1:21’700

Grave ritardo mentale

Delezione braccio corto


Sindrome cri du chat Delezione Ritardo nello sviluppo 1:50k
del cromosoma 5
psicomotorio

Gene ABL (→
proteinchinasi) dal
Traslocazione 9-22
braccio lungo del 9
Leucemia mieloide Il 22 diventa molto corto
Traslocazione Tumore / passa sotto il controllo
cronica e prende il nome di
del gene BCR sul
cromosoma Philadelphia
cromosoma 22 → over
espressione

Gene MIC (lungo cr 8) si


sposta vicino a IgH
(lungo cr 14) → entra
Linfoma di Burkitt Traslocazione Traslocazione 8-14 Tumore /
sotto il controllo di Igh →
iperproliferazione

Autosomiche recessive

Sostituzione di GAG con


GTG nel 6° codone del
Anemia falciforme Autosomica recessiva 5° esone del gene che
HBB ( → catena β
dell’emoglobina)

Parziale/totale deficienza
Albinismo Autosomica recessiva di pigmentazione
melaninica

Mutazione nel gene


Terapia con

CFTR che codifica per Produzione di muco

Fibrosi cistica Autosomica recessiva 1:2k-3k Ivacaftor (Kalydeco)

un canale regolatore del Infertilità maschile


Lumacaftor (Orkambi)
cloro

Incapacità di
Fenilchetonuria Autosomica recessiva metabolizzare la
fenilanilina →

Epidermolisi bollosa Lisi a livello dei


semplice cheratinociti
Geni dell'adesione
epitelio-mesenchimale Lisi a livello della
Epidermolisi Autosomica recessiva,
giunzione tra epidermide
giunzionale quella distrofica può e membrana basale
essere anche dominante
Mutazione del gene per il Cute cicratiziale ritraente
Epidermolisi distrofica collagene VII (→ no e continua fuoriuscita di
fibrille ancoranti) siero

2 del SMN1 → tipo I


Terapia genica prevede
Grave difficoltà motoria,
Del SMN1, sostituzione l'uso di vettori virali in
Atrofia muscolare debolezza muscolare
Autosomica recessiva SMN2 → tipo II
cui si inserisce copia
spinale (SMA) che porta a ipotonia

Entrambe sost SMN2 → funzionante di SMN1;

Ci sono 4 fenotipi diversi


tipo III Spinraza
Autosomiche dominanti

Patologia multiorgano ad
espressività variabile:

Cristallino, sistema Essendo ad espressività


Gene malattia: FBN1 su muscolare scheletrico,
variabil gli individui nella
Autosomica dominante,
braccio lungo note dismorfiche nel viso stessa famiglia possono
Sindrome di Marfan connettivopatia 1:35k
cromosoma 15 (→ e arti molto lunghi
presentare problemi
ereditaria
fibrillina 1) Si può avere una completamente diversi e
dilatazione del seno di più o meno gravi
Valsava → si dissecca
l’aorta discendente

FBN1: se mutazione fino


al penultimo
Displasia scheletrica amminoacido degli esoni
Nanismo
acromicrica/geleofisica 41-42 ho questo
nanismo, dal nucleotide
dopo ho Marfan

Per penetranza
Eritremalgia Non severa, stati febbrili incompleta molto
Autosomica dominante Molto rara
autosomica dominante transitori spesso non si manifesta
patologicamente

Espansione del gene IT5


sul braccio corto del Rigidità nei movimenti, 1/333k giappone

Corea di Huntington Autosomica dominante Onset tardivo


cromosoma 4 (→ demenza 1/8k USA e UK
huntingtina)

Non viene prodotto il


Mutazione puntiforme su
Nanismo Autosomica dominante a recettore FGFR3 per i
braccio corto del 1:25k L’omozigosi AA è letale
acondroplasico penetranza completa fattori di crescita dei
cromosoma 4
fibroblasti

Brachidattilia
Autosomiche dominanti Usate come esempio di penentranza incompleta
Polidattilia
• Sindromi di Ehler-
Danlos
• Ipercolesterolemia
familiare
• Rene policistico
adulto

X-linked recessive

Gene per fattori della


Emofilia X-linked recessiva
coagulazione

Ittiosi X-linked recessiva

Aspettativa di vita bassa,


Delezione nel gene DYS In 1/3 dei casi avviene
sviluppo psico-motorio,
Distrofia muscolare di ( →distrofina):
de novo
difficoltà cardiache e 1:3500 nati maschi
Duchenne se nelle porzioni Rilevabile con multiplex-
X-linked recessiva respiratorie

terminali (o frame-shift) PCRx


Segno di Gowers
Duchenne, altrimenti
Distrofia muscolare di Becker (in-frame) 1:30k nati maschi
Becker

Carenza di G6PDH
(glucosio 6-fosfato
Favismo X-linked recessiva deidrogenasi) → crisi
emolitiche a contatto
con fave o pollini

Malattia di Fabry

Cecità ai colori e
albinismo oculare

X-linked dominante

Ipertricosi
X-linked dominante
generalizzata
Incontinentia pigmenti X-linked dominante

Testicoli ingrossati,
Espansione di CGG nella
Malattia X-linked orecchi a sventola,
Sindrome dell’X fragile 5’ UTR di FMR1 (oltre le 1:4k maschi

dominante
ritardo mentale grave →
(malattia di Martin Bell) 200 ripetizioni si ha full 1:8k femmine
da espansione scemi del villaggio
mutation)
frankenstein

• Rachitismo
ipofosfatemico
• Sindrome di Alport
• Sindrome di Goltz
• Sindrome di Aicardi

Y-linked (caratteri)

Orecchie pelose
Più che malattie sono caratteri associati alla Y e influenzati dagli ormoni maschili
Calvizie

Disgenesia testicolare

Altro

MSX 1 oppure PAX9 →


Agenesia dentale Non nasce un dente Usata come esempio
eterogeneità genetica

Mutazione a livello di Tumore delle retina


Retinoblastoma
Rb1 (pediatrico)

Sindrome di Lynch Tumori con Geni MSH2, MLH1


predisposizione
Sindrome di Li- ereditaria Mutazione p53
Fraumeni

Tumore di Willis
Mutazioni dei tumor I portatori costituzionali
Carcinoma mammario soppressor BRCA1, Tumore al seno hanno più probabilità
BRCA2 ammalarsi

Mola idatiforme 46 cromosomi, tutti del


No embrione
completa padre
Anomalia dello sviluppo
46 cromosomi del padre
associata a
Mola parziale e 23 della madre
Embrione parziale 0,5:1000
degenerazione dei villi
69,XXX 69,XXY 69,XYY
corsali
Omozigosi per i geni
Mola ricorrente No embrione
NLRP7, KHDC3L

Se presente SNP su Ipertrofia della parete del


Cardiomiopatia gene ACE esso agisce muscolo cardiaco con
ipertrofica da gene modulatore → diminuzione di atri e
aumenta la patogenicità ventricoli

Trasmissione non mendeliana

Degenerazione dei
Eredità digenica con Mutazioni geni RDS e
Retinite pigmentosa fotorecettori → perdita
effetto sinergico ROM1
visione notturna

Difficoltà
Eredità digenica con Mutazioni dei geni RET e
Malattia di Hirsprung nell’evacuazione
effetto sinergico EDNRB
(stitichezza)

Mutazione di MYOC dà
esordio precoce, se è Uno dei due geni è
Glaucoma ad esordio Eredità digenica con
mutato anche un altro malattia, l’altro agisce
congenito effetto additivo
gene (CYP1B1Y) allora si come modulatore
ha esordio congenito

Sono colpiti
maggiormente tutti i
Encefalomiopatie
Multiorgano/ distretti con grande
(cardiopatie e Malattie mitocondriali
multisistemiche numero di mitocondri
miopatie)
(es. cervello, cuore, reni,
muscoli)
Malattie da espansione

Sindrome dell’X fragile


Vedi malattie X-linked dominanti
(malattia di Martin Bell)

Epilessia mioclonica
Neurologica
progressiva
Gruppo I
Si contraggono i
<50 ripetiz→ no fenotipo

muscoli, ma si fa fatica a
<300 → forma lieve

Distrofia miotonica 1, 2 Variazione gene ZNF9 decontrarli

<500→ forma intermedia

Tre fenotipi in base alla


>1000 → forma grave
gravità

Gruppo II → espansione
Corea di Huntington Vedi autosomiche dominanti
CAG (glutammina)

Malformazioni
complesse, non
Oloprosencefalia Gene ZIC2
separazione completa
emisferi cerebrali

Gruppo III → espansione Ritardo sviluppo osseo e


Displasia cleidocranica Gene RUNX2
GCN (alanina) dentale

Hand-Foot-Genital Gene HOXA13

Sinpolidattilia Gene HOXB13