Scienze

dell’Enogastronomia
Mediterranea
e
Salute

Relazione analisi
microbiologica
alimentare
Di succo di mandarino pastorizzato

Analisi Coliformi totali e colimetria del succo di

mandarino

a cura di Ivan Vinci

08/02/2010
 CONTEGGIO DEI COLIFORMI
I coliformi sono batteri a forma bastoncellare, appartenenti alla
famiglia delle Enterobatteriaceae, Gram negativi, asporigeni,
aerobi ed anaerobi facoltativi, capaci di crescere in presenza di sali
biliari. Quasi tutti possiedono una β-galattosidasi che li rende
capaci di fermentare il lattosio con produzione di acido lattico, d
aldeidi e di gas in 24-48 ore a temperature comprese tra 37° e
44°C. Sono abitualmente svelabili con le prove dei coliformi i
seguenti generi: Escherichia, Citrobacter, KIebsiella, Enterobacter,
etc.

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 COLIFORMI FECALI

La denominazione «Coliformi fecali» fu introdotta

successivamente a quella dei coliformi per evidenzia le specie di
certa provenienza fecale. I costituenti del gruppo (ad esempio
Escherichia coli, Klebsiella), oltre a rispondere alle caratteristiche
comuni tutti i coliformi devono possedere la capacità di
fermentare il lattosio con produzione di acido lattico e di gas dopo
un’incubazione di 24-28 ore a temperature più elevate di 37°C,
aggirandosi, secondo le metodiche, tra i 44 e i 44,5°C. Il saggio
positivo dei coliformi fecali ha valore di indicatore fecale
certamente più significativo di quello dei semplici coliformi, in
quanto è supponibile che la maggiore rappresentanza nel gruppo
sia sostenuta dagli stipiti di Escherichia coli. La presenza di
coliformi fecali, pur non rappresentando una prova di
identificazione, può far presupporre la presenza di altri
microrganismi di derivazione intestinale, tra i quali non si può
escludere la presenza di patogeni, anche se nessuna informazione
si può trarre sul numero e sulla identità di questi. L'importanza
della determinazione dei Coliformi negli alimenti è soprattutto
quella di valutare, oltre la carica iniziale e il livello igienico
dell’alimento, l'efficacia dei trattamenti di bonifica operati e di
mettere in evidenza eventuali ricontaminazioni avvenute dopo i
trattamenti stessi. Molto importante è anche valutare la presenza
di Coliformi ai fini della salubrità delle materie prime dei
semilavorati per i quali non è previsto un trattamento di bonifica
finale. Infine, la presenza di Coliformi in acque telluriche, non
sottoposte ad alcun trattamento, è un elemento negativo nel
giudizio di potabilità. La ricerca dei batteri Coliformi e la
valutazione della loro concentrazione numerica è definita
3
colimetria. La colimetria è un test basilare in microbiologia
alimentare e ambientale, che viene condotto quasi su ogni singolo
lotto di alimento, in quanto, come già detto, può fornire una
utilissima informazione circa la igienicità dei campione e delle
manipolazioni da questo subite. Può essere eseguita: 1) con il
metodo del conteggio diretto su terreno solido; 2) con il metodo
M.P.N. in terreno liquido; 3) con il metodo delle membrane
filtranti.

1 Piastra di terreno cromogeno in cui sono cresciute colonie di coliformi (blu e fucsia). Nello specifico le colonie di
colore fucsia sono di Escherichia coli.

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 Colimetria per succo di mandarino pastorizzato.
21/01/2010
Metodo MPN (numero più probabile): brodo di coltura Lauryl
Tryptose broth.

Preparo 2+1 bottiglie con 150 ml di brodo; 10+1 tubi con 18 ml di

brodo; 10 tubi con 9 ml di brodo. In ogni contenitore inserisco le
campanelle e provvedo alla sterilizzazione in caldaia alla
temperatura di 120° C per 15 min. Aspetto che la temperatura dei
contenitori raggiunga quella ambientale.

Inoculo per inclusione 50 ml di succo di mandarino in ognuna delle

bottiglie contenenti 150 ml di brodo al 5,12%; 10 ml di succo di
mandarino in ognuno dei tubi contenenti 18 ml di brodo al 4,73%;
1 ml di succo in ognuno dei tubi contenenti 9 ml di brodo al 3,56%.

Provvedo a correggere il pH del campione da 50 ml di succo e del

campione da 10 ml di succo. Non correggo quello da 1 ml di succo
poiché la quantità di succo non interferisce con il pH della
soluzione.

2 pHmetro, strumento con il quale si stabilisce il pH di un campione liquido.

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Il pH iniziale del campione in esame da 50 è di 5,25. Aggiungo 9,7
ml di soda al 4% portando il pH del campione a 7,02.

Il pH iniziale del campione da 10 ml di succo è di 4,72. Aggiungo

1,85 ml di soda al 4% portando il pH al valore di 7,05.

Dopo aver corretto il pH con la soluzione di soda non sterile, gli

stessi volumi di soda sterile sono stati aggiunti alle provette e alle
bottiglie dei due lotti (2 bottiglie da 50 ml di succo e 10 provette
da 10 ml di succo).

Inserisco i campioni in termostato a 37°C per 48 h.

Allo scadere del tempo previsto, controllo se nel terreno vi sia o

meno presenza di intorbidimento e gas nelle campanelle di
Durham. Nello specifico dei lotti analizzati di succo di mandarino
pastorizzato non vi è alcuna presenza di coliformi.

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 La prassi, qualora si fosse riscontrato intorbidimento e produzione
di gas, sarebbe stata la seguente:

Schema generale

LTB (Lauryl Tryptose Broth)

2 gg

Positivi

BGBB BGBB + TW Kovacs

37°C – 2gg 44°C – 1gg

 Si prendono in considerazione solo i tubi o la bottiglia di campione

con presenza di gas e intorbidimento e si effettuano ulteriori
analisi di conferma, cioè:
 Subcultura con BGBB (brilliant green bile broth), terreno selettivo
che conferma la presenza di Coliformi fecali quali Yersinia,
Klebsiella, Citrobacter, Enterobacter;
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 Preparato il terreno bile verde brillante, inserite le campanelle di
Durham e sterilizzato, si inocula 1 ml di campione, preso dal tubo
o bottiglia risultata positiva, almeno in due tubi per ogni diluizione
positiva.
 Si pongono i tubi in termostato: una a 44°C per 24 ore e una a
37°C per 48 ore.
 Si osserva la formazione di torbidità e gas nelle campanelle di
Durham.
 Si calcola il numero più probabile grazie alla tabella di Mc Crady e
si riporta il valore ottenuto per 100 ml di campione, ossia
moltiplicando il valore corrispondente nella tabella per l’inverso
del fattore di diluizione (se la diluizione maggiore è 10⁻² il fattore
diluizione sarà 10²)

3 Esempio di subcultura in BGBB (verde brillante): il primo tubo risulta negativo vista la limpidezza del liquido; il
secondo e il terzo tubo risultano positivi vista la torbidità del brodo nel secondo e la presenza di gas nelle
campanella di Durham del terzo tubo .

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 4 Esempio della tabella di Mc Crady per il calcolo MPN di batteri.

Parallelamente sarà effettuata una seconda sub cultura con brodo

triptonato con aggiunta del reattivo di Kovacs per la verifica di
indolo (selettivo per Escherichia Coli).

 Si inocula un tubo contenente brodo triptonato con 1 ml di

campione risultato positivo alla colimetria totale e si incuba a 37°C
da 2 a 5 giorni.
 Terminato il tempo stabilito, si aggiunge 0,2 ml di reattivo di
Kovacs su 10 ml si brodo e si osserva il viraggio del colore verso il
rosso. Se tale viraggio (entro 1/3 minuti) non avviene, la presenza
di E. Coli è negativa, altrimenti si conferma la presenza di E. Coli in
un determinato campione.

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 5 La presenza di indolo nel primo tubo stabilisce la presenza di E. Coli nel campione in esame.

Analisi presenza lieviti, muffe e batteri totali in 2 lotti di

succo di mandarino pastorizzato 21/01/2010.

Preparo due differenti terreni di coltura, MEA (Malt Extract Agar,

terreno per microrganismi acidofili) e PCA (Plate Count Agar,
terreno per microrganismi mesofili). Dopo la sterilizzazione in
caldaia a 120°C per 15 min. e il raffreddamento a 45°C di tutti i
contenitori, provvedo ad acidificare il MEA con acido lattico nello
specifico 2 ml di acido al 10% per 100 ml di terreno.

Preparo le diluizioni dei campioni (lotto A e lotto B) intero e 10⁻¹.

Includo 1 ml di succo in 9 ml di acqua distillata portando la
diluizione del campione a 10⁻¹ (0,1 ml di succo)

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Semino il campione di succo di mandarino nelle piastre Petri alle
quali successivamente aggiungo i terreni: 5 per ogni lotto con il
PCA e 5 per ogni lotto con il MEA. Dopo aver miscelato bene il
contenuto delle piastre e aspettato la solidificazione, inserisco il
tutto in termostato per 5 giorni a 30° C.

6 Piastra Petri con colonie di coliformi durante la conta.

Allo scadere del tempo previsto estraggo le piastre dall’incubatore

e dalla prima analisi visiva le piastre risultano negative. Il
procedimento di pastorizzazione ha eliminato completamente le
potenziali cariche batteriche del succo di mandarino.

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