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Farmacologia preclinica

Riferimenti: Dr. Sabata Pierno Prof. Diana Conte

Test preclinici
Valutazione del principio attivo prima del test sulluomo (clinici)

Studi in vitro
Colture cellulari Test di farmaci su cellule normali o cellule in cui viene indotta una mutazione

Studi in vivo
Organismi interi Test in vivo su modelli animali di patologie e animali sani

Valutazione tossicit
Acuta Subcronica Cronica Riproduttiva Cancerogenesi

Studi in vitro
propriet farmacologiche screening iniziale di tossicit metabolismo

Test di tossicit
Valutazione del rischio potenziale nelluomo derivante dallesposizione ad un farmaco

es. di test in vivo: inibizione


Misura della durata del sonno da esobarbitale (farmaco rapidamente disattivato dalle monoossigenasi epatiche) Gli inibitori di questo sistema prolungheranno dunque la loro azione es. somministrazione cloramfenicolo a topi 1 ora prima della somministrazione con pentobarbitale prolunga il sonno in maniera dose-dipendente

Test di neurotossicit
Su nuovi farmaci e agenti chimici Uso di modelli animali: in genere roditori Vengono valutati parametri neurocomportamentali come perdita di memoria, deficit somatosensoriali, disfunzioni motorie e anche laspetto fisico, reattivit, forza muscolare Supporto dei test in vitro

Meccanismi di tossicit acuta

I canali ionici che facilitano la trasmissione dellimpulso nervoso sono sensibili a perturbazioni causate da varie sostanze tossiche e farmaci. (Gli inibitori del trasporto ionico sono indicati in parentesi)

Test in vivo: tossicit acuta

Stabilire effetti tossici da singola dose: Si costruisce una curva dose risposta con almeno 5 animali per sesso Effetto quantale (tutto o nulla)
Fine: Standardizzare dosi definire meccanismi attribuire eventuale tossicit dorgano letalit determinazione requisiti sicurezza imballi

Fattori responsabili della variazione della DL50


Specie Razza et Genere Peso Stato di salute Stato nutrizionale Contenuto intestinale Via di somministrazione Stabulazione Temperatura Orario Stagione Errore umano

Saggio di irritazione oculare


Per valutare lirritazione dovuta a composti applicati topicamente nellocchio Variazione del test di Draize Animale da esperimento pi adatto: coniglio
Il test consiste nellapplicare il materiale da valutare nel sacco congiuntivale nellocchio. Laltro occhio funge da controllo. Dopo 1, 2, 3 giorni va esaminato laspetto della cornea (opacit), iride (aspetto e reazione alla luce), congiuntiva (arrossamento ed effetto sui vasi), palpebre (eventuale gonfiore). La colorazione alla fluoresceina pu migliorare lesame visuale perch il colorante pu essere pi facilmente assorbito dai tessuti danneggiati, che diventano fluorescenti quando locchio viene illuminato Nuove direttive: numero di animali minimo richiesto ridotto da 6 a 3. Il pH va controllato con attenzione

Test per irritazione cutanea applicazione topica di sostanze chimiche


Irritazione primaria Il composto da studiare viene applicato su unarea rasata di 5 cm2 sul dorso di conigli albini. Dopo 24 ore larea viene osservata valutando arrossamenti, lesioni, edemi ecc. Sensibilizzazione cutanea Valutazione reazioni allergiche. Ricerca di anticorpi. Animali usati: cavie Fase di induzione: trattamento ogni 3 giorni per 2 settimane. Poi trattamento topico di 24 ore simile al test di irritazione cutanea. Segue osservazione severit lesioni su numero animali

Sicurezza farmacologica
Test per lo sviluppo di nuovi farmaci
Identificare gli organi bersaglio (SNC, sistema cardio-vascolare, sistema polmonare) Identificare gli effetti indesiderati Possibili effetti tossicologici Identificare il meccanismo che porta agli effetti indesiderati

Studi di tossicit generale


Acuta: singola somministrazione; A breve termine (dosi ripetute): 14-28 giorni; Prolungata (10-25% della vita dellanimale, subcronica): 3-6 mesi (nel ratto) Cronica (>50% della vita): 1-2 anni nel ratto (in genere studi di cancerogenesi)

Rapporto con lesposizione delluomo


gli studi acuti rappresentano lesposizione dovuta ad incidenti o a sovradosaggi accidentali o volontari. gli studi subcronici rappresentano lesposizione (a livelli pi bassi di quelli dovuti ad incidenti) frequente a sostanze di uso professionale (es. solventi) o domestico (es. detergenti), ad additivi alimentari, farmaci e inquinanti ambientali; gli studi cronici rappresentano lesposizione giornaliera, per tutta la vita, ad additivi alimentari, residui di pesticidi nel cibo e nellacqua ecc.

Tipi di tossicit
Tossicit funzionale: alterazioni delle funzioni di un sistema (nervoso, cardiovascolare, endocrino) danno dorgano. Citotossicit: alterazione irreversibile di proteine (enzimi, canali ionici ecc.) o membrane (lipidi); disregolazione del metabolismo necrosi, apoptosi tossicit tissutale e dorgano o sistema (fegato, rene, SNC ecc.). Genotossicit: alterazione del DNA mutazioni, alterazioni cromosomiche cancerogenesi, malattie congenite. Reazioni allergiche: allergeni, apteni, modificatori degli antigeni cellulari risposta immunitaria.

Predittivit degli studi animali di 221 effetti tossici di 150 farmaci nelluomo.

Tossicit subcronica
Provocata da somministazione ripetuta (es. orale 28-90 gg) Essenziale per stabilire i regimi di dose Determinazione NOEL (No-observed effect level)
3 livelli di dose; Via di somministrazione con la dieta N animali (roditori) = 10-20 (maschi e femmine) per ogni livello di dose La specie scelta dovrebbe essere quella con maggiore similarit farmacocinetica e metabolica con luomo (il pi comune roditore il ratto il pi comune non roditore il cane) Per ridurre la variabilit si usano ceppi di roditori consanguinei Gli animali devono essere posti in quarantena prima di essere ammessi nellarea di sperimentazione Regolare ispezione da parte del veterinario

Valutazione della reversibilit

Cibo normale per 21-28 giorni Osservazione dei vari parametri

Lista dei parametri da valutare


Dati in vita
palpabili, lesioni esterne Occhi. Esame della cornea e della retina Consumo di cibo. settimanalmente Peso corporeo. Settimanalmente

Aspetto. Mortalit e morbilit. Pelle, pelo, eventuale presenza di masse

parametri di coagulazione Ematochimica. Elettroliti, glucosio, lipidi, sieroproteine, transaminasi e fosfatasi. Analisi delle urine. pH, densit, proteine, bilirubina Analisi delle feci. Sangue occulto, agenti tossici, metaboliti

Anomalie comportamentali Frequenza respiratoria ECG EEG Ematologia. Prima e dopo il test. Emoglobina, eritrociti, leucociti, piastrine,

Test terminali
Se vengono riscontrate lesioni viene esaminato anche il gruppo a dose pi bassa

Necropsia I tessuti sono rimossi pesati ed esaminati per evidenziare grosse lesioni, masse, ecc. vengono poi fissati in formalina tamponata per il successivo esame istologico Istologia I tessuti elencati, o evantuali masse, vengono inclusi sezionati e colorati per la microscopia ottica. Inclusione in paraffina, colorazione con ematossilina-eosina

Identificazione dei cancerogeni


Cancro: crescita incontrollata di cellule anormali con possibile invasione dei tessuti lontani Lanalisi epidemiologica ha rivelato la presenza di un accumulo di mutazioni di geni critici durante lo sviluppo del cancro

Alterazione processo di replicazione/riparazione DNA danno ossidativo DNA danni DNA causati da cancerogeni ambientali

Spesso un clone cellulare necessita di decenni per accumulare molteplici mutazioni critiche da consentire lo sviluppo di un cancro evidenziabile clinicamente Alcuni geni: proto-oncogeni sono presenti nelle cellule normali e regolano la crescita cellulare. Tali geni sono frequentemente mutati nel cancro Durante la cancerogenesi i geni soppressori di tumore (oncosoppressori) possono subire mutazioni e perdere attivit Alcuni proto-oncogeni e oncosoppressori alterano la capacit della cellula di andare incontro ad apoptosi

Agenti terapeutici come potenziali cancerogeni

Agenti alchilanti Ciclofosfamide Ormoni Fenacetina Metronidazolo Cimetidina

Saggio di riferimento Gold standard


Condotto x 2 anni sui roditori
Limiti: Differenze tra specie Utilizzo di alte dosi Breve ciclo vitale roditori Numerosit del campione Necessit di estrapolazione alluomo Costi elevati

Test preliminari di mutagenicit o tossicit genetica

Saggi di genotossicit / mutagenesi a breve termine sono stati sviluppati utilizzando batteri, lieviti, Drosophila, cellule umane o murine Valutazione della presenza di mutazioni puntiformi, mutazioni frame-shift, danni cromosomici e trasformazioni cellulari

Mutagenicit era sinonimo di cancerogenicit nei roditori solo nel 60% dei casi (meccanismi epigenetici?)

Saggio di Tennant (Science, 1987) 73 sostanze chimiche gi testate come cancerogene nel saggio sui roditori sono state analizzate su 4 saggi a breve termine: 1.Saggio di mutagenesi sulla Salmonella (test di Ames) 2.Saggio del linfoma di topo 3.Formazione di aberrazioni cromosomiche 4.Scambio di cromatidi fratelli in cellule ovariche di criceto

Tossicologia genetica
DNA e mutazioni

Mutazioni Variazioni stabili del materiale genetico trasmesse alla progenie

Mutazioni spontanee
provocate da fattori chimici endogeni e da errori nei processi che si attuano sul materiale genetico

Mutazioni indotte
prodotte dall'azione di particolari agenti fisici o chimici

Mutazioni cromosomiche
Alterazione della struttura del cromosoma Es. sindrome del cri du chat (microencefalia, difficolt intellettive) delezione braccio corto cromosoma 5

Mutazioni genomiche
riguardano il numero di cromosomi Aneuploidie = Aggiunta o perdita di cromosomi
le forme di aneuploidia pi frequenti sono la mancanza di un cromosoma da una coppia (monosomia) o la presenza di un cromosoma in pi in una coppia (trisomia) . Pi raro il caso di perdita di una coppia intera (nullisomia). Es. trisomia del cromosoma 21 (ridotto sviluppo fisico e mentale, suscettibilit a malattie dellapparato respiratorio) frequenza 1/700 nati La sindrome di Turner invece un esempio di monosomia; gli individui nati con questa anomalia possiedono un solo cromosoma sessuale, quello femminile X.

Mutazioni geniche

Sostituzioni o stop Es. anemia falciforme emoglobina S mutante AT in TA Valina al posto di ac. glutammico Delezione o inserzione di 1 o pi basi Scivolamento nella lettura (mutazioni frameshift)

Dominanti o recessive a seconda se si esprimano o meno nelle cellule diploidi allo stato eterozigote

Test di Ames

Stabilisce la capacit della sostanza in esame di indurre mutazioni in un ceppo di Salmonella che porta una mutazione per un enzima della via biosintetica dellistidina Forte correlazione tra mutagenicit e cancerogenicit Lagente chimico se mutageno potr determinare una mutazione (reversione) del gene compromesso permettendo cos al batterio di risintetizzare laminoacido essenziale.

Test di Ames
La sensibilit dei ceppi pu essere aumentata da mutazioni ulteriori Esistono ceppi ricombinanti per gli enzimi del metabolismo

Coltura di Salmonella istidina-dipendenti (medium + istidina)

non-mutageno

Miscela S9 Enz fegato ratto coltura su Agar privo di istidina incubazione 2 giorni 37C

mutageno

Potenziale mutageno Il mutageno pu casualmente revertire il fenotipo deficiente determinando la comparsa di cloni in grado di sintetizzare istidina
2007 J.F. DESAPHY

Tossicit cronica
Durata: generalmente 1 anno o pi Animali utilizzati: ratti e cani Studi di cancerogenesi: ratti e topi Fine dello studio: Definizione dei margini di sicurezza I parametri da valutare sono gli stessi usati per gli studi subcronici

I test di cancerogenesi
hanno requisiti in comune con i test subcronici e cronici Lagente chimico da testare pu essere somministrato nel cibo, acqua da bere, applicazione dermica, sondino, inalazione La somministrazione va effettuata a cominciare dopo lo svezzamento La dose pi alta utilizzata la MTD (max dose tollerata) Principale parametro determinato: incidenza tumorale misurata attraverso esami istologici Necessario un gran numero di animali a causa della possibilit di comparsa spontanea di tumori (50 o pi ratti o topi per sesso e per gruppo di trattamento) Necropsia ad uno stadio intermedio (es. 12 mesi) e alla fine del test

Test di teratogenesi tossicologia della riproduzione

Interferenza con la capacit riproduttiva Possibilit di introdurre malformazioni congenite


Negli adulti (trattamento precedente laccoppiamento e nelle femmine fino alla lattazione) Negli animali in gravidanza durante il periodo di organogenesi

Calcolo delle perdite pre- e post- impianto (riassorbimento precoce e tardivo e morte fetale) Procedura sperimentale
25 maschi vengono trattati per 70 gg che precedono laccoppiamento e 25 femmine per 14 gg prima dellaccoppiamento La durata scelta sulla base dei tempi critici di ovulazione e spermatogenesi Il trattamento viene continuato per tutta la gravidanza (21 gg) e fino allo svezzamento (ancora 21 gg) 3 livelli di DOSE (nel cibo, acqua da bere, con sondino) La dose alta viene scelta per causare una tossicit non eccessiva nella madre (es. tale da indurre decremento di peso corporeo del 10% o effetti su organi bersaglio) Basse dosi nel range dei no-effect level

Procedura sperimentale
Dopo la nascita i piccoli vengono contati, pesati ed esaminati per evidenziare eventuali anormalit Le nidiate sono raggruppate in numero costante (8-10) dopo 4 giorni Allo svezzamento i cuccioli vengono sacrificati e su di essi eseguita autopsia per valutare eventuali anormalit interne Negli studi multigenerazionali vengono salvati 25 animali per sesso e per gruppo per produrre le successive generazioni Il trattamento continua per tutto il test, che pu essere condotto per due tre generazioni

Per valutare effetti da parte materna o paterna possibile trattare solo un genitore e incrociarlo con un soggetto del sesso opposto non trattato Analogamente possibile distinguere tra gli effetti mediati dallutero o dovuti alla lattazione (scambiando i neonati delle femmine trattate con quelli delle femmine non trattate e viceversa)

Es. Antitumorali Antiepilettici Cortisonici Anticoagulanti orali

Effetti della Talidomide


Venduto negli anni 50-60 come sedativo, anti-nausea e ipnotico, rivolto in particolar modo alle donne in gravidanza. Prodotto in forma di racemo, fu ritirato dal commercio (1961) in seguito alla scoperta della teratogenicit dovuta ad uno dei suoi enantiomeri, resa tristemente evidente dalla nascita di migliaia di bambini che presentavano amelia (assenza degli arti) o vari gradi di focomelia (riduzione delle ossa lunghe degli arti), generalmente a carico degli arti superiori che quelli inferiori, e quasi sempre bilaterale. dopo 3 anni di prove su animali non gravidi e su donne in allattamento Effetti collaterali non gravi La specie umana risultata essere sensibile alla dose di 1 mg/kg. Inibitore dellangiogenesi

Teratogenesi: parametri da osservare


Indice della fertilit: n di gravidanze rispetto al n di accoppiamenti N dei nati vivi rispetto al n nati Perdite pre-impianto: n corpi lutei rispetto al n dei siti di impianto Perdite post-impianto: n dei siti di riassorbimento nellutero rispetto al n dei siti di impianto Durata della gestazione Effetti sul sistema riproduttivo Dimensioni e condizioni della nidiata, morfologia dei cuccioli alla nascita, genere Sopravvivenza dei cuccioli Aumento in peso e in prestazioni Tempi di comparsa dei punti di riferimento dello sviluppo: apertura occhi, eruzione dei denti, apertura vagina, separazione prepuzio nei maschi Anormalit morfologiche

Affinch un agente venga etichettato

Teratogeno
Occorre un significativo incremento dellincidenza di anormalit strutturali e funzionali sfavorevoli nella prole in seguito alla sua somministrazione alle femmine nel corso della gravidanza o direttamente allorganismo che si sta sviluppando

Gli studi di teratologia vengono condotti su due specie (roditori come il ratto e non roditori come il coniglio, cane, primati) Deve essere utilizzato un sufficiente numero di femmine in modo che vi siano almeno 20 femmine gravide per ogni gruppo di dose. Tempo di somministrazione tale da esporre le madri nel periodo di organogenesi (6-15 gg per ratti e topi, 618 gg per conigli) La sostanza viene soministrata direttamente con un sondino endogastrico (come richiesto da EPA) x un calcolo pi preciso della quantit 3 livelli di dose (dose pi elevata non pi del 10% mortalit nelle madri)

Colture cellulari
Test possibili: Vitalit e citotossicit Cancerogenesi e mutagenesi

9 COLTURE MICROBICHE 9 COLTURE DI CELLULE ANIMALI O VEGETALI

Isolamento di cellule dal tessuto, separazione e allestimento di colture cellulari

Transfezioni transienti e stabili


La trasformazione di cellule animali mediata dal DNA avviene in due fasi distinte temporalmente

1 trasfezione Introduzione del DNA nella cellula

2 integrazione incorporazione eventuale nel genoma

Espressione transitoria mediante coprecipitazione con fosfato di calcio


Utilizzare cellule che non esprimono il gene da inserire Plasmide contenente il gene pRC/CMV

CD-8 (pLEU) Carrier CaCL2 A B

2X HEBS

A+B
Si aggiunge il DNA alle cellule

Incubazione per 36-72h a 37C

Particelle sintetiche che possiedeono in superficie anticorpi per i recettori CD8 co-espressi con il gene da Dynal Beads studiare (gene reporter utile per identificare le cellule in cui avvenuta la trasfezione)

Metodo del calcio-fosfato


Molto usato Le cellule incorporano facilmente gli acidi nucleici quando si presentano sotto forma di un precipitato di complessi DNA-calcio fosfato. Da ottimi risultati sia per transfezioni transienti che permanenti

ESPRESSIONE ETEROLOGA DI PROTEINE Permette di fare esprimere ad una linea cellulare la proteina che si vuole studiare attraverso il trasferimento del gene codificante la proteina (trasfezione genica).
Incubazione per qualche ora Cellule al 70% di confluenza Plasmide contenente il cDNA codificante la proteina Gene di resistenza ad un antibiotico

Trasfezione transitoria
Il gene penetra in cellula ma non si integra nel genoma

Dopo 24 ore, le cellule esprimono la proteina. Dopo 3-4 giorni, lespressione cessa.

Selezione clonale

Incubazione con antibiotico Solo le cellule esprimenti il gene di resistenza sopravvivono

Trasfezione permanente

Il gene si integrato nel genoma della cellula

Il clone deriva da una cellula unica. Sono tutte uguali alla cellula madre, Esprimono tutte la proteina

Isolamento di un clone

esempio

Effetti della mexiletina sulla corrente al Na+ misurata mediante la tecnica del patchclamp da canali WT e mutati (paralisi periodica ipercaliemica A1156T, miotonia potassioaggravata G1306E, paramiotonia congenita R1448C) I canali mutati sono stati espressi transientemente in cellule tsA201 e la corrente al Na+ stata misurata 36-72 ore dopo la trasfezione Il farmaco ugualmente efficace su A1156T, meno efficace su G1306E e pi efficace su R1448C Mex, antiaritmico, blocca la corrente al sodio, voltaggio-dipendente, usata anche nelle patologie del muscolo scheletrico (miotonie da sodio e da cloro) caratterizzate da ipereccitabilit

Saggi per valutare lattivit dei farmaci


attivit analgesica antiaggregante antiinfiammatoria antiepilettica antiipertensiva broncodilatatoria antitussiva ecc.

valutazione dellefficacia delle propriet analgesiche di determinate sostanze


(Taber 1974)

Test piastra calda (hot plate o tail flick) nei roditori

test sensibili ai composti oppiacei


Tail flick attraverso stimolazione termica si rilevano risposte di tipo riflesso Hot plate si ritiene si tratti di risposte intenzionali ovvero mediate a livello centrale

Test dellhot plate


fu descritto per la prima volta da Woolfe e MacDonald, 1944 per saggiare la sensibilit al dolore di topi e ratti

Consiste nel mettere un roditore su una superficie riscaldata e misurare lintervallo di tempo (latenza) che intercorre prima che si verifichi una determinata risposta (es. leccarsi la zampa) Il tutto per un periodo di tempo generalmente non superiore a 60 sec la temperatura della superficie meno di 50C, temperatura che non arreca danni alla pelle del roditore numerosi studi sul comportamento animale si prefiggono di ridurre ulteriormente tale temperatura

Il test consiste nella valutazione dei tempi di latenza misurati nei gruppi di animali introdotti al test

Analisi dei risultati

Test statistici

Conclusione sugli effetti dei farmaci