Hirsch Et Al 2017

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Gruppo finanziatori PMC Europa

Manoscritto d'autore
Natura. Manoscritto d'autore; disponibile in PMC 2018 dicembre 06.
Pubblicato in forma modificata finale come:
Natura . 16 novembre 2017; 551(7680): 327–332. doi:10.1038/nature24487.
Rigenerazione dell'intera epidermide umana da parte di cellule staminali

transgeniche
Tobias Hirsch1,* , Tobias Rothoeft2,* , Norbert Teig2,* , Johann W. Bauer3,* , Graziella

Pellegrini4,5,* , Laura De Rosa5, Davide Scaglione6, Julia Reichelt3, Alfred Klausegger3,
Daniela Kneisz3, Oriana Romano7, Alessia Secone Seconetti5, Roberta Contin5, Elena
Enzo5, Irena Jurman8, Sonia Carulli9, Frank Jacobsen1, Thomas Luecke10, Marcus
Lehnhardt1, Meike Fischer2, Maximilian Kueckelhaus1, Daniela Quaglino7, Michele
Morgante8, Silvio Bicciato7, Sergio Bondanza9 e Michele De Luca5,#
1Dipartimento di Chirurgia Plastica, Centro Ustioni, Ospedale Universitario BG Bergmannsheil - Ruhr
Università di Bochum, Germania
2Dipartimento di Neonatologia e Terapia Intensiva Pediatrica, Ospedale Pediatrico Universitario, Ruhr

Università di Bochum, Germania
3EB House Austria e Dipartimento di Dermatologia, Ospedale Universitario del Paracelso

Università di Medicina, Salisburgo, Austria
4Dipartimento di Chirurgia, Medicina, Odontoiatria e Scienze Morfologiche, Università di Modena e Reggio

Emilia, Modena, Italia
5Centro di Medicina Rigenerativa “Stefano Ferrari”, Dipartimento di Scienze della Vita, Università degli Studi di
Modena e Reggio Emilia, Modena, Italia
6 IGA Technology Services srl, Udine, Italia
7Dipartimento di Scienze della Vita, Università di Modena e Reggio Emilia, Modena, Italia
8 Istituto di Genomica Applicata e Dipartimento di Scienze agroalimentari, ambientali e animali,

Università degli studi di Udine, Italia
9Holostem Terapie Avanzate srl, Modena, Italia
#A cui indirizzare la corrispondenza: Michele De Luca, Centro di Medicina Rigenerativa “Stefano Ferrari”, Dipartimento di Scienze della Vita, Università di Modena e
Reggio Emilia, Via Gottardi 100 – 41125 Modena, Italia, Tel: +39 059 2058 064, Fax: +39 059 2058 115, michele.deluca@unimore.it.
*Questi autori hanno contribuito ugualmente a questo lavoro
Contributi degli autori TH, TR, NT, JB, GP, che hanno contribuito in egual modo a questo lavoro, hanno definito procedure strategiche, eseguito trapianti di
innesti transgenici, procedure chirurgiche e mediche e follow-up clinico; LDR ha eseguito dati di immunofluorescenza e analisi di imaging, analizzato i dati e
assemblato tutti i dati di input, preparato le figure e modificato il manoscritto, DS, IJ, MM hanno eseguito il profilo di integrazione dell'epidermide transgenica; RC,
JRAK e DK hanno eseguito esperimenti di tracciamento clonale nelle cellule epidermiche; OR e S.Bi. condotto tutte le analisi bioinformatiche, ASS ed EE eseguito
esperimenti di ibridazione in situ, SC e S.Bo. eseguito tutte le procedure di colture e preparazione di innesti epidermici geneticamente modificati; FJ, TL, ML, MF, M, K
hanno effettuato il follow-up del paziente, DQ ha eseguito analisi di microscopia elettronica; MDL ha coordinato lo studio, definito procedure strategiche, amministrato
gli esperimenti e scritto il manoscritto.
Interessi finanziari concorrenti GP e MDL sono co-fondatori e membri del Consiglio di Amministrazione di Holostem Terapie Avanzate (HTA), srl, Modena, Italia; Chiesi
Farmaceutici SpA (co-fondatore di HTA), detiene una designazione di Farmaco Orfano (EU/3/15/1465) per le colture transgeniche utilizzate in questo documento.
Hirsch et al. Pagina 2
10Dipartimento di Neuropediatria, Ospedale Pediatrico Universitario, Università della Ruhr di Bochum,

Germania
Astratto
L'epidermolisi bollosa giunzionale (JEB) è una malattia genetica grave, spesso letale, causata da
mutazioni nei geni che codificano per il componente della membrana basale laminina-332. I pazienti
sopravvissuti a JEB sviluppano ferite croniche della pelle e delle mucose, che compromettono la loro qualità di
vita e portano al cancro della pelle. Qui mostriamo che le colture di cheratinociti transgenici autologhi hanno
rigenerato un'intera epidermide completamente funzionale su un bambino di 7 anni affetto da una forma devastante
e pericolosa per la vita di JEB. Il pattern di integrazione provirale èinstato
vivomantenuto
e il rinnovamento
a causa di epidermico no
qualsiasi selezione
clonale. Il tracciamento clonale ha mostrato che l'epidermide umana non è sostenuta da progenitori equipotenti,
ma da un numero limitato di cellule staminali a vita lunga, rilevate come olocloni, in grado di autorinnovarsi
in che
ampiamente e di produrre progenitori e in vivo i cheratinociti
vitroricostituiscono un modello che
terminali
può essere
differenziati.
applicato
Questo
ad altre
studio
terapie
fornisce
cellulari e geniche combinate mediate da cellule staminali.
es vivo
L'epidermolisi bollosa giunzionale generalizzata (JEB) è una malattia genetica grave, spesso letale,
caratterizzata da fragilità strutturale e meccanica dei tegumenti. Vesciche ed erosioni della pelle e della
mucosa si verificano all'interno della lamina lucida della membrana basale in seguito a un trauma
minore. Le massicce ferite cutanee croniche compromettono notevolmente la qualità della vita dei
pazienti, portano a infezioni e cicatrici ricorrenti e predispongono al cancro della pelle. La JEB è causata
LAMA3
da mutazioni nella proteina
, AGNELLO3 o LAMC2
eterotrimerica, nota anche come
geni, che laminina
codificano 5, costituita dalle
congiuntamente catene ÿ3,
la laminina-332 (a ÿ3 e
ÿ2) e nei geni che codificano per le integrine del collagene XVII e ÿ6ÿ41. Le mutazioni deleterie che
causano l'assenza di laminina-332 sono generalmente letali all'inizio. Nel JEB non letale, la laminina-332
è fortemente ridotta e gli emidesmosomi sono rudimentali o assenti. Non esiste una cura per JEB e più
del 40% dei pazienti soccombe alla malattia entro l'adolescenza1,2. I trattamenti sintomatici disponibili
possono solo alleviare le devastanti manifestazioni cliniche.
Il rinnovamento mensile e la riparazione tempestiva dell'epidermide umana sono sostenuti dalle cellule
staminali epidermiche, che generano colonie note come olocloni3,4. Gli olocloni producono cellule che
formano meroclone e paraclone, che si comportano come progenitori di amplificazione transitoria (TA)3,4.
Le colture epiteliali che ospitano cellule che formano olocloni possono ripristinare in modo permanente
la pelle massiccia e difetti oculari5–9. Uno studio clinico di fase I/II (1 paziente) e un singolo caso di
studio hanno fornito prove convincenti che il trapianto locale di colture epidermiche transgeniche può
generare un'epidermide funzionale, portando a una correzione permanente (il follow-up più lungo è di 12
anni) di JEB lesioni cutanee10–12. Tuttavia, la scarsità di aree trattate (per un totale di ~0,06 m2 ) non
ha migliorato significativamente la qualità di vita dei pazienti10–12.
Una delle principali critiche a questo approccio terapeutico è stata la sua presunta inidoneità
per le massicce lesioni cutanee che segnano la JEB generalizzata. Qui mostriamo la
rigenerazione salvavita dell'intera epidermide (~0,85 m2 ) su un bambino di 7 anni affetto da una
forma devastante di JEB mediante colture di cheratinociti transgenici autologhi. L'epidermide
rigenerata è rimasta robusta, resistente allo stress meccanico e non ha sviluppato vesciche o
erosioni durante i 21 mesi di follow-up. Tale epidermide completamente funzionale è interamente sostenuta
Natura . Manoscritto d'autore; disponibile in PMC 2018 dicembre 06.

da un numero limitato di cellule staminali epidermiche transgeniche, rilevate come olocloni, in grado di
autorinnovarsi ampiamente in vitro e in vivo .
Il paziente
Nel giugno 2015, un bambino di 7 anni è stato ricoverato presso l'Unità ustioni dell'ospedale pediatrico,
Università della Ruhr, Bochum, Germania. Portava una mutazione del sito di splicing dell'accettore omozigote
(C1977-1G>A, IVS 14-1G>A) all'interno dell'introne 14 di . Fin AGNELLO3
dalla nascita,
su tutto
il paziente
il corpo,
hainsviluppato
particolarevesciche
sugli
arti, sulla schiena e sui fianchi. Le sue condizioni sono peggiorate gravemente sei settimane prima del
ricovero, a causa dell'infezione da . Poco dopo il ricovero, ha sofferto completamenteStafilococco
aureola e Pseudomonas aeruginosa
perdita dell'epidermide su circa il 60% della superficie corporea totale (TBSA). Nelle settimane
successive tutti gli approcci terapeutici fallirono e la prognosi a breve termine del paziente era
sfavorevole (Metodi). Dopo il consenso informato dei genitori, le autorità di regolamentazione
regionali e il comitato di revisione etica dell'Università della Ruhr hanno autorizzato l'uso compassionevole di
es vivo terapia cellulare e genica. Anche i genitori del paziente hanno acconsentito alla pubblicazione del
le fotografie e le informazioni mediche incluse in questo documento.
Al primo intervento chirurgico, il paziente presentava una completa perdita dell'epidermide su circa l'80% di TBSA (Fig. 1a, b).
Rigenerazione di un'epidermide funzionale mediante colture epidermiche transgeniche
Nel settembre 2015, una biopsia di 4 cm2, prelevata da un'area della regione inguinale sinistra del
paziente attualmente priva di vesciche, è stata utilizzata per stabilire colture primarie di cheratinociti,
AGNELLO3
che sono state poi trasdotte con un vettore retrovirale (RV) esprimendo il controllo cDNA sotto
a lunghezza il
intera
di la ripetizione terminale lunga del virus della leucemia Moloney (MLV)13 (Metodi, Dati estesi Fig. 1 e
Informazioni supplementari). In sequenza, 0,85 m2 di innesti epidermici transgenici, sufficienti a coprire
tutta la superficie corporea denudata del paziente, sono stati applicati su un letto della ferita dermica
adeguatamente preparato (dati estesi Fig. 2a). Tutti gli arti, i fianchi e l'intera schiena sono stati innestati
a ottobre e novembre 2015. Alcune delle restanti aree denudate sono state innestate a gennaio 2016.
In precedenza, le lastre epidermiche transgeniche venivano coltivate su plastica, staccate

enzimaticamente dal vaso e montate su una garza non aderente10-12. La coltura di cheratinociti su
substrato di fibrina – attualmente utilizzata per il trattamento di ustioni cutanee e oculari massicce6,8,9
– elimina le complicate procedure di preparazione e trapianto degli innesti ed evita il restringimento
epidermico, consentendo la produzione di innesti più grandi utilizzando lo stesso numero di cellule
clonogeniche necessarie per produrre innesti plastici. Poiché la degradazione della fibrina dopo il
trapianto, che è fondamentale per consentire l'attecchimento cellulare, non è mai stata valutata in un
letto di ferita JEB, al primo intervento chirurgico abbiamo confrontato gli innesti in plastica e in coltura di
fibrina (Metodi, dati estesi Fig. 1).
Il braccio sinistro ha ricevuto innesti in coltura plastica (Dati estesi Fig. 2b, asterischi).
Alla rimozione della garza non aderente (10 giorni dopo l'innesto, dati estesi Fig. 2c, frecce),
era evidente l'attecchimento epidermico (asterischi). La rigenerazione epidermica, valutata a 1
mese, era stabile e completa (Dati estesi Fig. 2d). La gamba sinistra ha ricevuto innesti sia in
plastica che in coltura di fibrina (dati estesi Fig. 2e, asterisco e freccia, rispettivamente), entrambi

che ha mostrato un completo attecchimento a 10 giorni (dati estesi Fig. 2f, asterisco e freccia, rispettivamente)
e completa rigenerazione epidermica a 1 mese (dati estesi Fig. 2f, riquadro).
Dati simili sono stati ottenuti sugli altri arti. Pertanto, la schiena denudata del paziente (dati estesi Fig. 2g) ha ricevuto
solo innesti coltivati con fibrina (riquadro). Come mostrato nei dati estesi Fig. 2h, è stata osservata una rigenerazione
epidermica praticamente completa a 1 mese, ad eccezione di alcune aree (asterischi), alcune delle quali contenevano
isole di epidermide di nuova formazione (frecce). Nelle settimane successive, l'epidermide rigenerata che circonda
le lesioni aperte e quelle isole epidermiche si è diffusa e ha coperto la maggior parte delle aree spoglie (Dati estesi
Fig. 2i). Abbiamo quindi trapiantato i restanti difetti su fianchi, torace, coscia destra, mano destra e spalle. La
rigenerazione epidermica è stata raggiunta nella maggior parte di quelle aree.
Pertanto, circa l'80% del TBSA del paziente è stato ripristinato dall'epidermide transgenica (Fig. 1c).
Durante i 21 mesi di follow-up (oltre 20 cicli di rinnovamento epidermico), l'epidermide rigenerata ha aderito
saldamente al derma sottostante, anche dopo stress meccanico indotto (Fig. 1d e video in Informazioni
supplementari), è guarita normalmente e non ha formato vesciche, inoltre nelle aree in cui sono state eseguite le
biopsie di follow-up (Fig. 1e, freccia).
Il paziente è stato dimesso nel febbraio 2016 e attualmente conduce una normale vita sociale.
La sua epidermide è attualmente stabile, robusta, non presenta vesciche, prurito o richiede unguenti o
farmaci.
Dieci biopsie punch sono state eseguite casualmente, 4, 8 e 21 mesi dopo l'innesto. L'epidermide aveva una
morfologia normale e non potevamo rilevare vesciche, erosioni o distacco dell'epidermide dal derma sottostante (Dati
Sulha
estesi Fig. 3a). l'ibridazione utilizzando una sonda specifica del vettore posto
mostrato
costituita
chesolo
l'epidermide
da cheratinociti
rigenerata
transgenici
era
(Fig. 2a). Alt-AGNELLO3
momento del ricovero,il la
contrario, laminina
controllo e 332-ÿ3 era appena
l'epidermide rilevabile
transgenica nella pellequantità
esprimevano del paziente (Fig. 2b).identiche
praticamente Al
di laminina 332-ÿ3, che era localizzata correttamente alla giunzione epidermico-dermica (Fig. 2b).
La lamina basale conteneva quantità normali di catene di laminina 332-ÿ3 e ÿ2 e integrine ÿ6ÿ4, che erano tutte
fortemente diminuite al momento del ricovero (dati estesi Fig. 3b). Pertanto, i cheratinociti trasdotti hanno ripristinato
un adeguato meccanismo di adesione (dati estesi Fig. 3c).
Infatti, l'epidermide transgenica ha rivelato il normale spessore e continuità della membrana basale (Fig. 2c, punte
di freccia) e la normale morfologia degli emidesmosomi (Fig. 2c, frecce). A 21 mesi di follow-up, il siero del paziente
non conteneva autoanticorpi diretti contro la zona della membrana basale (Dati estesi Fig. 3d).
In sintesi, le colture epidermiche transgeniche hanno generato un'intera epidermide funzionale in un paziente con
JEB. Ciò è coerente con l'idea che le colture di cheratinociti sono state utilizzate per decenni per trattare con successo
vittime di ustioni in pericolo di vita fino al 98% di TBSA5,6,9,14. Si può sostenere che il quadro clinico del paziente
(perdita epidermica massiccia, condizioni critiche, prognosi sfavorevole a breve termine) era insolito e il nostro
intervento chirurgico aggressivo (obbligatorio per questo paziente) impensabile per il decorso clinico della maggior
parte dei pazienti con EB. Ma la sostituzione progressiva dell'epidermide malata può essere ottenuta con interventi
chirurgici multipli e meno invasivi su aree corporee più limitate. EB ha il vantaggio di un derma preservato (non
disponibile nelle ustioni profonde), che consente buoni risultati funzionali ed estetici. Questo approccio sarebbe ottimale
per i pazienti di nuova diagnosi nella prima infanzia. Un banco di trasdotti

le cellule staminali epidermiche prelevate alla nascita potrebbero essere utilizzate per trattare le lesioni cutanee mentre
si sviluppano, prevenendo, piuttosto che ripristinando, le manifestazioni cliniche devastanti che insorgono nell'età adulta.
Attualmente la terapia combinata cellulare e es vivononsono

genica può generalmente
essere applicata
piùalle
gestibili
lesioni
di delle
quellemucose
cutanee,
interne,
forse ad
cheeccezione
però
delle stenosi esofagee.
Profilo di integrazione dell'epidermide transgenica

Le colture transgeniche pre-innesto (PGc) sono state generate da circa 8,7x106 cellule clonogeniche primarie e
consistevano in 2,2x108 cheratinociti (divisi in 36 fiale), circa il 45% dei quali è stato seminato per preparare innesti epidermici
transgenici di 0,85 m2 (Dati estesi Fig. 1 ).
Per studiare il profilo di integrazione dell'intero genoma, 3 campioni di PGc sono stati sequenziati utilizzando due primer
LTR indipendenti (cioè, 3pIN e 3pOUT, Tabella supplementare 1) per l'arricchimento della libreria (n = 12; vedere Metodi).
Il sequenziamento ad alto rendimento ha recuperato un totale di 174,9 milioni di coppie di letture e le librerie ottenute
utilizzando i due primer LTR hanno mostrato un numero simile di letture e conteggi di inserimenti comparabili (Pearson
R>0,92, p<0,005). Dopo aver unito tutti i siti di integrazione dai due sistemi di priming indipendenti, abbiamo identificato
27.303 integrazioni in PGc (Fig. 3a, barre) con una copertura media di 2,5 letture/inserimento (Fig. 3a, linee e Tabella 4
supplementare). La stessa analisi è stata eseguita su colture primarie iniziate da 3 biopsie (~0,5 cm2 ciascuna) prelevate a
4 (gamba sinistra) e 8 (braccio sinistro e gamba sinistra) mesi dopo l'innesto, denominate rispettivamente 4Mc, 8Mc1 e
8Mc2 ( metodi).
Sorprendentemente, abbiamo rilevato solo 400, 206 e 413 integrazioni rispettivamente in 4Mc, 8Mc1 e 8Mc2 (Fig.
3a, barre) con una copertura media di 27,3, 19,5 e 20,4 (Fig. 3a, linee).
Per escludere che la principale differenza nel numero di integrazioni riscontrate nei campioni pre e post trapianto possa
essere attribuibile a reazioni PCR che causano una rappresentazione sbilanciata di ampliconi specifici dell'evento, o
all'effetto spazialità di biopsie punch, abbiamo stimato il numero atteso di PGc , integrazioni 4Mc, 8Mc1 e 8Mc2 utilizzando il
modello di ricattura di Chapman-Wilson sui dati ottenuti dalle librerie indipendenti (Informazioni supplementari)15. In PGc, il
modello ha stimato 65.030±2.120 integrazioni, circa il doppio del numero effettivo di inserimenti rilevati. Lo stesso modello ha
cioè 99%,
stimato 457±31, 323±50 e 457±24, integrazioni indipendenti rispettivamente in 4Mc, 8Mc1 e 8Mc2 (livello di confidenza
ÿ=0,01), che
del è
altamente coerente con il numero di eventi effettivamente rilevato. Da notare che il 58%, 43% e 37% delle integrazioni 4Mc,
8Mc1 e 8Mc2 , rispettivamente, sono stati identificati in PGc (Fig. 3b), che è coerente con la percentuale (~ 50%) di inserimenti
rilevati in PGc dall'analisi NGS .
Le integrazioni sono state mappate su promotori (definiti come regioni di 5 kb a monte del sito di inizio della trascrizione dei
geni RefSeq), esoni, introni e regioni intergeniche. In tutti i campioni pre e post-trapianto, circa il 10% degli eventi si trovava
all'interno dei promotori. La maggior parte delle integrazioni era intronica (~ 47%) o intergenica (~ 38%) e meno del 5% è
stata trovata negli esoni (Fig. 3c, pannello di sinistra). Abbiamo anche annotato integrazioni in elementi regolatori trascrizionali
definiti epigeneticamente (metodi e informazioni supplementari). Come mostrato in Fig. 3c (pannello di destra), circa il 27%
delle integrazioni era associato a promotori o potenziatori attivi e nessun

è stata rilevata una differenza significativa nella distribuzione degli inserzioni nei campioni pre e post-
trapianto (valore p>0, 05; test del chi quadrato di Pearson). Pertanto, il modello di integrazione è stato
mantenuto in vivo e il rinnovamento epidermico non ha determinato alcuna selezione clonale.
I geni contenenti un'integrazione non sono stati arricchiti funzionalmente nelle categorie di ontologia
genica relative ai processi biologici associati al cancro16, ad eccezione della migrazione cellulare e della
piccola trasduzione del segnale mediata da GTPasi (Fig. 3d e Tabella 1 dei dati estesi). Questi risultati
sono tuttavia attesi, poiché le nostre condizioni di coltura sono ottimizzate per favorire la proliferazione e
la migrazione dei cheratinociti, per sostenere le cellule clonogeniche ed evitare la conversione clonale
prematura e la differenziazione terminale, che sono tutti strumentali per il corretto rendimento clinico
degli innesti epidermici in coltura14. Pertanto, analogamente a quanto riportato nelle cellule staminali
ematopoietiche transgeniche17,18, le nostre analisi ad alto rendimento hanno rivelato una preferenza
del vettore specifica per cellula correlata allo stato della cellula ospite in termini di stato della cromatina
e attività trascrizionale al momento della trasduzione19.
I vettori MLV-RV hanno sollevato preoccupazioni sulla genotossicità inserzionale, che è stata
segnalata con cellule staminali ematopoietiche, ma in contesti patologici specifici17,20–22. Infatti,
es vivo terapia
un vettore ÿRV, simile al nostro, ha ottenuto un'autorizzazione all'immissione in commercio
genica per la
dell'immunodeficienza combinata grave dell'adenosina deaminasi ed è stato approvato per studi
clinici di Fase I/II su RDEB (https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02984085) 23. Il profilo di
in vitro
integrazione del paziente ha confermato l'assenza di selezione clonale. Allo stesso in vivo .
e non
modo,
abbiamo mai osservato eventi di immortalizzazione correlati a specifiche integrazioni provirali in molti
cheratinociti trasdotti MLV-RV coltivati in serie. Due pazienti JEB, che hanno ricevuto un totale di
~1x107 cheratinociti transgenici clonogenici in siti corporei selezionati (3,5 e 12 anni di follow-
up)10-12, e il paziente, che ha ricevuto ~3,9x108 cellule clonogeniche transgeniche in tutto il suo
corpo (Dati estesi Fig. 1), non ha manifestato lo sviluppo del tumore o altri eventi avversi correlati.
Pertanto, sulla base dei dati, lain vivo cheratinociti
frequenza di un evento di trasformazione
trasdotti rilevabileinferiore
da MLV-RV sarebbe (se presente)
a 1 su nei
1x107 durante i primi 12 anni di follow-up. Sebbene il follow-up di questo paziente sia più breve e non
consenta di trarre conclusioni definitive, la frequenza degli eventi di mutagenesi inserzionale rilevabili
fino ad oggi è inferiore a 1 su 3,9x108 .
Nella valutazione del rapporto rischio/beneficio, si dovrebbe
anche considerare che i pazienti con JEB gravemente colpiti possono sviluppare un carcinoma a cellule
squamose aggressivo come conseguenza della progressione della malattia.
L'epidermide transgenica è sostenuta da cellule staminali autorinnovanti

(olocloni)
La percentuale di cellule clonogeniche, inclusi gli olocloni, è rimasta relativamente costante
durante la massiccia espansione cellulare necessaria per produrre gli innesti (Dati estesi Fig. 1 e
Dati estesi Tabella 3). Il paziente ha ricevuto ~ 3,9 x 108 cellule clonogeniche, di cui ~ 1,6 x 107
erano cellule che formano oloclone, per coprire ~ 0,85 m2 del suo corpo (dati estesi Fig. 1 e 4 e dati
estesi Tabella 3). Pertanto, sulla superficie corporea del paziente sono state trapiantate ~4,6x104 /
cm2 di cellule clonogeniche o ~1,8x103 /cm2 di cellule staminali (dati estesi Fig. 4).
io
Se le cellule clonogeniche originariamente trasdotte fossero tutte progenitrici equipotenti a vita
lunga, () avremmo recuperato migliaia di integrazioni per cm2 di epidermide rigenerata; () iitutto

le cellule clonogeniche contenute nelle colture 4Mc, 8Mc1 e 8Mc2 avrebbero integrazioni
indipendenti, indipendentemente dal tipo clonale. Se invece l'epidermide transgenica
fosse stata sostenuta solo da un ristretto numero di cellule staminali longeve (generando
iocentinaia
continuamente pool di progenitori TA),di()integrazioni
avremmo recuperato,
per cm2 ; ()almero-
massimo,
e paracloni
solo poche
ii olocloni
contenuti nelle colture 4Mc, 8Mc1corrispondenti.
e 8Mc2 avrebbero le stesse integrazioni trovate negli
Il numero di integrazioni rilevate nelle colture post-trapianto (Fig. 3a) è coerente con il numero
di cellule staminali che sono state trapiantate (Dati estesi Fig. 4), quindi supporta fortemente
quest'ultima ipotesi, che è stata verificata da analisi provirali a livello clonale (Dati estesi Fig. 5)
su PGc, 4Mc e 8Mc1. Sono stati analizzati un totale di 687 cloni (41 olocloni e 646 mero/
paracloni). PGc, 4Mc e 8Mc1 hanno generato rispettivamente 20, 14 e 7 olocloni e 259, 264 e
123 mero/paracloni. Pertanto, PGc, 4Mc e 8Mc1 contenevano rispettivamente il 7,2%, il 5,0% e
il 5,4% di cellule che formano oloclone (Tabella 3 dei dati estesi). Ogni clone è stato coltivato per
ulteriori analisi. Le librerie di giunzioni vettore-genoma, generate dalla PCR mediata
dall'amplificazione lineare (LAM) seguita da pirosequenziamento, hanno recuperato 31 integrazioni
indipendenti mappate in modo inequivocabile sul genoma degli olocloni (Tabella 2 dei dati estesi).
Un oloclone (4Mc) non era trasdotto, 28, 11 e 1 oloclone contenevano rispettivamente 1, 2 e 3
integrazioni. Undici olocloni in 4Mc condividevano lo stesso modello di integrazione. Lo stesso è
accaduto per due coppie di olocloni in 8Mc1. I numeri di copie di olocloni sono stati confermati
da RTq-PCR (dati estesi Fig. 6). Sorprendentemente, il 75% e l'80% delle integrazioni trovate
negli olocloni 4Mc e 8Mc1 sono stati recuperati rispettivamente in PGc (Fig. 4a), supportando
l'indagine basata su NGS e un campionamento rappresentativo. Il modello di integrazione
osservato negli olocloni conferma l'assenza di selezione di integrazioni specifiche durante il
in vivoil3c),
rinnovamento epidermico (Fig. 4b) e rispecchia modello
inclusa
trovato
l'assenza
nelle di
loro
geni
colture
associati
parentali
al controllo
(Fig.
del ciclo cellulare, alla morte cellulare o oncogenesi (Fig. 3d e tabella dati estesi 1).
Il tracciamento clonale è stato quindi eseguito mediante PCR, utilizzando le coordinate

genomiche degli inserzioni di oloclone. Come previsto, la stragrande maggioranza dei
merocloni e paracloni PGc (91%) non conteneva le stesse integrazioni rilevate negli olocloni
corrispondenti (Fig. 4c, PGc). Tale percentuale è scesa al 37% già a 4 mesi dall'innesto (Fig.
4c, 4Mc). Sorprendentemente, praticamente l'intera popolazione clonogenica di colture
primarie di cheratinociti stabilite a 8 mesi conteneva le stesse integrazioni rilevate nei
in vivo
corrispondenti olocloni (Fig. 4c, Questi
mesi. 8Mc1).dati
Pertanto, l'emivita
mostrano dei progenitori
formalmente AT è di circa
che l'epidermide 3-4
rigenerata
è sostenuta solo da cellule staminali a vita lunga (olocloni) e sostiene l'idea che merocloni e
paracloni sono progenitori di breve durata continuamente generati dagli olocloni, entrambi .
L'elevata percentuale di integrazioni di oloclone recuperata ininPGc, e in vivo
vitroinsieme al numero
eventi di
condivisi tra culture (Fig. 3b), suggerisce che la copertura media dell'analisi NGS in PGc ha
consentito di identificare preferenzialmente integrazioni negli olocloni e nelle cellule TA
derivanti da tali olocloni già durante il processo di coltivazione.
In sintesi, come illustrato in Dati estesi Fig. 7, complessivamente questi risultati dimostrano
ioindipendenti,
che () PGc consisteva in una
() merocloni miscela di(che
e paracloni olocloni, merocloni
possono essereeisolati
paracloni transgenici
direttamente da una pelle
ii

biopsia) sono progenitori dell'AT, non si autorinnovano e si perdono progressivamente durante la

in vivo e rinnovamento epidermico, quindi non contribuiscono al mantenimento a lungo
coltivazione
iii ) l'epidermide
termine dell'epidermide; (come olocloni; è(èsostenuta
transgenica andato un ampio
solo dalleauto-rinnovamento (epidermide,
cellule staminali a vita lunga rilevate )
come confermato dal iv numero
le cellule di eventi
staminali condivisi
fondatrici tra campioni
contenute nella e tra olocloni.
coltura primaria originale devono avere
in vitro e in vivo ) per sostenere in definitiva il rigenerato
Discussione
L'intera epidermide di un paziente con JEB può essere sostituita da colture epidermiche transgeniche
autologhe contenenti un numero appropriato di cellule staminali. Sia lo stelo che i progenitori dell'AT
sono strumentali per una corretta rigenerazione dei tessuti nei mammiferi24. Tuttavia, la natura e le
proprietà delle cellule staminali epidermiche dei mammiferi e dei progenitori dell'AT sono oggetto di
dibattito25,26. Sebbene le colture epidermiche siano state utilizzate per 30 anni nella clinica14, è
stato difficile ottenere una prova formale dell'attecchimento di cellule staminali in coltura. Allo stesso
modo, l'identificazione di olocloni come cellule staminali epiteliali umane e mero/paracloni come
progenitori TA e il loro ruolo nella rigenerazione epiteliale umana a lungo termine sono stati dedotti da
prove convincenti, ma indirette6,8,9,27. Utilizzando integrazioni come segni genetici clonali, dimostriamo
che la stragrande maggioranza dei progenitori TA viene progressivamente persa entro pochi mesi
dall'innesto e l'epidermide rigenerata è infatti sostenuta solo da un numero limitato di cellule staminali
autorinnovanti di lunga durata. Dati simili sono stati prodotti con cellule staminali ematopoietiche
transgeniche28. Questa nozione si oppone a un modello che postula l'esistenza di una popolazione di
progenitori epidermici equipotenti che generano direttamente cellule differenziate durante la vita
dell'animale25 e promuove un modello in cui cellule staminali specifiche persistono durante la vita
dell'essere umano e contribuiscono sia al rinnovamento che alla riparazione mediante dando origine a
pool di progenitori che persistono per vari periodi di tempo, ricostituiscono cellule differenziate e
contribuiscono a breve termine alla guarigione delle ferite26. Quindi, la caratteristica essenziale di
qualsiasi innesto epiteliale in coltura è la presenza (e la conservazione) di un numero adeguato di
cellule che formano oloclone. L'idea che l'epidermide transgenica sia sostenuta solo da cellule staminali
innestate riduce ulteriormente il potenziale rischio di oncogenesi inserzionale.
In conclusione, le cellule staminali epidermiche transgeniche possono rigenerare un'epidermide

completamente funzionale praticamente indistinguibile da un'epidermide normale, finora in assenza di
eventi avversi correlati. Le diverse forme di EB colpiscono circa 500.000 persone in tutto il mondo (http://
www.debra.org). L'esito positivo di questo studio apre la strada alla terapia genica di altri tipi
di EB e fornisce un modello che può essere applicato ad altre cellule staminali combinate
mediate es vivo terapie cellulari e geniche.
Metodi
Dichiarazione etica
Cinque settimane dopo il ricovero del paziente, abbiamo considerato un trattamento palliativo, poiché
la situazione clinica era peggiorata. Il padre della paziente ha chiesto possibili trattamenti sperimentali.
Abbiamo informato i genitori sulla possibilità del trapianto di colture epidermiche
geneticamente modificate. Con l'aiuto di un interprete, i genitori sono stati informati che il

la suddetta procedura era stata applicata solo su due pazienti con epidermolisi bollosa e su siti corporei
limitati. Sono stati inoltre informati che, date le condizioni critiche del paziente, la complessità dell'intera
procedura chirurgica necessaria per l'applicazione dell'innesto avrebbe potuto essere essa stessa letale. È
stato anche discusso il potenziale rischio di sviluppo del tumore all'interno del trapianto. Poiché i genitori
hanno ancora espresso il desiderio di utilizzare questa procedura sperimentale, il comitato etico della
ricerca locale della Facoltà di medicina dell'Università della Ruhr di Bochum, contattato nel luglio 2015, ha
approvato l'esecuzione della procedura se le autorità responsabili hanno approvato il trattamento proposto
nel nostro paziente. Abbiamo contattato il Paul-Ehrlich-Institut, che ha rinviato la richiesta al Consiglio
distrettuale di Arnsberg. Il Consiglio distrettuale di Arnsberg, Renania settentrionale-Vestfalia, Germania,
responsabile dell'approvazione di trattamenti impegnati con nuovi prodotti medici, ha autorizzato l'uso
compassionevole della terapia cellulare e genica combinata nell'agosto 2015. Il Consiglio distrettuale di
es vivo
Duesseldorf, Renania settentrionale-Vestfalia, Germania, ha approvato il lavoro di ingegneria genetica

secondo la legge sull'ingegneria genetica §9 Abs. 2 GenTG sulla base della preesistente approvazione
per il Gene Technology Lab Security Level 2, che era stato modificato nella sala operatoria del BG
University Hospital Bergmannsheil, Ruhr-University Bochum nell'agosto 2015.
L'intera procedura utilizzata per preparare l'epidermide transgenica è stata precedentemente

scientificamente rivista e valutata dal Ministero della Salute italiano e approvata dal Comitato di revisione
etica dell'Università di Modena e Reggio Emilia, i quali hanno entrambi approvato una sperimentazione
clinica di fase I/II con le stesse colture transgeniche nel giugno 2015.
Allo stesso modo, le autorità di regolamentazione austriache hanno esaminato scientificamente
e approvato 2 ulteriori studi clinici che prevedono l'uso di colture transgeniche molto simili, l'unica
differenza è il transgene utilizzato nel vettore.
Tutte le procedure sono state eseguite in aderenza all'ultima versione disponibile (2008) delle
"Linee guida per la traduzione clinica delle cellule staminali" della Società internazionale per la
ricerca sulle cellule staminali (ISSCR). Poiché tutti i requisiti legali attualmente richiesti in Germania
per ottenere l'approvazione al trattamento erano pienamente soddisfatti e le condizioni cliniche del
paziente stavano rapidamente peggiorando, abbiamo deciso di procedere con il trattamento salvavita,
iniziato a settembre 2015, dopo aver ottenuto i genitori ' consenso informato. Tutti i documenti sono stati
presentati ai genitori in tedesco e nella loro lingua madre tradotti da un traduttore accreditato. Anche i
genitori del paziente hanno acconsentito alla pubblicazione di fotografie e informazioni mediche incluse in
questa pubblicazione. Tutte le fotografie sono state presentate loro prima di firmare i moduli di consenso.
Paziente, decorso clinico, procedure chirurgiche e post-operatorie
Fin dalla nascita il paziente ha sviluppato ripetutamente vesciche, a seguito di traumi minori, sulla
schiena, sugli arti e sui fianchi, che occasionalmente hanno causato ferite croniche persistenti fino a un anno.
Sei settimane prima dell'effettiva esacerbazione, le sue condizioni sono peggiorate con lo sviluppo di
enormi lesioni cutanee. Un giorno prima del ricovero, ha sviluppato febbre seguita da una massiccia perdita
dell'epidermide. È stato ricoverato in un ospedale di cure terziarie dove è stata eseguita la cura topica delle
ferite utilizzando medicazioni in schiuma riassorbibile (Mepilex, Mölnlycke Healthcare, Erkrath, Germania).
Poiché il paziente appariva settico con parametri di infezione elevati, ha iniziato

trattamento antibiotico sistemico con meropenem e vancomicina. Gravi squilibri

elettrolitici richiedevano la sostituzione parenterale di sodio, potassio e magnesio. Svelati i
tamponi Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa. A causa dell'ampia area della
ferita e dell'ulteriore deterioramento delle sue condizioni cliniche, il paziente è stato trasferito al centro
ustioni pediatrico dell'Università della Ruhr 4 giorni dopo. Al momento del ricovero, ha subito una completa
perdita dell'epidermide su circa il 60% della superficie corporea totale (TBSA), interessando tutti gli arti, la
schiena e i fianchi. Il paziente era febbrile, cachettico, con un peso corporeo totale di 17 kg (sotto il 3°
percentile), presentava segni di scarsa perfusione e la proteina C-reattiva (CRP) era di 150 mg/L. Il
trattamento antibiotico è stato continuato secondo la valutazione microbiologica con flucloxacillina e
ceftazidima. Retrospettivamente, la diagnosi di sindrome della pelle ustionata da stafilococco era sospettata
a causa di desquamazioni traballanti che apparivano 10 giorni dopo l'inizio dei sintomi e valutate a 47.
Staphylococcus
Abbiamo iniziato aureus è stato
una terapia nutrizionale trovatomediante
aggressiva sui tamponi. Il punteggio
sondino clinico iscorEB29
nasogastrico erakcal/
(1100-1300
giorno) e nutrizione parenterale aggiuntiva (700 kcal /d kcal/kg/d, glucosio 4 g/kg/d, aminoacidi 3 g/kg/d,
grasso 1,5 g/kg/d) secondo le sue esigenze nutrizionali calcolate con la formula di Galveston. È stato
determinato un apporto necessario di circa 1800 kcal/giorno. Le vitamine e gli oligoelementi sono stati
sostituiti secondo necessità poiché lo zinco, il selenio e altri oligoelementi erano al di sotto della soglia di
rilevamento. È stato inoltre avviato il blocco beta-adrenergico con propranololo, come in gravi ustioni30. A
causa del sanguinamento durante il cambio della medicazione e della continua perdita di liquidi corporei a
causa delle diffuse erosioni cutanee, è stata necessaria la trasfusione di 300 ml di globuli rossi concentrati
ogni 7-12 giorni per mantenere il valore di Hb al di sopra di 6-7 g/dl, e 20 g di albumina sono stati sostituiti
una volta alla settimana per mantenere i livelli di albumina al di sopra di 2,0 g/dl. L'assistenza al paziente è
stata eseguita in conformità con le linee guida per il trattamento dell'epidermolisi bollosa31. Il paziente è
stato immerso in una soluzione di iodio-povidone (PVP) o risciacquato con una soluzione di poliesanide-
biguanide (PHMB) in anestesia generale, prima su base giornaliera e successivamente a giorni alterni.
Abbiamo anche impiegato diverse medicazioni per ferite e antimicrobici topici, tra cui gel PHMB e unguento
PVP, senza alcun impatto significativo sulla guarigione delle ferite.
Tuttavia, le ferite sono diventate più pulite e Staphylococcus aureus

non erano più rilevabili per diverse settimane. Il paziente
presentava una sindrome da risposta infiammatoria sistemica persistente (SIRS) con febbre alta, atrofia
e valori elevati di proteine di fase acuta (CRP, ferritina). Soffriva di dolore cronico che richiedeva un
trattamento farmacologico completo con fentanil, dronabinol, gabapentin, amitryptiline e FANS. Il
trattamento antibiotico è stato continuato secondo tamponi effettuati una volta alla settimana; i tamponi
Pseudomonas
hanno rivelato un'infezione intermittente della ferita con e di nuovo. Il trattamento è stato modificato ogni
aeruginosa e nel corso Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis due settimane
Staphylococcus aureusomettendo glicopeptidi, carbapenemi e altri farmaci di ultima istanza utilizzando
principalmente ceftazidima, cefepima, ampicillina, flucloxacillina e tobramicina. A causa delle sue
condizioni pericolose per la vita, abbiamo eseguito un allotrapianto senza successo di innesti cutanei a
spessore diviso prelevati da suo padre. Nonostante un attecchimento iniziale, la perdita completa
dell'innesto si è verificata 14 giorni dopo il trapianto. Anche i tentativi di trattamento con Suprathel
(Polymedics Innovation GmbH, Denkendorf, Germania), amnion e pelle di donatore conservata con
glicerolo (Glyaderm, Euro Tissue Bank, Beverwijk, Paesi Bassi) non hanno avuto successo. Ulteriori
tentativi di trattamento sono stati giudicati inutili da diversi esperti in questo campo. Dopo 5 settimane in
terapia intensiva, il paziente non tollerava più l'alimentazione tramite sondino nasogastrico o duodenale
e iniziò a vomitare dopo piccole quantità di cibo.
A causa della massiccia epatosplenomegalia, un PEG o PEJ non era fattibile. C'era un catetere Broviac

è stata avviata la nutrizione parenterale impiantata e totale (1500 kcal/die, glucosio 14 g/kg/die,
aminoacidi 4 g/kg/die, grassi 2 g/kg/die). A seguito di un tentativo di aumentare la somministrazione
di grasso attraverso la nutrizione parenterale, il paziente ha sviluppato una pancreatite che si è risolta
dopo aver omesso il grasso dalla nutrizione parenterale per alcuni giorni. Con questo regime nutrizionale
il peso del paziente è rimasto stabile ed è stata ottenuta una glicemia inferiore a 150 mg/dl senza
somministrazione di insulina. A questo punto, le cure palliative sembravano l'unica opzione rimasta. A
causa della prognosi a breve termine molto sfavorevole, abbiamo deciso di avviare un approccio
ex vivo epidermiche
terapeutico sperimentale utilizzando la terapia cellulare e genica combinata mediata da cellule
autologhe
staminali
(vedi
Dichiarazione etica). Gli innesti transgenici sono stati preparati, gratuitamente, secondo gli standard di
Good Manufacturing Practices (GMP) da Holostem Terapie Avanzate Srl presso il Centro di Medicina
StefanoEmilia,
Rigenerativa "", Università di Modena e Reggio FerrariModena,
il primoItalia.
trapianto
Ad ottobre
di colture
2015
transgeniche
abbiamo eseguito
sui 4
arti (e parte dei fianchi). A quel tempo, il paziente soffriva di una completa perdita dell'epidermide su circa
l'80% del suo corpo e aveva ancora bisogno di una trasfusione di 300 ml di globuli rossi concentrati ogni
7-12 giorni e 20 g di albumina una volta alla settimana per mantenere il livello di albumina sopra 2,0 g/
dl . Ha continuato a soffrire di febbre alta, atrofia e valori elevati di proteine di fase acuta (CRP, Ferritina).
Le ferite sono state colonizzate
Staphylococcus aureus e
Escherichia coli . La terapia antibiotica perioperatoria è stata eseguita con flucloxacillina,
ceftazidima e ciprofloxacina. In anestesia generale è stata eseguita un'attenta e
approfondita disinfezione con octenidina dicloridrato (Schuelke & Mayr, Norderstedt, Germania) e lo
sbrigliamento chirurgico di tutti gli arti e fianchi, sia con spugne di rame che con bisturi. Le aree
sbrigliate hanno mostrato una buona perfusione con derma intatto. Dopo aver ottenuto l'emostasi
utilizzando una garza imbevuta di adrenalina, tutte le aree sbrigliate sono state lavate accuratamente
con soluzione salina per prevenire il contatto di adrenalina con innesti in coltura. Gli innesti sono stati
accuratamente trapiantati sulle aree denudate e sbrigliate e ricoperti con Adaptic, una medicazione
non aderente (Systagenix Wound Management, Gargrave, Regno Unito) e una medicazione sterile.
Dopo l'intervento, poiché dopo il trapianto era raccomandata l'immobilizzazione totale, il
paziente è stato mantenuto in sedazione continua con isoflurano per 12 giorni utilizzando il
sistema AnaConDa (SedanaMedical, Uppsala, Svezia). Un'infezione del flusso sanguigno
correlata al catetere è stata trattata con successo con vancomicina e meropeneme.
Nonostante l'uso di clonidina e propofol, il paziente ha sviluppato un forte delirio dopo la
sedazione con isoflurano, che è stato risolto dalla levomepromazina. L'attecchimento è stato
valutato a 8-14 giorni. La rigenerazione epidermica è stata valutata a 1 mese (vedi testo). Dopo
il primo trapianto, non era più necessaria la regolare trasfusione settimanale di globuli rossi e
l'infusione di albumina. La condizione generale è migliorata e la nutrizione enterale è tornata
possibile con il paziente che tollerava fino a 400 kcal/die tramite sondino nasogastrico a
complemento della nutrizione parenterale (1500 kcal/die, glucosio 14 g/kg/die, aminoacidi 4 g/kg/
die, grasso 2 g/kg/giorno)32. A novembre 2015 è stato eseguito un secondo trapianto di dorso,
glutei (e piccole zone delle spalle e della mano sinistra). Queste ferite sono state colonizzate
Staphyloccus epidermidiscon
e Enterococcus faecium al momento del trapianto. Il trattamento antibiotico è stato effettuato con
vancomicina e ceftazidima a causa della sospetta infezione del catetere di Broviac. Tuttavia, a causa
dell'alto rischio e dei gravi effetti collaterali della sedazione a lungo termine, il paziente non è stato sedato
dopo il secondo trapianto. Tutte le medicazioni sulla schiena e sui glutei hanno dovuto essere rimosse a
enterococcus
causa dell'infezione quattro giorni dopo il trapianto.faecium
È stata avviata la terapia
polihexanide. Sulantimicrobica topica
dorso, l'innesto con
è guarito
nel

dopo quattro settimane, nonostante l'infezione precoce, è apparsa una pelle stabile senza formazione di vesciche (vedi
testo). Quattro settimane dopo il secondo trapianto, i valori di PCR sono rimasti al di sotto di 100 mg/l e il paziente non era
più febbrile (Dati estesi Fig. 8). La nutrizione enterale completa è diventata nuovamente possibile. La superficie corporea
interessata è rimasta al di sotto del 10% di TBSA. A gennaio 2016, abbiamo eseguito una terza procedura in modo simile
coprendo i difetti rimanenti su fianchi, torace, coscia destra, mano destra e spalle. Queste ferite sono state colonizzate
Staphylococcus epidermidis . Le cellule trapiantate si sono innestate bene. Il
il paziente potrebbe essere ritirato dai suoi analgesici. Il catetere Broviac è stato rimosso e il paziente è stato dimesso 7
mesi e mezzo dopo il ricovero. In questo momento, aveva ancora lievi difetti sulla coscia destra e sui glutei (Fig. 1 e Dati
estesi Fig. 2). Il punteggio clinico di iscorEB era 12. La pelle trapiantata era clinicamente stabile e non formava vesciche. Il
bambino è tornato alla normale scuola elementare nel marzo 2016.
Linee cellulari
Linea cellulare 3T3J2: le cellule 3T3-J2 del topo sono state un regalo del Prof. Howard Green, Harvard Medical
School (Boston, MA, USA). Una banca cellulare 3T3-J2 di grado clinico è stata istituita secondo gli standard GMP da
un appaltatore qualificato (EUFETS, GmbH, Idar-Oberstein, Germania), secondo le linee guida ICH. Le cellule 3T3-J2
certificate GMP sono state autorizzate per l'uso clinico dalle autorità di regolamentazione nazionali ed europee e
coltivate in terreno di aquila modificato (DMEM) di Dulbecco integrato con siero di vitello irradiato al 10%, glutammina (4
mM) e penicillina-streptomicina (50 UI/ ml).
Linea cellulare MFG-LAMB3-Packaging: un vettore retrovirale che esprime il cDNA a lunghezza intera di 3,6 kb sotto il
AGNELLO3 controllo dell'MLV LTR è stato costruito clonando un cDNA LAMB3 da 3,6 kb (Gene Bank Accession #Q13751)
nella spina dorsale MFG 13 Un frammento 5' di LAMB3 cDNA (563bp) dal sito ATG al sito StuI è stato ottenuto mediante
PCR utilizzando come templato il plasmide LB3SN 33. Il prodotto PCR è stato clonato nei siti NcoI e BamHI del vettore MFG.
Il secondo frammento di LAMB3 cDNA (3050 bp) è stato ottenuto da LB3SN mediante digestione enzimatica da StuI a XmnI
e clonato nel vettore MGF nel sito StuI. L'intero cDNA di LAMB3 è stato completamente sequenziato. Le linee cellulari
produttrici di Am12-MGFLAMB3 sono state generate dalla transinfezione nell'anfotropico Gp+In breve, il DNA plasmidico è
stato introdotto nella linea cellulare di confezionamento ecotropico GP+E86 34 mediante trasfezione standard di fosfato di
inv Linea
calcio. Il quarantottesimo dopo la trasfezione, il supernatante è stato raccolto e utilizzato
cellulare diper infettare la linea
confezionamento cellulare
Am12 34. di
confezionamento anfotropica GP+envAml2 ATCC n
° CRL 9641 13 per 16 ore in presenza di 8 ug/ml di Polibrene. Le cellule Am12 infette sono state selezionate
clonalmente in terreno HXM integrato con FCS al 10% e contenente 0,8 mg/ml di G418 e 0,2 mg/ml di igromicina B
(Sigma). Singole colonie sono state sottoposte a screening per la produzione di LAMB3 umana mediante
immunofluorescenza utilizzando un anticorpo specifico per l'anticorpo monoclonale LAMB3 6F12 (dalla Dott.ssa Patricia
Rousselle, CNRS, Lione) e per il titolo virale. Le linee cellulari produttrici risultanti hanno mostrato un titolo virale di unità
formanti colonie 2X106 (ufc). Una banca cellulare master di un clone di imballaggio ad alto titolo (Am12-2/8) è stata
realizzata secondo gli standard GMP da un appaltatore qualificato (Molmed AGNELLO3

SpA, Milano,eItalia)
coltivata
secondo
in DMEM
le linee
integrato
guida con
ICHil
10% di feto irradiato siero bovino, glutammina (2 mM) e penicillina-streptomicina (50 UI/ml). Tutte le certificazioni, qualità e

i test di sicurezza (compresa la rilevazione di virus e altri microrganismi entrambi) sono in vitro e in
vivo stati eseguiti secondo gli standard GMP per entrambe le linee cellulari.
Generazione di fogli epidermici geneticamente corretti e preparazione del trapianto—

Le colture primarie sono state avviate dalla biopsia cutanea prelevata da un'area della regione
inguinale non vesciche. Gli innesti epidermici in coltura transgenica sono stati preparati secondo gli
Stefano Ferrari
standard GMP da Holostem Terapie Avanzate Srl presso il Centro di Medicina Rigenerativa "",
Università di Modena e Reggio Emilia, Modena, Italia. In breve, una biopsia cutanea di 4 cm2 è stata
tritata e tripsinizzata (0,05% di tripsina e 0,01% di EDTA) a 37°C per 3 ore. Le cellule sono state
raccolte ogni 30 minuti, piastrate (2,7x104 cellule/cm2 ) su cellule 3T3-J2 irradiate in modo letale
(2,66x104 cellule/cm2 ) e coltivate in CO2 al 5% e atmosfera umidificata nel mezzo di crescita dei
cheratinociti (KGM): DMEM e Ham's F12 terreno (miscela 2:1) contenente siero bovino fetale irradiato
(10%), insulina (5 ÿg/ml), adenina (0,18 mM), idrocortisone (0,4 ÿg/ml), tossina del colera (0,1 nM),
triiodotironina (2 nM ), glutammina (4 mM), fattore di crescita epidermico (10 ng/ml) e penicillina-
streptomicina (50 UI/ml). Le colture primarie subconfluenti sono state tripsinizzate (0,05% di tripsina
e 0,01% di EDTA) a 37°C per 15-20 minuti e seminate (1,33x104 cellule/cm2 ) su uno strato di
alimentazione (8x104 cellule/cm2 ) composto da 3T3 irradiato in modo letale -cellule J2 e produttore
inv Am12-
GP+cells12 (una miscela 1:2) in KGM. Dopo 3AGNELLO3
giorni di coltivazione,
coltivate in KGM
le cellule
su unosono
strato
state
di alimentazione
raccolte e
3T3-J2 regolare. Le colture trasdotte subconfluenti sono state riunite, risospese in KGM addizionato
con glicerolo al 10%, aliquotate e congelate in azoto liquido (36 fiale, 5x106 cellule/fiala). Ad ogni
passaggio, l'efficienza della formazione di colonie (CFE) da parte dei cheratinociti è stata determinata
placcando 1000 cellule, fissando le colonie con 3,7% di formaldeide 12 giorni dopo e colorandole con
1% di rodamina B.
Per la preparazione di innesti in coltura plastica, i cheratinociti trasdotti sono stati scongelati e
placcati (1x104 cellule/cm2 ) su piastre di coltura da 100 mm contenenti cellule 3T3-J2 irradiate in
modo letale e cresciute fino alla confluenza in KGM senza penicillina-streptomicina. Gli innesti sono
stati quindi staccati con Dispase II, 2,5 mg/ml (Roche Diagnostics Spa) e montati con il lato basale
rivolto verso l'alto su garza sterile non aderente (Adaptic, Systagenix Wound Management, Gargrave, Regno Unito).
Per gli innesti coltivati con fibrina, i gel di fibrina sono stati preparati in piastre da 144 cm2 (Greiner,
Stoccarda, Germania) come descritto10,12,35. I gel di fibrina erano costituiti da fibrinogeno (23,1
mg/ml) e trombina (3,1 UI/ml) in NaCl (1%), CaCl2 (1 mM) e Aprotinina (1786 KIU/ml). I cheratinociti
trasdotti sono stati scongelati e placcati (1x104 cellule/cm2 ) su cellule 3T3-J2 irradiate in modo letale
sui gel di fibrina e fatte crescere come sopra. Gli innesti sono stati lavati due volte in DMEM contenente
4 mM di glutammina e posti in scatole di polietilene sterili, biocompatibili, non permeabili ai gas
contenenti DMEM e 4 mM di glutammina. Le scatole sono state chiuse, termosigillate e confezionate
in un sacchetto di plastica trasparente sigillato e sterile per il trasporto in ospedale.
Immunofluorescenza (IF), Ibridazione in situ (ISH), Microscopia elettronica a trasmissione

(TEM) e colorazione ematossilina/eosina
Per l'IF sono stati utilizzati i seguenti anticorpi: anticorpo monoclonale murino 6F12 contro
laminina 332-ÿ, laminina 332-ÿ3 BM165 mAb (entrambi della Dr. Patricia Rousselle, CNRS,
Lione), laminina 332-ÿ2 D4B5 mAb (Chemicon), integrina ÿ6 450 -30A mAb e ÿ4 integrina
450-9D mAb (Thermo Fisher Scientific).

Per l'immunofluorescenza, le biopsie cutanee normali sono state ottenute come rifiuti chirurgici anonimizzati,
tipicamente da addominoplastica o riduzione mastoplastica e utilizzate come controllo normale.
L'approvazione etica per l'ottenimento del tessuto, delle schede informative del paziente e dei moduli di
consenso è stata ottenuta e approvata dalle nostre istituzioni (Comitato Etico Provinciale, Prot. N° 2894/
CE). Le biopsie cutanee del paziente sono state eseguite in modo casuale, previo accordo con le schede
informative del paziente e i moduli di consenso, a 4, 8 e 21 mesi. Le biopsie cutanee sono state lavate in PBS,
incorporate in Killik-OCT (Bio-Optica) e congelate. L'immunofluorescenza è stata eseguita su sezioni di pelle
da 7ÿm (fissate in PFA 3%, permeabilizzate con PBS/tritone 0,2% per 15 minuti a temperatura ambiente e
bloccate 1 ora a temperatura ambiente con BSA 2% in PBS/tritone 0,2%) utilizzando gli anticorpi descritti in
precedenza in BSA 2 % in PBS/tritone 0,2% e aggiunto alle sezioni di pelle per 30 minuti a 37°C.
Le sezioni sono state lavate 3 volte in PBS/tritone 0,1% e incubate con Alexa Fluor 488 anti-topo di capra
(Life Technologies), diluito 1:2.000 in BSA 2%, PBS/tritone 0,2% per 30 minuti a 37°C. I nuclei cellulari sono
stati colorati con DAPI. Gli occhiali sono stati quindi montati con il mezzo di montaggio Dako e i segnali
fluorescenti sono stati monitorati al microscopio confocale Zeiss LSM510meta con un obiettivo a immersione
in olio Zeiss EC Plan-Neofluar 40x/1,3.
Per valutare la percentuale di colonie trasdotte, 10.000 cellule del pool di PGc trasdotte subconfluenti
sono state piastrate su un vetrino da camera e coltivate per 5 giorni come sopra.
I vetrini della camera sono stati fissati in metanolo al 100% per 10 minuti a -20°C e immunofluorescenza
l'analisi è stata eseguita come sopra. Le colonie positive alla laminina 332-ÿ sono state contate al
microscopio Zeiss AXIO ImagerA1 con obiettivo EC-Plan Neofluar 20x/0,5.
Sul posto l'ibridazione (ISH) è stata eseguita su sezioni di pelle da 10 ÿm. Sintesi della sonda DIG-RNA
è stato eseguito secondo le istruzioni del produttore (Roche, DIG Labeling MIX).
Le coppie di primer con sequenze di promotori Sp6/T7 (MWG Biotech) sono state utilizzate per ottenere
modelli di DNA per la trascrizione in vitro. Sono stati utilizzati i seguenti primer specifici per il vettore: 5'-Sp6-
AGTAACGCCATTTTGCAAGG-3' (Tm 60°C) e 5'-T7-
AACAGAAGCGAGAAGCGAAC-3' (Tm 58°C) 11,12. Le sezioni OCT sono state fissate in PFA 4% e
permeabilizzate con proteinasi K 5ÿg/ml e post-fissate in PFA 4%. Le sezioni sono state quindi incubate in
una soluzione di ibridazione (50% di formammide, 4x SSC, Yeast RNA 500 ÿg/ml, 1x soluzione di Denhard,
2 mM EDTA, 10% di destrano solfato in acqua trattata con DEPC) a 37°C per 1 ora. Le sonde DIG sono
state diluite in una soluzione di ibridazione preriscaldata a 80°C per 2 minuti e aggiunte alla fetta per 20 ore a
37°C. Le sezioni sono state lavate, bloccate in tampone anticorpo (1% di reagente bloccante di Roche in PBS
tween 0,1%) contenente il 10% di siero di pecora per 1 ora a temperatura ambiente. L'anticorpo anti-DIG 1:200
è stato diluito nella stessa soluzione bloccante e aggiunto al vetrino per 4 ore a temperatura ambiente. I
segnali sono stati sviluppati con la soluzione BM-Purple accesa a temperatura ambiente fino a quando il
segnale non ha raggiunto l'intensità desiderata. Le fette sono state quindi montate in glicerolo al 70% e
visualizzate con il microscopio Zeiss Cell Observer con obiettivo EC-Plan Neofluar 20x/0,5.
Per la microscopia elettronica a trasmissione, le biopsie cutanee sono state fissate in glutaraldeide al 2,5%
nella soluzione salina di Tyrode pH 7,2 (24 ore a 4°C), post fissate in tetrossido di osmio all'1% (Electron
Microscopy Sciences) per 2 ore a temperatura ambiente, disidratate in etanolo e propilene ossido e
incorporato in resina Spurr (Polysciences). Sezioni ultrasottili di 70 nm di spessore sono state raccolte su
griglie di rame, colorate con acetato di uranile e citrato di piombo e osservate con un microscopio elettronico
Jeol 1200 EXII (Jeol Ltd, Akishima, Giappone).

Per la colorazione H&E, le sezioni (7ÿm) sono state colorate con H&E (ematossilina Harris per 2 min, acqua
corrente per 1 min, eosina Y per 2 min, etanolo al 70% per 1 min, etanolo al 95% per 1 min, etanolo al
100% per 1 min, due risciacqui in xilene al 100% per 1 min ciascuno) e osservati con il microscopio Zeiss
AXIO ImagerA1 con obiettivo EC-Plan Neofluar 20x/0,5.
Analisi clonale e analisi del DNA: l'analisi clonale è stata eseguita come descritto34 e mostrata in Dati
estesi Fig. 5. Le colture epidermiche subconfluenti sono state tripsinizzate, diluite in serie e piastrate in
piastre da 96 pozzetti (0,5 cellule/pozzetto). Dopo 7 giorni di coltivazione, i singoli cloni sono stati identificati
al microscopio invertito e tripsinizzati. Un quarto del clone è stato coltivato per 12 giorni su un piatto da 100
mm (indicatore), che è stato quindi fissato e colorato con rodamina B per la classificazione del tipo clonale3.
La parte rimanente del clone (3/4) è stata coltivata su piastre da 24 multipozzetti per l'estrazione del DNA
genomico e ulteriori analisi (Dati estesi Fig. 5).
Preparazione e sequenziamento della libreria: le librerie con codice a barre Illumina sono state ottenute da 3
colture pre-trapianto indipendenti (PGc, generate da 3 fiale, ciascuna contenente circa 220.000 cheratinociti
clonogenici) e 3 colture post-trapianto (4Mc, 8Mc1 e 8Mc2). Per ogni campione, 2 provette con 500 ng di DNA
genomico sono state tranciate in 100 ÿl di acqua applicando 3 cicli di sonicazione di 15 sec/ciascuno in un
Bioruptor (Diagenode) per ottenere frammenti di 300-500 bp. Il DNA frammentato è stato recuperato mediante
purificazione con 0,8 volumi di perline Agencourt AMPure XP, due fasi di lavaggio con etanolo all'80% ed
eluizione in Tris-HCl 10 mM.
La riparazione delle estremità del DNA e la coda A delle estremità smussate sono state entrambe
eseguite utilizzando i reagenti Agilent SureSelectXT (Agilent Technologies), secondo le specifiche manuali,
seguiti dalla purificazione con 1,2 volumi di perline AMPure XP. Un adattatore universale personalizzato è stato
generato ricotturando <Phos-TAGTCCCTTAAGCGGAG - C3> oligo e
<GTAATACGACTCACTATAGGGCNNNNNNCTCCGCTTAAGGGACTAT> oligo su un termociclatore da 95°C
a 21°C, con diminuzione di 1°C/min in un Tris-HCl 10 mM, 50 Tampone mM NaCl. La legatura dell'adattatore
universale al DNA con coda A è stata eseguita in un volume di reazione di 30ÿl con 400 U di T4 DNA ligasi
(New England Biolabs) con il rispettivo tampone T4 DNA ligasi 1X e 35 pmol di dsDNA adattatore universale e
incubato a 23°C per 1 h, a 20°C per 1 h, e infine inattivato a caldo a 65°C per 20 min. Ciascun prodotto di
legatura è stato purificato con 1,2 volumi di perline AMPure XP come descritto sopra. L'eluato di ciascuna
reazione è stato suddiviso in 3 provette diverse per eseguire una reazione PCR indipendente al fine di mitigare
la riduzione della complessità specifica della reazione. Ciascuna provetta è stata amplificata mediante PCR con
una combinazione di primer con indice I7 (701/702/703), per multiplexare i campioni sulla stessa corsia di
sequenziamento Illumina e di due primer LTR I5 (501/502) per arricchire specifici codici a barre di MLV
-Sequenze LTR (Tabella Supplementare 1). La reazione PCR è stata eseguita in un volume finale di 25 ÿL, con
20 pmoli di ciascun primer e master mix Phusion High-Fidelity 1X (New England Biolabs). I prodotti della PCR
sono stati purificati con microsfere XPure 0,8 AMPure e tutti i prodotti di amplificazione dello stesso campione
(2 frammentazioni, 3 reazioni PCR) sono stati raggruppati e quantificati sul chip ad alta sensibilità Bioanalyzer
2100. Il sequenziamento accoppiato a 125 bp è stato eseguito su Illumina HiSeq2500 (chimica V4). I codici a
barre Illumina su tutte le corsie Illumina sono stati combinati per mantenere una distanza minima di hamming di
almeno 3 nucleotidi.
L'estrazione e il de-multiplexing delle letture è stata ottenuta utilizzando il software CASAVA (v. 1.8.2)
applicando un disadattamento massimo del codice a barre di 1 nucleotide e considerando la doppia indicizzazione di

Sequenze I7-I5. Le letture sono state elaborate utilizzando la pipeline bioinformatica descritta in dettaglio nei
metodi. In breve, le letture sono state prima ispezionate con cutadapt36 per verificare arricchimenti specifici,
quindi tagliate utilizzando FASTX-Toolkit (http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/) e bbduk2 (http://jgi.doe.gov/
data-and- strumenti/bbtools/) per rimuovere adattatori e primer e mappato alla sequenza di riferimento del
genoma umano GRCh37/hg19 utilizzando BWA MEM37 con parametri predefiniti e il flag -M. Infine, la
coordinata iniziale dell'allineamento è stata utilizzata come sito di integrazione putativo.
Annotazione genomica e funzionale degli eventi di integrazione: l'annotazione dei siti di

integrazione alle caratteristiche del gene è stata eseguita utilizzando il Chipseeker
pacchetto R36.
I siti di inserimento sono stati mappati su promotori (definiti come regioni di 5 kb a monte del sito
di inizio della trascrizione), esoni e introni dei geni RefSeq e regioni intergeniche.
L'arricchimento funzionale nei processi biologici GO dei geni che ospitano un sito di integrazione è stato
clusterProfiler
eseguito utilizzando il pacchetto R36, impostando
statistica.
una sogliaL'annotazione
del valore q dei
di 0,05
siti diper
integrazione
la significatività
agli elementi
regolatori trascrizionali definiti epigeneticamente è stata eseguita con la suite BEDTools 38 utilizzando i dati
ChIP-seq disponibili pubblicamente sulle modifiche dell'istone (H3K4me3, H3K4me1 e H3K27ac) nei progenitori
dei cheratinociti umani (GSE64328)36.
PCR mediata da amplificazione lineare (LAM), NGS su olocloni, PCR su mero/

paracloni e analisi del sito di integrazione: 100 ng di DNA di cheratinociti trasdotti sono stati
utilizzati come modello per LAM-PCR. Il prodotto LAM-PCR è stato avviato con una PCR lineare a 50 cicli e
digerito con 2 enzimi contemporaneamente senza dividere la quantità di DNA utilizzando 1ÿl di MseI (5U/ÿl) e
1ÿl di PstI (5U/ÿl) (Thermo Fisher, Waltham, USA) e legatura di una cassetta linker complementare al sito di
restrizione MseI. La LAM-PCR è stata digerita con 2 enzimi contemporaneamente senza dividere la quantità di
DNA. Il secondo enzima PstI è stato introdotto per eliminare le sequenze 5´LTR-LAMB3 indesiderate. Il primo
prodotto di PCR biotinilato esponenziale è stato catturato tramite sfere magnetiche e riamplificato da una
seconda PCR annidata. Primer LAM-PCR per MLV-PCR, oligonucleotide 5ÿ-biotinilato complementare alla
sequenza 3´-LTR (5´- AGNELLO3 utilizzati sono nella tabella 2. Per il LAM iniziale
GGTACCCGTGTATCCAATAA-3´) è stato utilizzato per la fase di amplificazione lineare. Le 2 fasi di

amplificazione esponenziale sequenziale sono state eseguite con oligonucleotidi annidati complementari
alla sequenza 3´-LTR (5´- GACTTGTGTCTCGCTGTTCCTTGG-3´); (5´-GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC-3
´), ciascuno accoppiato con gli oligonucleotidi complementari alla cassetta del linker (Tabella Supplementare
2). Gli ampliconi LAM-PCR sono stati separati su gel di agarosio standard al 2% (Biozym, Hessisch Oldendorf,
Germania) e le bande asportate sono state clonate nello StrataClone PCR Cloning Kit (Agilent Technologies,
Santa Clara), purificate con PCR utilizzando il kit di purificazione del prodotto High Pure PCR (Roche, Basilea,
Svizzera), fucile clonato e sequenziato da Sanger, o utilizzato come prodotto PCR non purificato come
modello per la preparazione della libreria NGS. I frammenti sono stati riparati alla fine, legati con adattatore,
riparati da nick e purificati utilizzando lo Ion Plus Fragment Library Kit (Life Technologies, Carlsbad, USA).
Anche la preparazione delle dime e la corsa di sequenziamento sulla macchina sono state eseguite secondo i
protocolli di Life Technologies. È stata pianificata una copertura verticale media per raggiungere almeno 2000
letture.

Lo screening dei siti di integrazione dei merocloni e dei paracloni è stato effettuato mediante PCR
utilizzando una combinazione del primer FW MLV 3´LTR control F (5'-
GGACCTGAAATGACCCTGTG-3') della LTR e uno specifico reverse primer (Tabella
Supplementare 3) in prossimità del sito di integrazione. Il DNA genomico degli olocloni è stato
utilizzato come controlli positivi.
Numero di copie del virus (PCN): l'analisi TaqMan PCR è stata eseguita con TaqMan Universal
AGNELLO3 e : GAPDH
PCR Master Mix e sonde specifiche per vettore (Hs00165078_m1; Hs03929097_g1, AGNELLO3:
Biosystems).
Applied
GAPDH
L'amplicone si trovava tra esoni adiacenti per riconoscere solo il provirus
AGNELLO3 AGNELLO3. Reazioni
sono stati eseguiti con ABI Prism 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems),
utilizzando 10 ng di DNA genomico. La quantità relativa che mette in relazione il segnale PCR del
GAPDH
provirus bersaglio è stata normalizzata al livello di (gene di controllo
genomico interno) la
utilizzando nello stesso DNA 2-ÿÿCT .
quantificazione
Analisi bioinformatica dei dati di sequenziamento
Per elaborare le letture del sequenziamento, abbiamo assemblato una pipeline bioinformatica personalizzata composta
da strumenti standard per l'analisi dei dati NGS. In particolare, abbiamo utilizzato per la prima volta cutadapt (v1.14; https://
cutadapt.readthedocs.io/en/stable/)36 verificare la presenza, a coppie lette, di sequenze

specifiche indicative di un arricchimento riuscito. In particolare, nella lettura contenente la sequenza di
primer LTR I5 (lettura 1), abbiamo cercato la sequenza di primer e, alla sua estremità 3', la sequenza
LTR rimanente. Invece, nella lettura che ospita il primer di indicizzazione I7 (lettura 2), abbiamo cercato
la presenza della sequenza di adattatori comuni che precede le 6 basi di indicizzazione. Le coppie
contenenti entrambe le sequenze sono state mantenute per l'analisi dopo aver ritagliato il primer I5 e la
sequenza LTR rimanente in lettura 1 e la sequenza dell'adattatore comune in lettura 2. Quindi, abbiamo
utilizzato FASTX-Toolkit (http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ ) per rimuovere dalla lettura 2 le prime 6
basi di indicizzazione, utilizzate come componente deduplicatore durante il demultiplexing. Poiché ci si
aspetta che metà dei prodotti di amplificazione non siano informativi nel rilevamento del sito di inserimento,
data l'identità dei due LTR del genoma MLV, abbiamo applicato bbduk2 (http://jgi.doe.gov/data-and -tools/
bbtools/) per identificare e rimuovere le coppie di lettura che rappresentano eventi di arricchimento del
primer LTR rivolti verso l'interno. In bbduk2 abbiamo impostato la lunghezza del kmer su 27 (k=27) e la
distanza di modifica e i parametri maxbadkmers entrambi su 1. Le letture sono state allineate sulla
sequenza di riferimento del genoma umano GRCh37/hg19 utilizzando BWA MEM 37 con parametri
predefiniti e flag -M (per includere la firma a mappatura multipla nel file BAM). Le coppie di lettura che
condividevano le stesse coordinate di mappatura e lo stesso componente deduplicatore sono state
etichettate come duplicati PCR e rimosse. Le coppie di lettura allineate sono state ulteriormente filtrate per
mantenere solo quelle mappature a una distanza compresa tra 150 e 600 bp (corrispondente alla
dimensione prevista dell'inserto della libreria), consentendo un massimo di 1 bp soft-clip (non allineato) su
tutte le estremità, ad eccezione di l'estremità 5 'della lettura 2 dove abbiamo consentito una clip morbida
di 20 bp poiché contiene la sequenza dell'adattatore comune non tagliata a 18 bp. Infine, abbiamo
mantenuto leggere 1 sequenze con una qualità di mappatura minima di 40 ed estratto e contato le
coordinate di allineamento della loro prima base, che rappresentano il sito di inserimento presunto. I siti di
inserimento entro 10 bp l'uno dall'altro sono stati trattati come un singolo inserimento, i loro conteggi sono
stati sommati utilizzando BEDTools (v2.15; http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/content/bedtools-suite.html)

38 e il conteggio sommato assegnato alla coordinata sinistra. Quando si intersecano i siti di inserimento
tra i campioni, abbiamo considerato la sovrapposizione di quegli eventi di inserimento più vicini di 30 bp.
Calcolo del numero previsto di integrazioni
Il numero atteso di integrazioni (cioè la dimensione prevista della popolazione) nei campioni PGc, 4Mc, 8Mc1 e
8Mc2 è stato calcolato in R applicando un modello di cattura-ricattura basato sulla stima di Chapman e sui suoi
intervalli di confidenza 15,39:
n +1n +1
1 2
N= ÿ1
n +1
11
n +1n
1 2 + 1 n 21 n 12
N±Z
1 - ÿ/2 2
n +1 n +2
11 11
dove N è il numero stimato di integrazioni, n1 è il numero di integrazioni trovate nella libreria 3pIN, n2 quelle
trovate nella libreria 3pOUT, n11 il numero di integrazioni sovrapposte, n12 e n21 l'inserimento rispettivamente
al netto di 3pIN e 3pOUT, e
Z 1- ÿ /2 = 2,56 per ÿ=0,01.
Annotazione genomica e funzionale di eventi di inserimento
Per annotare i siti di integrazione alle caratteristiche del gene, abbiamo Chipseeker Pacchetto R
utilizzato (v1.10.3, https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/ChIPseeker.html) 40. I siti di
integrazione sono stati mappati su promotori, definiti come regioni di 5 kb a monte dei siti di inizio della
trascrizione (TSS), esoni e introni dei geni RefSeq, e su regioni intergeniche.
Abbiamo eseguito l'annotazione funzionale dei geni che ospitano siti di integrazione utilizzando il
clusterProfiler Pacchetto R (v3.2.14; https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/
clusterProfiler.html) 41, impostando una soglia del valore q di 0,05 per definire i processi biologici di
ontologia genica (GO) arricchiti.
Per annotare i siti di integrazione a elementi regolatori trascrizionali definiti epigeneticamente (promotori e
potenziatori), abbiamo utilizzato la suite BEDTools (v2.15; http://
bedtools.readthedocs.io/en/latest/content/bedtools-suite.html) 38. Definiamo promotori e potenziatori utilizzando i dati ChIP-
seq disponibili pubblicamente sulle modificazioni dell'istone (H3K4me3, H3K4me1 e H3K27ac) prodotte nei progenitori dei
cheratinociti umani 42. In breve, sono stati raccolti file letto contenenti le coordinate delle regioni genomiche arricchite per
ciascuna modifica dell'istone (picchi) scaricato dal database Gene Expression Omnibus (GSM1568245 per H3K4me3,
GSM1568244 per H3K4me1 e GSM1568247 per H3K27ac). I picchi H3K4me3 vicini al TSS (<5 kb) dei geni RefSeq sono
stati definiti come promotori, mentre i picchi H3K4me1 lontani dal TSS (>5 kb) sono stati definiti come potenziatori. Promotori
e potenziatori sono stati classificati come "attivi" se si sovrappongono ai picchi di H3K27ac, altrimenti sono classificati come
"deboli". Infine, i siti di integrazione sono stati mappati su promotori e potenziatori attivi e deboli.

Le differenze nell'annotazione dei siti di integrazione alle caratteristiche del gene e agli elementi normativi
test.chisq
sono state testate utilizzando funzione
il pacchetto R. (test del chi quadrato di Pearson) del statistica
Analisi bioinformatica dei dati NGS da olocloni
L'analisi dei dati è stata implementata con singole sequenze di lettura del file BAM. I risultati di output con ÿ 5%
di copertura della query, ÿ 95% di identità e una dimensione di ÿ 48 bp sono stati presi in considerazione per la
conferma come sito di integrazione con PCR di controllo. Le sequenze sono state allineate al genoma umano ()
Consorzio
utilizzando NCBI BLAST (https://di riferimento del genoma GRCh37
blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). L'identificazione del gene più vicino è stata eseguita con script PERL
dedicati. La visualizzazione delle integrazioni RTCGD CIS come funzionalità sull'output UCSC BLAT è stata
ottenuta collegandosi a UCSC tramite l'interfaccia web RTCGD (http://rtcgd.abcc.ncifcrf.gov); la posizione
della mappa di ciascuna delle integrazioni retrovirali è stata automaticamente caricata come tracce
personalizzate sul motore di ricerca UCSC BLAT.
Analisi statistiche e visualizzazione dei dati
Le analisi statistiche sono state implementate in R (v3.3.1, http://www.r-project.org/). La figura 3d è stata

generata utilizzando ggplot2/index.html).
ggplot2 Pacchetto R (v2.2.1, https://cran.r-project.org/web/packages/
Disponibilità dei dati
Tutti i dati di sequenziamento ad alto rendimento dei profili di integrazione sono stati depositati nel Sequence
Read Archive (SRA) con il numero di accesso SRP110373. Tutti i dati utilizzati per generare i dati principali e
supplementari sono forniti come file di dati di origine.
Dati estesi
Tabella dati estesi 1
un. Arricchimento del processo biologico correlato al cancro nei geni che ospitano un inserimento.
Gli arricchimenti statisticamente significativi a un livello di confidenza del 95% (valore qÿ0,05 in un test esatto
di Fisher) sono in grassetto. Le categorie GO sono state selezionate per rappresentare i segni distintivi del
cancro descritti in Hanahan D, Weinberg RA. Cellula. 4 marzo 2011;144(5):646-74.
b. Annotazioni genomiche e funzionali di integrazioni in olocloni.
Valore q (FDR)
Processo biologico correlato al cancro GO ID Descrizione
PGc 4Mc 8Mc1 8Mc2
GO:0070265 morte cellulare necrotica 0,28 0,58 0,56 0,65
GO:0010939 regolazione della morte cellulare 0.31 0,53 0,53 0,64

necrotica
Morte cellulare e apoptosi 0,25 0,54 0,53 0,66

GO:0097300 morte cellulare necrotica programmata
--- 0,52 0,67 0,72

GO:2001233 regolazione della via di
segnalazione apoptotica
0,06 0,67 --- ---

GO:0006282 regolazione della riparazione del DNA
0,53 0,54 --- 0,66

Riparazione del DNA GO:0006298 riparazione della mancata corrispondenza
GO:0006302 riparazione rottura doppio filo 0,64 0,57 0,72 0,91

Valore q (FDR)
Processo biologico correlato al cancro GO ID Descrizione
PGc 4Mc 8Mc1 8Mc2
0,82 0,75 --- 0,83

GO:0006289 riparazione dell'escissione di nucleotidi
0,84 0,58 --- 0,72

GO:0036297 riparazione cross-link interstrand
GO:0001525 angiogenesi 9.54E-05 0.52 0,59 0,74

Angiogenesi
GO:0045765 regolazione dell'angiogenesi 0,53 0,73 0,73 0,72
GO:0090130 migrazione dei tessuti 7.82E-06 0.50 0,53 0.04
GO:0090132 migrazione dell'epitelio 3.64E-06 0.50 0,53 0.04
GO:0010631 migrazione delle cellule epiteliali 3.26E-06 0.49 0,53 0.04
Migrazione 2.43E-06 0.44 0,53 0,05

GO:0010632 regolazione della migrazione delle
cellule epiteliali
0,22 --- 0,53 0,65

GO:0051546 migrazione dei cheratinociti
GO:0001667 migrazione cellulare di tipo ameboidale 3.19E-08 0.52 0,53 0.06
0,85 0,58 0,63 ---

GO:0002526 risposta infiammatoria acuta
0,82 0,45 --- ---

Infiammazione GO:0002544 risposta infiammatoria cronica
GO:0050727 regolazione dell'infiammazione 0,80 0,69 0,61 0,80

risposta
GO:0000723 manutenzione dei telomeri 0,48 0,77 0,63 0,72
GO:0007004 mantenimento dei telomeri tramite 0,38 --- --- 0,73

telomerasi
Attività telomerasica 0,69 --- --- 0,65

GO:0032204 regolazione della manutenzione
dei telomeri
0,66 --- --- ---

GO:0051972 regolazione dell'attività della
telomerasi
0,14 0,60 0,74 ---

GO:0000075 checkpoint del ciclo cellulare
0.18 --- --- ---

GO:1901976 regolamento del checkpoint del
ciclo cellulare
Ciclo cellulare 0,02 0,48 0,83 ---

GO:1901987 regolazione della transizione di fase del
ciclo cellulare
0,01 0,57 0,60 ---

GO:0045786 regolazione negativa del ciclo cellulare
GO:0050673 proliferazione delle cellule epiteliali 4.06E-03 0.52 0,65 0,75
GO:0050678 regolazione della proliferazione delle 0,01 0,52 0,60 0,72

cellule epiteliali
Proliferazione 1.24E-03 0.56 0,55 ---

GO:0043616 proliferazione dei cheratinociti
0,01 0,54 0,53 ---

GO:0010837 regolazione della proliferazione dei
cheratinociti
0,25 0,73 0,60 ---

GO:0072089 proliferazione delle cellule staminali
GO:0006096 processo glicolitico 0,15 0,65 --- 0,75
Glicolisi 0,22 0,54 --- 0,66

GO:0006110 regolazione del processo glicolitico
Annotazione agli
Esempio chr inizio fine ID Holoclone Annotazione ai geni Simbolo del gene elementi Recoin I
normativi
PGc chr5 131410002 131410003 PGc_H1 Introne CSF2 nessun segno No

Annotazione
Esempio chr inizio fine ID Holoclone Annotazione ai geni Simbolo del gene agli elementi Recoin I
normativi
chr2 144859325 144859326 PGc_H2 Introne GTDC1 nessun segno No
chr4 101941589 101941590 PGc_H3 Intergenico - potenziatore debole n
chr4 39355299 39355300 PGC_H4 Introne RFC1 potenziatore debole n
chr19 17908000 17908001 PGc_H5 Introne B3GNT3 nessun segno No
chr19 42615156 42615157 PGc_H6 Introne POU2F2 nessun segno No
chr5 -
150977858 150977859 PGC_H7* Intergenico potenziatore attivo sì
chr17 80832738 80832739 PGC_H7* Introne TBCD potenziatore attivo sì
chr16 56726522 56726523 PGc_H7* Intergenico - nessun segno sì
chr2 8999619 8999620 PGc_H8 Introne MBOAT2 nessun segno No
chr3 47024025 47024026 PGc_H9 Promotore CCDC12 promotore attivo si
chrY 18367597 18367598 PGC_H10 Intergenico - nessun segno No
chr6 160458524 160458525 PGC_H11 Introne IGF2R nessun segno No
chr14 91711334 91711335 PGc_H12 Promotore GPR68 promotore attivo si
LOC10192813
chr11 13946563 13946564 PGc_H13 Promotore 2 nessun segno sì
chr14 33789922 33789923 PGc_H14 Introne NPAS3 nessun segno No
chr13 20693331 20693332 PGc_H15 Intergenico - potenziatore debole n
chr6 136930722 136930723 PGC_H16 Introne MAP3K5 potenziatore debole sì
chr18 65398639 65398640 PGc_H17 Introne LOC643542 nessun segno No
chr4 11625725 11625726 PGc_H18 Intergenico - potenziatore attivo n
- nessun segno
chr20 22743911 22743912 PGc_H19 Intergenico sì
chr8 48293010 48293011 PGc_H20 Introne SPIDR potenziatore attivo n
4Mc chrl 183130951 183130952 4Mc H1-11** Intergenico - nessun segno sì
chr9 103188807 103188808 4Mc_H1-11** Promotore MSANTD3 promotore attivo sì
chr14 105213201 105213202 4Mc_H12 Introne ADSL1 nessun segno No
chr15 39577423 39577424 4Mc_H13 Intergenico - nessun segno sì
8MC1 chr8 67025314 67025315 8Mc1_H1-2 Intergenico - potenziatore attivo sì
chr9 125129763 125129764 8Mc1_H3 Promotore PTGS1 nessun segno sì
chr17 76158277 76158278 8mc1_H4-5 Introne C17orf99 nessun segno No
chrX 114601642 114601643 8Mc1_H6 Intergenico - nessun segno sì
chr5 - nessun segno

135342207 135342208 8Mc1_H7 Intergenico sì

Tabella dati estesi 2
L'analisi clonale è stata eseguita su colture pre-innesto (PGc), un innesto pronto per il trapianto
(innesto) e su colture primarie stabilite a 4 (4Mc) e 8 (8Mc1) mesi dopo l'innesto.
H, M e P indicano rispettivamente olocloni, merocloni e paracloni. La frequenza indica la
percentuale di olocloni rilevata nella popolazione di cheratinociti clonogenici. L'innesto
non è stato utilizzato per le analisi LAM-PCR o NGS ma per la quantificazione dell'oloclone
come parte del controllo di qualità.
ID campione ID replicato Numero totale di cloni HM/PH Frequenza (%)
PG-1 88 10 78 11.36
PG-2 63 4 59 6.35
PGc PG-3 62 3 59 4.84
PG-4 66 3 63 4.55
Totale 279 20 259 7.17
Corruzione Corruzione 95 4 91 4.21
4 Mc-1 121 8 113 6.61
4 Mc-2 105 5 100 4.76

4Mc
4 Mc-3 52 1 51 1.92
Totale 278 14 264 5.04
8Mc1-1 56 4 52 7.14
8Mc1 8Mc1-2 74 3 71 4.05
Totale 130 7 123 5.38
Materiale supplementare
Fare riferimento alla versione Web su PubMed Central per materiale supplementare.
Ringraziamenti
Questo articolo è dedicato alla memoria del professor Howard Green, la cui passione e impegno per l'eccellenza nella scienza e nell'istruzione
ha ispirato i ricercatori del Center for Regenerative Medicine.
Holostem Terapie Avanzate srl ha sostenuto tutti i costi di produzione GMP e procedure di innesti epidermici transgenici.
Questo lavoro è stato parzialmente sostenuto dal Ministero dell'Istruzione, Università e Ricerca (MIUR), n.
CTN01_00177_888744; Regione Emilia-Romagna, Asse 1 POR-FESR 2007-13; Fondazione Cassa di Risparmio di Modena; DEBRA Südtirol -
Alto Adige; DEBRA Austria; Consiglio europeo della ricerca (CER) nell'ambito del programma di ricerca e innovazione Orizzonte 2020 dell'Unione
europea (accordo di sovvenzione n. 670126-DENOVOSTEM) e ERC nell'ambito del settimo programma quadro dell'Unione europea (accordo di
sovvenzione n. 294780-NOVABREED); Epigenetica Progetto Flagship sovvenzioni CNR-MIUR. Ringraziamo Ole Goertz, MD per il suo contributo
alle procedure chirurgiche, il Dipartimento di Anestesiologia, in particolare Peter Zahn, MD e Tim Maecken, MD e l'intero staff di sala operatoria, in
particolare Sarah Taszarski e Victoria Stroh, per la loro dedicata assistenza perioperatoria, gli infermieri del reparto PÄD1 per un'assistenza
continua e devota al bambino. Ringraziamo Anna Neumayer e Jeremias Frank per l'assistenza tecnica nella definizione delle integrazioni cloni,
Birgit Mussnig per l'esecuzione dell'immunofluorescenza indiretta, Maria Carmela Latella per la determinazione del numero medio di integrazioni
nelle colture pre e post-innesto e M.
Forcato per feedback critici sulle analisi bioinformatiche.

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Figura 1. Rigenerazione dell'epidermide transgenica.

a, Quadro clinico del paziente che mostra una massiccia perdita epidermica. b,
Rappresentazione schematica del quadro clinico. La pelle denudata è indicata in rosso, mentre le aree con
vesciche sono indicate in verde. Le aree color carne indicano la pelle attualmente priva di vesciche.
Gli innesti transgenici sono stati applicati sia su aree rosse che verdi. c, Restauro dell'intera epidermide del
paziente, ad eccezione di pochissime aree sulla coscia destra, glutei, parte superiore delle spalle/
collo e ascella sinistra (asterischi, complessivamente ÿ2% di TBSA). d, Funzionalità ed elasticità della
pelle normale. e, Assenza di formazione di vesciche nei siti in cui sono state effettuate alcune biopsie post-
trapianto (freccia).

Figura 2. Restauro di una normale giunzione epidermico-dermica.

Sezioni di pelle sono state preparate dalla pelle normale, dalla pelle del paziente affetta (ammissione) e dalla pelle
Sul posto
transgenica a 4, 8 e 21 mesi di follow-up. a, l'ibridazione è stata
() sueseguita
sezioni utilizzando una La
spesse 10 ÿm. sonda transgene
sonda specifica
E-caderina
specifica () è stata utilizzata comet-AGNELLO3
controllo. Barre
statadieseguita
scala, 40
con
ÿm.
6F12
b, l'immunofluorescenza
moAbs su sezioni spesse
della 7laminina
ÿm. DAPI
332-ÿ3
(blu) è
Cdh1 microscopia
contrassegna i nuclei. La linea tratteggiata
elettronica segnasulasezioni
è stata eseguita giunzione epidermico-dermica.
di pelle Barre
spesse 70 nm. Una di scala, basale
membrana 20 ÿm. regolare
c, La
(frecce) e normale

emidesmosomi (punte di freccia, ingrandimento maggiore nell'inserto) sono evidenti nella pelle
transgenica dei pazienti. Barre di scala, 1 ÿm.

Figura 3. Profilo di integrazione dell'epidermide transgenica.

a, Le integrazioni sono state identificate nelle librerie ottenute utilizzando due primer LTR (3pIN, barre
grigio chiaro; 3pOUT, barre grigio scuro; Tabella supplementare 1) e nel set unito (barre nere).
Le linee (asse secondario) rappresentano la copertura media dell'integrazione, calcolata dopo la
rimozione dei duplicati della PCR. b, diagramma di Venn del numero di integrazioni condivise tra i
campioni. c, percentuale di integrazioni mappate su: promotori, esoni, introni e regioni intergeniche (a
sinistra); promotori e potenziatori attivi e deboli definiti epigeneticamente o regioni genomiche senza
segni di istoni (a destra); (valore p>0,05; test del chi quadrato di Pearson). d, Grafico a punti dei primi 5
termini del processo biologico GO arricchiti per ciascun campione. Il colore del punto indica la
significatività statistica dell'arricchimento (valore q); la dimensione del punto rappresenta la frazione di
geni annotati in ciascun termine.

Figura 4. Profilo di integrazione delle cellule staminali e TA.

a, Percentuale di integrazioni di oloclone recuperate nella popolazione di massa PGc. b,
integrazioni di Holoclone mappate su: promotori, esoni e introni e regioni intergeniche (a sinistra);
promotori e potenziatori attivi e deboli definiti epigeneticamente o regioni genomiche senza segni
di istoni (a destra). c, Il grafico a torta PGc (segmento grigio) mostra che il 91% di mero/
i paracloni non contenevano le stesse integrazioni rilevate nei corrispondenti olocloni (ciascuno
indicato da diversi segmenti blu). I grafici a torta 4Mc e 8Mc1 (segmenti grigi) mostrano che tale
percentuale è scesa rispettivamente al 37% e al 17%.

Hirsch Et Al 2017

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Gruppo finanziatori PMC Europa

Rigenerazione dell'intera epidermide umana da parte di cellule staminali

Tobias Hirsch1,* , Tobias Rothoeft2,* , Norbert Teig2,* , Johann W. Bauer3,* , Graziella

2Dipartimento di Neonatologia e Terapia Intensiva Pediatrica, Ospedale Pediatrico Universitario, Ruhr

3EB House Austria e Dipartimento di Dermatologia, Ospedale Universitario del Paracelso

4Dipartimento di Chirurgia, Medicina, Odontoiatria e Scienze Morfologiche, Università di Modena e Reggio

6 IGA Technology Services srl, Udine, Italia

8 Istituto di Genomica Applicata e Dipartimento di Scienze agroalimentari, ambientali e animali,

9Holostem Terapie Avanzate srl, Modena, Italia

*Questi autori hanno contribuito ugualmente a questo lavoro

Hirsch et al. Pagina 2

10Dipartimento di Neuropediatria, Ospedale Pediatrico Universitario, Università della Ruhr di Bochum,

Natura . Manoscritto d'autore; disponibile in PMC 2018 dicembre 06.

Hirsch et al. Pagina 3

Rigenerazione di un'epidermide funzionale mediante colture epidermiche transgeniche

In precedenza, le lastre epidermiche transgeniche venivano coltivate su plastica, staccate

Natura . Manoscritto d'autore; disponibile in PMC 2018 dicembre 06.

Hirsch et al. Pagina 4

Natura . Manoscritto d'autore; disponibile in PMC 2018 dicembre 06.

Hirsch et al. Pagina 5

Attualmente la terapia combinata cellulare e es vivononsono

delle stenosi esofagee.

Profilo di integrazione dell'epidermide transgenica

transgenici di 0,85 m2 (Dati estesi Fig. 1 ).

rilevati in PGc dall'analisi NGS .

delle integrazioni era associato a promotori o potenziatori attivi e nessun

Natura . Manoscritto d'autore; disponibile in PMC 2018 dicembre 06.

Hirsch et al. Pagina 6

L'epidermide transgenica è sostenuta da cellule staminali autorinnovanti

Natura . Manoscritto d'autore; disponibile in PMC 2018 dicembre 06.

Hirsch et al. Pagina 7

Il tracciamento clonale è stato quindi eseguito mediante PCR, utilizzando le coordinate

Natura . Manoscritto d'autore; disponibile in PMC 2018 dicembre 06.

Hirsch et al. Pagina 8

biopsia) sono progenitori dell'AT, non si autorinnovano e si perdono progressivamente durante la

In conclusione, le cellule staminali epidermiche transgeniche possono rigenerare un'epidermide

Natura . Manoscritto d'autore; disponibile in PMC 2018 dicembre 06.

Hirsch et al. Pagina 9

Duesseldorf, Renania settentrionale-Vestfalia, Germania, ha approvato il lavoro di ingegneria genetica

L'intera procedura utilizzata per preparare l'epidermide transgenica è stata precedentemente

Paziente, decorso clinico, procedure chirurgiche e post-operatorie

Natura . Manoscritto d'autore; disponibile in PMC 2018 dicembre 06.

Hirsch et al. Pagina 10

trattamento antibiotico sistemico con meropenem e vancomicina. Gravi squilibri

Tuttavia, le ferite sono diventate più pulite e Staphylococcus aureus

Natura . Manoscritto d'autore; disponibile in PMC 2018 dicembre 06.

Hirsch et al. Pagina 11

Natura . Manoscritto d'autore; disponibile in PMC 2018 dicembre 06.

Hirsch et al. Pagina 12

Staphylococcus epidermidis . Le cellule trapiantate si sono innestate bene. Il

bambino è tornato alla normale scuola elementare nel marzo 2016.

mM) e penicillina-streptomicina (50 UI/ ml).

confezionamento anfotropica GP+envAml2 ATCC n

realizzata secondo gli standard GMP da un appaltatore qualificato (Molmed AGNELLO3

Natura . Manoscritto d'autore; disponibile in PMC 2018 dicembre 06.

Hirsch et al. Pagina 13

Generazione di fogli epidermici geneticamente corretti e preparazione del trapianto—

Immunofluorescenza (IF), Ibridazione in situ (ISH), Microscopia elettronica a trasmissione

Natura . Manoscritto d'autore; disponibile in PMC 2018 dicembre 06.

Hirsch et al. Pagina 14

Natura . Manoscritto d'autore; disponibile in PMC 2018 dicembre 06.

Hirsch et al. Pagina 15