La Melatonina Inibisce Le Cellule Staminali Del Glioblastoma Attraverso La Soppressione Dell'asse Di Segnalazione EZH2-NOTCH1

23/4/2021 La melatonina inibisce le cellule staminali del glioblastoma attraverso la soppressione dell'asse di segnalazione EZH2-NOTCH1
Int J Biol Sci. 2017; 13 (2): 245–253. PMCID: PMC5332878

Pubblicato online il 6 febbraio 2017. Doi: 10.7150 / ijbs.16818 PMID: 28255276
La melatonina inibisce le cellule staminali del glioblastoma

attraverso la soppressione dell'asse di segnalazione EZH2-
NOTCH1
Xiangrong Zheng , 1, * Bo Pang , 2, * Guangyan Gu , 3 Taihong Gao , 1 Rui Zhang , 1 Qi Pang , 1, ✉ e
Qian Liu 3, ✉
1Department of Neurosurgery, Shandong Provincial Hospital Affiliated to Shandong University, Jinan 250021,
Shandong, China;
2Department of Neurosurgery, Qilu Hospital of Shandong University, Jinan 250012, Shandong, China;
3Department of Histology and Embryology, Shandong University School of Medicine, Jinan, 250012,
Shandong, China.
✉ Corresponding authors: Dr. Qian Liu, Department of Histology and Embryology, Shandong University School
of Medicine, 44# Wenhua Xi Road, Jinan, 250012, Shandong, China. Tel/Fax: 86-531-88382047, E-mail:
qian_liu1980@163.com. Dr. Qi Pang, Department of Neurosurgery, Shandong Provincial Hospital Affiliated to
Shandong University, 324# Jingwu Road, Jinan, 250021, Shandong, China. Tel/Fax: 86-531-87938911, E-mail:
pangqi@sdu.edu.cn
* These authors contributed equally to the study.
Competing Interests: The authors have declared that no competing interest exists.
Received 2016 Jul 11; Accepted 2016 Dec 27.
Copyright © Ivyspring International Publisher
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license (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/). See http://ivyspring.com/terms for full terms and
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Astratto
Le cellule staminali del glioblastoma (GSC) svolgono un ruolo essenziale nella crescita del glioma,
nella radio e chemio-resistenza e nella recidiva. L'eliminazione delle GSC è quindi diventata una
strategia e una sfida chiave nella terapia del glioblastoma. Qui, mostriamo che la melatonina,
un'indolamina derivata dall'I-triptofano, ha inibito in modo significativo la vitalità e la capacità di auto-
rinnovamento delle GSC accompagnate da una diminuzione dei marcatori delle cellule staminali.
Abbiamo identificato la segnalazione EZH2-NOTCH1 come la via del segnale chiave che regolava gli
effetti della melatonina nelle GSC. Invece di silenziare trascrizionalmente l'espressione genica
generando un segno epigenetico metilato all'istone 3 alla lisina 27 (H3K27), EZH2 regola l'espressione
di NOTCH1 legandosi direttamente a NOTCH1promotore. Inoltre, la correlazione tra le espressioni di
EZH2 e NOTCH dominio intracellulare 1 (NICD1) è stata osservata nei campioni di tumore clinico,
evidentemente a sostegno dell'esistenza dell'interazione EZH2-NOTCH1 nei gliomi e nelle GSC.
Collettivamente, abbiamo dimostrato che la melatonina, un potenziale inibitore del tumore, svolge la
sua funzione in parte sopprimendo le proprietà GSC attraverso l'asse di segnalazione EZH2-NOTCH1.
Parole chiave: melatonina, cellule staminali simili al glioblastoma, vitalità, autorinnovamento, EZH2,
NOTCH1
introduzione
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5332878/?fbclid=IwAR1PpS6oUf73-j7PAOHnmysJgMxC_aCTcOqpUUfVVjsLcj3sF2KA9ahisMo 1/16
Le cellule staminali tumorali (CSC) sono sottopopolazioni di cellule tumorali che hanno la capacità di
propagare i tumori in vitro e in vivo e hanno caratteristiche delle cellule staminali normali. È stato
riferito che i glioblastomi multiforme (GBM) hanno anche una sottopopolazione di cellule staminali
che sono responsabili della proliferazione del glioma, della resistenza a chemio e radioterapia e della
recidiva del tumore 1 - 4 . È probabile che le terapie che non eradicano il comparto dell'SGC abbiano
scarso successo.
La melatonina (N-acetil-5-metossitriptamina) è un'indolamina derivata dall'I-triptofano che viene

secreta dalla ghiandola pineale. È ben documentato che la melatonina è coinvolta nella regolazione dei
ritmi cronobiologici e della funzione endocrina 5 . In seguito, molte altre funzioni della melatonina
sono stati segnalati come ad esempio, le proprietà anti-infiammatorie e antiossidanti immuno-
miglioramento 6 - 8 . Negli ultimi anni, sempre più prove hanno dimostrato che la melatonina ha effetti
inibitori su molti tipi di cancro, come al seno, del colon e cancro gastrico 9 - 11 . È stato anche riferito
che la melatonina ha inibito la proliferazione delle cellule di glioma sia in vitro che in vivo,in relazione
al suo ruolo inibitorio nei principali effettori intracellulari come PKC, Akt e NF-kB 12 . Tuttavia, gli
effetti e il meccanismo in cui la melatonina può inibire le GSC sono lungi dall'essere chiariti. Meno
chiare sono l'entità e la natura della rete di regolamentazione coinvolta e come queste potrebbero
influenzare la funzione della melatonina.
EZH2 è uno dei componenti principali delle proteine del gruppo polycomb (PcG). Funziona come una
lisina metil-transferasi, soprattutto per catalizzare la tri-metilazione dell'istone 3 alla lisina 27
(H3K27me3). In un'ampia gamma di tumori, inclusi i glioblastomi, è ben riconosciuta un'elevata
espressione di EZH2 e la sua espressione è fortemente legata alla neoplasia del tumore, all'invasività e
alla prognosi sfavorevole 13 , 14 . Studi recenti hanno anche suggerito che la sovraregolazione di EZH2
è stata identificata come marker per le GSC, forse riflettendo il suo ruolo nel mantenimento delle
cellule staminali 15 . La segnalazione EZH2 regola la proliferazione e l'auto-rinnovamento delle GSC e
le protegge dalla morte cellulare indotta dalle radiazioni 3 , 16. I modulatori EZH2, d'altra parte, hanno
dimostrato di influenzare lo sviluppo della nicchia GSC e la crescita del tumore 17 , suggerendo EZH2
come potenziale bersaglio terapeutico per sradicare i glioblastomi.
Recettori tacca e leganti sono single-pass proteine transmembrana che svolgono un ruolo importante
nelle decisioni destino delle cellule durante lo sviluppo embrionale e postnatale 18 - 20 . I recettori
NOTCH sono sovraespressi in molti tipi di cancro come il cancro del pancreas, del collo dell'utero,
della mammella, del colon e del polmone 20 . Uno studio precedente ha mostrato che NOTCH1 era
diminuito EZH2 era soppresso nel tumore pancreatico 21 .
In questo studio, abbiamo fornito la prima prova che mostra che la melatonina può inibire la vitalità e
l'auto-rinnovamento delle GSC, che è correlata a una diminuzione dell'espressione della proteina PcG
EZH2. Inoltre, abbiamo identificato NOTCH1 come la molecola segnale chiave che regola gli effetti
mediati da EZH2 della melatonina nelle GSC. Presi insieme, i nostri risultati suggeriscono che la
melatonina, come bloccante dell'asse di segnalazione EZH2-NOTCH1, può essere utilizzata come
potenziale agente terapeutico per prevenire la progressione del glioma.
Materiali e metodi
Linee cellulari, colture GSC e campioni di tessuto

Le linee cellulari di glioblastoma (U251 e T98G) sono state ottenute dalla raccolta di colture di tipo
della banca di cellule dell'Accademia cinese delle scienze (Shanghai, Cina). Le cellule sono state
mantenute nel mezzo di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM; HyClone, Logan, UT, USA) integrato
con siero bovino fetale al 10% (FBS; HyClone, Logan, UT, USA) a 37 ° C con 5% di CO2. Le sfere
tumorali sono state ottenute dalle cellule U251 e T98G coltivate in terreno DMEM / F12 (HyClone,
Logan, UT, USA) integrato con il 2% di B27 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 25 ng / ml di fattore di
crescita dei fibroblasti basici ricombinanti umani (bFGF; R&D systems, Minneapolis, MN, USA),
25ng / ml epidermal growth factor (EGF; R&D systems, Minneapolis, MN, USA) and 1% penicillin /
streptomycin (Gibco, Birmingham, MI, USA). La metà del mezzo di formazione della sfera è stata
sostituita a giorni alterni. 67 campioni GBM e 12 campioni di cervello umano normale sono stati
ottenuti dal Dipartimento di Neurochirurgia del Provincial Hospital affiliato alla Shandong University.
Lo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Università di Shandong e tutti i pazienti hanno
fornito il consenso informato scritto.
PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR)

Il reagente Trizol (Gibco, Birmingham, MI, USA) è stato utilizzato per l'estrazione dell'RNA. Real-
time ABI 7300 Fast Real-time PCR System (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA) e il kit SYBR
Green PCR (Applied TaKaRa, Giappone) sono stati utilizzati per Real-time PCR 22 . Le sequenze dei
primer sono mostrate nella tabella1.
Tabella 1
Primer oligonucleotidici utilizzati per la PCR in tempo reale.
Gene Forward Primer Primer inverso

EZH2 5'-TTGTTGGCGGAAGCGTGTAAAATC-3 ' 5'-TCCCTAGTCCCGCGCAATGAGC -3 '
NOTCH1 5'-AAGCTGCATCCAGAGGCAAAC-3 ' 5'-TGGCATACACACTCCGAGAACAC-3 '
NOTCH2 5'-GTTACAGCAGCCCTTGCCTGA-3 ' 5'-CCATGGATACAAGGGTTACTTGCAC-3 '
NOTCH3 5'-ATCGGCTCGGTAGTAATGCTG-3 ' 5'-ACAACGCTCCCAGGTAGTCA-3 '
NOTCH4 5'-TGCGAGGAAGATACGGAGTG-3 ' 5'-GGACGGAGTAAGGCAAGGAG-3 '
CCND1 5'-GGGCCACTTGCATGTTCGT-3 ' 5'-CAGGTTCCACTTGAGCTTGTTCAC-3 '
CCNE1 5'-CCGGTATATGGCGACACAAGA-3 ' 5'-CAAACTGGTGCAACTTTGGAG-3 '
CCNE2 5'-TGGGAACTTTGTCCTGTAACAATVA-3 ' 5'-CACAAGGCAGCAGCAGTVAGTA-3 '
CTNNB1 5 '-GAGTGCTGAAGGTGCTATCTGTCT-3' 5'-GTTCTGAACAAGACGTTGACTTGGA-3 '
DVL2 5'-GACATGAACTTTGAGAACATGAGC-3 ' 5'-CACTTGGCCACAGTCAGCAC-3 '
HES1 5'-GGACATTCTGGAAATGACAGTGA-3 ' 5'-AGCACACTTGGGTCTGTGCTC-3 '
CD133 5'-AGTGGCATCGTGCAAACCTG-3 ' 5'-CTCCGAATCCATTCGACGATA-3 '
SOX2 5'-GTGAGCGCCCTGCAGTACAA-3 ' 5'-GCGAGTAGGACATGCTGTAGGTG-3 '
GAPDH 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 ' 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3 '
Apri in una finestra separata
Test di vitalità cellulare

Cell counting kit-8 (Dojindo, Japan) è stato utilizzato per monitorare la vitalità proliferativa delle
cellule. In breve, 3000 cellule sono state piastrate su piastre di coltura a 96 pozzetti in un volume finale
di 100μL. Dopo 48 ore, 10μL di soluzione CCK-8 sono stati aggiunti in ciascun pozzetto e incubati a
37 ° C per 2 ore. La densità ottica di ogni campione è stata misurata in uno spettrofotometro a 450 nm.
Gli esperimenti sono stati ripetuti 6 volte.
Immunoistochimica (IHC)
Blocchi rappresentativi fissati in formalina e inclusi in paraffina sono stati selezionati e tagliati in fette
spesse 5μm. La colorazione IHC è stata eseguita utilizzando il metodo standard del complesso avidina-
biotina. Gli anticorpi primari utilizzati nello studio erano i seguenti: anti-EZH2 (Cell Signaling and
Technology, Boston, MA, USA), anti-NOTCH1 (NOTCH intracellular domain 1, NICD1) (Cell
Signaling and Technology, Boston, MA, USA) . I punteggi di colorazione sono stati determinati come
metodo precedente 23 . I punteggi da 0 a 4 sono stati considerati a bassa espressione e da 6 a 16 i
punteggi sono stati considerati ad alta espressione.
Western blotting
Il blotting di Wstern è stato condotto come descritto 22 . Sono stati utilizzati i seguenti anticorpi
primari: anti-CD133 (Abgent, USA), anti-SOX2 (Abgent, USA), anti-EZH2 (Cell Signaling and
Technology, Boston, MA, USA), anti-NOTCH1 (NOTCH dominio intracellulare 1, NICD1)
(Segnalazione cellulare e tecnologia, Boston, MA, USA), anti-HES1 (Abcam, Cambridge, MA, USA) e
anti-β-ACTIN (Zhongshan Golden Bridge Biotechnology, Cina).
Luciferase Reporter Assay

Il dosaggio del reporter della luciferasi è stato condotto come metodo precedente 22 .
Immunoprecipitazione della cromatina (CHIP)

Il GSC U251 è stato reticolato con formaldeide all'1%, spento aggiungendo 125 mM di glicina e lisato
in tampone di lisi (1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 1 mM PMSF). La cromatina è
stata successivamente sonicata per generare frammenti di DNA tra 200-600 bps. I lisati eliminati sono
stati quindi diluiti e incubati con gli anticorpi per una notte a 4 ° C. I seguenti anticorpi sono stati
utilizzati per eseguire la precipitazione: anti-H3K27me3 (Cell Signaling and Technology, Boston, MA,
USA), anti-EZH2 (Cell Signaling and Technology, Boston, MA, USA) e anti-SUZ12 (soppressore di
zeste 12) (Abcam, Cambridge, MA, USA). Come controllo negativo è stata utilizzata una IgG
corrispondente all'isotipo. La reticolazione dei frammenti di DNA è stata invertita dalla pronasi e
successivamente incubata a 42 ° C per 2 ore e 68 ° C per 8 ore. Il NOTCH1il DNA promotore negli
immunoprecipitati è stato rilevato mediante qRT-PCR. Sono stati utilizzati i seguenti primer: F: 5'-
TAGGTCCCTCCCAGCCTTT-3 '; R: 5'-GCTGATTTATTTCTCCACCACGA-3 '.
Plasmidi e interferenza dell'RNA
L'atterramento da parte di un piccolo RNA a forcina (shRNA) è stato eseguito utilizzando il vettore
GV248 (GeneChem, Shanghai, Cina) seguendo le istruzioni del produttore. Sono state utilizzate le
seguenti sequenze: EZH2, 5'-GAAATCTTAAACCAAGAAT-3 '; rimescolare, 5 '-
TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'. La sovraespressione e la ricostituzione di EZH2 sono state ottenute
utilizzando il vettore GV230 (GeneChem, Shanghai, Cina). La lipofectamina 2000 (Invitrogen,
Carlsbad, CA, USA) è stata utilizzata per trasfettare i plasmidi nelle cellule.
Analisi statistica
I dati quantitativi sono stati espressi come media ± deviazione standard (SD). La significatività è stata
testata mediante ANOVA unidirezionale o test t a due code in vari gruppi. Le differenze nelle
proporzioni sono state valutate mediante il test U Mann-Whitney. L'analisi della correlazione del rango
di Spearman è stata utilizzata per analizzare la correlazione tra EZH2 e l'espressione del dominio
intracellulare NOTCH 1 (NICD1). P <0,05 è stato considerato statisticamente significativo.
Risultati
Proliferazione inibita dalla melatonina e capacità di autorinnovamento delle GSC

Le linee cellulari di glioblastoma U251 e T98G sono state coltivate nel mezzo di arricchimento delle
cellule staminali (senza siero, integrato con B27, bFGF ed EGF) per più di 3 settimane fino a quando il
diametro delle sfere tumorali ha raggiunto circa 200μm (Figura 1UN). Successivamente abbiamo
valutato i livelli di espressione di CD133 e SOX2, due marcatori GSC comunemente usati, nelle linee
cellulari di glioma rispetto alle sfere tumorali derivate dalla rispettiva linea cellulare. I risultati hanno
mostrato che le espressioni di mRNA di CD133 e SOX2 erano significativamente più alte nelle cellule
della sfera tumorale (Figura1B). Queste cellule sono state poi chiamate GSC U251 e GSC T98G in base
alle loro origini e utilizzate nei seguenti esperimenti.

Figura 1
Vitalità inibita dalla melatonina e capacità di autorinnovamento delle GSC. ( A ) Le immagini

rappresentative del GSC U251 e GSC T98G (400 ×). ( B ) i livelli di espressione dell'mRNA di CD133 e
SOX2 sono stati determinati mediante qRT-PCR nelle linee cellulari GSC U251 e GSC T98G e nelle linee
cellulari originali. I dati sono stati presentati come media ± DS da tre esperimenti indipendenti. * P <0,05,
** P <0,01 vs. controllo. ( C ) GSC U251 e GSC T98Gsono stati trattati con melatonina 0, 100nM, 100μM,
1mM per 48 ore. La vitalità cellulare è stata determinata mediante dosaggio CCK-8. I dati sono stati
presentati come media ± DS da tre esperimenti indipendenti. * P <0,05, ** P <0,01 vs. risultati del
controllo senza melatonina. ( D ) I cambiamenti morfologici sono stati mostrati nel GSC U251 e nel GSC
T98G trattati con melatonina 0, 100μM, 1mM per 10 giorni (200 ×). Sono stati calcolati i numeri della sfera
tumorale. I dati sono stati presentati come media ± DS da tre esperimenti indipendenti. * P <0,05, ** P
<0,01 vs. risultati del controllo senza melatonina.
Per studiare l'effetto della melatonina sulla vitalità delle GSC, il dosaggio CCK-8 è stato utilizzato per
valutare il numero di cellule del GSC U251 e del GSC T98G trattati con diverse concentrazioni di
melatonina (0,1-1000 μM). Come mostrato in figura1C, la melatonina ha inibito la vitalità delle GSC in
modo dose-dipendente (Figura 1C). In particolare, sia la melatonina da 100 μM che quella da 1 mM
hanno esercitato notevoli effetti inibitori della crescita su GSC U251 e GSC T98G , anche se l'effetto di
100 μM su GSC T98G è piuttosto moderato.
Come accennato in precedenza, le GSC sono caratterizzate dalla loro capacità di auto rinnovamento.
Per testare l'effetto della melatonina sull'auto-rinnovamento della GSC, è stato eseguito un test di
formazione di sfere. Circa 5 × 10 4 GSCs dissociati sono stati piantati in ogni medium ambito di
formazione integrato con 100 um o 1mm di melatonina. Dopo 10 giorni, è stato contato il numero delle
sfere tumorali. Come il risultato illustrato nella figura1D, la melatonina ha ridotto significativamente la
formazione delle sfere tumorali (Figura 1D). Inoltre, sono diminuiti anche i livelli di espressione di
mRNA e proteine dei marcatori GSC, CD133 e SOX2 (Figure2A e 2B), sostenendo un ruolo della
melatonina nella regolazione delle proprietà delle cellule staminali delle GSC.

figura 2
EZH2 è stato coinvolto nel ruolo inibitorio della melatonina nella regolazione delle proprietà
dell'SGC. I livelli di mRNA ( A ) e proteine ( B ) di CD133, SOX2 ed EZH2 sono stati mostrati nel GSC
U251 e nel GSC T98G trattati con melatonina 1 mM per 48 ore. Ciascuna barra rappresenta la media ± DS di
tre esperimenti indipendenti. * P <0,05, ** P <0,01 vs. controllo. ( C ) Il GSC U251 trasfettato con GV230-
EZH2 (EZH2) o GV230 da solo (Con) è stato trattato con melatonina 0,1 mM per 48 ore. La vitalità
cellulare è stata determinata mediante dosaggio CCK-8. I dati sono stati presentati come media ± DS da tre
esperimenti indipendenti. * P <0,05, ** P<0,01. ( D ) I cambiamenti della morfologia e dei numeri della
sfera tumorale sono stati mostrati nelle celle indicate (200 ×). Ciascuna barra rappresenta la media ± DS di
tre esperimenti indipendenti. ** P <0,01. ( E ) i livelli di mRNA di CD133 sono stati determinati mediante
qRT-PCR nelle cellule indicate. Il risultato rappresenta la media ± DS di tre esperimenti indipendenti. * P
<0,05, ** P <0,01.
EZH2 è stato coinvolto nel ruolo inibitorio della melatonina nella regolazione delle
proprietà dell'SGC
È ben documentato che l'EZH2 svolge un ruolo fondamentale nel mantenimento delle GSC 17 .
Pertanto, è stato ipotizzato che il coinvolgimento della melatonina nella regolazione delle proprietà
GSC possa essere collegato a EZH2. Per verificare questa ipotesi, abbiamo prima studiato l'effetto della
melatonina sull'espressione di EZH2 nel GSC U251 e nel GSC T98G . Le GSC sono state trattate con
melatonina 1 mM per 48 ore. L'analisi qRT-PCR ha indicato che l'espressione di mRNA di EZH2 era
significativamente ridotta nelle GSC trattate con melatonina rispetto a quelle senza melatonina (Figura
2UN). Di conseguenza, il livello di proteina EZH2 è stato notevolmente ridotto (Figura2B).
Per determinare se la down-regulation di EZH2 può spiegare, almeno in parte, l'effetto inibitorio
osservato della melatonina sulle GSC, abbiamo abbattuto EZH2 nel GSC U251 introducendo un vettore
GV248 di EZH2 shRNA. I risultati hanno mostrato che l'esaurimento di EZH2 ha inibito la vitalità e
l'auto-rinnovamento del GSC U251 (Figure S1A e S1B). Nel frattempo, anche CD133, l'importante
marker GSC, era sotto-regolato (Figura S1 C), il tutto in coerenza con i cambiamenti delle GSC trattate
con le concentrazioni effettive di melatonina. D'altra parte, quando EZH2 è stato up-regolato nel GSC
U251 , le capacità proliferative e di auto-rinnovamento di queste cellule erano elevate (Figure2C e 2D,
corsia2). Un risultato simile si è manifestato con il livello di mRNA di CD133 (Figura2E, corsia2).
Ancora più importante, la melatonina 1 mM ha abbassato la vitalità o l'auto-rinnovamento delle GSC a
un livello comparabile sia nelle cellule di controllo che in quelle con sovraespressione di EZH2 (Figure
2C e 2D, corsia3,4). Allo stesso modo, l'espressione dell'mRNA di CD133 era significativamente
ridotta (Figura2E, corsia3,4). Collettivamente, questi dati hanno suggerito che l'EZH2 non era solo
necessario per il mantenimento delle GSC, ma anche coinvolto nel ruolo inibitorio della melatonina
nella regolazione delle proprietà delle GSC.
NOTCH1 era un gene bersaglio EZH2 coinvolto negli effetti della melatonina
I cambiamenti del profilo di espressione genica globale sono stati analizzati nel knockdown GSC U251
di EZH2. È interessante notare che NOTCH1 è stato uno dei geni più significativamente sottoregolati
che è correlato con l'esaurimento di EZH2, come evidenziato da una diminuzione di 2,7 volte nelle
trascrizioni (dati non pubblicati). Poiché è ben noto che la segnalazione NOTCH gioca un ruolo critico
nel controllo della sopravvivenza e della multi-potenza di GSC 24 , 25 , abbiamo ipotizzato che
NOTCH1 sia coinvolto negli effetti mediati da EZH2 della melatonina nelle GSC. Per testare questa
idea, è stata eseguita la qRT-PCR nel GSC U251 e nel GSC T98Gper valutare le espressioni di mRNA
della famiglia NOTCH e dei geni del pathway di segnalazione NOTCH. I risultati hanno mostrato che
la melatonina ha ridotto in modo più significativo l'espressione di mRNA di NOTCH1 in entrambe le
GSC rispetto ad altri recettori NOTCH. Anche i componenti della via di segnalazione NOTCH1, come
CCND1 , CCNE2 e HES1 , sono stati deregolamentati (Figura3UN). Coerentemente, l'analisi
immunoblot ha mostrato che le espressioni del dominio intracellulare NOTCH 1 (NICD1) e HES1
erano notevolmente diminuite quando EZH2 era inibito dalla melatonina (Figura3B).

Figura 3
NOTCH1 era un gene bersaglio EZH2 coinvolto negli effetti della melatonina. ( A ) Il GSC U251 e il
GSC T98G sono stati trattati con melatonina 1 mM per 48 ore. I livelli di espressione dell'mRNA della
famiglia NOTCH e dei geni della via di segnalazione NOTCH sono stati determinati mediante qRT-PCR. I
dati sono stati presentati come media ± DS da tre esperimenti indipendenti. * P <0,05 vs. controllo. ( B ) I
livelli di proteine di EZH2, NICD1 e HES1 sono stati analizzati mediante immunoblot nel GSC U251 e
GSC T98G trattati con melatonina 1 mM per 48 ore. β-ACTIN serviva come controllo del carico. ( C ) Il
GSC U251 è stato trasfettato con pGL2- NOTCH1; un vettore codificante EZH2-shRNA (shEZH2) o
scrambled-shRNA (shSC), o un vettore codificante wild-type EZH2 (EZH2) o il suo controllo comparativo
(Con); e pSV-Renilla. I valori nei grafici rappresentano la media dell'attività FLuc: RLuc ± SD eseguita in
triplicato. * P <0,05 vs. controllo. ( D ) I livelli di proteine del dominio intracellulare NOTCH 1 (NICD1)
e HES1 sono stati esaminati mediante immunoblot nelle GSC EZH2 impoverite (shEZH2) o sovraespresse
(EZH2). β-ACTIN è stato utilizzato come controllo del carico. ( E ) Il GSC U251 è stato trattato con
melatonina 0,1 mM per 48 ore. L'analisi ChIP è stata eseguita utilizzando anticorpi contro EZH2, tri-
metilazione dell'istone 3 a lisina 27 (H3K27me3) o soppressore di zeste 12 (SUZ12) con primer mirati alla
regione del promotore di NOTCH1. Come controllo negativo è stato utilizzato IgG corrispondente
all'isotipo. I dati sono presentati come media ± DS da tre esperimenti indipendenti. * P <0,05, ** P <0,01
vs. controllo.
Per esaminare ulteriormente se la segnalazione NOTCH1 è effettivamente regolata da EZH2 nelle

GSC, è stato eseguito il test reporter a doppia luciferasi. Come il risultato mostrato nella figura3C, una
notevole riduzione dell'attività della luciferasi della regione del promotore di NOTCH1 è stata
accoppiata con il knockdown di EZH2 endogeno, mentre l'up-regolazione di EZH2 nel GSC U251 ha
aumentato l' attività trascrizionale di NOTCH1 (Figura3C). Un risultato comparabile è stato osservato
nel GSC T98G (dati non mostrati), confermando un ruolo positivo di EZH2 nella transattivazione
NOTCH1 . Inoltre, immunoblot ha rilevato una significativa inibizione dei livelli di proteine NICD1 e
HES1 nelle GSC impoverite di EZH2. La sovraespressione di EZH2, d'altra parte, ha prodotto un
effetto opposto, suggerendo un controllo funzionale di EZH2 sull'attività di NOTCH1 (Figura3D).
Successivamente abbiamo chiesto il meccanismo specifico di EZH2 nella transattivazione NOTCH1 .

Il test di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) è stato condotto nel GSC U251 utilizzando gli
anticorpi che rilevano EZH2, la tri-metilazione dell'istone 3 alla lisina 27 (H3K27me3) o il soppressore
di zeste 12 (SUZ12), un altro componente chiave del Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2 ). È
interessante notare che un significativo arricchimento per la proteina endogena EZH2 è stato rilevato
nel promotore NOTCH1 , che, tuttavia, può essere bloccato con l'aggiunta di melatonina 1 mM. Al
contrario, nessun rilevamento di H3K27me3 o SUZ12 si è verificato nella regione del promotore di
NOTCH1 (Figura3E). Questi dati hanno indicato che EZH2 può funzionare legandosi direttamente al
promotore NOTCH1 nelle GSC e questo effetto è indipendente da H3K27me3 o PRC2.
Rilevanza clinica esistente tra l'attivazione di EZH2 e NOTCH1
Per sondare l'evidenza della rilevanza clinica tra l'attivazione di EZH2 e NOTCH1, 67 campioni GBM
e 12 tessuti cerebrali umani normali sono stati analizzati per le espressioni di EZH2 e NOTCH dominio
intracellulare 1 (NICD1) mediante immunoistochimica (IHC). I risultati hanno mostrato che una
notevole sovraregolazione di queste due proteine è stata osservata in 37 (EZH2) o 34 (NICD1) di 67
campioni GBM rispetto ai campioni cerebrali normali (P <0,01; Figura4A), tra i quali il 73% dei
campioni EZH2 alti erano anche NICD1 alti (P <0,001; Figura4B). Inoltre, c'era una correlazione
positiva significativa tra le espressioni di EZH2 e NICD1, evidentemente a sostegno di NOTCH1 un
potenziale bersaglio di EZH2 nei GBM umani (Figura4C).
Figura 4
Rilevanza clinica esistente tra l'attivazione di EZH2 e NOTCH1. ( A ) IHC è stato eseguito per rilevare
i livelli del dominio intracellulare 1 (NICD1) di EZH2 e NOTCH nei campioni GBM e nei campioni di
campioni cerebrali normali (400 ×). ( B ) Distribuzione dell'espressione di EZH2 e NICD1 in 67 campioni
GBM. (P <0,001). ( C ) Correlazione tra l'espressione di EZH2 e NICD1 in 67 campioni GBM ( P <0,01).
Discussione
In considerazione della forte capacità di tumore-propagazione di GSC, terapie GSCs-mirate hanno
attirato sempre più attenzione negli ultimi anni 26 - 28 . Qui, mostriamo che la melatonina ha inibito la
vitalità e l'auto-rinnovamento delle GSC, accompagnato da una diminuzione dell'espressione dei
marcatori delle cellule staminali. Inoltre, abbiamo riscontrato una riduzione dei livelli di espressione
dei componenti della via di segnalazione EZH2 e NOTCH1, aggiungendo quindi una nuova prospettiva
per interpretare gli effetti antitumorali della melatonina.
EZH2 è un importante regolatore epigenetico implicato nel mantenimento delle cellule staminali
tumorali. È stato riferito che la sovraespressione di EZH2 è frequentemente osservata nei gliomi
maligni e nelle GSC 15 . L'inibizione di EZH2 ha interrotto la conversione morfologica e alterata
tumorigecità delle GSC nei topi NOD-SCID 17. In questo studio, abbiamo dimostrato che l'espressione
di EZH2 è correlata alla propagazione di GSC, all'auto-rinnovamento e all'espressione di marker GSC,
fornendo un'ulteriore prova diretta della funzione di EZH2 nel modulare la "radice" delle GSC. Più
sorprendentemente, la melatonina ha abbassato la vitalità o l'auto-rinnovamento della GSC a un livello
comparabile sia nelle cellule di controllo che in quelle con sovraespressione EZH2. Un risultato simile
si è manifestato con il livello di espressione di CD133, suggerendo che gli effetti esercitati dalla
melatonina nelle GSC erano, almeno in parte, dipendenti dall'espressione di EZH2.
Per sondare il target a valle di EZH2 negli effetti mediati dalla melatonina, è stata esaminata l'analisi
del database SAGE dei potenziali geni target EZH2. NOTCH1 era uno dei geni più significativamente
down-regolati. Per coincidenza, la melatonina ha ridotto notevolmente NOTCH1 nelle GSC così come
altri componenti della via di segnalazione NOTCH1 (ad esempio CCND1 , CCNE2 e HES1 ), che sono
regolati da NOTCH1 . Anche il segmento della proteina NOTCH1 attiva, dominio intracellulare
NOTCH 1 (NICD1) è stato deregolamentato, suggerendo che NOTCH1 potrebbe mediare gli effetti di
EZH2 sul trattamento della melatonina.
Successivamente abbiamo chiesto il meccanismo specifico di EZH2 nella transattivazione NOTCH1 .

Studi sostanziali hanno indicato che l'EZH2 di solito funziona tramite la repressione trascrizionale
attraverso la sua attività di metilazione degli istoni su H3K27. Ad esempio, interconversione biologica
tra GSCs e non GSCs dissociati è associato al guadagno o perdita di EZH2 / PRC2 mediata tri-
metilazione dell'istone 3 a lisina 27 (H3K27me3) su pluripotenti o geni di sviluppo-associata (es
NANOG , Wnt1 , BMP5 ) 29. Dati gli effetti divergenti elevati di EZH2 a seconda del contesto e delle
specificità del tipo di cellula tumorale, più studi hanno iniziato a rivelare un ruolo indipendente da
H3K27me3 di EZH2 nelle GSC. Suvà et al. ha riferito che C-MYC era un bersaglio a valle di EZH2
legandosi direttamente al promotore C-MYC tramite SUZ12 17 . Kim et al. ha affermato che la
fosforilazione mediata da AKT a S21 in EZH2 ha facilitato la metilazione di STAT3, con conseguente
aumento della fosforilazione della tirosina e attivazione di STAT3 nelle GSC 3 , 30 . Nel nostro studio,
abbiamo scoperto che EZH2 regolava l'espressione di NOTCH1 interagendo direttamente con
NOTCH1promotore. Questo risultato è coerente con gli effetti indipendenti da H3K27me3 di EZH2
negli studi sopra e ha suggerito un meccanismo specifico per la melatonina negli effetti anti-GSC.
Inoltre, è stata osservata una correlazione significativa tra le espressioni di EZH2 e NOTCH dominio
intracellulare 1 (NICD1) nei campioni di tumore di pazienti affetti da GBM, a sostegno evidente
dell'esistenza della via di segnalazione EZH2-NOTCH1 nei gliomi maligni.
In conclusione, questo studio ha dimostrato che la melatonina, un inibitore del tumore, svolge la sua
funzione in parte regolando le proprietà GSC attraverso l'asse di segnalazione EZH2-NOTCH1. Per
quanto riguarda l'applicazione clinica della melatonina nella GBM, la concentrazione applicata in vitro
è molto più alta della concentrazione data ai pazienti. Quindi la concentrazione effettiva potrebbe
essere raggiunta attraverso la somministrazione locale di farmaci, che necessitano di ulteriori studi in
futuro.
Materiale supplementare
Figura S1.
Clicca qui per il file di dati aggiuntivi. (1.1 M, pdf)
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (81471517), dalla
Natural Science Foundation della provincia di Shandong (ZR2013HQ060 e ZR2014HM008), dal
Science and Technology Development Project della provincia di Shandong, Cina (2014GGB14439 e
2014GGB14257).
Abbreviazioni
GSC Cellula simile a staminali di glioblastoma
GBM glioblastomi multiforme
PcG gruppo polycomb
H3K27me3 tri-metilazione dell'istone 3 alla lisina 27
bFGF fattore di crescita dei fibroblasti di base
EGF fattore di crescita epidermico
CCK-8 Kit per il conteggio delle cellule-8
IHC immunoistochimica
PATATA FRITTA immunoprecipitazione della cromatina
shRNA piccolo tornante RNA
NICD1 Dominio intracellulare NOTCH 1
SUZ12 soppressore di zeste 12
PRC2 Polycomb Repressive Complex 2.
Riferimenti
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La Melatonina Inibisce Le Cellule Staminali Del Glioblastoma Attraverso La Soppressione Dell'asse Di Segnalazione EZH2-NOTCH1

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23/4/2021 La melatonina inibisce le cellule staminali del glioblastoma attraverso la soppressione dell'asse di segnalazione EZH2-NOTCH1

Int J Biol Sci. 2017; 13 (2): 245–253. PMCID: PMC5332878

La melatonina inibisce le cellule staminali del glioblastoma

Received 2016 Jul 11; Accepted 2016 Dec 27.

Copyright © Ivyspring International Publisher

La melatonina (N-acetil-5-metossitriptamina) è un'indolamina derivata dall'I-triptofano che viene

Linee cellulari, colture GSC e campioni di tessuto

PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR)

Primer oligonucleotidici utilizzati per la PCR in tempo reale.

Gene Forward Primer Primer inverso

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Test di vitalità cellulare

Luciferase Reporter Assay

Immunoprecipitazione della cromatina (CHIP)

Plasmidi e interferenza dell'RNA

Proliferazione inibita dalla melatonina e capacità di autorinnovamento delle GSC

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Vitalità inibita dalla melatonina e capacità di autorinnovamento delle GSC. ( A ) Le immagini

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Per esaminare ulteriormente se la segnalazione NOTCH1 è effettivamente regolata da EZH2 nelle

Successivamente abbiamo chiesto il meccanismo specifico di EZH2 nella transattivazione NOTCH1 .

Rilevanza clinica esistente tra l'attivazione di EZH2 e NOTCH1

Successivamente abbiamo chiesto il meccanismo specifico di EZH2 nella transattivazione NOTCH1 .

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GSC Cellula simile a staminali di glioblastoma

GBM glioblastomi multiforme

PcG gruppo polycomb

H3K27me3 tri-metilazione dell'istone 3 alla lisina 27

bFGF fattore di crescita dei fibroblasti di base

EGF fattore di crescita epidermico

CCK-8 Kit per il conteggio delle cellule-8

PATATA FRITTA immunoprecipitazione della cromatina

shRNA piccolo tornante RNA

NICD1 Dominio intracellulare NOTCH 1

SUZ12 soppressore di zeste 12

PRC2 Polycomb Repressive Complex 2.

6. Carrillo-Vico A, Lardone PJ, Alvarez-Sanchez N. et al. Melatonina: tampone il sistema immunitario.

10. Motilva V, Garcia-Maurino S, Talero E. et al. Nuovi paradigmi nell'infiammazione intestinale

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