DIAGNOSI DIRETTA

RICERCA E IDENTIFICAZIONE DI ACIDI

NUCLEICI DI AGENTI DA INFEZIONE

1
I saggi molecolari consentono di:

1) rilevare qualitativamente il genoma di un

microrganismo/virus;

2) quantificare il genoma di un microrganismo/virus;

3) tipizzare il genoma di un microrganismo/virus.

2
 Metodologie per la rivelazione e
identificazione di acidi nucleici di agenti da
infezione

 amplificazione genica

3
 La reazione polimerasica a catena (PCR)
DNA: molecola costituita da 4 desossinucleotidi uniti da legami fosfodiesterici:
• deossiadenosinmonofosfato (dAMP),
• desossitimidinmonofosfato (dTMP)
• desossiguanosinmonofosfato (dGMP)
• desossicitidinmonofosfato (dCMP)
a formare una doppia elica dove attraverso legami idrogeno la base A è
accoppiata a T e G=C
Nel 1955 Arthur Kornberg dell’Università di Stanford scoprì un enzima
cellulare, la DNA polimerasi, che catalizza la replicazione e la riparazione
del DNA.
Questo enzima può allungare un corto oligonucleotide iniziatore (primer)
aggiungendo un nucleotide per volta alla sua estremità 3’, ma solo se il
primer è ibridizzato al filamento complementare detto “stampo” o
“template”. La polimerasi estende così l’estremità 3’ del primer fino al
termine 5’ dello stampo. 4
3’
3’ 5’
 La reazione polimerasica a catena (PCR)

Nel 1993 Kary Mullis vince il premio Nobel per la chimica per la scoperta
della PCR negli anni 80.
Tale reazione consente di ottenere mg di copie di segmenti specifici di
DNA o RNA partendo da quantità minime di acidi nucleici (anche una sola
molecola).
Applicazioni:
Genetica medica
Diagnostica
Medicina forense
Analisi alimentari
Filogenesi molecolare…..

5
 PCR - REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI
DNA
1
E’ “IL” mezzo per produrre in vitro grandi quantità di una specifica
PCR
sequenza di DNA, partendo da DNA estremamente complesso.
1 x 109

Il principio a cui si ispira la PCR è la replicazione del DNA:

REPLICAZIONE PCR
Primer
3’ 5’

Nuovo filamento
5’ 3’
DNA stampo

DNA polimerasi

Primer
DNA polimerasi oligonucleotidico
termostabile Nuovo filamento
DNA stampo
3’
5’ 3’ 5’
Primers

Nuovo filamento
3’ 5’
5’ 3’ 6
 LE FASI DELLA PCR

 
 DENATURAZIONE:
Il DNA viene denaturato mediante
Denaturazione
riscaldamento in provetta a ~ 92-95°C Allungamento
(~ 70°C)
(~ 95°C)

 «ANNEALING»:
La miscela viene raffreddata fino a
raggiungere la temperatura che garantisce Annealing
(~ 60°C)
la specifica ibridazione dei primers alle
regioni dello stampo ad essi complementari
Tra 40 e 60°C


 ALLUNGAMENTO:
La temperatura della miscela viene portata a 68-72°C consentendo
alla DNA polimerasi termostabile di sintetizzare il filamento
complementare allo stampo a partire dall’innesco oligonucleotidico
7
I PRIMI 4 CICLI DELLA REAZIONE POLIMERASICA A CATENA (PCR)

4° ciclo
3° ciclo
Frammento desiderato 2° ciclo
1° ciclo

DNA stampo

35° ciclo

8
 La preparazione del campione
• Esempi di campioni biologici impiegati: siero, cellule mononucleate
del sangue periferico, materiale bioptico, urina, feci, liquor,
plasma, ecc.

• Purezza del campione: assenza di componenti che possono inibire

o diminuire l’efficienza della PCR (es. componenti porfirinici del
gruppo eme, urea, SDS, sodio acetato…). La fase di estrazione
degli acidi nucleici dovrà garantire l’eliminazione/riduzione di
inibitori.

• Quantità del campione: trattandosi di un metodo altamente

sensibile, non sono necessarie grandi quantità di campione.

• Conservazione del campione: per evitare degradazioni dovute a

nucleasi, è necessario congelare il campione a -20°C o -80°C ed
evitare ripetuti scongelamenti. 9
 L’acido nucleico bersaglio

• Bersaglio a DNA: per la diagnosi di malattie infettive, il bersaglio

è rappresentato da un gene essenziale conservato o specifico
(presenza di sequenze conservate o variabili).

• Bersaglio a RNA: l’RNA deve prima essere retrotrascritto a

DNA complementare (cDNA) mediante impiego dell’enzima
retrotrascrittasi e un «primer» oligonucleotidico antisenso
(sintesi di DNA da 3’ a 5’).

10
 Preparazione del campione per PCR:
estrazione degli acidi nucleici
da campioni non cellulari (plasma, siero liquor, liquido
amniotico, urine, tamponi in terreno di trasporto…)
La procedura prevede quattro fasi:
- Trattamento con: - agente caotropico (guanidina tiocianato: lisi delle
cellule e denaturazione delle proteine, inibendo DNasi e RNasi),
- detergente non ionico (Triton-100, Tween-20, no SDS)
- agente riducente (2-mercaptoetanolo)
- Precipitazione ad alta temperatura delle proteine e loro separazione per
centrifugazione e successiva eliminazione
- Precipitazione degli acidi nucleici con etanolo e un co-precipitante inerte
(poliacrilamide lineare) e recupero tramite centrifugazione
- Lavaggio del deposito di acidi nucleici e loro scioglimento in acqua sterile
ultrapura
 Preparazione del campione per PCR:
estrazione degli acidi nucleici
Da campioni con cellule (sangue intero, leucociti periferici,
linfomonociti, granulociti, prelievi cervicali, autoptici e bioptici,
escreato, BAL...)

La procedura può prevedere :

- Termolisi alcalina: trattamento ad alta temperatura con una base
(idrossido di sodio) = lisi delle cellule
- Eliminazione degli inibitori ad alta temperatura per chelazione e
adsorbimento su resina
- Neutralizzazione del lisato con tampone TRIS cloridrato

12
 ESTRAZIONE
AUTOMATIZZATA
DI ACIDI
NUCLEICI

13
A. Durante l’incubazione dei campioni lisati gli acidi nucleici vengono catturati
da particelle magnetiche di silice cariche positivamente
B. Il sistema attrae le particelle di silice consentendo la purificazione degli
acidi nucleici attraverso diversi lavaggi
C. La fase di riscaldamento rilascia gli acidi nucleici dalla silice
D. Le particelle magnetiche di silice sono separate dall’eluato tramite un
supporto magnetico

14
 COMPONENTI DI UNA REAZIONE DI PCR

Mg2+
Stampo DNA a doppio filamento

Oligonucleotidi (18-25 basi) complementari a regioni dei

Primers
filamenti opposti che fiancheggiano la sequenza DNA
bersaglio

Deossiribonucleotidi trifosfati Miscela equimolare di dATP,

dTTP, dGTP, dCTP

Tampone contenente Lo ione Mg2+ è essenziale per il

cloruro di magnesio funzionamento dell’enzima DNA polimerasi

Tradizionalmente viene usata la Taq polimerasi, enzima

Enzima termostabile estratto dal batterio termofilo Thermus
aquaticus (concentrazione tra 0.5 e 5 unità per 100 μl
reazione. T ottimale: 72°C) 15
...STRATEGIE PER AUMENTARE LA SPECIFICITA’
NESTED PRIMER PCR
Procedura:
 L’amplificazione è realizzata con
un set di primers

 Il prodotto è riamplificato con un set

di primers interni ai precedenti

Ia PCR
5’ 3’

3’ 5’

3’ 5’
5’ 3’

IIa PCR
3’ 5’
pr. nested
pr. nested
5’ 3’

5’ 3’
3’ 5’

I prodotti non specifici amplificati nella

Ia PCR non saranno amplificati nella IIa
16
 Considerazioni…

E’ necessario disporre di aree separate per estrazione,

allestimento dell’amplificazione, amplificazione e
rivelazione dei prodotti di amplificazione
E’ necessario disporre di camici, guanti e strumenti dedicati
per ciascuna fase (pipette a dispensazione positiva,
microprovette e puntali sterili esenti da DNasi e RNasi,
puntali con filtro per aerosol)
I campioni e i reagenti devono essere manipolati sotto
cappe a flusso laminare

17
 Considerazioni…
Per garantire la correttezza della preparazione del campione e
l’assenza di inibitori è consigliabile utilizzare controlli interni
(es. co-amplificazione del DNA bersaglio con un gene del DNA
cellulare come quello della β-globina)
Nella miscela di amplificazione del DNA estratto da campioni
cellulari oltre ai primer per il bersaglio sono presenti primer per la
sequenza che codifica la β-globina
Per i campioni acellulari, si aggiunge al campione prima
dell’estrazione un plasmide con le regioni del gene per la β-globina
e si utilizza la miscela di reazione sopra descritta
E’ opportuno validare ciascuna sessione di estrazione e
amplificazione con un controllo negativo, utilizzando H2O al
posto del campione, e un controllo positivo, utilizzando un
campione contente il DNA bersaglio. 18
 Rivelazione dei prodotti di PCR

Corsa elettroforetica
- in campo elettrico a intensità e direzione costante dei prodotti di
amplificazione su gel d’agaroso;
- colorazione del DNA con bromuro d’etidio e visualizzazione ai raggi
U.V.;
- la distanza della banda è inversamente proporzionale al log10 del
numero di coppie di basi;
- confronto con bande di migrazione a lunghezza nota (indicatore di
pesi molecolari). Valutazione : lunghezza del prodotto.

19
Rivelazione dei prodotti di PCR
Elettroforesi su gel

20
 I gel più utilizzati: agarosio con percentuali tra 0,7 e 2%.
A basse concentrazioni di agarosio si risolvono meglio i pesi
molecolari alti, mentre ad alte concentrazioni quelli bassi.
Per risolvere frammenti di DNA molto piccoli ( tra 200 e 1 bp) si ricorre
a gel di poliacrilammide

Per poter visualizzare il DNA su un gel, altrimenti invisibile, bisogna colorarlo con
bromuro di etidio, un agente intercalante che emette fluorescenza quando eccitato
21
a lunghezze d’onda ultraviolette.
Rivelazione e identificazione dell’RNA di virus
dell’epatite A mediante RT-nested PCR da feci

1 2 3 4

1380 pb
517 pb
459 pb
192 pb 397 pb
247 pb
75 pb

1: campione di feci 3: controllo positivo virus epatite A

2: controllo negativo 4: indicatore di pesi molecolari
22
Genotipizzazione del virus dell’epatite C
(HCV) mediante ibridazione inversa su
prodotti di amplificazione

23
 Virus dell’epatite C
50-60 nm

Capside

RNA
Genoma Genotipo Sottotipo
1 a, b, c ...
2 a, b, c ...
3 a, b ..
4, 5, 6.. a, ..

5’ NC E1 E2/NS1 Ns2 Ns3 Ns4 Ns5 3’

24
Strutturali Non strutturali
ETEROGENEITA’ GENETICA DI HCV
ALBERO FILOGENETICO
P Simmonds. Gut 1997;40:291

a
g a
GENOTIPI e b 6a
c
Omologia: 66-69% 6b c

b7
f c da
b
e
SOTTOTIPI d
11a
Omologia: a 4 5
70-79%
2 6 6a
3
ISOLATI
1 6b
9c
Omologia: 80-90% b
9b
c 9a
c
c
a b
a d l
QUASISPECIE a
Omologia: >90%
25
10a
HCV: distribuzione geografica
dei genotipi
 Genotipi di HCV

1a, 1b, 1c, 2a, 2b, 2c, 3a, 3b, 4a, 5a, 6a, 7

Genotipi che rispondono meglio alla terapia

(interferone e ribavirina)

27
Antivirali diretti (DAA) per la terapia dell’infezione da HCV

28
Antivirali diretti (DAA) per la terapia dell’infezione da HCV

29
Bagno termostatato a
50°C+ 5°C in presenza
di soluz.denaturante a
base di NaOH

cromogeno Precipitato purpureo

Fosfatasi alcalina
Streptoavidina

30
Autoblot - 3000H, MedTec Inc. per l’esecuzione del saggio
INNO LIPA Genotyping 31
 SAGGIO DI IBRIDAZIONE INVERSA (LiPA: LINE PROBE ASSAY)
PER LA GENOTIPIZZAZIONE DI HCV
Siero/Plasma
Estrazione
RNA virale

Regioni 5’ NRT 244 pb RT-PCR

cDNA
e core

(Rivelazione)

Ibridazione inversa

Analisi
Genotipi 1-6 32
(LiPA Genotypingt)
33
HCV Genotype Assay (Li.P.A.)

34
REAL TIME PCR
 REAL TIME PCR
Consente di quantificare in tempo reale l’amplificazione della
sequenza bersaglio

Il sistema di rivelazione impiega sonde fluorescenti che si

“accendono” nel momento in cui l’enzima Taq polimerasi amplifica
le sequenze di interesse

Il sistema di rivelazione registra la fluorescenza emessa dall’inizio

alla fine dell’amplificazione, fornendo l’andamento della reazione
momento per momento (“real time”)

Le applicazioni possono essere quantitative (quantificazione di virus

e batteri, espressione genica) e qualitative (riconoscimento di ceppi
batterici o virali, mutazioni geniche)
 Le sonde di rivelazione

La maggior parte delle sonde di rivelazione è costituita

da una sequenza specifica di DNA coniugata ad una
molecola fluorescente (“reporter”) e ad una molecola
che “maschera” la fluorescenza (“quencher”)
La PCR Real Time misura l'amplificazione in tempo reale durante la
fase esponenziale, quando l'efficienza di amplificazione è minimamente
influenzata da variabili di reazione, ottenendo risultati molto accurati.

1. halogen tungsten lamp

2a. excitation filters
4. sample plate
2b. emission filters
3. intensifier
5. ccd detector

Curva di amplificazione

Il segnale di fluorescenza può

essere generato da:
1) coloranti fluorescenti che
si intercalano nel DNA a
doppio filamento;
Incremento di
2) sonde fluorescenti
fluorescenza
sequenza-specifiche.

Cicli di PCR
 Nella Real Time PCR, i primi cicli, in
cui non è misurabile la variazione nel
segnale della fluorescenza,
definiscono la linea base (baseline)
della curva.

Linea soglia
Un aumento della fluorescenza oltre
la linea base indica il rilevamento del
prodotto di PCR.

Linea di base
Ct

Un secondo parametro importante è la linea soglia, parallela alla linea di base, che deve
tagliare le curve dei campioni nella fase di crescita esponenziale.

La curva di amplificazione di ogni campione taglia la linea soglia in un punto, chiamato ciclo
soglia (threshold cycle, cT), definibile come il numero del ciclo (o frazione di questo
numero) in cui la curva di amplificazione del campione in fase esponenziale taglia la linea
soglia.

Il ciclo soglia è un indicatore fedele della quantità iniziale di DNA.

Linea soglia
Il diagramma del logaritmo delle quantità iniziali di DNA nei confronti dei valori di ciclo
soglia è una retta.

Se nella reazione sono presenti campioni a quantità nota di DNA (standards), dai quali viene
ricavata una retta di riferimento, si può calcolare la quantità di DNA iniziale presente nei
campioni oggetto di studio.

S1
••

S2
••

•
 Applicazione quantitativa della real time PCR
Sistema Taqman su ABI7700 (AB)

Utilizzando una serie di diluizioni di

uno standard a numero noto di
copie è possibile determinare una
corrispondenza tra concentrazione
di DNA bersaglio e il numero di
cicli in cui l’inizio della reazione di
amplificazione viene rilevata dallo
strumento (Ct).

Tale corrispondenza viene espressa

come una retta di taratura.
Sarà possibile determinare la
concentrazione di DNA bersaglio
misurando il Ct.
Questo principio può essere applicato a
qualsiasi tipo di sistema o sonda.
FORMATO GENERALE DEI KIT PER PCR REAL TIME

REAL TIME SYSTEM KIT

- Buffer
- dNTPs
FLACONE 1 - Taq Gold polimerasi
STANDARDS
Q-Amplimaster
- ROX (fluorocromo passivo) Q-Amplistandard
RTS 000
- UNG (riduz. contaminazione)
-105 copie/5 µl
FLACONE 2 - SONDA MGB specifica
Q-Ampliprobe -104 copie/5 µl
RTS xxx-P -103 copie/5 µl
FLACONE 3 - PRIMERS virus specifici -102 copie/5 µl
Q-AmpliMix
RTS xxx-M

CONSUMABILE
- 2 Micropiastre FORMATO DA
- Tappi ottici o sealing tape

PROTOCOLLO D’USO 96 REAZIONI

43
 Sonde per real time PCR…
SISTEMA TAQMAN: l’attività 5’-esonucleasica della Taq polimerasi
allontana il reporter dal quencher e provoca l’emissione di
fluorescenza, che viene registrata. L’intensità è proporzionale
all’amplificato prodotto, poiché ogni copia di DNA duplicata è
accompagnata dalla liberazione del reporter.

44
 Meccanismo
della reazione Taq-man
Q = QUENCHER
POLIMERIZZAZIONE
R Q R = REPORTER
PRIMER SENSO SONDA
3’ 5’
5’ 3’
PRIMER
ANTISENSO

SPIAZZAMENTO R
Q
3’ 5’
5 3’
’

R
TAGLIO
Q
3’ 5’
5’ 3’

POLIMERIZZAZIONE R Q
COMPLETA
3’ 5’
5’ 3’
Altri tipi di sonde per real time
PCR
BEACONS: sonde a SCORPIONS: presentano
“forcina”, che una struttura a “forcina” e
presentano reporter e fungono anche da primer
quencher adiacenti se per la PCR.
in posizione ripiegata.
Se nell’amplificato è
Quando la sonda
presente la sequenza
ibridizza con la
bersaglio, la parte ripiegata
sequenza di interesse
della sonda ibridizza, si
amplificata, si
distende e si ha emissione
“distende”.
di fluorescenza
Questo cambiamento
di conformazione
allontana il reporter dal
quencher e si ha
emissione di
fluorescenza.
46
I VANTAGGI DELLA REAL TIME PCR
RAPIDITA’, RILEVAZIONE IN TEMPO REALE
RIDUZIONE DEI RISCHI DI CONTAMINAZIONE
SPECIFICITA’ (2 PRIMERS+1 SONDA)
AFFIDABILITA’ E RIPRODUCIBILITA’ DEL SISTEMA
ACCURATEZZA DEI RISULTATI (FLUORESCENZA MULTICOLORE PER
MULTIPLEX PCR, OSSIA PCR CHE CONTEMPORANEAMENTE NELLO
STESSO SAGGIO RICERCANO PIU’ ANALITI)
FORMATO PRONTO ALL’USO CON IL MINOR NUMERO POSSIBILE DI
MANIPOLAZIONI
ANALISI SU LARGA SCALA DEI CAMPIONI

47
 IL SAGGIO

ESTRAZIONE Extracell/Extragen/Extrazol
automatica/strumentale

RETROTRASCRIZIONE Per target ad RNA

+ REAL TIME PCR Real Time system +

Standard quantitativi

Foglio di calcolo Excel

ANALISI e/o
RISULTATI Software integrato
48
 L’ALLESTIMENTO DELLA SEDUTA
ANALITICA*

ESTRATTO
o cDNA
o STANDARD

STD
C4 C12
105

STD
C5 C13
104

STD
C6 C14
103

STD
C7 C15
102

AmpliMIX AmpliPROBE AmpliMASTER B C8 C16

C1 C9 C17
MISCELA RICOSTITUITA
C2 C10 C18

PER 24 REAZIONI
C3 C11 C19

* anche sedute “MULTIPLE”

49
 ANALISI QUANTITATIVA….

- EFFETTUARE OGNI REAZIONE IN

STD
C4 C12
105

STD
C5 C13

SINGOLO
104

STD
C6 C14
103

STD

- INSERIRE 4 PUNTI STANDARD E

C7 C15
102

B C8 C16

CONTROLLO NEGATIVO IN OGNI C1 C9 C17

SEDUTA DI AMPLIFICAZIONE C2 C10 C18

C3 C11 C19

IL FORMATO DA 96 REAZIONI CONSENTE

L’ANALISI FINO A 91 CAMPIONI (IN SINGOLO)

50
 SAGGIO
QUANTITATIVO
PCR DEGLI STANDARD
N° COPIE NOTO

VENGONO EMESSE E MISURATE

LE FLUORESCENZE

PCR DEL CAMPIONE PER INTERPOLAZIONE DEI

DATI SI OTTIENE UN
N° COPIE SCONOSCIUTO
VALORE QUANTITATIVO
ASSOLUTO (N° DI COPIE)

ESTRAZIONE (RETROTRASCRIZIONE) RTS+ST. ANALISI

51
52
53
 IL RISULTATO FINALE

DATO QUANTITATIVO fornito dallo strumento

Es 50 * 102 per reazione

Foglio di calcolo Excel

e/o software integrato

CARICA VIRALE
10.000 virus/ml di plasma

54
Concludendo…

I saggi molecolari sono:

- rapidi;
- in generale, abbastanza costosi;
- consentono l’identificazione del microrganismo/virus;
- non evidenziano l’infettività e la vitalità degli agenti di
infezione;
- consentono di rilevare microrganismi/virus non
coltivabili;
- necessitano di continui aggiornamenti in stretta
correlazione con la variabilità dei microrganismi/virus e la
scoperta di nuovi agenti d’infezione;
- sono molto sensibili e specifici.