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Metodi e sistemi in Biochimica

Lezione n. 1

Tecnica della PCR e Applicazione


La reazione a catena della Polimerasi (PCR), fornisce spesso unalternativa al clonaggio genico e alle librerie geniche, per ottenere quantit utilizzabili di specifiche sequenze di DNA. La PCR richiede luso di una coppia di primer, che si appaiono alle sequenze fiancheggianti ad entrambi i lati della regione che si vuole amplificare. La polimerasi (polm) sintetizzer nuovi filamenti di DNA a partire da ciascun primer. La denaturazione dei prodotti ed il riappaiamento dei primer consentir un secondo ciclo di sintesi. Cicli ripetuti di denaturazione, appaiamento (annealing) ed estensione dei primer consentir una amplificazione esponenziale della sequenza di DNA che stata compresa tra i due primer. Il prodotto raddoppier ad ogni ciclo.La reazione si basa sulluso di 2 oligonucleotidi(primer) lunghi circa 17-30 paia di basi, posizionati alle estremit della sequenza che deve essere amplificata. I primer sono scelti in modo che la sintesi del DNA proceda verso linterno della regione da amplificare, e che si ibridino ai 2 filamenti del DNA stampo una volta che questo stato denaturato. La successiva reazione di estensione porta alla formazione di due molecole a doppio filamento di DNA bersaglio, ognuna delle quali viene nuovamente denaturata e sottoposta ad un secondo ciclo di ibridazione ed estensione. Al terzo ciclo vengono prodotte 2 molecole a doppio filamento, delimitate dai 2 primer, che corrispondono esattamente alla regione da amplificare. Da questo momento in poi i successivi cicli di denaturazione, ibridazione ed estensione portano allaccumulo esponenziale della regione di DNA desiderata. La metodica inziale (descritta da Mullis) della PCR utilizzava il frammento di Klenow della DNA pol di E.coli che per, a causa del passaggio ad alta temperatura, doveva essere riaggiunta ad ogni nuovo ciclo. Lintroduzione della Taq DNA polimerasi ricavata dal batterio termofilo Termusaquaticusha permesso di migliorare la procedura in quanto tale enzima resistente alle alte temperature e quindi non rende necessario la continua aggiunta durante lamplificazione della polimerasi, diminuendo in questo modo le possibilit di contaminazione e velocizzando il processo, in quanto ha permesso lautomazione della reazione di amplificazione. Essendo resistente alle alte temperature, luso della taq permette una temperatura elevata anche durante la fase di estensione (72 C invece di 37 C), questo permette di mantenere unalta specificit di appaiamento (annealing) per i primer. Nelle reazioni di PCR, oltre alla Taq, vengono usate diverse polimerasi, con caratteristiche diverse infatti ci che interessa della polimerasi, oltre alla capacit d di resistere alle alte temperature lattivit esonucleasica 3-5 (la capacit di correggere gli errori) una caratteristica pi o meno presente nelle varie pol che si usano generalmente nella PCR. Tra queste abbiamo la pfu proveniente dalla Pyrococcusfuriosus, una delle pi usate con attivit di correzione di bozze (esonucleasica 3-5) e termostabile, quindi capace di garantire un elevata fedelt, ed un bassissimo tasso di errore durante la replicazione (generalmente le DNA polimerasi duplicano il DNA con un tasso derrore intorno a 10 -9). Un'altra caratteristica importante che si deve tener conto nella scelta della pol la capacit di aggiungere nucleotidi allestremit del frammento polimerizzato, e generalmente si ha un aggiunta di Adenine (questo importante per il clonaggio). Questepol danno degli amplificati con delle A sporgenti che possono essere sfruttate per il clonaggio in Coli in siti predisposti ad avere delle T sporgenti. Altre caratteristiche sono la processivit, ovvero il numero medio di nucleotidi sintetizzati dalla polimerasi nell'unit di tempo, quindi capace di incorporare nucleotidi successivi senza

dissociarsi dallo stampo (una polimerasi maggiormente processiva sar meno precisa perci determiner un maggior tasso di mismatch) e la termostabilit, poich lenzima non possiede mai una stabilit assoluta.

La PCR per innescare la reazione di amplificazione richiede solo una piccola quantit di DNA stampo, inoltre sono necessari 2 primersintetizzati secondo le nostre esigenze, questi sono lunghi circa 17-30 basi, e sono specifici per potersi appaiare alle estremit della sequenza che deve essere amplificata. Lappaiamento (annealing) del primer allo stampo una tipica reazione di ibridazione DNA-DNA (o DNA-RNA nel momento un cui si lavora su mRNA per la formazione del cDNA). Per far avvenire lannealing necessario denaturare lo stampo a doppio filamento, e la temperatura usata per tale scopo nella PCR 94 C, che non danneggia eccessivamente le pol termosensibili come la Taq ( questa fase dovrebbe durare allincirca per 1 minuto in cui viene mantenuta tale temperatura). Durante la fase di denaturazione anche lenzima viene in parte denaturato quindi si potranno fare un numero definito di cicli, infatti dopo 20-25 massimo 30 cicli lattivit dellenzima tende a dimi nuire, questo significa che la pol funziona meno bene e quindi sintetizza meno bene introducendo pi errori. La Temperatura viene poi abbassata fino a raggiungere una temperatura di annealing ottimale, alla quale i due primer si appaiano ai filamenti oppos ti di DNA ( una temperatura di circa 40-50 C). Questa lunica temperatura della reazione di PCR che pu essere ampiamente modificata, e quindi ottimizzata in modo da ottenere la massima efficienza di appaiamento allo stampo corretto ed il minimo legame alle altre sequenze. Se la temperatura di annealing troppo bassa c il rischio che i primer si appaino ad altre sequenze dello stampo, determinando la produzione di prodotti aspecifici o di nessun prodotto. Se la temperatura di annealing troppo alta i primer possono non essere in grado di legarsi al sito corretto. La temperatura richiesta dipende dalla sequenza e dalla lunghezza dei primer, infatti lappaiamento G-C pi forte di quello A-T, quindi pi G e C saranno presenti nel primer, maggiore la forza del suo appaiamento e quindi pi elevata la temperatura che potr essere utilizzata. Generalmente la temperatura di annealing di 40 -60 C fino a raggiungere 72 C per stampi con un alto contenuto di GC. Variando la temperatura di annealing possibile consentire il legame a sequenze solo in parte complementari al primer quindi variare la specificit dellamplificazione. Quindi la temperatura di annealing permette lappaiamento e linizio della fase di estensione, dove la Pol sintetizzer i filamenti di DNA complementari a partire dai primer (ovviamente questi sono in DNA). La sintesi della pol pu essere interrotta alzando la temperatura a 94 C permettendo linizio di un nuovo ciclo di PCR. Completando il primo ciclo di PCR si ottengono 2 molecole di DNA a doppio filamento per ciascuna delle molecole originarie. Queste molecole sono costituite da un filamento originale e laltro di nuova sintesi delimitato all estremit, in modo specifico dal primeroligonucleotidico ed allaltra estremit in mod o aspecifico, dipendente dalla durata della fase di estensione.

Per ottenere la sequenza codificante di un gene, il cDNA di una proteina (cDNA a differenza del gene contiene solo gli esoni stato processato), possiamo intraprendere diverse strategie, possiamo partire dal gene o dalla proteina. Nel caso del cDNA dobbiamo tener conto se si lavora con cell eucariotiche come cell di mammifero, ricche di introni e quindi il cDNA molto diverso dal gene oppure con procarioti come batteri in cui gli introni sono molto rari quindi generalmente il cDNA corrisponde al gene stesso. Ormai si tende a partire dal gene per ottenere informazioni sulla proteina, qualche anno fa era frequente avere informazioni iniziali sulla proteina e da questa si arrivava alla sequenza codificante. Per fare questo necessario avere informazioni sulla sequenza amminoacidica mentre se si parte dal gene si cercano informazioni a livello della sequenza nucleotidica. Partendo dalla proteina si cerca di ottenere informazioni su di essa, possiamo ottenere informazioni sulla sequenza aa attraverso diverse metodologie come la degradazione di Edman, che permette il sequenziamento degli aa, in quanto consente di tagliare un solo residuo, quello N-Term, il quale reagisce con lisotiocianato di fenile formando un complesso (feniltioidantoina) facilmente identificabile con tecniche analitiche, oppure con metodi pi moderni come la spettroscopia di massa, che pu fornire informazioni di sequenza o alle estremit N o C -Term o a livello di sequenza interna. Una volta che si ottengono queste piccole informazioni a livello di sequenza amminoacidica, possiamo costruire delle sonde oligonucleotidiche. Questasonda pu essere utilizzata per pescare il cDNA o il gene di interesse allinterno di una libreria genomica di cDNA. Una volta ottenuto il cDNA possiamo esprimerlo ottenendo la proteina. Una volta ottenuta la proteina possiamo studiarla a livello funzionale e strutturale, produrre anticorpi contro di essa e cos via. Strategie di clonaggio di sequenze codificanti: La prima possibilit che abbiamo : Screening di librerie di cDNA o di DNA genomico: per fare questo necesario avere a disposizione una porzione di sequenza nucleotidica o amminoacidica che mi permetta di costruire la sonda da utilizzare per lo screening. La sonda tanto pi specifica tanto pi sar capace di ibridizzare soltanto con quelle sequenze complementari ad essa, quindi che codificano la nostra proteina. Per fare questo dobbiamo avere costruito (o aver a disposizione una libreria genomica o di cDNA, cosa non sempre molto semplice). Promemoria: a) Libreria genomica: una collezione di cloni che rappresenta lintero genoma di un organismo b) Libreria di cDNA: libreria genica costituita da copie di DNA dellmRNA presente nelle cell al momento dellisolamento. a) Nella libreria genomica, il primo passo consiste nel frammentare il DNA genomico in pezzi di dimensioni tali da poterli clonare in un vettore appropriato. Il fattore principale che influenza la scelta del vettore costituito dalla dimensione dellinserto che questi vettori possono accogliere, poich questo determina la dimensione della libreria che rappresenter lintero genoma. Quindi possiamo avere librerie costituite da coloniebatteriche (nel caso dei plasmidi, cosmidio dei vettori BAC), o da placche fagiche distribuite su uno strato di batteri (nel caso di lambda). Una libreria basata su vettori YAC (cromosomi artificiali di lievito) possono essere inseriti in cell di lievito mediante elettroporazione. Dimensioni dellinserto : plasmide contiene 4 kb, lambda 18 kb, cosmide 40 kb (plasmide che contiene il sito cos di lambda che permette il clonaggio di frammenti di DNA di dimensioni maggiori), BAC 300 kb, YAC 600 kb fino a 2 Mb in alcuni modificati. Oltre la scelta del vettore importante anche la digestione del genoma, infatti si preferisce usare pi frammenti per creare frammenti sovrapposti per poter unire i vari segmenti ed avere una visione pi ampia di insieme. b) Nella libreria di cDNA si prendono solo i geni espressi che rappresentano una piccola percentuale del DNA genomico. Si allestisce la libreria a partire dagli mRNA isolati dalla cell target. Questa libreria rappresenta solo quei geni che sono effettivamente espressi. Per entrambe le librerie importante la rappresentativit ovvero la presenza di tanti cloni per ogni singolo sequenze, che nella libreria di cDNA saranno maggiori le sequenze pi rappresentate, mentre in quelle genomiche avremo anche le sequenze non codificanti, che sono la maggior parte. Generalmente si tende a fare uno screening di una libreria di cDNA soprattutto quando si lavora con una proteina di un organismo superiore. Il cDNA fornisce una serie di vantaggi, che viene sfruttato anche dallaltra strategia di clonaggio di una sequenza codificante che : RACE (amplificazione rapida delle estremit del cDNA): questo approccio basato sulla amplificazione, ad entrambe le estremit della molecola di cDNA, con un primer gene -specifico, complementare ad una regione nota e con un primer universale.Il primer gene-specifico possibile solo se si conosce o si pu dedurre in qualche modo, la sequenza di almeno una piccola parte del gene. Questa metodologia si basa sullutilizzo del cDNA, questo significa che il templato iniziale mRNA. La Taq non funziona su di un templato ad RNA ma richiede DNA, quindi bisogna passare da RNA a DNA e questo reso possibile dallutilizzo della Trascrittasi inversa ( DNA polimerasi RNA-dipendenti dei retrovirus).

Quindi mRNA trascritto in cDNA dalla trascrittasi, in questo modo ottengo un templato in DNA per poter fare la PCR, che richiede due inneschi. Per fare un amplificazione allestremit 3 dellmRNA (RACE 3), posso sfruttare il fatto che gli mRNA eucariotici possiedono una coda di poliA al 3. Questa coda pu essere utilizzata come sito di legame per un primer complementare universale oligo(dT), che lo possiamo utilizzare come innesco per la sintesi del primo filamento di cDNA. Infatti la trascrittasi inversa pu iniziare la sintesi del filamento a partire da questo primeroligo T. Questo primer ad oligo T presenta una sequenza addizionale generalmente un sito di restrizione per facilitare il clonaggio ed anche un sito pi efficace per la successiva amplificazione ( potrei usare la sequenza di restrizione come sito di amplificazione).La parte che si appaia la sequenza ripetuta delle T. Questa processo mi produrr una popolazione di cDNA a singolo filamento tutte sintetizzati a partire dal coda di poli A. Ora posso fare un amplificazione a partire da un oligo che corrisponde alla sequenza aggiuntiva rispetto alle T (si trova a valle), ed un oligo che pu essere scelto da noi, gene-specifico, che viene deciso in base alle conoscenze che abbiamo sulla sequenza della nostro proteina, questo permetter di ottenere la sequenza codificante dalloligo, fino alla fine. Se il nostro oligo (gene-specifico) se appaia al N-Term della proteina avremo lintera sequenza codificante, se loligo si appaia in una regione interna, questo perch abbiamo ottenuto informazioni solo su di una regione interna della sequenza della proteina, avremo solo quel tratto. La trascrizione di una parte della sequenza codificante non ci permette di poter utilizzare in codificato in quanto solo una porzione della sequenza, questo dovuto infatti al fatto che la trascrittasi produrr trascriver fino al oligo gene specifico. Un pezzo di sequenza codificante non la si pu esprimere poich ci manca la porzione 5 del trascritto (corrisponde al N-Term della proteina). La prozione al 5 la si pu ottenere con la tecnica del Race al 5, che ci consente di amplificare lestremit 5 del mRNA. In questo caso facciamo una trascrittasi inversa in modo specifico (nel Race 3 la trascrittasi non lavorer in modo specifico perch lavorer su tutti gli mRNA in quanto uso come primer un oligo T che si appaia su tutte le codi di poliA). In questo caso scegliamo un innesco specifico, un oligo gene specifico disegnato sulla base delle nostre conoscenze della nostra sequenza e che si appai verso il 5. Questo dovrebbe produrre un singolo cDNA della proteina di nostro interesse. Ottenuto il singolo filamento della proteina a cDNA facciamo la PCR, ed utilizzeremo come inneschi: il nostro oligo genespecifico come innesco a valle. Non conoscendo la sequenza a monte (non sappiamo come inizia la sequenza) quindi non possiamo fare un primer specifico per questa regione ma possiamo ovviare questo problema attraverso un trucco aggiungendo noi una sequenza che ci permetta di utilizzarla come innesco. Questo possibile utilizzando un enzima con attivit terminal transferasi, capace di aggiungere nucleotidi allestremit 3 del frammento in trascrizione. Per esempio la desossicitosina pu aggiungere una coda allestremit 5 analoga alla coda di poli A. Generalmente forniamo un solo dNTP allenzima per ottenere una coda di poli A o di poli C. In questo modo

abbiamo prodotto una piccola zona di sequenza che conosciamo, che possiamo utilizzare per disegnare un oligo specifico, in quanto abbiamo creato un estremit a sequenza nota. A questo punto si pu fare una PCR con loligo cos ottenuto ed loligo gene-specifico. Questa metodologia dovuto al fatto che la PCR necessita di 2 primer per funzionare, quindi dobbiamo fornire primer che riconoscono e si appaiano a 2 regioni. Dopo questa procedura potremmo avere una porzione codificante ottenuta con Race 3 ed una porzione codificante ottenuta con Race 5 parzialmente sovrapposte, e li possiamo utilizzare come templato per estendere ottenendo li ntero cDNA codificante. Come si progetta un oligonucleotide a partire da una sequenza aa: se abbiamo delle informazioni di sequenza amminoacidica, ricavate direttamente dalla proteina, da qui possiamo disegnare loligo. Il problema che sorge che il codice genetico degenerato, quindi abbiamo aa codificati da pi di un codone. Esistono 2 aa codificati da un singolo codone ( Trip e Met), mentre la molti sono codificati da 4 e 2 codoni in cui la 3 base del codone quella che cambia mentre 3 aa sono codificati da 6 codoni in cui cambiano lo 3 base e la 1 e sono Leu, Arg e Ser.

Il problema che causa la degenerazione che noi non sappiamo quale la precisa sequenza nucleotidica corrispondente alla sequenza aa. Esempio noi abbiamo questa sequenza trovata al N-Term: Met(1)-Leu(6)-Pro(4)-Gln(2)-Lys(2)-Trp(1)-Asp(2)-Gly(4)-Se(6)r-Met(1)-Asn(2)-Gly(4)-Arg(6) In parentesi ci sono I possibili codoni, noi sappiamo sicuramente il codone AUG ma per la leucina abbiamo sei possibilit di codoni diversi tra loro, quindi non sappiamo quale codone si trova sul cDNA, questo significa che disegneremo oligo degenerati. In questo modo avremo oligo con basi diverse nella stessa posizione e lappaiamento sar perfetto solo per un oligo mentre gli altri si appaieranno in modo meno specifico che causeranno lintroduzione di artefatti. Ci che si cerca di fare di evitare di includere nella sequenza che utilizzo per disegnare loligo, gli aa che sono codificati da 6 codoni che presentano una degenerazione molto alta. Inoltre si esclude lultima base dellultimo codone in modo da minimizzare ulteriormente la degenerazione. In questa sequenza meglio partire dalla Pro per disegnare loligo poich in questo modo eliminiamo la degenerazione della Leu che si trova in seconda posizione.La degenerazione di una sequenza (e quindi anche di un oligo) si calcola: moltiplicando il numero di codoni per ciascun aa. Infatti se partiamodall Pro-Gln-Lys-Trp-Asp-Glyavremo una degenerazione di 128 (calcolato come 4 x 2 x 2 x 1 x 2 x 4). Quindi avremo una miscela di 128 oligo che codificano tutti per questa sequenza ma ciascuno con una base di differenza, e tra questi 128 oligo solo uno appaier perfettamente, gli altri avranno da 1 a pi basi errate. Un metodo che si pu attuare per abbassare il numero dei possibili oligo degenerati escludere lultima base dellultimo codone, quindi nellesempio eliminiamo lultima base della Gly ( usiamo solo GG), in questo modo faremo un oligo da 17 basi riduciamo di un fattore 4 la degenerazione, passando da 128 a 32 possibili oligo. Questo metodo ci permette di ridurre il numero possibili di oligo che comunque tradurranno per la stessa sequenza aa e tutte codificheranno una Gly terminale poich bastano le prime 2 basi del codone. Se per le nostre esigenze sperimentali dobbiamo includere nella sequenza delloligo N-termMet(1)-Leu(6)-Pro(4)Gln(2)-Lys(2)-Trp(1), quindi dobbiamo partire dalla Met saremmo costretti ad includere anche la Leu che presenta una degenerazione di 6 codini, possiamo decidere di non utilizzare tutti e sei i codini (e per esempio mettere solo 2 codoni). In questo modo invece di avere una degenerazione di 96 la possiamo ridurre a 32. Per eliminare limitare il numero dei codoni possiamo utilizzare il codonusage, ovvero la frequenza di uso dei codoni. Infatti non tutti i codoni per un dato aa sono utilizzati con la stessa frequenza da parte di un organismo. Scegliendo il codone (o i due codoni) pi usato(i) per ciascun residuo aminoacidico nella sequenza bersaglio si pu ridurre la degenerazione totale delloligonucleotide, ma nello stesso tempo si riduce la probabilit di un appaiamento perfetto. Nei diversi organismi non tutti i codoni sinonimo sono utilizzati con la stessa frequenza, alcuni sono utilizzati pi di altri. Ci sono delle tabelle di frequenza di uso dei diversi codoni ormai abbastanza efficaci poich essendo noti i genomi di molti organismi si potuto avere una visione completa. In genere esiste anche una relazione tra livelli di espressioni endogeni di una proteina e codoni utilizzati, proteine espresse ad alti livelli di solito presentano codini utilizzati pi frequentemente. Esiste anche una

correl ione con i tR questo perch l traduzione per la sintesi di una proteina richiede oltre al mR ri osomi e quindi a codoni utilizzati pi frequentemente sono associati li elli pi alti di tR per quel codone. tR Quindi la scelta di eliminare dei codoni meno utilizzati pu essere fatta sulla base di queste tabelle. Un altro metodo che si pu utilizzare per ridurre la degenerazione l uso delle base insolite, che ci danno appaiamenti non canonici come l n osina (deossi Inosina) che presenta appaiamenti multipli. Infatti I si pu appaiare con A,C,T quindi nel caso dell Arg che presenta 6 possibili codoni dove la 2 base sicuramente una G mentre 1 base pu essere una A o C, quindi possiamo costruire un oligo IGN. In realt non molto corretto questo metodo perch pu fare appaiamenti diversi e quindi tradurre per altri aa come in questo caso con la C s, e cos per la terza base quindi pu aumentare l errore, traducendo per altri aa. Questo metodo aumenta il rischio di introduzione di errori quindi meglio ridurre la degenerazione utilizzando la tabella di frequenza di uso dei codoni. La lunghezza degli oligo pu essere da 18 basi ma preferibile usare oligo di lunghezza maggiore intorno i 20-22 basi per aumentare la specificit in quanto hanno una capacit di riconoscimento della sequenza migliore, imponendo temperature di appaiamento pi elevate durante la PCR, questo perch pi bassa la temperatura di appaiamento pi bassa la specificit , aumentando il rischio dei mismatch. Esempio pratico di una progettazione di un oligo per il clonaggio del cDNA di una proteina Ftr1 in lievito (Pichia p.): Questa proteina Ftr1 un trasportatore del Ferro.Per la progettazione dell oligo servono delle informazioni sulla proteina, che possono essere anche indirette in quanto non siamo riusciti ad isolare la proteina e quindi non abbiamo definito la sequenza. Infatti possiamo determinare la sequenza indirettamente se si conosce la famiglia della proteina, pi o meno conservate. Ftr1 presente in diversi lieviti e presenta delle caratteristiche ben precise, una proteina di membrana che presenta un canale centrale dove passa il Fe e attraverso un allineamento di sequenza all interno della famiglia possibile identificare le regioni conservate da quelle meno. Da questa analisi si potuto osservare delle regioni conservate ed importanti per il funzionamento della proteina, questo stato confermato attraverso mutagenesi sito-specifica, infatti se questi aa vengono sostituiti, la proteina perde la sua funzione. Da questo posso ipotizzare che se queste sequenze sono essenziali per il funzionamento della proteina saranno conservate anche nella proteina di mio interesse. Dall analisi delle sequenze osservo che l estremit N e C-Term delle proteine di questa famiglia non sono conservate. Questo ci dice che non possiamo disegnare un oligo che si appai al N o al CTerm. Per disegnare l oligo scelgo la sequenza conservata anche se centrale alla sequenza della proteina, come le regioni in rosso o in blu. La sequenza in rosso presenta un alto grado di degenerazione ed analizzando la sequenza se ne pu osservare l importanza, infatti costituita da LeuArg-Glu-Gl -Leu-Glu-Ala-Val-Val, dove i due Glutammati sono essenziali per il funzionamento della proteina. Questa sequenza ricca di aa codificati da 6 codoni questo rende inutile l utilizzo di un ologo cos disegnato. Ci che stato fatto un lavoro di analisi delle frequenze di uso dei codoni in Pichia, per cercare di ridurne la degenerazione attraverso l uso di codoni pi frequenti in questo organismo. Per esempio nel caso dell Arg in Pichia il 50% delle volte codificato dal codone AGA. Questo metodo stato esteso su tutti gli aa della sequenza scelta prendendo i codoni pi frequenti, e questo approccio ha permesso di ridurre la degenerazione (dalla 221184 iniziale a 768 sono stati utilizzati solo i primi 2 aa dell ultimo aa). Questo oligo stato utilizzato per un approccio di RACE al 3, quindi mRNA estratto da Pichia, uso della trascrittasi inversa con oligoT ed infine PCR con il nostro oligo e ladattatore agganciato alloligoT. Questo ha permesso di ottenere una porzione nucleotidica di circa 900 bpche se allineati con le altre sequenze delle permeasi (Ftr1) esiste una certa omologia di sequenza con regioni conservate e quindi abbiamo effettivamente ottenuto la porzione codificante di Ftr1 in Pichiapastoris da una certa regione in gi . Per completare la sequenza possiamo fare unRACE 5 oppure utilizzare questa sonda 900 pb come sonda per uno screening di una libreria di cDNA. Se nella libreria di cDNA presente un clone con lintera sequenza codificante possiamo cos pescare la sequenza, attraverso ibridazione. Ottenuta la sequenza codificante per una proteina di nostro interesse, generalmente si producono mutanti, attraverso metodologie di mutagenesi sito-specifica o mutagenesi causale (detta evoluzione guidata in vitro).
      

La Mutagenesi sito-specificageneralmente fatta quando abbiamo un ipotesi predefinita e vogliamo valutare per esempio il ruolo di specifici residui aa sulla struttura o sulla funzione della proteina. Come nellesempio precedente di Ftr1 cera lipotesi predefinita sullimportanza funzionaledei residui di Glutammato per la proteina ed attraverso mutagenesi osservo se questo vero. In questo caso si producono pochi mutanti in cui si va ad analizzare le propriet. LaMutagenesi casuale (evoluzione guidata in vitro)in quanto si cerca di riprodurre in tempi pi rapidi ci che succede durante levoluzione. Si utilizza generalmente per modificare le propriet di una proteina in modo pi o meno globale, senza necessit di avere informazioni specifici su quali residui aa si devono modificare, infatti si producono un grande numero di varianti e poi si vanno ad analizzare le varie propriet sulle varianti. Ci che fa levoluzione far sopravvivere le varianti migliori e quindi si osservano solo le varianti buone. In questo modo si producono moltissime varianti poi si seleziona le varianti con le propriet che ci interessano. Questo viene fatto in diversi modi generalmente basato sulla PCR, e in genere sono o rimescolamenti di DNA o PCR in cui faccio produrre errori a caso (PCR errorprone, DNA shuffling, STEP, mutagenesi a saturazione). 1)Mutagenesi sito-specifica: (si vuole mutare un aa allinterno della proteina quindi cambiarne il codone) Si inserisce il cDNA della proteina in un vettore, per introdurre la mutazione devo disegnare un primer che porti la mutazione di codifica, faccio PCR tra questo oligo ed uno specifico a monte e a valle del segmento. Primer 1 e primer 4 ciascuno complementare ad una delle estremit della regione da mutagenizzare. Primer 2 e primer 3 sono disegnati in modo da essere sovrapposti e introdurre la mutazione nei due filamenti di nuova sintesi. Si hanno 2 reazioni di PCR distinte: PCR con primer 1 e 2, per amplificare lestremit 5 del frammento: il prodotto risultante porta la mutazione allestremit 3. PCR con primer 3 e 4, per amplificare lestremit 3 del frammento: il prodotto risultante porta la mutazione allestremit 5. I due prodotti di PCR sono mescolati, si effettua una denaturazione seguita da una rinaturazione in modo che i filamenti delle due reazioni di PCR possono ibridare tra loro. Solo dalle molecole ibride date dallappaiamento delle estremit 3, la DNA polimerasi pu produrre la versione mutata del frammento originario che potr essere successivamente amplificato con la coppia di primer 1 e 4. Lefficienza di mutagenesi molto alta. Per inserire la sequenza codificante allinterno della vettore senza aggiungere aa, utilizzare come oligo ad un estremit del cDNA il sito di restrizione (quando presente) per formare un megaprimer come base per la trascrizione dellintero segmento. In questo caso il prodotto della prima reazione utilizzato come megaprimer per la seconda reazione.50:00 Ci sono una serie di accorgimenti tecnici come il fatto che il megaprimer non deve essere troppo grande altrimenti si corre il rischio che si possa appaiare su se stesso, generalmente megaprimer funzionali sono di 200-400 pb. Altro accorgimento che si deve abbondare con la concentrazione di templato nella seconda reazione di PCR per facilitare lappaiamento. Il terzo accorgimento che il megaprimer deve essere purificato in genere su gel di agarosio, per separarlo dai 2 oligo che sono stati utilizzati per produrlo. Questo metodo ha un alta efficienza se si bravi possiamo avere un efficienza del 100%. Ci sono diverse varianti di questa tecnica come nel fare dei pezzi che si sovrappongono ottenendo cos lo stesso tipo di effetto. Varianti di questo genere si basano su pezzi formati da inneschi diversi che possono essere introdotti simultaneamente in sessioni multiple.

Per esempio in figura i pezzetti ai lati portano mutazioni mentre quelli al centro serve per unirli in questo modo faccio una serie di PCR per prrodurre i vari pezzi e poi li uso come templato. Questo permette di ottenere la presenza di siti di restrizione per il clonaggio successivo. La cosa importante da ricordare che devo avere dei frammenti che mi permettono di inserire la sequenza modificata allinterno del vettore. Queste sono strategie che funzionano bene.

Strategia di mutagenesi sito specifica dove viene amplificato lintero plasmide, questo metodo stato messo a punto recentemente ed stato messo a disposizione commercialmente come Kit. ( detta Mutagenesi Quikchange) In questo caso disegno 2 oligo complementari che portano una mutazione di interesse e si fa una PCR con una polimerasi ad alta fedelt che amplifica lintero plasmide. I 2 oligo fungeranno da innesco da entrambe le parti per poter amplificare lintero plasmide. Il frammento da mutare clonato in plasmide, estratto da un ceppo di E.coli dam+ (Dam metila ladenina della sequenza GATC). Il plasmide usato come stampo in una reazione di PCR con due primersovrapposti e complementari, ciascuno dei quali contiene la mutazione desiderata. Si effettua una digestione con DpnI, un enzima di restrizione che taglia solo il DNA metilato di origine batterica che sar degradato (il DNA di nuova sintesi non metilato). Il plasmide estratto dai batteri usato come templato metilato a differenza del fr ammento amplificato. Questo plasmide mutagenizzato utilizzato per effettuare la trasformazione in batterio. I passaggi critici sono: la digestione con DpnI per rimuovere il templato altrimenti si producono batteri con sequenze wild type, e lappaiamento degli oligo sul templato che deve essere preciso. Inoltre importante utilizzare una polimerasi con alta fedelt poich non dobbiamo introdurre altre mutazione ma solo quella scelta da noi.

2) Mutazione casuali o evoluzioni guidate in vitro:Pu essere fatta in diversi modi. Una delle possibilit attraverso il metodo del DNA shuffling, ovvero un rimescolamento di plasmidi di DNA omologhi. In generale quandosi parla di mutazione sito-specifica si parte da un singolo templato di DNA, mentre quando si fa evoluzione in vitro spesso si parte da una miscela di templati, che possono essere derivate da sequenze codificanti omologhe appartenenti a proteina della stessa famiglia ma diverse, oppure da una popolazione di sequenze codificanti derivate da PCR ad alta frequenza di errori che introdurranno mutazioni casuali. Queste sequenze possono essere mescolate, per esempio in questo metodo vengono frammentate, e poi rimescolate utilizzando oligo al 3 e 5 della nostra sequenza codificante, e si otterr una popolazione di sequenze codificanti costituite da frammenti

appartenentiinizialmente a sequenze codificanti di proteine diverse, e attraverso la PCR vengo uniti i vari frammenti c he presentano zone sovrapposte, formando proteine ibride con nuove sequenze codificanti. Un'altra possibilit la ricombinazione STEP (PCR ad estensione sfalsata), il templato una popolazione eterogenea di sequenze codificanti. Si fa una PCR con tempi di estensione molto rapidi, di circa 5 secondi, si ottiene un appaiamento di primer casuali sulle varie sequenze formando amplificati ibridi che derivano in parte dal filamento bianco ed in parte da quello nero (a fianco). La PCR ad alta frequenze di erroreviene fatta scambiando lo ione Magnesio con Manganese. Questo avviene in quanto il Mg ha la funzione di schermare i fosfati facilitando il legame tra i nucleotidi mentre il Manganese non riesce a svolgere questa funzione. Quindi utilizzando il Manganese la Taq scambia i nucleotidi inserendo mutazioni casuali. Un'altra possibilit di usare tamponi con pH non ottimale per la polimerasi che ne induce lintroduzione di errori. Un'altra possibilit luso di miscele nucleotidiche non ottimali con una predominanza di un nucleotide rispetto ad un altro, questo causer errori in quanto un nucleotide terminer prima di altri e quindi verr incorporato un nucleotide diverso. La polimerasi essendo un enzima presenta condizioni ottimali di funzionamento ma anche condizioni non ottimali, in cui funziona meno bene causando errori nella sintesi. Nellevoluzione guidata in vitro si producono un gran numero di varianti questo comporta un buon sistema di screening successivo. Quindi con questo metodo ci vuole un buon sistema di screening per capire quali tra tutte le varianti sono quelle migliorate. Ci sono sistemi di screening diversi a seconda di quello che stiamo modificando, per esempio se la propriet dellenzima permette la sopravvivenza del batterio in cui stato introdotto una variante (questo lavoro di mutagenesi spesso viene fatto in batteri perch sono facilmente maneggevoli e trasformabili e quindi possibile ottenere molte varianti), se la modificazione non comporta la sopravvivenza o meno dei batteri possiamo fare uno screening di moltissime varianti perch sopravvivranno poche soltanto quelle con miglioramento della propriet di interesse. Un esempio la resistenza ad un antibiotico per produrre un enzima che porta una resistenza ad un antibiotico, questo enzima pi efficiente non si fa altro che piastrare i batteri su piastra selettive a diverse concentrazioni di antibiotico, se lenzima efficiente il batterio sopravvive altrimenti no. (1:08?). Se si vuole migliorare la propriet di un enzima che non abbia questo effetto bisogna utilizzare saggi di propriet enzimatica che permettano di esaminare ci che successo. Un esempio: si lavorato su una classe di enzimi, le lipasi una classe di enzimi capaci di idrolizzare i lipidi trasformando i trigliceridi in glicerolo e in acidi grassi. La propriet della lipasi che si voleva modificare era lenantioselettivit aumentandonela capacit. Questo stato fatto attraverso entrambi le strategie, mutazione casuale e sito specifica. La selettivit di un enantiomero rispetto ad un altro una caratteristica presente in tutti gli enzimi, alcuni sono enantioselettivi altri non lo sono. Le lipasi sono enzimi idrolitici, che idrolizzano molte molecole come il 3-acil glicerolo (non sono sicuro) e altre molecole pi o meno rilevanti a livello fisiologico, e dal punto di vista farmacologico precursori di farmaci, infatti sono utilizzati in industria nella risoluzione di una miscela racemica. Ovvero se abbiamo una miscela di 2 enantiomeri, e lenzima enantioselettivo, trasf ormer pi rapidamente un enantiomero rispetto ad un altro. Lenantioselettivit misurata attraverso un parametro, il rapporto enantiomerico, che il rapporto tra la velocit di catalisi per un enantiomero e la velocit di catalisi per laltro enantiomero. Se questo rapporto enantiomerico 1 lenzima non enantioselettivo e le due velocit di catalisi sono identiche. Se questo rapporto superiore ad 1 significa che un enantiomero viene trasformato pi velocemente dellaltro, pi alto questo rapporto pi sar sbilanciata la velocit di catalisi dellenzima nei confronti di uno dei due enantiomeri. Questi ricercatori erano interessati a modificare lenantioselettivit della lipasi per facilitare la catalisi di un enantiomero rispetto ad un altro. Quello che venne fatto fu mutagenesi casuale con PCR ad alta frequenza di errori (detta error-probe PCR), quindi hanno prodotto delle varianti di vettori di espressione per batteri e hanno trasformato E.Coli con una questa libreria di mutanti, hanno espresso la proteina ed hanno fatto un saggio di attivit enzimatica. Per determinare lattivit enzimatica possibile tramite saggi spettrofotometrici, in cui fornendo un substrato se questo viene trasformato diviene un prodotto colorato dosabile. Come substrato forniamo singoli entiomeri quindi in una piastra forniamo un enantiomero R, mentre nellaltra lenantiomero S ed andiamo a vedere in quanto tempo si sviluppa colore in un caso o nellaltro (comparando i due pozzetti).Un altro modo fornire una soluzione racemica e dopo un certo arco di tempo prelevare il supernatante nella provetta che contiene il materiale e analizzarli mediante cromatografia HPLC, andando a misurare la quantit dei 2 enantiomeri. Concettualmente dobbiamo avere a disposizione un saggio di attivit enzimatica che ci permetta di valutare cosa successo. In questi casi le lipasi sono dosate attraverso un saggio fotometrico in cui si utilizza un estere di un acido grasso che presenta un centro chirale, il cui prodotto sia colorato facilmente. (carbonio chirale quel carbonio che presenta 4 sostituenti differenti, presentando

un centro chirale pu esistere in un enantiomero R ed uno S). La scissione dellacido grasso forma un prodotto di colore giallo. Quindi fornendo un enantiomero se catalizza la reazione osserveremo il colore giallo. Se fornendo laltro enantiomero, e confrontandone il prodotto possiamo capire se enantioselettivo oppure no. Il processo di mutagenesi casuale per laumento di enantioselettivit viene ripetuto pi generazioni, questo significa che vengono fatti pi cicli di mutagenesi dal ceppo che presenta un miglioramento. Partendo dal wt cicli di mutazione aumentano lenantioselettivit dellenzima questo possibile prendendo il ceppo migliorato e farne pi cicli di mu tazione casuale. Il ceppo che presenta un miglioramento viene estratto il plasmide e sequenziato e si osserva ci che cambiato. Nel momento in cui si ipotizza che una data regione sia importante per il funzionamento si pu fare mutazione sito -specifica sul sito attivo della lipasi, che permette di mutare un aa e capire se c un miglioramento. Questo esperimento ha aumentato la selettivit enantiomerica con una velocit ci catalisi superiore di 25 volte di un enantiomero rispetto allaltro (rapporto enantiomerico 1/25).Lo studio dei dati strutturali sulla lipasi e della posizione di queste mutazioni non ha dato spiegazione sul perch di questo aumento dellenantioselettivit. Meccanismo catalitico della lipasi: Funzionano come proteasi a Serina (tripsina e chemotripsina), cio presentano una triade catalitica in cui c una Ser, His, Glu o Asp. Durante la catalisi il carbonio carbonilico, in caso delle proteasi a Ser, del legame peptidico, nel caso delle lipasi dellestere, questo carbonio viene attaccato dalla Ser del sito attivo che presenta un nucleofilo forte attivato dalla presenza dellHis e del Glu/Asp, che la polarizza ulteriormente, si forma un intermedio covalente con lenzima, questo intermedio covalente evolve verso un intermedio tetraedrico dove il substrato legato covalentemente alla Ser, e linterermedio tetraedrico carico negativamente, e nel sito attivo dellenzima c quello che si dice cavit dellossanione, dove sono presenti dei residui amminoacidici che stabilizzano questa carica negativa che si forma. Questo stato di transizione dellintermedio tetraetricoistabile anionico stabilizzato dallenzima attraverso linterazione con i residui presenti nella cavit dellossianione. Questa stabilizzazione fa si che si abbia lattacco dellH2O, liberando la parte alcolica del substrato resta legata la parte carbossilica con lintermedio Acyl enzima (stabilizza ulteriormente). Nel caso dellidrolisi lenzima viene deacetilato da una molecola H2O, tornando alla situazione di partenza. Nel sito attivo importante il sito catalitico, la triate catalitica, e i residui della cavit dellossanione che stabilizzano lintermedio di reazione. Lapproccio di mutagenesi sito-specifico sulla lipasi stato fatto sul sito attivo dell enzima di un lievito, e si andato ad analizzare la sua struttura, per vedere cosa cera nel sito attivo oltre i siti importanti per la catalisi, che potessero dar e indicazioni su quali fossero le basi molecolari dellenantioselettivit di questo enzima per dei substrati (una catena fenolica con un centro chirale e acido grasso). Uno studio per omologia con altre lipasi hanno messo in evidenzia un alfa elica che si trova vicino il sito attivo che modula in parte laccessibilit, e alcuni aa idrofobici ( essendo il s ubstrato idrofobico mi aspetto di trovare aa di questa natura). Questi aa si trovavano nellimbocco del canale che porta al sito attivo. Studiando la struttura del sito attivo e dellenzima posso capire quali sono i siti importanti per la proteina e ipotizzare il tipo di enantioselettivit, in quanto un enantiomero interagisce in modo diverso con la proteina per via della sua struttura che comporta che si posizionino in modo diverso. Sono stati modificati alcuni aa e ci che si fatto stato dei saggi di attivit enzimatica per valutare leffetto delle mutazioni. Sono stati modificati vari aa, non quelli della triade catalitica, infatti hanno modificato un aa presenti nella cavit ossanionica, e sono stati modificati alcuni residui idrofobici. Inizialmente si andato a valutare lattivit enzimatica generale dellenzima con un saggio che produce un prodotto colorato, questo si fa perch quando si manipola la sequenza di una proteina, quello che pu succedere che si pu compromettere lattivit enzimatica, infatti modifiche del sito attivo pu causare modifiche conformazionali che possono causare la perdita dellattivit dellenzima. Quindi dopo la modifica la prima cosa che si va a fare vedere se lenzima non ha perso la funzionalit. Quindi potremmo trovare varianti migliori e varianti che hanno perso o in parte lattivit. Se lenzima ancora attivo si valuta lenantioselettivit utilizzando un substrato chirale valutando le velocit di catalisi per i due enantiomeri valutando il rapporto enantiomerico. Questo enzima partiva con un

enantioselettivitper lenantiomero S in un rapporto enantiomerico di 3 (3 volte pi attivo per il substrato S). Hanno mutato lo stesso aa, una Valina, prima con Alanina e poi con la Leu, ed hanno ottenuto in un caso, quello della Ala, un miglioramento della enantioselettivit rendendo lenzima pi selettivo per la forma S, mentre la mutazione con la Leu ha comportato un inversione dellenantioselettivit rendendo lenzima pi selettivo per la forma R. La spiegazione di questo evento stata cercata in come andava a legare il substrato R o S nel sito attivo (tramite modello), e si notato che la Valina si trovi proprio nellimbocco e modula la possibilit che si leghi i due enantiomeri, quindi se la si sostituisce con un aa pi piccolo lenantiomero S riesce a posizionare meglio, mentre con un aa pi grande (Leu) lenantiomero S non riesce a posizionarsi nel modo corretto, favorendo il legame con laltro enantiomero. Con altre mutazioni hanno dimostrato che se si sostituisce la Val con la Ser si ha un aumento della enantioselettivit questo perch il substrato contiene un aloggenuro, esteri dellacido 2-bromofenilacetico, essenzialmente un intermedio nella sintesi di farmaci, e latomo di Bromo facilitato nel legame se aa leggermente polare come la Ser (mentre lAla aa non polare). In questo esempio c stato uno studio della struttura, dei residui importanti in questo modo da un ipotesi iniziale si muta singoli aa e ci che stato visto limportanza della Val 232, che se mutato comporta una modifica della enantioselettivit.