Cos un OGM?

Un OGM un organismo il cui materiale

genetico stato modificato in modo diverso
da quanto avviene in natura con
laccoppiamento e/o la ricombinazione
genetica naturale

In genere uno o pi geni presi da altri

organismi vengono introdotti nel patrimonio
ereditario dellorganismo che si vuole
modificare attraverso particolari vettori, tra i
quali i pi usati sono
plasmidi e virus.

Le principali tappe per la sintesi di

un ogm sono:
Isolamento del gene esogeno e preparazione

del vettore
Trasferimento del gene esogeno alla pianta
ospite
Identificazione e sviluppo della pianta
geneticamente modificata

Isolamento del gene esogeno e

preparazione del vettore tramite
una delle seguenti tecniche:
Estrazione di DNA
Sintesi artificiale di un gene di cui sia nota la

sequenza
Isolamento del gene

Sintesi chimica di oligonucleotidi

(<100 nucleotidi)
La sequenza delloligo si ricava da:
Informazioni preliminari sulla struttura del gene
Sequenza della corrispondente proteina.
E necessario:
conoscere la sequenza di almeno 6 amminoacidi contigui
nella proteina
Tenere presente che il codice genetico degenerato.
Gli oligo degenerati sono sintetizzati programmando il
computer in modo tale che introduca contemporaneamente pi
basi diverse in una certa posizione.

Gli oligonucleotidi vengono sintetizzati usando un sintetizzatore di DNA

programmabile costituito fondamentalmente da un sistema di reagenti per la sintesi di
oligonucleotidi.
La prima base viene fissata ad un supporto solido, solitamente una biglia di vetro o
polistirene che ancora la catena di DNA in formazione nella colonna di reazione.
La sintesi del DNA consiste in una serie di reazioni chimiche:
I fase - Deblocking: la prima base, fissata al supporto solido per mezzo di un linker
molecolare, viene de-protetta per rimozione di un gruppo Trityl protettivo. Questa fase
genera un gruppo 5OH che reagisce con la base successiva.
II fase - Coupling: la base successiva attivata e si accoppia al gruppo 5OH dellultima
base della catena.
III fase - Capping: ogni base che non reagisce viene protetta da un cap per evitare che
non prenda parte alle reazione delle fasi successive del ciclo di sintesi.
IV fase - Oxidation: il legame tra la prima base e la seconda base accoppiata con successo
viene ossidato per stabilizzare la catena in formazione.
V fase - Deblocking: il gruppo 5Trityl viene rimosso dalla base alla quale stato aggiunto.
Ciascun ciclo di reazione da come risultato laggiunta di una singola base di DNA. Una
catena di basi di DNA pu essere costruita grazie alla ripetizione di diversi cicli di sintesi
fino ad ottenere la lunghezza desiderata.

Cos lefficienza di accoppiamento (coupling efficiency)?

Lefficienza di accoppiamento viene usata per misurare lefficienza del sintetizzatore nellaggiungere
Nuove basi alla catena di DNA in formazione.
Ad ogni step di accoppiamento approssimativamente l1% delle basi disponibili non riescono a
reagire con la nuova base in ingresso. Lefficienza di accoppiamento significativamente influenzata
dalla qualit delle materie prime utilizzate, dalle condizioni dello strumento e dal protocollo di
sintesi utilizzato.
Perch importante lefficienza di accoppiamento?
Lefficienza di accoppiamento importante perch gli effetti sono cumulativi durante la sintesi del
DNA.
La tabella mostra gli effetti dellefficienza di accoppiamento sulla percentuale di prodotti full-length
al termine della sintesi di oligonucleotidi di lunghezza differente.

La tabella mostra inoltre

che pi lungo un
oligonucleotide, minore
sar la resa di un prodotto
full-length attesa. Anche se
si ottiene il 99% di
efficienza di
accoppiamento per ogni
aggiunta di una singola
base, il prodotto di sintesi
di un frammento di DNA
lungo 95mer sar costituito
soltanto dal 38,5% di


peroligonucleotidi
rimuovere tutte le catene
incompletedevono
che si sonoessere
accumulate
nel corso
Gli
sintetizzati
purificati
della reazione e
le molecole che possono interferire nelle successive reazioni finita la sintesi del
DNA, la
catena completa viene rilasciata dal supporto solido in seguito a trattamento
con una
soluzione basica come idrossido di ammonio. Dopo il trattamento si
ottiene una nuova
soluzione che contiene loligonucleotide full-lenght richiesto pi tutte le catene
di DNA che
sono abortite durante la sintesi.
Infine, la catena di DNA full length separata dai frammenti aboriti grazie ad
una tecnica
chiamata HPLC (High Performance Liquid Chromatography).

Isolamento del gene

Lisolamento del gene la tecnica pi
complicata, e
consiste nel tagliare il DNA. appannaggio di
enzimi
specifici quali gli enzimi di restrizione e
ligasi.
Esistono numerosi enzimi di restrizione,
ognuno dei
quali taglia il DNA a livello di una specifica
sequenza
di basi, chiamata sito di restrizione.
Gli enzimi di restrizione agiscono solo su DNA
estraneo e non tagliano mai il DNA della
cellula che li
ha prodotti perch il batterio protegge il
proprio
DNA con un meccanismo chiamato
metilazione.
Il DNA di qualsiasi organismo, se incubato in
provetta con un enzima di restrizione, verr
tagliato

con la tecnica della PCR si duplica il DNA in laboratorio, sapendo che Il

gene
esogeno deve essere preceduto da regioni di controllo specifiche,
come il
promotore, per consentire lespressione nellorganismo ospite.
Successivamente
deve essere introdotto in un vettore, ovvero una molecola da DNA in
grado di
replicarsi nella cellula ospite.
A questo scopo, sono spesso utilizzati plasmidi modificati
geneticamente, in cui
sono stati eliminati tutti i geni originali, ma che contengono:
unorigine di replicazione del DNA, che permette ai plasmidi di
replicarsi indipendentemente dal cromosoma della cellula ospite
un gene marcatore, che permette di riconoscere le cellule che
contengono il plasmide da quelle che (generalmente un gene per la
resistenza ad un antibiotico)
una zona polylinker, ovvero un sito di clonaggio in cui possa essere
inserito il frammento di DNA esogeno
Il plasmide ricombinato ottenuto mediante ligazione ad opera
dellenzima DNA
ligasi che forma legami fosfodiesterici per ripristinare la molecola
circolare