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14/11/13

Tecnologia del DNA ricombinante Enzimi di restrizione Marcatura sonda Elettroforesi

Concetti fondamentali
1973. Scienziati di Stanford e della UCSF inserirono un frammento di DNA derivante da un plasmide in un altro plasmide

1 molecola di DNA ricombinanate

Introdotta in cellule di E. coli

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Tecniche del DNA ricombinante


1. Metodologie per localizzare specifiche sequenze di DNA 2. Tecniche volte al taglio del DNA in punti specifici 3. Procedure per amplificare migliaia di volte una particolare sequenza di DNA generando una quantit sufficiente per successive manipolazioni 4. Metodiche per mutare e unire i frammenti di DNA per produrre le sequenze desiderate

5. Procedure per trasferire le sequenze di DNA allinterno delle cellule riceventi

Le nucleasi hanno ampio spettro di attivit ma per la maggior parte si tratta di esonucleasi, che rimuovono i nucleotidi dalle estremit di molecole di DNA e/o RNA, o di endonucleasi che tagliano i legami fosfodiesterici allinterno di una catena polinucleotidica

Le nucleasi

Una endonucleasi di restrizione un enzima che lega una molecola di DNA a livello di una sequenza specifica e taglia il doppio filamento nellimpalcatura zucchero-fosfato

Questa propriet alla base del clonaggio dei geni e di tutti gli altri aspetti della tecnologia del DNA ricombinante

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Le endonucleasi di restrizione si distinguono in tre gruppi: Tipologia Tipo I Tipo II Tipo III Sito di taglio
siti casuali distanti da quello di riconoscimento Allinterno del sito di riconoscimento siti casuali vicini a quello di riconoscimento

enzimi di tipo II
Le sequenze riconosciute variano di solito da 4 a 8 coppie di basi ma la maggior parte riconosce sequenze di 4 o 6 coppie di basi Quasi tutti i i siti di restrizione sono simmetrici nel senso che la sequenza identica su entrambi i filamenti della doppia elica del DNA si usa il termine di palindromo o sequenza di basi a simmetria binaria (presentano la stessa sequenza se vengono lette in direzione 5-3 sia su unelica che sullaltra)

5 GATATC 3 5-GATATC- 3 3 CTATAG 5

5-GATATC- 3

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Lenzima scinde limpalcatura zucchero-fosfato delle molecole di DNA in corrispondenza delle specifiche sequenze

Lenzima pu tagliare la sequenza in maniera asimmetrica lasciando delle code appiccicose (sticky ends o cohesive ends)

Il frammento avr delle code a singola elica che potranno ibridare con le code di altri frammenti generati dalla digestione dello stesso enzima

Lenzima pu tagliare la sequenza esattamente al centro lasciando due tronconi mozzi con le due eliche della stessa lunghezza (blunt end o flush end)

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Per assegnare in modo chiaro ed univoco un codice ad un enzima di restrizione stato deciso che: Le prime 3 lettere, scritte in corsivo sono prese dalla nomenclatura binomiale del batterio di origine

Escherichia coli

Eco

Sierotipi differenti dello stesso organismo sono identificati da una quarta lettera minuscola

Haemophilus influenzae

c,d e f

Hinf

Un numero romano indica lordine di scoperta, qualora dallo stesso batterio vengano isolati enzimi diversi

Haemophilus influenzae

Hinf I, Hinc II, Hind III

MseI, tetracutter

TruI, tetracutter 5 T T A A 3 3 A A T T 5

Due enzimi che hanno:

5 T T A A 3 3 A A T T 5

stesso sito di riconoscimento e stesso sito di taglio


sono detti isoschizzomeri

5-T-3 5-TAA-3 3-AAT-5 3-T-5

5-T-3 5-TAA-3 3-AAT-5 3-T-5

Due enzimi che hanno:

XmaI, esacutter 5 C C C G G G 3 3 G G G C C C 5

SmaI, esacutter 5 C C C G G G 3 3 G G G C C C 5

stesso sito di riconoscimento ma diverso sito di taglio


sono detti neoschizzomeri

5-C-3 5-CCGGG-3 3-GGGCCC-5 3-C-5

5-CCC-3 3-GGG-5

5-GGG-3 3-CCC-5

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L utilit delle endonucleasi di restrizione viene accresciuta dalla possibilit di riunire le molecole precedentemente tagliate e creare combinazioni di DNA inedite (nuove!)

DNA-LIGASI
scoperta nel 1967

permette di legare covalentemente molecole di DNA promuovendo legami fosfodiestere tra gruppi 5-fosfato e 3-OH liberi

Osservare i frammenti di DNA Alla fine della reazione di digestione ci si pongono domande: Gli enzimi hanno tagliato il DNA? Quante volte ci accaduto? Mezzo utile: elettroforesi su gel valido strumento di analisi che permette di separare molecole di diverso peso molecolare, forma, carica originariamente presenti in una miscela

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Poich il gruppo fosfato di ciascun nucleotide porta una carica negativa i frammenti di DNA si muovono verso il polo positivo

Durante la migrazione il gel agisce da setaccio Le molecole di DNA passano attraverso i pori presenti tra le particelle del gel

I segmenti di dimensioni inferiori migrano pi rapidamente di quelli grossi e con il tempo si separano in base alle dimensioni

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Funzionamento elettroforesi

una volta che il gel ha corso per un certo periodo di tempo, molecole di dimensioni differenti saranno separate perch avranno percorso distanze diverse nel gel

Normalmente in un altro pozzetto vengono caricati frammenti di DNA a lunghezza nota (ladder)

Confrontando la distanza di migrazione dei frammenti da analizzare con quella del ladder possibile stimare le dimensioni approssimative dei campioni a lunghezza ignota

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Tuttavia la quantit di DNA poca per poterne permettere la visualizzazione diretta Si ricorre ad alcuni stratagemmi: molecole di DNA possono essere visualizzate trattando il gel con coloranti fluorescenti come letidio bromuro che si legano al DNA intercalandosi tra le basi impilate

Ciascuna banda rivela la presenza di una popolazione di molecole di DNA di dimensioni specifiche

In alternativa possibile visualizzare i frammenti di DNA aggiungendovi un marcatore radioattivo o chimico

autoradiografia

la radioattivit presente nel campione impressiona lemulsione e produce unimmagine della molecola

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Marcare = rendere evidenziabile La sonda pu essere marcata ai terminali 3 o 5 oppure in tutta la sua lunghezza Per marcare al 5 un filamento di DNA (o di RNA) si utilizza la polinucleotide-chinasi catalizza il trasferimento di un fosforo da un ATP ad un terminale 5-OH libero (non fosforilato)

$" #" !"


Si tratta del P in posizione $, il pi lontano dalladenina

Se la molecola di ATP presenta il P in $ radioattivo allora le molecole di DNA dopo la reazione avranno acquisito lestremit 5 radioattiva

La reazione catalizzata dalla chinasi oltre che di ATP abbisogna anche di unestremit 5 defosforilata

Per questo il DNA o RNA viene prima trattato con un altro enzima la fosfatasi alcalina che elimina il gruppo fosfato allestremit 5 di un acido nucleico

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Rimozione P al 5 ad opera della fosfatasi alcalina

Fosfatasi alcalina pi diffusa la


CIP (Calf Intestinal Phosphatase)

cio estratta dallintestino del vitello


Chinasi con P

Questo metodo introduce nella migliore delle ipotesi un atomo di fosforo 32P per filamento

Metodi per marcare un frammento in tutta la sua lunghezza Pi utilizzato nick-translation spostamento progressivo del nick (taglio sulla singola elica) Ricalca il sistema di riparazione del DNA

RISULTATO FINALE: una specifica molecola di DNA a doppia elica resa radioattiva in unalta percentuale dei suoi nucleotidi

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Se si taglia con un enzima un segmento di DNA piccolo (es. plasmide o cosmide) i pochi segmenti prodotti possono essere visualizzati su gel come bande distinte

Se si esegua la stessa operazione con il DNA genomico si ottiene un numero elevato di frammenti che si manifesta come uno smear

Di solito si interessati unicamente a un numero limitato di frammenti verosimilmente quelli che contengono un gene specifico di interesse Ci si avvale allora di una sonda radioattiva che prima prevede:

Trasferimento di DNA o DNA BLOTTING

Al di sopra del gel viene posto il filtro di nitrocellulosa (o nylon) evitando la formazione di bolle daria

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La soluzione salina sale attraverso il gel trascinando con s il DNA che si attaccher alla nitrocellulosa con legami di tipo elettrostatico

Tecnica ideata da Ed Southern (Southern Blotting) In genere si usa dire fare un Southern per indicare unanalisi di DNA su gel e susseguente trasferimento e ibridazione

possibile trasferire da un gel a un supporto solido anche lRNA (Northern blotting) libridazione di una sonda pu rilevare le dimensioni di una piccola molecola di mRNA, la sua abbondanza relativa oppure i tessuti in cui il messaggero viene trascritto

Il Westhern blotting il trasferimento di proteine da un gel a una membrana In questo caso al sonda di solito costituita da un anticorpo, utilizzato per stabilire le dimensioni di una particolare molecola proteica e il suo profilo di espressione

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