LABORATORIO GENETICA UMANA 2019-2020

Prof.ssa Mara Giordano (mara.giordano@med.uniupo.it)

gruppo A
Prof.ssa Lucia Corrado (lucia.corrado@med.uniupo.it),
gruppo B

8 ore propedeutiche alla parte pratica

16 ore parte sperimentale
 Programma fatto da 5 moduli

1. Estrazione degli acidi Nucleici e loro quantificazione

2. Principi alla base delle tecniche di analisi del DNA, cenni

di elettroforesi del DNA

3. PCR e sue applicazioni

4. Analisi di frammenti

5. Sequenziamento Sanger
Estrazione acidi nucleici
 ESTRAZIONE acidi nucleici

Esistono molti metodi

Come scegliere?
• tipo di acido nucleico (ssDNA, dsDNA, RNA totale, mRNA, etc.)

• fonte (tessuti vari, cellule da sangue periferico, saliva, urine, tessuto in paraffina,
coltura cellulare )

• risultato desiderato (quantità, purezza, tempo richiesto)

• applicazione prevista post-estrazione (PCR, cloning, marcatura, restrizione

enzimatica, southern blotting)
I passi principali della purificazione degli acidi nucleici sono:

1. Rompere la membrana cellulare

2. Allontanamento delle membrane

3. Separare gli acidi nucleici dagli altri componenti cellulari(lipidi,

proteine e carbodidrati)

4. Precipitazione alcoolica e purificazione

5. Dosaggio
Rottura della parete e/o membrana cellulare cellule eucariotiche
animali

Le membrane delle cellule animali sono solubilizzate con detergenti

blandi quali SDS (sodio dodecil solfato)

Per un campione di tessuto è necessaria un’iniziale omogenizzazione

che è realizzata mediante:
• Metodi meccanici: omogeneizzatore a pestello (potter)
• Vibrazioni ultrasoniche
• Congelamento/scongelamento
 Estrazione DNA GENOMICO
il DNA è una molecola molto lunga, sottile, fragile e sensibile alle forze meccaniche, è
molto difficile recuperarlo in forma intatta

È costituito da 46 filamenti ( doppia elica ciascuno)= i cromosomi

Le tecniche di estrazione del DNA non consentono di estrarre i cromosomi interi, il DNA
durante l’estrazione viene più o meno frammentato ( a seconda della tecnica utilizzata)

maneggiare con delicatezza-no vortex a velocità elevata-no pipettamento eccessivo e vigoroso

 Estrazione DNA GENOMICO

E’ sufficiente che il DNA si mantenga in frammenti di 50-100 kilobasi (kb)

per poter effettuare qualsiasi analisi successiva

-metodiche classiche utilizzate per l’estrazione del DNA

 l’estrazione Fenolo/Cloroformio
 il “Salting Out”

Inoltre esistono svariati kit commerciali,= tempi molto ridotti, qualità non ottimale
 ESTRAZIONE FENOLO/CLOROFORMIO
PRIMA FASE : LISI CELLULARE attraverso l’utilizzo di :

- soluzioni contenenti detergenti (SDS, Triton X-100) per solubilizzare le membrane cellulari

- Proteinasi K per la digestione delle proteine

SECONDA FASE: SEPARAZIONE ACIDI NUCLEICI DALLE PROTEINE

duplice estrazione Fenolo/Cloroformio, che permette di separare:
- una componente organica inferiore contenente proteine
- da una fase acquosa superiore, contenente gli acidi nucleici
- All’interfaccia, le proteine denaturate e in parte dissolte dal fenolo, formano uno strato bianco.
Centrifugazione
 Centrifugazione

III fase

Sodio acetato

Etanolo assoluto
TERZA FASE: precipitazione del DNA in etanolo assoluto (100%) in
presenza di Sali: tale precipitazione in presenza di concentrazioni
relativamente alte di ioni monovalenti (100-500mM) è
indispensabile per concentrare le soluzioni di DNA ed eliminare i
residui di Fenolo e Cloroformio. IV fase

LA QUARTA FASE: prevede un breve lavaggio in etanolo al 70% che Recupero DNA e
permette di rimuovere gran parte dei cationi monovalenti che lavaggio con
possono interferire con le successive analisi molecolari. etanolo 70%

Si ottiene un DNA molto PURO, ma il fenolo è un composto tossico

 METODO DEL “SALTING OUT”
METODO DEL “SALTING OUT”
Questo metodo che prevede anch’esso la lisi delle cellule mediante: Lisi cellulare con
- tampone di lisi detergenti e
- il trattamento con la Proteinasi K proteinasi K

Le proteine presenti vengono allontanate mediante precipitazione con i Sali

Mediante trattamento con etanolo si ottiene la precipitazione del DNA.

Aggiungo Alta
concentazione
NaCl (6M)

DNA in soluzione
A basse concentrazioni di Sali, la solubilita’ delle proteine aumenta Proteine precipitate
lentamente (salting in)

ad alte concentrazioni di Sali, la solubilita’ delle proteine diminuisce

bruscamente (salting out) causando la precipitazione delle stesse. Recupero DNA e
lavaggio con
etanolo 70%
PRINCIPIO DEL “SALTING OUT”.
La solubilità delle proteine dipende fortemente dalla concentrazione salina (forza ionica) della soluzione