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Prefazione
Lobiettivo di questa tesi stato lo studio del polimorfismo, mediante
tecniche NMR allo stato solido, di una serie di molecole di interesse farmaceutico.
Il polimorfismo la capacit di una molecola di organizzarsi in forme cristalline
diverse e la sua importanza, da un punto di vista applicativo, risiede nel fatto che
in funzione del polimorfo considerato possono variare propriet quali solubilit,
biodisponibilit, igroscopicit, duttilit, conducibilit termica, etc In ambito
farmaceutico tale fenomeno di estrema importanza perch, a seconda della
forma considerata pu variare la biodisponibilit e di conseguenza le propriet
terapeutiche del farmaco. Molte volte, sia in ambito farmaceutico che industriale,
un polimorfo pu essere scartato a causa di propriet non completamente
conformi ai parametri di riferimento, e questo si riflette in termini economici sui
processi produttivi industriali. Di conseguenza lo studio, la sintesi e la
caratterizzazione dei polimorfi ha attirato notevole interesse scientifico nonch
grossi interessi economici.
Da qui nasce lesigenza di avere tecniche in grado di distinguere i vari
polimorfi e soprattutto caratterizzarli. Una delle tecniche di gran lunga pi diffusa
la diffrazione ai raggi X di cristallo singolo, che in grado di definire in modo
esatto la struttura del composto ma necessita di un campione altamente cristallino
che non sempre possibile ottenere. Unalternativa a questultima la diffrazione
a raggi X di polveri che, seppur meno informativa, spesso sufficiente per
distinguere le varie forme. A queste si affiancano metodi calorimetrici quali la
calorimetria a scansione differenziale (DSC) e l analisi termogravimetrica
(TGA), molto interessanti per quanto riguarda la stabilit termica dei polimorfi,
oltre al Raman e lIR nel campo delle spettroscopie ottiche.
Una tecnica che sta assumendo sempre pi importanza negli ultimi anni
lNMR allo stato solido, grazie alla messa a punto di sequenze innovative per
mezzo delle quali si in grado di ottenere risultati estremamente interessanti e
utili al fine di evidenziare differenze anche minime tra i diversi polimorfi. Questa
tecnica pu dare informazioni quantitative sulla cristallinit di un prodotto,
sullesistenza di polimorfi e di conseguenza sulla presenza di siti non equivalenti.
Da questa tecnica si possono, inoltre, ricavare informazioni estremamente
2
dettagliate sui legami idrogeno e di conseguenza distinguere i diversi siti
molecolari in base alle interazioni in cui sono coinvolti, analisi difficili da
evidenziare con altre tecniche. Queste informazioni si possono ricavare dal
chemical shift dei picchi isotropi che strettamente legato allintorno chimico,
dallanalisi dellanisotropia del chemical shift (CSA) grazie a sequenze
bidimensionali 2DPASS, dai tempi di rilassamento oltre che da esperimenti 2D
FSLG-HETCOR in grado di valutare eterocorrelazioni tra atomi di idrogeno e
carbonio pi o meno distanti. Inoltre questa tecnica multinucleare, ovvero si
possono osservare pi nuclei quali
1
H,
13
C,
15
N,
31
P,
29
Si,
19
F; di conseguenza il
numero di molecole potenzialmente analizzabili mediante lNMR allo stato solido
decisamente grande. Ecco quindi che oltre a distinguere i diversi polimorfi si
in grado di stabilire in che modo le varie forme differiscono e quali atomi sono
pi o meno coinvolti in interazioni intermolecolari.
Nel corso di questa tesi sono state prese in considerazione tre molecole di
interesse farmaceutico: il Piracetam, un agente nootropico, la Didanosina, farmaco
usato in terapie antiretrovirali che previene la replicazione del virus dellHIV e
lAcido barbiturico. Inoltre si sono analizzate le possibili conversioni meccano-
chimiche tra i diversi polimorfi. Questo stato fatto per vedere se, sottoponendo
le diverse forme a forze meccaniche (come la macinazione) simulando in qualche
modo ci che pu avvenire durante il ciclo produttivo di una sostanza, si
verificano passaggi da una forma ad unaltra. Infatti la stabilit di una forma di un
determinato farmaco durante il processo di produzione di notevole importanza,
per questo fondamentale monitorare tutto il ciclo produttivo di un prodotto fino
allo stoccaggio e alla sua introduzione in commercio. Si inoltre osservato che la
macinazione in grado, in alcuni casi, di andare oltre alla semplice conversione
tra polimorfi, infatti in condizioni particolari pu attivare equilibri tautomerici.






3
La tesi verr suddivisa in cinque capitoli principali:
Nel primo capitolo si tratter il polimorfismo e limportanza di tale
fenomeno nei vari campi della scienza e dellindustria, soprattutto
farmaceutica. Inoltre si analizzeranno le tecniche per la ricerca e il
monitoraggio dei polimorfi, la stabilit di questultimi e possibilit di
interconversione tra le varie forme. Infine verr approfondito il legame
idrogeno, che svolge un ruolo di primaria importanza in questo fenomeno.
Nel secondo capitolo verr presentata la spettroscopia NMR allo stato
solido, dalle basi teoriche alle tecniche sviluppate per ottenere spettri in
alta risoluzione, oltre alle innovative tecniche bidimensionali prima citate
per lanalisi dellanisotropia del chemical shift (CSA) e per valutare le
etrocorrelazioni.
Nel terzo capitolo verranno riportati i risultati sperimentali e le discussioni
relative allo studio del polimorfismo, al network di legami idrogeno e alle
conversioni meccano-chimiche della molecola di Piracetam.
Nel quarto capitolo verranno presentati i risultati sperimentali e le
discussioni relative allo studio del polimorfismo della molecola di
Didanosina.
Infine nel quinto capitolo verranno illustrati i risultati sperimentali e le
discussioni relative allo studio del polimorfismo, al network di legami
idrogeno e agli equilibri tautomerici della molecola dell Acido
Barbiturico edei suoi derivati.






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1.1 Introduzione
Una sostanza allo stato solido pu presentarsi sotto diverse forme: cristallina,
amorfa e sotto forma di solvati o co-cristalli. Nel caso si trovi allo stato cristallino,
possibile che la medesima molecola si organizzi in modi diversi, dando luogo a
polimorfi, cio fasi costituite dalla stessa struttura molecolare ma con un
differente impaccamento cristallino. Lo stesso pu avvenire nel caso di solvati e
co-cristalli, mentre alla stato amorfo la struttura priva di periodicit (Fig. 1). Nel
1965 McCrone definisce polimorfo una fase cristallina solida di un dato
composto, che risulta dalla possibile esistenza di almeno due diversi
arrangiamenti delle molecole di quel composto allo stato solido[1].

Fig. 1: Differenti modi in cui pu organizzarsi una medesima molecola

Le prime evidenze dellesistenza del polimorfismo risalgono a circa 200 anni fa,
precisamente al 1788, ad opera del chimico tedesco Klaproth che prese in esame il
polimorfismo del carbonato di calcio (calcite, laterite e aragonite) [2], anche se il
riconoscimento vero e proprio dellesistenza di tale fenomeno appartiene al secolo
scorso grazie al lavoro svolto da Mitscherlich [3], anche lui chimico tedesco. Le
cause del differente arrangiamento di una molecola allo stato solido, dipendono da
pi fattori, quali la stabilizzazione di diverse forme di risonanza, la possibilit di
5
multiple interazioni tra molecole dello stesso tipo e la libera rotazione attorno a
legami semplici.
Nonostante il polimorfismo sia conosciuto ormai da molto tempo, ad oggi
non ancora stato completamente compreso. Questo fenomeno molto diffuso;
infatti, un terzo delle sostanze organiche, nelle condizioni normali di pressione e
temperatura, presenta polimorfismo, mentre un altro terzo pu dare origine a
solvati ed idrati. In tabella 1, sono riportati alcuni esempi di composti,
prevalentemente di interesse farmaceutico, con i loro relativi polimorfi, ma questo
fenomeno coinvolge un largo numero di sostanze che hanno uno spiccato
interesse in vari campi della scienza.

FARMACO N. Polimorfi Altre Forme (solvati, etc.)
Ampicillina 1 1
Barbital 6
Codeina 3
Cortisone 2 1
Cortisone AcO 8
Fluocortolone 2 19
Nicotinamide 7
Testosterone 3
Tolbutamide 3

Tab. 1: Composti farmaceutici con i loro rispettivi polimorfi

Al momento esistono diverse convenzioni per identificare i vari polimorfi che si
basano sulluso di lettere greche minuscole (, , , ecc), lettere latine maiuscole
(A, B, C, ecc), numeri romani (I, II, III, ecc), piuttosto che nomi che ne
descrivano le propriet (colore, temperatura di transizione tra una fase e unaltra,
forma, ecc..). Solitamente lordine con cui sono denominati, crescente nel caso dei
numeri o progressivo nel caso delle lettere, relativo ad un ordine decrescente di
stabilit.

1.2 Tipi di polimorfi
E possibile classificare il fenomeno del polimorfismo in diverse sottoclassi,
le quali si distinguono in funzione del motivo che sta alla base della diversa
6
organizzazione strutturale della molecola. Un composto che presenta pi strutture
dovute a differenze conformazionali viene identificato con il nome di
polimorfismo conformazionale [4]. Risulta ovvio, infatti, che ogni cambiamento
di impaccamento causa un cambiamento geometrico nelle molecole e viceversa
[5], ed il grado di cambiamento cristallino dipender dalla rigidit della molecola.
Nel caso dei sistemi ad anello, questi conservano sempre la propria forma nelle
differenti strutture [6], ma possono mostrare sostanziali differenze
conformazionali nei vari polimorfi, anche nel caso di sistemi rigidi come gli
steroidi [7].
Il polimorfismo conformazionale inoltre presente nei casi in cui c una
rapida interconversione tra isomeri [8]. Racemi e sistemi conglomerati in rapida
conversione chirale sono di fatto polimorfi [9]. Questi sistemi presentano un
semplice cambiamento conformazionale che li rende luno limmagine speculare
dellaltro. Bench sia difficile da accettare, le forme destrogira e levogira di simili
sistemi sono polimorfi [10]. La linea di confine che separa il polimorfismo dal
polimorfismo conformazionale e dalla chiralit stato discusso per la prima volta
da Eistert e collaboratori [11]. La tradizionale visione ristretta del polimorfismo, e
di conseguenza lesclusione della chiralit e dellisomeria, ha portato
considerevoli difficolt ai ricercatori che lavorano in questo campo [8]. Un modo
per evitare tale problema di adottare la terminologia proposta da McCrone e
collaboratori [12, 13]. Essi considerano polimorfi tutte le molecole che presentano
in soluzione la medesima struttura, indipendentemente dal polimorfo da cui esse
derivano, ma senza escludere, di per se, isomeri tautomeri e conformeri, come
suggerito da Dunitz [14]. In questo modo sistemi che interscambiano rapidamente
vengono inclusi, mentre sono esclusi quelli che interscambiano lentamente.
Nonostante lapparenza, questa definizione aumenta di poco gli esempi di
polimorfismo, ma evita, daltro canto, che vi siano situazioni artificiose in cui si
accettano fasi come polimorfi basandosi solamente sul comportamento, senza che
la struttura cristallina mostri la presenza di differenti impaccamenti cristallini [15-
17].
Un cenno particolare va ai solvati e co-cristalli, i quali costituiscono una
classe particolare di polimorfi. Un solvato un solido cristallino costituito
7
dallinsieme di due differenti molecole di cui una un solvente.Le strutture dei
solvati possono differire sia per la diversa disposizione delle molecole nel
cristallo, sia per il diverso numero di molecole di solvente incorporate. Per questo
motivo in alcuni casi vengono chiamati pseudo-polimorfi mettendo in evidenza
che esiste una relazione simile a quella presente nei polimorfi. I solvati si possono
dividere in due categorie: stechiometrici e non stechiometrici. Un solvato
stechiometrico pu presentare una struttura cristallina unica, non isomorfa ad
unaltra forma. In questi casi, di solito, la struttura cristallina collassa quando il
solvente viene rimosso (de-solvatazione) portando ad unopacit nel cristallo [18].
E possibile, per, anche ottenere sistemi stechiometrici con solvati isomorfi tra
loro, e spesso anche isomorfi con una forma anidra. Questo porta alla possibilit
che vi sia un passaggio cristallo singolo-cristallo singolo per solvatazione/de-
solvatazione. Inoltre ci sono solvati non stechiometrici in cui spesso il solvente
lacqua; in questo caso i composti sono chiamati idrati. Le molecole di acqua,
dotate di un forte momento dipolare, inizialmente si orientano intorno agli ioni
che costituiscono la superficie del cristallo, con la parte negativa verso gli ioni
positivi o viceversa. In tal modo indeboliscono le forze coulombiane fra gli ioni,
penetrando sempre pi profondamente nel reticolo cristallino, dando inizio alla
formazione di solvati. I processi di solvatazione e de-solvatazione, cos come
linterconversione tra i vari polimorfi, possono avvenire anche durante la
manipolazione dei farmaci o di altri prodotti industriali (soprattutto durante la
lavorazione e la formulazione): di conseguenza lo stoccaggio risulta unarea
chiave per lindustria farmaceutica e non. Per quanto riguarda i co-cristalli essi
sono costituiti dallaggregazione di due o pi composti, indipendenti luno
dallaltro, i quali si presentano allo stato solido a temperatura ambiente (RT). Si
distinguono quindi dai solvati, ma anche dai sali, i quali, bench siano formati da
due diverse specie allo stato solido (gli ioni), non sono indipendenti luno
dallaltro quindi non si possono considerare co-cristalli; tuttavia, nulla vieta
lesistenza di co-cristalli solvati. In fig. 2 sono rappresentati schematicamente due
polimorfi di co-cristalli e un co-cristallo solvato.

8

Fig. 2: Polimorfi di un Co-cristallo

Dal punto di vista termodinamico, in linea di principio, si possono
distinguere due grandi classi di relazioni che legano due o pi polimorfi: relazione
enantiotropica e monotropica. Due polimorfi enantiotropici sono in grado di
interconvertire ad una certa temperatura attraverso una transizione di fase solido-
solido, mentre per quanto riguarda i monotropici linterconversione non
possibile prima della temperatura di fusione [19,20]. Esistono casi in cui un
polimorfo pu essere in relazione monotropica con un secondo polimorfo ma in
relazione enantiotropica con un terzo polimorfo. Un esempio rappresentato
dallacido flufenamico [21]. In figura 3 rappresentato il diagramma di un
sistema enantiotropico a due specie (curva verde e rossa): alla temperatura
indicata con tp pu avvenire la transizione tra le due forme, ovvero ci sono le
condizioni di interconvertibilit. Sopra tale temperatura solitamente si ottiene la
forma rossa, favorita termodinamicamente ad alte temperature, mentre al di sotto,
la forma stabile quella verde, termodinamicamente favorita a bassa temperatura.
9

Fig. 3: Diagramma enantiotropico di un sistema a due specie
In un sistema monotropico, figura 4, a differenza di un sistema enantiotropico,
non c un punto in cui le due curve si incontrano, quindi non si possono
verificare le condizioni di interconvertibilit viste prima. Nonostante la
termodinamica ne teorizzi uno, questo solamente virtuale e si trova al di sopra
della temperatura di fusione. La transizione pu avvenire solamente se si porta il
sistema al di sopra della temperatura di fusione e in ogni caso viene favorita la
forma cineticamente pi stabile.

Fig. 4: Diagramma monotropico di un sistema a due specie.
10
Questultimo fenomeno da considerarsi per alcuni aspetti fastidioso, dal
momento che una forma termodinamicamente pi stabile potrebbe rimanere
nascosta per motivi cinetici per poi manifestarsi in un secondo momento.
Lesistenza di relazioni enantiotropiche tra i polimorfi indicativo del fatto che le
stabilit relative (e perci anche lenergia libera di Gibbs) tra un polimorfo e un
altro, sono molto simili [22, 23] e per tale ragione prevedere il polimorfismo di un
dato composto difficilmente possibile [24,25].

1.3 Come si ottengono i polimorfi
Bench spesso si trovino per caso, ci sono svariati modi, dipendenti da
diversi fattori, con cui si possono ottenere i polimorfi. Questi possono essere
ottenuti tramite raffreddamento di sostanze fuse, per condensazione di vapori o
per cristallizzazione sotto diverse condizioni. Per ottenere diversi polimorfi di una
molecola possibile variare le condizioni di cristallizzazione modificando [26]:
Temperatura e conseguente velocit di raffreddamento della soluzione.
Concentrazione e relativo grado di sovrasaturazione.
Solvente e diverse interazioni soluto-solvente.
Velocit di nucleazione.
Un aspetto molto importante, se si deve pianificare una cristallizzazione, la
scelta del solvente da utilizzare; infatti lottenimento di una forma piuttosto che
unaltra dipende fortemente da tale scelta. In particolare, affinch il solvente sia
un buon candidato per il processo di cristallizzazione, la solubilit del composto
in esame deve essere compresa tra i 5 e 200 mg/mL a temperatura ambiente.
Solubilit maggiori portano ad un liquido molto viscoso che favorisce la
formazione di forme amorfe, mentre solventi alto bollenti possono favorire la
formazione di fasi metastabili. Per rendere la scelta pi agevole, i solventi sono
raggruppati in funzione delle propriet chimico-fisiche, quali la polarit, la diversa
proticit, la tendenza a formare legami idrogeno, la costante dielettrica, la
viscosit e la tensione superficiale. Ci permette di individuare facilmente il
gruppo di solventi che meglio presentano le caratteristiche desiderate ( Figura 5).

11
1 Cicloesano (1.4), Benzene (61.7), Toluene (34.1), n-pentano (54.7),
Mesitilene (8.3), Tetracloroetano(60.7).
2 Etere di etilico (38.9), Trietilammina (64.5), Butilammina (27.8)
3 Cloroformio (5.8), Acetato di etile (34.7), Tetraidroforano (5.1), Fluoro
benzene (28.8), Clorobenzene (13.2).
4 Acido Acetico (56.4), Propanolo (63.9), 1-butanolo (19.8), Etanolo (192.7),
Mofolina (34.0), 1-pentanolo (39.4).
5 Piridina (85.0), Butanone (9.0), Acetone (42.9),Pentanone (31.4),
Ciclopentanone (62.2).
6 N,N-Dimetilformamide (35.1), Dimetilsolfossido(74.7), N,N-
Dimetilacetammide (59.1)
7 Acetonitrile (61.3), nitrometano (125.6)
8 Anilina (1.3), Alcol Benzilico (13.3)
9 Acido Formico
10 Glicole Etilenico
11 Metanolo
12 Dietilammina
13 Diclorometano
14 Glicerolo
15 Acqua

Fig. 5: Scala di polarit di diversi solventi con relative costanti dielettriche.
Un altro aspetto importante rappresentato dalla velocit di nucleazione che pu
essere influenzata da diversi fattori quali la velocit di agitazione, il livello di
sovrasaturazione, il seeding, tracce di impurit e temperatura. Un discorso
analogo pu essere fatto per la velocit di crescita dei cristalli che, anche in questo
caso, pu essere influenzata da temperatura, agitazione, densit e viscosit del
solvente. Nella maggior parte dei casi, la temperatura ottimale per la nucleazione
non coincide con quella ottimale per la crescita dei cristalli, di conseguenza
occorre trovare un giusto compromesso tra le due.
In alcuni casi, possibile far uso di tecniche particolari quali il seeding dove,
dopo la solubilizzazione del composto in esame in un opportuno solvente, si
introducono cristalli di un eteronucleo, assicurandosi che non sia solubile nel
solvente scelto, che presentano il gruppo spaziale desiderato. Questa operazione
in grado di indirizzare la cristallizzazione verso la forma delleteronucleo
introdotto. Unaltra tecnica particolare per ottenere polimorfi lutilizzo della
CO
2
supercritica. Il biossido di carbonio, alla temperatura di 37,7 C e pressione
di 68 atm, si trova nello stato supercritico, in cui non c' distinzione fra fase
vapore e fase liquida ( vedi figura 6).
12

Fig. 6 : Comportamento della CO
2
supercritica allaumentare della pressione
Aumentando la temperatura a pressione costante (68 atm), o viceversa
aumentando la pressione a temperatura costante (37,7 C), si definisce una zona in
cui la CO
2
rimane nello stato supercritico. In particolare, all'interno di questo
stato, varie combinazioni di pressione e temperatura portano a differenti propriet
solubilizzanti del biossido di carbonio. Lanidride carbonica in fase supercritica
assume le caratteristiche di solvente non polare ed paragonabile all n-esano;
con questo metodo perci possibile solubilizzare composti che presentano
determinate caratteristiche di polarit. Il vantaggio di questa tecnica che
lanidride carbonica viene allontanata sotto forma di gas dando la possibilit di
recuperare i composti senza dover evaporare il solvente o cristallizzare il
composto.
Ogni composto che si prende in esame caratterizzato da una propria curva
di solubilit, che ne descrive landamento in un determinato solvente in funzione
della temperatura.

Fig. 7: Andamento della solubilitdi una generica specie in funzione di Temperatura e
Concentrazione.
13
In figura 7 riportata la curva di solubilit di un generico composto in cui si
possono chiaramente distinguere tre zone: una in cui il composto in soluzione,
una zona metastabile e una zona dove la sovrasaturazione tale per cui si ha la
formazione di un precipitato. Nel caso in cui un composto abbia due distinti
polimorfi, questi avranno due curve di solubilit distinte e lottenimento di una
forma piuttosto che laltra dipender dalle condizioni di temperatura e
concentrazione in cui mi posizioner. In figura 8, riportato il diagramma di un
sistema enantiotropico a due specie, dove si pu facilmente osservare che la forma
I (blu) quella stabile a bassa temperatura, mentre la forma II quella stabile ad
alte temperature. Osservando il diagramma, si pu notare che raffreddando il
sistema e portandosi nelle condizioni descritte dal punto A, si ha esclusivamente
la cristallizzazione spontanea della forma I (stabile a basse temperature), mentre
portandosi nel punto D, cristallizzer solamente la forma II (stabile ad alte
temperature).


Fig. 8: Rappresentazione delle curve di solubilit per un sistema enantiotropico a due specie
14
Ci sono poi tutte le situazioni intermedie, ovvero quelle descritte dalla figura 9 al
punto B, dove il polimorfo che si otterr dipender dalla velocit di nucleazione e
di accrescimento delle due forme. In tale situazione il solvente gioca un ruolo
decisivo nel favorire la formazione di una o dellaltra forma. Unulteriore
situazione rappresentata dal punto C della figura 10: in questo caso la
formazione del polimorfo dipende dalla cinetica, ma soprattutto dal seeding
accidentale. Basti pensare che il nostro corpo, a riposo, produce circa un milione
di particelle di polvere al minuto.

Fig. 9: Rappresentazione delle curve di solubilit per un sistema enantiotropico a due specie

Fig. 10: Rappresentazione delle curve di solubilit per un sistema enantiotropico a due specie.
15
Bisogna porre attenzione al fatto che le trasformazioni allo stato solido nei cristalli
molecolari spesso mostrano un alto grado di isteresi. Quindi, pu essere
necessario scaldare la forma stabile a bassa temperatura, a temperature maggiori
di quella di transizione termodinamica, prima che si osservi linizio della
transizione. Anche quando non si osservano transizioni solido-solido a
temperatura pi bassa del punto di fusione questa non una prova sufficiente che
il sistema sia monotropico; la trasformazione pu essere semplicemente troppo
lenta per essere osservata. Allo stesso modo le trasformazioni inverse, ottenute per
raffreddamento della forma ad alta temperatura, sono inevitabilmente
accompagnate da isteresi. A volte listeresi pu essere cos lunga, che la forma ad
alta temperatura si pu mantenere indefinitamente a temperature molto inferiori
del punto di transizione.

1.4 Importanza del polimorfismo
Il principale interesse per il polimorfismo nasce dal fatto che diverse fasi
cristalline o amorfe, pur contenendo la stessa molecola, possono possedere
propriet chimiche, fisiche e meccaniche anche molto diverse, con conseguenze
notevoli sul loro utilizzo, manipolazione ed assorbimento.
Queste propriet, sono:
Propriet fisiche e termodinamiche: densit, indice di rifrazione,
conducibilit termica ed elettrica, igroscopicit, punto di fusione,
potenziale chimico, energia libera, capacit termica, pressione di vapore,
solubilit e stabilit termica.
Propriet spettroscopiche: propriet elettroniche, vibrazionali e rotazionali,
risonanza magnetica nucleare e caratteristiche spettrali.
Propriet cinetiche: velocit di scioglimento, cinetiche delle reazioni allo
stato solido, stabilit.
Propriet meccaniche: durezza, compressibilit, espansione termica.
Propriet chimiche: reattivit chimica e fotochimica.
Propriet di superficie: energia libera di superficie, abito cristallino, area
superficiale, distribuzione della grandezza delle particelle.
16
In figura 11, sono riportate alcune immagini, realizzate al microscopio elettronico,
in cui si pu chiaramente vedere come nel caso del paracetamolo si possono avere
forme dei cristalli differenti, a seconda del tipo di polimorfo.

Fig.11: Immagini registrate al microscopio a scansione elettronica di differenti polimorforfi del
Paracetamolo
La possibilit che una stessa molecola mostri caratteristiche a volte anche
contrastanti, ha numerose implicazioni e conseguenze in molti campi della
chimica sia nellambito della ricerca che in quello industriale. Per quanto riguarda
lambito industriale, il pieno controllo di una forma cristallina di primaria
importanza, dal momento che le propriet ultime di un determinato prodotto
dipendono in maniera preponderante dal modo in cui le molecole sono
organizzate allo stato solido. Le industrie, oltre a conoscere esattamente la natura
dei materiali ottenuti durante il processo produttivo, devono venire a conoscenza
della stabilit dei prodotti nel tempo ed apprendere le diverse propriet chimico-
fisiche causate dalle differenti forme cristalline. Per esempio, nellindustria degli
esplosivi il polimorfismo estremamente importante, visto che al variare della
forma cristallina di un prodotto, varia anche la sensibilit alla detonazione.
Nellindustria alimentare il comportamento di grassi, zuccheri e polisaccaridi
durante la lavorazione, il confezionamento e lo stoccaggio, pu cambiare a
seconda del polimorfo, portando anche ad un prematuro deterioramento del
prodotto. Un esempio, quello della cioccolata. A tutti capitato almeno una
volta di mangiare cioccolata che, invece di sciogliersi in bocca, possedeva una
consistenza dura e granulosa; questo accade quando il componente pi
importante, il burro di cacao, subisce una transizione di fase dalla forma con
temperatura di fusione simile a quella presente allinterno della bocca, ad una
delle numerose forme che hanno temperature di fusione maggiori. Il burro di
17
cacao, a seconda delle condizioni di raffreddamento, pu solidificare in differenti
forme [27], ognuna delle quali ha un determinato punto di fusione. La pi stabile
quella che presenta il punto di fusione maggiore, che in relazione monotropica
rispetto alle altre. La sua cinetica di nucleazione e di crescita dei cristalli molto
lenta, di conseguenza la si ottiene difficilmente in condizioni di raffreddamento
diretto. Il numero di forme conosciute del burro di cacao cresciuto negli anni e
tuttoggi sono riconosciute sei forme, anche se si suppone che ce ne siano sette. In
tabella 2 sono riportati la nomenclatura e la temperatura di fusione di tutte le
forme conosciute.
POLIMORFI PUNTO di FUSIONE (C)
I 17.3
II 23.3
III 25.5
IV 27.3
V 33.8
VI 36.3

Tab. 2 : Temperatura di fusione dei polimorfi del burro di cacao.

La stessa cosa vale nel campo dei coloranti, sia di tipo alimentare che non, visto
che a seconda della fase pu variare la cromaticit. Un tipico esempio di
composto che pu dare origine a tre diversi polimorfi cromaticamente differenti
il 5-metil-2-[(2-nitrofenil)amino]-3tiofencarbonitrile anche detto ROY (dalla sua
variazione cromatica Red, Orange e Yellow). Tale specie rappresenta un tipico
esempio di polimorfismo conformazionale, visto che le diverse forme, riportate in
figura 12, differiscono per il diverso angolo diedro tra lanello fenilico e quello
tiofenico [28]. In figura 12 sono riportate le diverse strutture conformali dei tre
polimorfi, mentre in figura 13 si pu chiaramente vedere le variet cromatiche e le
differenti caratteristiche sia strutturali che chimico-fisiche delle tre forme.
18

Fig 12 : Strutture dei tre polimorfi ( Red, Orange, Yellow) del 5-metil-2-[(2-nitrofenil)amino]-3-
tiofencarbonitrile

Fig 13 : Differenze di forma e di colore dei due polimorfi RO5 (red) e YO4 (yellow) del 5-metil-2-
[(2-nitrofenil)amino]-3-tiofencarbonitrile.

Anche in ambito farmaceutico, tale problema e di estrema rilevanza, sia perch le
propriet di efficienza terapeutica e la tossicit possono variare in funzione del
tipo di polimorfo, sia da un punto di vista brevettuale e di conseguenza
economico.
Nellambito della ricerca, invece, sebbene studiato da tempo, il polimorfismo
nei cristalli molecolari ancora oggi uno dei fenomeni pi affascinanti della
chimica dello stato solido [1,29]. Esso rappresenta una sfida aperta allidea stessa
19
di poter progettare e costruire in modo razionale solidi cristallini con architetture e
propriet definite partendo dalla conoscenza dei componenti molecolari utilizzati
(ingegneria cristallina, crystal engineering) [30]. Infatti, la capacit di
controllare linsorgenza del fenomeno tuttora limitata. In molti casi
lottenimento di questa o quella forma cristallina o di una fase amorfa un
risultato della casualit, piuttosto che un processo sotto completo controllo
umano. Inoltre la possibilit di interconversione tra le varie forme pu avere
conseguenze molto serie sulla vita di un prodotto e sul mantenimento delle
propriet desiderate, come ad esempio lefficacia terapeutica nel caso di un
farmaco o le propriet cromatiche nel caso di un pigmento [31]. Pi in specifico,
va considerato che, in funzione di variabili quali temperatura, pressione e umidit
relativa, una forma metastabile pu trasformarsi in una forma
termodinamicamente pi stabile o una forma cristallina anidra pu trasformarsi in
una forma cristallina idrata per assorbimento di vapore dallambiente. Oppure una
forma cristallina solvata pu, a sua volta, trasformarsi in una forma cristallina
anidra o con diverso grado di solvatazione per perdita di solvente. Nella maggior
parte dei casi la forma cristallina di arrivo ha propriet completamente diverse da
quella di partenza. Identificare tutte le fasi cristalline di una sostanza e la loro
stabilit nel tempo ed agli agenti esterni (stabilit termica, chimica, meccanica)
quindi necessario fin dagli stadi iniziali del suo studio, e ancora di pi prima
dell immissione in commercio, nel caso si tratti di una sostanza di interesse
industriale. Ci sono tre principali motivi che giustificano lo studio del fenomeno
del polimorfismo. Il primo un motivo etico come nel caso dei farmaci, le cui
propriet e gli effetti sui pazienti dipendono dal tipo di polimorfo; una questione
scientifica, che spinge ad una pi approfondita conoscenza della materia, ed infine
una questione commerciale, legata ai brevetti, alla loro estensione ed
allaggressione da parte di terzi.

1.5 Il problema del POLIMORFISMO in ambito farmaceutico
Da un punto di vista pratico il pieno controllo di una forma cristallina di
primaria importanza per progettare ed ottimizzare un determinato processo
produttivo, dal momento che le propriet ultime di un prodotto industriale
20
dipendono dal modo in cui le molecole sono organizzate allo stato solido. Per
questo motivo prioritario conoscere esattamente la natura dei materiali ottenuti
durante il processo produttivo. Si deve conoscere la stabilit del prodotto nel
tempo ed apprendere le diverse propriet chimiche e fisiche causate dalle
differenti forme cristalline. Il fenomeno del polimorfismo di cui si parlato
ampiamente fin qui, gioca un ruolo fondamentale nel campo farmaceutico;
conoscere e controllare la chimica dello stato solido dei principi attivi un
importante aspetto del processo di sviluppo del farmaco. Infatti, circa l80-90%
dei farmaci attualmente in commercio venduta e somministrata allo stato solido
in forma di polvere, pastiglie o compresse [32].
Un esempio emblematico di impatto del polimorfismo su una formulazione
farma-ceutica quello del Ritonavir (Norvir), farmaco per la cura del HIV. A
causa dellimprovvisa comparsa di una forma pi stabile e drammaticamente
meno solubile, costrinse la Abbott (casa produttrice) a ritirare il farmaco dal
mercato per un lungo periodo ed a sostituirne la distribuzione in forma solida con
una formulazione in sospensione, con maggiori problemi legati alla stabilit. Tutto
questo per limpossibilit di ottenere la forma solida con la voluta solubilit,
autorizzata dalla Food and Drug Administration (FDA). A seguito di questo
episodio, la comunit internazionale e la FDA hanno cominciato ad occuparsi, e
soprattutto preoccuparsi, del problema del polimorfismo cristallino. Il fenomeno,
come gi detto, molto comune in campo organico e farmaceutico; infatti il 70%
dei barbiturati, il 60% delle sulfonammidi ed il 23% degli steroidi esistono in
diverse forme polimorfe o solvate (tabella 3). Basti pensare che Greeser e Burger
hanno raccolto informazioni riguardanti 599 forme polimorfiche e solvati (idrati
inclusi) di composti farmaceutici solidi a 25 C [33,34].

FARMACI

Composti
Esaminati

% di Polimorfi
% di polimorfi
instabili o metastabili
Steroidi (p.f<210C) 48 67% 17%
Sulfamidici 40 40% 23%
Barbiturici 38 63% 11%

Tab. 3 : Tre categorie di farmaci con relative percentuali di polimorfismo
21
Lampicillina, figura 14, un tipico caso in cui la biodisponibilit alterata in
funzione del polimorfo considerato. Essa presenta una forma cristallina e uno
pseudopolimorfo triidrato: questultima meno solubile ed ha unazione di
rilascio del principio attivo molto pi lenta rispetto alla prima forma. Come si pu
vedere dal grafico riportato a fianco della struttura dellampicillina, la fase
cristallina presenta dei picchi ematici pi alti, conseguenza di una maggiore
biodisponibilit.

Fig 14 : A) Struttura dellampicillina; B) Grafico Livelli ematici vs Tempo dei due polimorfi
dellampicillina.
Un altro esempio di polimorfismo in ambito farmaceutico quello che coinvolge
il Cloramfenicolo palmitato, un antibiotico di largo spettro, il quale presenta
almeno tre forme cristalline (A, B, C), una amorfa (D) e pi solvati. Le forme A e
B sono quelle termodinamicamente pi stabili e di conseguenza le pi facili da
ottenere. In figura 15, sono riportati i livelli ematici riscontrati dopo la
somministrazione di tale farmaco in cinque diverse combinazioni tra forma A e B
[35].

Figura 15 : Grafico livelli ematici vs. tempo dei polimorfi del Cloramfenicolo palmitato.
22
Come si pu notare il polimorfo B quello maggiormente attivo, viceversa la
forma A non in grado di raggiunge un livello terapeutico efficace. In particolare,
la differente efficacia dovuta essenzialmente alla maggior solubilit di B, mentre
A cos poco solubile che gli enzimi presenti nell'organismo non sono in grado di
idrolizzarlo liberando la base da assorbire. D'altra parte, B metastabile e si
trasforma lentamente in A limitando l'efficacia del prodotto. Per quanto riguarda la
forma amorfa, essa meglio assorbita nei bambini.
Attualmente, la FDA richiede alle industrie farmaceutiche sia lo studio del
polimorfismo dei farmaci sottoposti a test clinici e successivamente immessi sul
mercato, sia un monitoraggio continuo del processo di produzione [36]. Inoltre
lEuropean Patent Office (EPO) impone a chi deposita un brevetto su un farmaco
che si presenta sottoforma di polvere cristallina, una caratterizzazione per
diffrazione di raggi X [37]. Il caso del Ritonavir sopra riportato e altri casi meno
eclatanti, ma comunque importanti, hanno fatto riflettere su dove posizionare
lanalisi del polimorfismo allinterno del processo di sviluppo di un farmaco. Tale
procedura comprende diverse fasi che vanno dalla sintesi e purificazione del
principio attivo alla sua introduzione sul mercato, passando inevitabilmente
attraverso i costosissimi test pre-clinici e clinici, (figura 17), suddivisi in quattro
fasi, che sono:
Fase 0 (pre-clinica): l'introduzione di un farmaco in terapia deve soddisfare un
principio inderogabile: "primum non nocere". L'obiettivo, perci, verificare in
laboratorio il maggior numero possibile di caratteristiche positive e negative. Le
nuove molecole, che possono nascere per sintesi chimica o per estrazione,
vengono sottoposte a screening farmacologico: una serie di test in vitro che
indicano se una sostanza pu avere una qualche attivit terapeutica. Pi o meno a
questo punto entrano in causa gli esperimenti su animali da laboratorio, che
servono a comprendere le propriet farmacocinetiche e farmacodinamiche. In
pratica un principio attivo deve possedere una via di somministrazione accettabile,
essere assorbito una volta somministrato, poi raggiungere i suoi bersagli, esplicare
la sua azione ed essere eliminato; il tutto, ovviamente, senza essere tossico. Tale
fase richiede da 2 a 3 anni e costituisce il 30% dell'investimento totale.
23
Fase I: la prima sperimentazione sull'uomo, e si effettua su un numero limitato
di volontari sani (da 20 a 50) e serve a confermare quanto sperimentato
sull'animale, cio che la molecola non pericolosa. Operativamente i volontari
vengono divisi in 2 o 3 gruppi; ciascun gruppo ricever ogni giorno, per alcune
settimane, una certa dose della sostanza in oggetto e sar costantemente
controllato. Questi test avvengono in ambito ospedaliero, dove i soggetti possono
essere tenuti sotto osservazione dal personale medico. In alcuni casi particolari,
come per i farmaci antitumorali, la Fase I non avviene sul volontariato, bens nel
malato di tumore in fase avanzata e quindi considerato incurabile. Questa scelta
conseguente al fatto che, in generale, i farmaci antitumorali sono molto tossici e
non sarebbe corretto sottoporre persone sane a questi trattamenti.
Fase II: la sperimentazione si allarga coinvolgendo un numero maggiore di
individui, affetti dalle patologie che rientrano nella probabile attivit terapeutica
del farmaco candidato. In questo modo si identifica leffetto terapeutico del
farmaco sulla patologia. Ulteriore scopo della fase II stabilire la minima dose
efficace sull'uomo e il regime di somministrazione ottimale (posologia e durata
del trattamento). Questo stadio dura circa un paio d'anni.
Fase III: rappresenta l'ultima verifica prima dell'entrata in commercio, e quindi
deve soddisfare un numero molto ampio di requisiti, tanto che pu richiedere
alcuni anni. La sperimentazione si effettua su qualche centinaio di pazienti che
vengono divisi in gruppi ai quali verr somministrato il nuovo principio attivo,
oppure il farmaco d'elezione per quella specifica patologia. In questa fase, infatti,
si deve verificare se la nuova molecola offre dei vantaggi rispetto a quelle gi
esistenti, che ne giustifichino la commercializzazione.
Esiste poi una quarta fase, che la cos detta fase di farmaco-vigilanza, che tiene
sotto controllo le possibili reazioni anche gravi che il farmaco pu provocare a
breve e lungo termine.
La ricerca e lo sviluppo di un farmaco un processo ad alto rischio di
fallimento, lungo e costoso. Solo una molecola su 10.000 sintetizzate riesce ad
arrivare allo sviluppo clinico; e solo una su 10 riesce a superare con successo tutte
le fasi dello sviluppo clinico e giungere ai pazienti. Proprio lelevato costo delle
fasi cliniche induce a posizionare lo studio del polimorfismo subito dopo la sintesi
24
e purificazione del principio attivo, in modo da non correre il rischio di scoprire
un nuovo polimorfo in fase di sperimentazione clinica. Questo evento obbliga a
ricominciare tutto il ciclo dallinizio con inevitabili danni in termini economici
(costi aggiuntivi ed estremamente alti) e di tempo, aspetto preziosissimo in questo
ambito di ricerca. Quindi, il polimorfismo costituisce un rilevante problema se si
manifesta alla fine del percorso di valutazione di un farmaco, ma pu
rappresentare un criterio di scelta se analizzato nelle fasi iniziali, perch permette
di identificare la forma cristallina pi adatta ai test clinici e in prospettiva al
mercato.

Figura 16 : Relazione tra la ricerca dei polimorfi, brevettaggio e le varie fasi di sviluppo di un
farmaco.
Per questo il monitoraggio dei polimorfi un aspetto importantissimo e va diretto
non solo alla ricerca delle diverse forme cristalline, ma anche allo studio delle loro
propriet chimico-fisiche.
Lo studio del polimorfismo ha quindi aspetti molteplici:
1. Completa la conoscenza delle caratteristiche chimiche e fisiche di un
principio attivo;
2. Costituisce uno strumento strategico di difesa e di attacco brevettuale su
farmaci noti e generici;
3. Rappresenta innovazione per lindustria che acquisisce preziose
informazioni mettendola in condizioni tali da poter brevettare un nuovo
farmaco e/o prolungare la durata di uno gi esistente.
25
Occorre sottolineare un aspetto concettualmente importante: dal punto di vista
chimico, polimorfi e solvati sono diversi perch differiscono nella struttura e in
altre caratteristiche conseguenti. Allo stesso modo, dal punto di vista
farmacologico, se un polimorfo di una molecola ha propriet di principio attivo,
un secondo polimorfo della medesima pu non essere efficace come farmaco.
Lobiettivo del monitoraggio dei polimorfi quindi quello di verificare se le
differenze tra questultimi sono tali da modificare la biodisponibilit del farmaco,
e di conseguenza lequivalenza terapeutica o altre propriet che inducano a
variazioni di dosaggio o di formulazione. Questa informazione essenziale per
poter accedere ad una abbreviated new drug application con la FDA [38]. Vale
la pena di sottolineare che, sebbene il polimorfismo sia percepito principalmente
come un problema di difesa per le cause brevettuali che hanno scosso il mercato
dei generici (vedi ranitidina cloridrato, terazosin ecc.), il caso del Ritonavir
dimostra invece quanto il polimorfismo sia in primo luogo un problema etico, con
ricadute che possono essere disastrose sui pazienti che fanno affidamento su una
determinata terapia, quando questa dovesse inaspettatamente rendersi impossibile,
incerta o addirittura fallire.

1.6 Monitoraggio di polimorfi (polymorph screening) e caratterizzazione
Con lespressione monitoraggio di polimorfi o polymorph screening si
intende unazione di ricerca attiva e di caratterizzazione delle forme cristalline,
solvate ed amorfe di un determinato principio attivo. Questa azione ha lo scopo
duplice di individuare la forma termodinamicamente pi stabile e di raccogliere
quante pi informazioni possibili sullesistenza di forme cristalline
enantiotropiche, monotropiche e di forme amorfe e solvate. La relazione tra le
diverse fasi illustrata in figura 18. Il monitoraggio dei polimorfi richiede
lutilizzo combinato di tecniche allo stato solido diverse, quali la microscopia e la
microscopia con piatto riscaldante, calorimetria a scansione differenziale (DSC),
termogravimetria (TGA), spettroscopia Raman e infrarosso (Raman e IR),
diffrazione di raggi X di cristalli singolo e polvere (SCXRD, PXRD),
spettroscopia di risonanza magnetica allo stato solido (SSNMR). Inoltre,
altrettanto importante lo studio del comportamento della fase solida in funzione
26
delle diverse variabili in grado di influenzare o determinare il processo di
cristallizzazione. Infatti, tutti i protocolli di monitoraggio, sia automatizzati (ad
esempio lhigh-throughput crystallization) sia manuali, puntano sulla ricerca di
forme cristalline mutando la temperatura, la scelta dei solventi, le condizioni di
formazione del precipitato e di interconversione tra forme solide, pressione e
trattamento meccanico, assorbimento e rilascio di vapore, temperatura ecc. Il
modo pi efficace di procedere quello di valutare leffetto sulla fase cristallina,
sia essa anidra, solvata, o amorfa, modificando una variabile alla volta.

Fig. 18 : Relazione tra polimorfi, solvati e fase amorfa ed il tipo d iprocesso di preparazione o
interconversione. 1, cristallizzazione; 2,desolvatazione; 3, esposizione a solventi/vapor acqueo,
4,liofilizzazione; 5, riscaldamento; 6, fusione; 7, precipitazione; 8,raffreddamento rapido; 9,
macinazione; 10, spray drying; 11,kneading, 12, wet granulation

Infine, va menzionata la possibilit di sfruttare la determinazione della struttura
molecolare e cristallina mediante diffrazione di raggi X su cristallo singolo.
Questa tecnica, sebbene pi onerosa della diffrazione su polveri, fornisce una
conoscenza esatta della stereogeometria e della distribuzione delle molecole nel
cristallo e consente di individuare il numero e la posizione delle molecole di
solvente. Inoltre, la conoscenza della struttura da cristallo singolo consente di
calcolare il diffrattogramma di polveri teorico della sostanza permettendo cos
un confronto con il diffrattogramma di polvere misurato, privo di quegli artefatti
sperimentali (orientazione preferenziale, miscele, presenza di amorfo) che spesso
complicano o rendono incerta linterpretazione dello spettro sperimentale. Fin qui
abbiamo parlato del polimorfismo legato al principio attivo, ma non bisogna
dimenticare linterazione di questultimo con gli eccipienti e il polimorfi-smo
27
stesso degli eccipienti. Inoltre occorre porre molta attenzione alla possibilit che si
verifichino reazioni solido-solido, reazioni solido-vapore e reazioni chimiche
attivate meccanicamente o fotochimicamente sia dal principio attivo, che
dalleccipiente o da entrambi. Ci sono, poi, i metodi teorici di approccio al
polimorfismo (la cosiddetta packing prediction) per il calcolo delle possibili
strutture cristalline di una data molecola, o i vari metodi presentati in letteratura
per la ricerca di polimorfi quali cristallizzazioni su superfici funzionalizzate, in
CO
2
supercritica, co-cristallizzazioni, metodi di kneading, di solvent drop e high-
throughput technologies, etc[39].

1.7 Il legame idrogeno
Il legame idrogeno un fenomeno di notevole importanza in ambito chimico
perch combina direzionalit e forza con la selettivit [40, 41] e gioca un ruolo
unico in natura. Per esempio, il riconoscimento molecolare degli acidi nucleici
basato sulla formazione di legami idrogeno deboli [42-46]. Il legame idrogeno, sia
debole che forte, stato studiato con metodi sia chimici che fisici ed nota la sua
implicazione nelle strutture, nelle propriet fisiche [47,48] nonch nella reattivit
di molecole e complessi [49]. Nel caso del polimorfismo la possibilit da parte di
una molecola di formare diversi network di legame a idrogeno spesso legata al
numero di polimorfi trovati. Questo il caso di molecole con pi siti accettore e
donatore di questa interazione. Inoltre, stabilit (termodinamica o cinetica) e
propriet di una forma sono spesso associate alla forza dei legami a idrogeno che
presenta e sono numerosi gli articoli che fanno riferimento a queste interazioni per
spiegare le caratteristiche (strutturali, meccaniche, chimiche, fisiche) di una
sostanza [50]. Il legame idrogeno un caso particolare di interazione fra dipoli. Si
tratta di un legame dipolo permanente - dipolo permanente in cui implicato un
atomo di idrogeno coinvolto in un legame covalente con elementi molto
elettronegativi come azoto, ossigeno, o fluoro. Questi attraggono a s gli elettroni
di valenza, acquisendo una parziale carica negativa (o-) lasciando l'idrogeno con
una parziale carica positiva (o+). Tale legame si forma quando la carica positiva
relativamente forte dell'idrogeno, viene in contatto con un doppietto elettronico di
un gruppo funzionale di un'altra molecola, il quale lega lidrogeno. Questultimo
28
viene definito accettore, mentre il gruppo dov legato l' idrogeno in maniera
covalente viene detto donatore. Lenergia dei legami idrogeno deboli
prevalentemente dominata da fattori elettrostatici, mentre nelle interazioni forti le
distanze tra gli atomi pesanti sono minori e presentano propriet magnetiche e
vibrazionali pi simili a quelle dei legami covalenti piuttosto che a quelle di
interazioni elettrostatiche. Tuttavia anche la polarizzazione, il trasferimento di
carica e la repulsione giocano un ruolo fondamentale. La forza di tale interazione
pu variare da 5 KJ/mol a centinaia di KJ/mol e questo dipende dalla molecola
presa in considerazione e se si trova in fase gassosa o in soluzione [51-58]. Questo
perch essa dipende dalla costante dielettrica del mezzo; infatti, essendo un
legame elettrostatico, vale la legge di Coulomb; di conseguenza leffetto della
carica ha una grande influenza sulla forza di tale interazione. Sono, infatti,
conosciuti legami idrogeno favoriti da carica negativa [59] da carica positiva [60]
e dalla risonanza [61-64]. Come si hanno legami covalenti deboli e forti, cos si
hanno legami idrogeno deboli e forti e non vi una reale linea di demarcazione tra
i due tipi di interazione e, comunque, la distinzione tra forti e deboli puramente
convenzionale. Unulteriore caratteristica la direzionalit dellinterazione; ad
esempio nell'acqua gli atomi di ossigeno, idrogeno e il doppietto elettronico,
debbono essere allineati lungo lo stesso asse perch sia possibile la formazione del
legame. Tale interazione presente in molte molecole sia inorganiche che
organiche, nonch nelle proteine e negli acidi nucleici. Inoltre ampiamente
utilizzato in natura per creare riconoscimenti selettivi tra vari tipi di coppie, quali
messaggeri/recettori, substrati/enzimi ecc Esso alla base di quasi tutte le
architetture bi- e tridimensionali supramolecolari ed linterazione fondamentale
nellingegneria cristallina. Questa interazione estremamente interessante anche
dal punto di vista chimico: infatti, come detto in precedenza, spesso lottenimento
di polimorfi, idrati e solvati, dipende dal numero, dal tipo e dalla forza dei legami
a idrogeno che si vengono a formare e che caratterizzano le varie strutture. A
seconda della coppia accettore/donatore che si forma, si possono ottenere
polimorfi diversi e, generalmente, maggiore la presenza di gruppi donatori ed
accettori in una molecola e maggiore la sua probabilit di dare origine a diverse
forme cristalline.
29
Qui di seguito verranno trattati alcuni tipi di legame idrogeno che coinvolgono
gruppi con caratteristiche differenti.

1.7.1 Il legame idrogeno O-HO formato dal gruppo carbossilico
I legami a idrogeno formati dai gruppi -COOH sono il prototipo dei sistemi a
legami a idrogeno forte nei complessi cristallini [48,65]. Questo limpaccamento
fondamentale che viene mantenuto passando da solidi organici ad organometallici
[66]. Come nei solidi organici, i complessi che portano un gruppo COOH di solito
formano un anello per interazione di due gruppi -COOH, mentre gli acidi
dicarbossilici originano una catena di molecole legate tramite anelli carbossilici.

1.7.2 Legami idrogeno N-HO con gruppi ammidici o amminici
Relazioni analoghe a quanto visto per i gruppi COOH, si verificano quando
in molecole organiche e complessi di coordinazione ci sono gruppi ammidici
primari e secondari o semplici ammine sono presenti sui leganti [67]. Un caso in
cui fortemente presente questo tipo di legame nella struttura del DNA come si
pu vedere in figura 19.

Fig. 19 : Rappresentazione del legame idrogeno tra grppi N-H e atomi di O e N tra le basi azotate
presenti nel DNA.
30
1.7.3 Legami idrogeno O-HO con gruppi idrossili
Unaltra comune coppia donatore-accettore quella formata dai gruppi -OH.
Generalmente i gruppi -OH danno origine a catene od anelli, in particolare
tetrameri ed esameri, i quali sono abbastanza frequenti nei cristalli di alcool
organici (fig. 20). Solitamente questi motivi dimpaccamento sono spesso
conservati in cristalli di complessi organometallici.

Figura 20: Possibili disposizioni cristalline degli idrossidi in presenza di legami idrogeno.

1.8 Tecniche per lo studio dei polimorfi
Le tecniche maggiormente utilizzate per lo studio del polimorfismo sono la
microscopia, i metodi termici (DTA, DSC e TGA), la spettroscopia IR, le misure
di solubilit, le misure di densit (flottazione, picnometria, dilatometria), la
diffrazione di raggi X di polveri e diffrazione di raggi X di cristallo singolo. Nella
scorsa decade molte nuove tecniche ed apparecchiature sono diventate pi
facilmente disponibili come ad esempio lNMR allo stato solido, lIR in
riflettanza diffusa, luso del vicino IR e luso di tecniche combinate come ad
esempio la microscopia abbinata allinfrarosso. Queste hanno facilitato il
trattamento dei polimorfi diminuendo la possibilit di interconversione durante la
misura ed hanno permesso lo studio di nuove propriet e la misura di nuove
variabili prima erano difficili da ottenere a causa, ad esempio, delle dimensioni
della microcristallinit. Oltre ai metodi riportati ve ne sono molti altri applicabili a
particolari aspetti del polimorfismo ed alle transizioni solido-solido. Esempi di
questo sono la microscopia di scansione ad effetto tunnel [68], la diffrazione
31
elettronica [69], la microscopia a forza atomica [70], la microscopia elettronica
[71-72] e le misure termobarometriche [73].

1.8.1 Microscopia
La microscopia hot-stage la pi usata tra le tecniche di analisi dei
polimorfi e rappresenta il pi importante metodo per lo studio e la formazione di
polimorfi [1]. Questa tecnica risulta cos importante che in mani esperte pu
fornire velocemente, e da sola, interessanti informazioni sul comportamento dei
polimorfi [74-77]. Esperimenti di ciclo di temperatura, di fusione e di
ricristallizzazione da solvente seguiti con un microscopio polarizzatore
equipaggiato con un hot-stage [78-80] permettono di identificare il punto di
transizione, la relazione che lega i polimorfi (monotropica o eniantiotropica), la
tendenza a formare fasi superfredde, la generazione di stati stabili ed instabili e
la registrazione delle loro propriet ottiche [76, 81, 82]. Si possono altres ricavare
informazioni su solvati e sublimati.

1.8.2 IR
Le tecniche IR attualmente disponibili includono quella in sospensione [83-
85], a pastiglia [84-88], a riflettanza diffusa [89, 90] ed a Attenuated Total
Reflection (ATR). Tutte presentano rischi di transizione, in particolare per la
forma amorfa e per i cristalli con stabilit limitata. Lo spettro in soluzione
solitamente escluso per distinguere i polimorfi, ma utilizzato per la conferma
dellidentit della molecola, per lo studio della sua purezza e per distinguere tra
polimorfi, solvati ed isomerie. Il fattore chiave nella scelta della procedura risiede
nella stabilit del polimorfo e nelle condizioni in cui si deve operare.

1.8.3 Raman
Gli spettri Raman sono simili e complementari agli spettri IR in quanto si
basano sullo stesso fenomeno ma su differenti regole di selezione [91, 92]. Lo
spettro Raman dei solidi tende a presentare bande pi affusolate rispetto a quelli
IR. Ed pi sensibile alla conformazione dei polimorfi. Un vantaggio della
32
spettroscopia Raman quello di non aver bisogno della preparazione del
campione per lanalisi diminuendo, quindi, la possibilit di avere trasformazioni
inattese.

1.8.4 Raggi X
La spettroscopia di diffrazione di raggi X di cristallo singolo la tecnica che
porta alla descrizione pi completa dei polimorfi, visto che d informazioni
sullimpaccamento cristallino, sulle interconnessioni della molecola e sulla
conformazione tridimensionale della molecola nel cristallo. Il motivo per cui non
sempre questa tecnica viene utilizzata legato alla difficolt di formare cristalli
adatti alla risoluzione, mentre la spettroscopia di diffrazione di polveri pu sempre
essere ottenuta. La distinzione tra i vari polimorfi basata sulla differenza dello
spettro delle diverse forme. Si possono svolgere analisi a temperature variabile, in
modo tale da cogliere il passaggio da una forma allaltra grazie allimprovvisa
variazione del volume della cella unitaria, che si ripercuote inevitabilmente sulla
forma dello spettro.

1.8.5 DSC, TGA
La tecnica di calorimetria a scansione differenziale (DSC) appartiene ai
metodi termici assieme allanalisi termogravimetrica (TGA) e allanalisi
termodifferenziale (DTA). La TGA si basa sulla perdita di massa durante il
riscaldamento dovuto alla perdita di solvente, alla sublimazione od alla
decomposizione del campione. La DSC e la DTA sono vie alternative per
misurare la capacit termica di un campione. Infatti, durante una transizione di
fase, il calore assorbito o emesso dal campione varia e tale variazione si riflette
nello spettro con una variazione della linea di base, la quale pu essere positiva o
negativa a seconda della variazione.

1.8.6 NMR allo stato solido
Tra le varie tecniche utilizzate per lo studio dei polimorfi vi lNMR allo
stato solido. Questa tecnica di caratterizzazione ha avuto un grande sviluppo negli
33
ultimi anni e pu essere estremamente utile per la comprensione strutturale,
dinamica e cinetica dei polimorfi. Poich tutti gli elementi presentano almeno un
nucleo magneticamente attivo, la struttura chimica pu essere studiata osservando
diversi tipi di nucleo. In particolare non solo il
13
C, ma anche
31
P,
19
F o
15
N in
abbondanza naturale possono essere buoni candidati per rivelare, distinguere,
caratterizzare e quantificare diversi polimorfi. Questa tecnica presenta molti
vantaggi rispetto ad altre; in primo luogo non invasiva n distruttiva ed molto
pratica in quanto non necessaria nessuna preparazione particolare del campione
[93]. Permette di analizzare campioni cristallini, ma anche campioni amorfi e
sostanze in polvere, i quali non possono essere caratterizzati con i raggi X, perch
non presentano ordine a lungo raggio. Tramite lNMR allo stato solido possibile
monitorare le trasformazioni e studiare fenomeni dinamici che avvengono allo
stato solido (come conversioni, isomerizzazioni, scambio chimico) oltre ad
effettuare misure cinetiche. Dal momento che il metodo multinucleare e
sensibile alle variazioni locali dellintorno nucleare, possibile utilizzarlo per lo
studio di sintesi a pi fasi e per la valutazione della quantit relativa delle fasi.
Inoltre, possibile, mediante sequenze di impulsi particolari, determinare la forza
dellinterazione dipolare tra due nuclei. Essendo tale interazione proporzionale
allinverso del cubo della distanza nucleare, si in grado di determinare le
distanze internucleari [94]. Daltra parte sono presenti anche alcuni svantaggi
come il costo relativamente alto degli spettrometri, il fatto che questa tecnica
richieda un operatore molto esperto ed i lunghi tempi di acquisizione per nuclei
poco sensibili come
15
N o
13
C.
Nel capitolo seguente verr ampiamente discussa la tecnica NMR allo stato
solido e i recenti sviluppi apportati in questo campo ed inoltre verranno trattate le
tecniche utilizzate nel lavoro di tesi.
34
Bibliografia capitolo 1

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39
2.1 Introduzione
La Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) una tecnica strumentale che
consente di conoscere propriet a livello sub-molecolare di materiali di varia
natura, tramite lo studio dellinterazione tra il materiale in esame e il campo
magnetico in cui viene posto. Il fenomeno su cui si basa stato scoperto dai fisici
Felix Bloch e Edward Purcell nel 1946 e da allora questa tecnica ha conosciuto
continue evoluzioni sia teoriche, che sperimentali. Nonostante il primo
esperimento NMR sia stato effettuato su un campione di paraffina allo stato
solido, negli anni successivi tutta la ricerca fu rivolta allo sviluppo di tecniche per
lo studio di sistemi allo stato liquido dove la mobilit molecolare tale da rendere
linterpretazione degli spettri meno complessa. Tuttavia negli anni 70 vennero
introdotte tecniche quali la rotazione allangolo magico Magic Angle Spinning
(MAS), la Cross-polarization (CP) e il Disaccoppiamento eteronucleare ad alta
potenza (DD), che hanno permesso di ottenere spettri ad alta risoluzione anche in
fase solida, dando cos nuovo impulso alle applicazioni dellNMR. [1]

2.2 NMR allo Stato Solido (NMR SS)
La forza della spettroscopia NMR allo stato solido rispetto a quella in
soluzione risiede nella capacit di dare informazioni strutturali anche su composti
di cui non possibile ottenere la struttura dai raggi X: cio campioni in polvere
che presentano cristallinit a breve raggio od addirittura amorfi. Tali informazioni
sono relative anche agli atomi di idrogeno, in particolare quando danno origine
alle interazioni di legame idrogeno. Questa ricchezza di informazioni per, spesso
la fonte dei problemi che inizialmente avevano impedito la diffusione di questa
tecnica allo stato solido. Successivamente per, con il progredire della tecnologia
e lo sviluppo da parte degli spettroscopisti di nuove sofisticate sequenze
dimpulso stato possibile superare i problemi e ottenere selettivamente le
informazioni adeguate. La spettroscopia NMR misura le componenti delle
interazioni magnetiche lungo la direzione del campo magnetico statico applicato.
Tali interazioni sono: linterazione Zeeman, linterazione dipolare, linterazione
quadrupolare, linterazione di accoppiamento scalare e di schermo elettronico (o
anisotropia del chemical shift).
40
Tutte le interazioni che contano e che danno le informazioni di interesse chimico,
allo stato solido diventano anisotrope,[2, 3] cio sono dipendenti
dallorientazione, di conseguenza variano con gli angoli relativi allarrangiamento
locale della specie in osservazione, rispetto al campo magnetico esterno applicato.
In un liquido i rapidi e casuali moti molecolari (tumbling molecolare) [4, 5]
rendono il mezzo isotropo ed in particolare mediano lanisotropia delle
interazioni. In fase liquida, linterazione dipolare ha un valore medio isotropo
nullo, per cui non si osserva, mentre il chemical shift risulta mediato al suo valore
isotropo non nullo normalmente conosciuto come chemical shift. In un solido
lassenza di moti isotropi fa s che lo spettro NMR dipenda dalle diverse
orientazioni delle molecole rispetto al campo e dalla loro distribuzione. Per
esempio la frequenza di risonanza di un dato nucleo, dipende, dallorientazione ,
rispetto al campo, del frammento molecolare che lo contiene. In un cristallo
singolo, dove tutti gli elementi che formano il cristallo sono disposti in modo
ordinato e ripetitivo, si avranno frequenze di risonanza che dipendono da com
orientato il cristallo allinterno del campo magnetico. In un campione di polvere
cristallina tutte le orientazioni sono possibili e lo spettro risultante sar pi
complicato e difficile da comprendere perch somma di tutte le frequenze dei
nuclei per tutte le orientazioni possibili. Quindi nei sistemi in soluzione, le
larghezze dei segnali, per i nuclei di spin come
1
H e
13
C, sono sostanzialmente
pi piccole di 1 Hz, mentre le larghezze di banda di
13
C ed
1
H per i tipici solidi
organici in polvere e in forma microcristallina si aggirano rispettivamente intorno
a 30 e 60 Hz. Tale larghezza, d limpressione di aver perso tutte le informazioni
concernenti lo spostamento chimico e la costante di accoppiamento. Tutti i
contributi che possono influenzare uno spettro NMR, sia allo stato solido che allo
stato liquido, sono racchiusi nellespressione dell Hamiltoniano di spin
complessivo H.

Z D SC CS Q
H H H H H H = + + + +
Dove H
z
linterazione di Zeeman, H
D
linterazione dipolare, H
SC

linterazione scalare, H
CS
linterazione di anisotropia del chemical shift e H
Q

linterazione quadrupolare.

41
2.2.1 Interazione Zeeman
E linterazione tra il campo magnetico esterno B
0
e il momento magnetico
nucleare; il suo contributo allHamiltoniano descritto dal termine:
0

Z Z
H I B = h
in cui il rapporto giromagnetico.
Questo termine permette di discriminare i nuclei attivi (I
Z
= 0) e di valutare la
sensibilit del nucleo verso il campo magnetico (sensitivit del nucleo) che
funzione di .

2.2.2 Interazione dipolare
Tale interazione il contributo perturbativo apportato da un nucleo sui livelli
energetici del momento magnetico nucleare di un altro nucleo; lespressione
quantomeccanica di questo contributo data da:
3 2
0

( )
4
D I S
H r A B C D E F

= + + + + + h
dove I e S sono gli spin dei due nuclei accoppiati e i vari termini A, B, C, D, E ed
F sono correlati ai contributi associati a vari tipi di transizione.
Ci che pi significativo per questi termini la loro dipendenza
dallorientazione relativa dei nuclei interagenti, che per i termini A (contributo
secolare) e B (contributo di flip-flop) si esplicita nella dipendenza da (1 3
cos
2
), mentre i restanti allatto pratico assumono un peso tale da essere
trascurabili.
Alla luce di ci si avr che due nuclei isolati daranno origine ad un doppietto alle
frequenze:
2
0
(1 3cos ) = +

La posizione del doppietto sar funzione della distanza internucleare r e della
mutua orientazione dei nuclei, informazioni da cui possibile ottenere dati
strutturali.
Il contributo di ogni nucleo attivo (particolarmente sensibile quello dei protoni per
lelevato momento dipolare) porta ad un allargamento di banda del segnale NMR,
42
molto utile perch correlabile, in funzione della temperatura, con la presenza di
moti molecolari.

2.2.3 Anisotropia del chemical shift
Tale interazione consiste in un contributo magnetico causato dagli elettroni
presenti attorno ad un nucleo. LHamiltoniano del chemical shift :

0

CS i iz izz
i
H B I =

h
dove
izz
lelemento zz del tensore di schermo delli-esimo nucleo nel sistema
di riferimento fisso. Applicando un campo magnetico esterno su un nucleo attivo
di una molecola, linterazione Zeeman genera livelli energetici che vengono
perturbati nella loro posizione ad opera del contributo schermante o deschermante
degli elettroni che circondano il nucleo stesso. Questo possibile perch, tali
elettroni, avendo anchessi uno spin, sono in grado di generare piccoli campi
magnetici locali, che possono andare a sommarsi o a sottrarsi al campo magnetico
esterno B
0
agendo in maniera schermante o deschermante sui livelli energetici
dellatomo. In questo modo il campo magnetico percepito da un determinato
nucleo funzione della densit elettronica che presente attorno a questo nucleo.
Quindi, dal momento che la densit elettronica, che dipende dal n degli elettroni,
varia da atomo ad atomo e soprattutto varia in funzione dellintorno chimico
dellatomo preso in considerazione, anche il campo magnetico effettivo percepito
dal nucleo, cambia da atomo ad atomo. Per cui come per linterazione dipolare,
poich in un solido tutte le direzioni sono contemporaneamente possibili, uno
stesso nucleo risuoner a chemical shift differenti, dipendenti dallorientazione
della molecola rispetto a B
0
. Lanisotropia del chemical shift, in soluzione viene
mediata dal tumbling molecolare ad un valore isotropo, cos non nel solido,
dove d origine ad una grandezza tensoriale caratterizzata da tre valori, che
corrispondono alle tre direzioni ortogonali nello spazio figura 1.
43

Figura 1: Rappresentazione delle componenti del tensore di schermo.
Si definisce Anisotropia del Chemical Shift (CSA):
33 ISO
=
dove:
11 22 33
( )
3
ISO

+ +
=
Un cristallo singolo, ad esempio, dar un segnale singolo per ogni particolare
orientazione rispetto al campo magnetico, ed il chemical shift dipender
dallorientazione del cristallo stesso rispetto al campo magnetico esterno.
In un campione policristallino, invece, il segnale finale sar una somma dei
segnali corrispondenti a tutte le possibili orientazioni, dando origine ad un segnale
allargato. La forma della banda allargata, figura 2, dipender dagli elementi
principali del tensore di schermo il quale pu essere rappresentato da una matrice
3 x 3, come riportato qui di seguito:



44


Figura 2: Rappresentazione schematica della forma della banda teorica per uno spettro di polvere.
(a): tensore asimmetrico; (b): tensore assialmente simmentrico.
Analizzando le tre componenti principali del tensore di schermo, o
11
, o
22
e o
33
, si
possono ricavare utili informazioni sul tipo di legame in studio.
I valori delle tre componenti tensioriali possono essere ricavate in diversi modi:

da studi NMR di cristallo singolo;
da studi NMR di cristalli liquidi;
da studi NMR di polveri (con ovvi problemi dovuti a scarsa sensitivit e
sovrapposizione di pattern anisotropici);
Dallanalisi delle spinning side-bands in esperimenti MAS a bassa velocit
di rotazione, mediante semplici programmi di fittine;

2.2.4 Interazione scalare
Questinterazione si instaura tra due nuclei per mediazione degli elettroni di
legame e si definisce come J coupling.
Il termine dellHamiltoniano che rappresenta questinterazione :

SC
H J I S =
in cui J (costante di accoppiamento) una grandezza tensoriale.



45
2.2.5 Interazione quadrupolare
E linterazione del momento di quadrupolo con il gradiente di campo
elettrico non sfericamente simmetrico, e si verifica solo per nuclei con I > . Se
linterazione quadrupolare piccola rispetto a quella Zeeman si ottiene per
lHamiltoniano la seguente espressione:
2 2
1

(3 )(3cos 1)
4 (2 1) 2
CC
Q Z
Q
H I I
I I

e la corrispondente frequenza di transizione tra i livelli energetici m ed (m+1)
sar:
2
1
1 1
(3cos 1)( )
2 (2 1) 2 2
CC
m m Zeeman
Q
m
I I

+

= +

+


Per una determinata transizione uninterazione pu provocare un allargamento di
banda; se la larghezza della banda pari a , tale allargamento pu essere
rimosso introducendo un mixing degli stati generati dallinterazione ad una
velocit pi grande di . Nei solidi il moto molecolare non sufficiente a
mediare efficacemente i vari stati, per cui occorre utilizzare opportune tecniche
per realizzarne il mixing.

2.3 NMR SS in Alta Risoluzione
Come si visto precedentemente linterazione dipolare e linterazione di
anisotropia del chemical shift hanno una forte dipendenza angolare, di
conseguenza queste interazioni possono essere mediate a zero con opportuni
accorgimenti, usando tecniche particolari quali la rotazione allangolo magico
(MAS) e il disaccoppiamento dipolare ad alta potenza (DD).

2.3.1 Magic Angle Spinning (MAS)
Per uninterazione anisotropa la frequenza di risonanza pu essere in generale
espressa come:
e
aniso
= f(,)
46
con (0,) le coordinate polari del versore lungo il campo magnetico esterno. E
possibile, mediante trasformazione del sistema di riferimento, riferire
lorientazione del frammento molecolare rispetto ad un asse arbitrario che forma
un angolo
r
rispetto al campo magnetico esterno in modo da passare al sistema di
laboratorio, il cui asse z coincide con la direzione del campo magnetico stesso. Se
inoltre si ruota rispetto a tale asse, la frequenza risulta un valore medio sulle
diverse orientazioni (definite dagli angoli polari 0
a
e
a
) assunte dal frammento
molecolare rispetto allasse di rotazione. In particolare si ha che:
=f ' ( , ) 1/2 3cos 1
aniso
r a a
2

da cui risulta che nel caso in cui lasse di rotazione sia a 54.74 rispetto al campo
magnetico esterno, valore per il quale il termine (3cos
2
0
r
-1) si annulla,
e
aniso
diventa uguale a zero, e la sola componente isotropa dellinterazione
contribuisce allo spettro.
Langolo 0
r
detto angolo magico.


Figura 3: Rappresentazione dellangolo magico.


E da tenere presente che la rotazione ad angolo magico annulla leffetto delle
anisotropie delle diverse interazioni soltanto se la frequenza di rotazione molto
maggiore di e
aniso
. Per velocit inferiori si osservano una serie di bande, dette
bande rotazionali o spinning sidebands, distanziate di intervalli multipli della
frequenza di rotazione e
r
,
3
come si pu chiaramente osservare in figura 4.
47

Figura 4:Rappresentazione dellevolozione di un segnale anisotropo in funzione delle velocit di
rotazione allangolo magico
Con i moderni spettrometri si ottengono velocit massime pari a circa 30-35 kHz
sufficienti quindi ad eliminare lanisotropia del chemical shift, ma non tutti gli
accoppiamenti dipolari. Per esempio, nel caso di molecole organiche in cui le
distanze carbonio-protone sono piccole (dellordine di 1-2 ), laccoppiamento
dipolare
13
C-
1
H non viene mediato a zero dalla rotazione ad angolo magico. E
quindi necessario, in questo caso, combinare la tecnica MAS con il
disaccoppiamento dipolare ad alta potenza.

2.3.2 Disaccoppiamento dipolare ad alta potenza (DD)
Il metodo pi comunemente usato per annullare linterazione dipolare
eteronucleare
13
C-
1
H in esperimenti
13
C MAS, consiste nellirraggiamento
continuo con un campo magnetico B
1

perpendicolare a B
0

alla frequenza di
risonanza dei nuclei protonici durante il periodo di acquisizione del segnale. In
questo modo la magnetizzazione del nucleo
1
H precede intorno a B
1

ed il nucleo
13
C vede una situazione media in cui il momento magnetico del nucleo protonico
nullo.

48
2.4 Tecniche usate in NMR SS in Alta Risoluzione
Le tecniche fin qui descritte servono per ottenere spettri
13
C NMR ad alta
risoluzione in fase solida. Tuttavia, per ottenere questi spettri in tempi di misura
ragionevoli devono essere risolti altri due importanti problemi. Il primo nasce
dalla lunghezza dei tempi di rilassamento longitudinale T
1
dei nuclei
13
C (anche
dellordine dei minuti) [2, 3, 6]. Il secondo costituito dalla bassa abbondanza
naturale e bassa sensibilit NMR del
13
C [7, 8], che impongono la necessit di
acquisire un elevato numero di FID per avere un buon rapporto S/N. Insieme
questi due fattori possono rendere i tempi di misura proibitivi.

2.4.1 Cross-Polarization
Una delle tecniche pi utilizzate per ovviare a questi problemi la cross-
polarization (CP) che sfrutta la possibilit di trasferire magnetizzazione (o
polarizzazione) dall
1
H, cio da uno spin abbondante, al
13
C, cio ad uno spin
raro, ad esso accoppiato dipolarmente. Per avere trasferimento di polarizzazione
tra due nuclei accoppiati dipolarmente occorre innanzitutto che entrambi siano in
condizione di spin-lock. Si ha spin-lock quando la componente della
magnetizzazione lungo un campo applicato B
1
, perpendicolare a B
0
e molto
maggiore dei campi locali (accoppiamenti dipolari, chemical shift), non precede
intorno a B
0
ma rimane allineata lungo tale direzione. La magnetizzazione di tale
sistema di spin pu essere mantenuta in tale condizione solo per un tempo limitato
infatti, essa pu rilassare longitudinalmente nel sistema ruotante, secondo il tempo
caratteristico T
1p
. Lo scambio di polarizzazione fra
1
H e
13
C accoppiati
dipolarmente avviene quando si irradiano contemporaneamente i due nuclei con
campi B
1

alle rispettive frequenze di risonanza tali che sia verificata la condizione
di Hartmann-Hann:

B
1H
=
C
B
1C

dove
I

il rapporto giromagnetico del nucleo H e B
1I
lintensit del campo
magnetico trasversale applicato sul nucleo H. Lequazione di Hartmann-Hann
implica che:

1
H
=
1
C

49
ovvero che i due sistemi di riferimento ruotanti siano sincroni e di conseguenza si
ha possibilit di trasferimento di magnetizzazione. Se si parte da una situazione in
cui si ha solo magnetizzazione dei nuclei
1
H, dopo il trasferimento di
magnetizzazione la componente della magnetizzazione dei nuclei
13
C
proporzionale a quella dei nuclei
1
H che lhanno generata, ovvero quelli che
interagiscono dipolarmente. In ogni caso il massimo guadagno in
magnetizzazione, rispetto alleccitazione diretta del nucleo
13
C, al massimo

H
/
C
= 4. E da tenere presente inoltre che ai fini del tempo di attesa fra una
scansione e quella successiva, conta il T
1

del nucleo
1
H che, rispetto agli altri
nuclei, ha tempi di rilassamento molto pi corti. In questo modo possibile
registrare spettri
13
C in abbondanza naturale in tempi relativamente brevi.
Lesperimento
1
H-
13
C CP generalmente schematizzato come riportato in figura
5. La crescita della magnetizzazione dei nuclei
13
C durante il tempo di contatto t
CP

segue un andamento esponenziale con tempo caratteristico T
CP

che dipende dalle
interazioni dipolari dei nuclei coinvolti nel trasferimento di magnetizzazione.


Figura 5: Rappresentazione schematica della sequenza CPMAS.

E chiaro quindi che per nuclei
13
C direttamente legati a nuclei
1
H la crescita della
magnetizzazione sar pi rapida rispetto a quella di nuclei quaternari. Inoltre,
50
durante il tempo di contatto la magnetizzazione dei nuclei
1
H e quella dei nuclei
13
C che si crea sono soggette a rilassamento longitudinale T
1p
. Tutto ci fa s che,
in primo luogo, le intensit dei diversi picchi in uno spettro CP non rispettino le
quantit relative dei diversi tipi di nuclei
13
C presenti nel campione, e in secondo
luogo, la dinamica di CP, cio landamento della magnetizzazione del
13
C nel
tempo, non sia una semplice funzione esponenziale. In particolare si ha che:

M(t)=M
0
1-T
CH
/T
1
e
-t/T
1e
-t/T
1 1
-1
H
H


Lequazione sopra riportata consente di ottenere M
0
, ovvero massima la
magnetizzazione ottenibile da M(t) noti i valori di T
CH
e
1
per i diversi tipi di
carbonio. M
0

direttamente proporzionale al numero di nuclei
13
C che
contribuiscono al picco in esame e la sua determinazione consente quindi di
ricavare le quantit relative dei diversi tipi di carbonio presenti in un campione.

2.4.2 CP-MAS
La sequenza CP-MAS la combinazione delle tecniche di Cross Polarization
e di Magic Angle Spinning. Essa permette di ottenere spettri allo stato solido in
alta risoluzione, con larghezze di banda dellordine di qualche decina di Hz per
nuclei come il
13
C o il
31
P. Gli accorgimenti sopra elencati, per poter mediare le
varie interazioni, tecnicamente portano a differenze di costruzione dello
spettrometro NMR allo stato solido rispetto alla tecnica classica in soluzione. In
particolare la parte che racchiude in s tutti i dispositivi per ottenere spettri ad alta
risoluzione il probe. Come illustrato nelle figure seguenti, il probe di un NMR
allo stato solido costituito da un blocco cilindrico che porta il campione al centro
del campo del magnete, su cui una testina angolata regolabile permette la
rotazione del campione allangolo magico.
Il campione viene introdotto in un rotore cilindrico in zirconia che viene chiuso
con un apposito tappo dotato di speciali alettature; una volta inserito nella testina,
51
il campione viene posto in rapida rotazione mediante due flussi di aria compressa,
uno che solleva il rotore e laltro che agisce sulla alettature (figure 6).



Figura 6: Esempi di probe per stato solido e differenti rotori utilizzati.

2.4.3 Spectral editing
Lo spectral editing una tecnica usata per poter semplificare spettri
complessi e per lassegnazione dei segnali originati da nuclei diversi in
esperimenti NMR in alta risoluzione, i quali risulterebbero difficilmente
assegnabili con normali tecniche di cross polarizationAllo stato liquido le tecniche
editing, quali DEPT, INEPT e ATP sono ormai esperimenti standard, mentre allo
stato solido, nonostante la CPMAS sia comunemente usata da circa una 20 anni,
le tecniche di editing sono poco sviluppate ed il loro utilizzo non routinario. Una
delle tecniche di spectral editing maggiormente usata la dipolar dephasing o
Non-Quaternary-Suppresion (NQS), ma sfortunatamente questa da solo
informazioni sui atomi di carbonio quaternari e metilici mentre non in grado di
distinguere chiaramente i gruppi CH e CH
2
. Per poterli distinguere sono stati
proposti diversi metodi [9-13], tra cui tecniche bidimensionali quali separed-local-
field (2DSLF) oppure la medesima adattata in maniera momodimensionale. Tali
sequenze sono basate puramente sul fatto che gruppi CH2 hanno due
accoppiamenti dipolari C-H, perch possiedono due idrogeni, mentre i gruppi CH
ne hanno uno solo. Nel 1992 stato proposto un semplice metodo per distinguere
gruppi CH, CH2, CH3 e carboni quaternari (C
q
) chiamato CPPI (Cross-
52
Polarization Polarizazion-Inversion). Questo si ottiene usando un generico
esperimento CPMAS, integrato con una sequenza di inversione di polarizzazione
(PI) [14-16], come si pu vedere nello schema della sequenza riportata in figura 7.

Figura 7: Sequenza di impulsi per lesperiminto di Spectral-editing allo stato solido.
Gli spins I rappresentano il sistema di spins abbondanti, ovvero il protone (
1
H),
mentre gli spins S corrispondono al sistema di spin del carbonio (
13
C, spin raro).
Sotto le condizioni di Hartmann-Hahn, la magnetizzazione del carbonio, M
S
,
cresce gradualmente incrementando il tempo di contatto,
CP
, durante la Cross-
polarization. In seguito ad un tempo di contatto sufficientemente lungo gli spin S
e I raggiungono un equilibrio termico cio a seguito del trasferimento di
magnetizzazione dallidrogeno al carbonio raggiungono la stessa temperatura di
spin. A questo punto, cambiando la fase dello spin-lock sullo spin I (1H) di 180
la temperatura di spin dei protoni invertita quindi anche la sua magnetizzazione.
Di conseguenza i sistemi di spin di carbonio e idrogeno non sono pi
allequilibrio termico e perch ci siano nuovamente le condizioni che portino ad
un equilibrio, deve avvenire un ulteriore trasferimento di energia. Quindi, man
mano che si incrementano i tempi di inversione di polarizzazione,
P1
, la
magnetizzazione del carbonio prima decresce, poi si annulla e infine diventa
negativa. Questo processo denominato inversione di polarizzazione[16] in cui la
dinamica degli spin simile a quella che si realizza in una normale cross-
polarization. Tale tecnica pu essere applicata sia con basse, che con alte velocit
di rotazione. In particolare usando basse velocit di rotazione si frutta la diversa
velocit nel meccanismo di rilassamento (meccanismo di cross-relaxation) e la
diversa capacit termica, che indipendente dalla mobilit molecolare, dei gruppi
53
CH, CH
2
, CH
3
e Cq. Questo si traduce in un efficacia nel meccanismo di
inversione che segue la seguente serie CH
2
>CH>CH
3
>Cq. Ad alte velocit di
rotazione, nellordine dei 10 KHz, si sfrutta invece la diversit della componente
dipolare dellhamiltoniano delle quattro specie. In particolare la componente
dipolare dellhamiltoniano dei gruppi CH, mediata solo in parte dalla velocit di
rotazione di conseguenza risulta disomogenea, mentre per i gruppi CH
2
la
componente dipolare pi grande, circa 35 KHz, di conseguenza la rotazione non
in grado di mediarla neanche in parte e di fatto risulta omogenea. Questo, porta
nuovamente ad una maggiore velocit di inversione per i gruppi CH
2
rispetto ai
CH. Provando una serie di spettri con tempi di polarizzazione inversa,
PI
,
differenti si in grado di ottenere uno spettro con i segnali degli atomi di carbonio
quaternari ed i metili positivi, i segnali dei CH nulli mentre i CH2 negativi.
Questo semplifica notevolmente gli spettri anche quando questi sono molto
complicati dalla sovrapposizione dei segnali. In figura 8 riportato un esempio di
spettro CPPI per il un campione di colesteril acetato [17].

Figura 8: a) Struttura del Colesteril Acetato b) Rappresentazione dello spettro CPMAS del
Colsteril Acetato registrato ad una velocit di rotazione di 4.7 kHz cb) Spettro risultante
dallesperimento di spctral-editing eseguita con un
P1 pari a 20 s
ed ugule velocit di rotazione. I
segnali contrassegnati dal pallino sono i
13
CH.
54
2.4.4 2D-PASS
La presenza delle spinning sidebands, allinterno di uno spettro, rappresenta
un problema, ma allo stesso tempo unopportunit per ricavare importanti
informazioni. La loro presenza fa si che la sensibilit peggiori, perch lintensit
del picco isotropo diminuisce a favore del contributo anisotropo, inoltre
confondono e complicano molto linterpretazione dello spettro. Tuttavia esse
contengono preziose informazioni sulle anisotropie di schermo dei vari siti
allinterno della molecola. Queste informazioni si possono ottenere registrando
spettri a basse velocit di rotazione, ma la presenza di diversi pattern di spinning
sidebands assegnati ai diversi picchi isotropi rende lo spettro di difficile
interpretazione. Di conseguenza nata lesigenza di ottenere informazioni
sullanisotropia del chemical shift (CSA) di differenti siti presenti allinterno di
molecole complesse usando tecniche di rotazione allangolo magico. Ci sono
numerosi approcci per separare le informazioni riguardanti la parte isotropa ed
anisotropa del chemical shift. Generalmente si dividono in due tipologie: quelli
che ottengono informazioni sulla CSA da spettri a banda larga che ricordano il
pattern di un campione in polvere statico; oppure quelli in cui linformazione
viene ricavata dallanalisi delle spinning sidebands presenti in un normale spettro
CP-MAS. Solitamente i primi sono metodi molto elaborati e difficili perch
richiedono che gli spin in un campione ruotante si comportino come se fossero
statici. Una particolare tecnica che riesce a ricavare utili informazioni sulla CSA
da normali spettri CP-MAS registrati a basse velocit di rotazione, un
esperimento bidimensionale chiamato 2D-PASS (Two dimensional phase-
adjusted spinning sidebands) suggerito per la prima volta da Dixon agli inizi degli
anni 80 [18, 19].
La sequenza di impulsi 2D-PASS, combinando spettri con differenti fasi
delle spinning sideband, in grado di separare in righe individuali di uno spettro
bidimensionale le spinning sidebands dei diversi picchi isotropi in base al loro
ordine (dove le spinning sidebands di ordine k sono separate dal relativo picco
isotropo da k
r
con
r
uguale alla velocit di rotazione del rotore).
Linformazione sulla CSA quindi conservata ed possibile ricostruire uno
spettro quantitativo e puramente isotropico attraverso unelaborata somma delle
55
righe del data set. In altre parole il risultato finale una correlazione tra la
componente isotropa e anisotropa di uno spettro in cui attraverso la seconda
dimensione si ottengono informazioni addizionali sullintorno chimico del nucleo.
Uno schema dellesperimento 2D-PASS riportato in figura 9.


Figura 9: Sequenza di impulsi per lesperiminto 2D-PASS allo stato solido
La sequenza inizia con una normale cross-polarization
1
H-
13
C necessaria per
accrescere la magnetizzazione del nucleo raro (
13
C) in modo da poter essere
acquisito con una maggiore sensibilit e in tempi relativamente brevi. La sequenza
evolve poi per un periodo
r
(indicato con il nome PASS in figura 9), pari al
periodo del rotore cio
r
= 2/
r
. Durante questo periodo si usano cinque impulsi
per preparare le componenti della magnetizzazione in maniera tale che siano
introdotti dei cambiamenti di fase ben definiti nelle spinning sidebands. A questo
punto la magnetizzazione del carbonio libera di evolvere durante i tempo di
56
acquisizione t
2
in cui osservata in presenza di disaccoppiamento sul canale del
protone. Nel primo esperimento 2D (t
1
=0) i cinque impulsi sono separati
uniformemente di un valore pari a
r
/6 e disposti simmetricamente rispetto al
centro di un singolo periodo del rotore denominato PASS. In tale configurazione
laquisizione durate il t
2
non influenzata dalla sequenza di impulsi della PASS e
quindi lesperimento corrisponde ad una semplice CP-MAS. Nei successivi
incrementi di t
1
, la posizione degli impulsi varia seguendo landamento delle
curve riportato nel diagramma sotto lo schema della sequenza 2D-PASS in figura
9. Queste differenti posizioni degli impulsi sono quelle che permettono di ottenere
gli spettri con cambiamenti di fase delle spinning sidebands ben definiti. [17,20].
Il numero di incrementi di t
1
dipende dal numero di spinning sidebands del
composto in esame. Nel caso di composti che contengono un numero limitato di
spinnig sidebands ne sono necessari solo pochi.
Un esempio di applicazione di tale sequenza riportato in Figura 10 per un
campione di ampicillina acquisito ad una velocit
r
di 1030 Hz. Come si pu
notare lo spettro 1D CPMAS (riportato in alto nel prospetto A in figura 10) appare
alquanto complicato e di difficile interpretazione per il fatto che le spinning
sidebands si sovrappongono sia tra loro che con i segnali isotropi tipici
dellampicillina. Nel prospetto B le spinning sidebands sono separate lungo la
seconda dimensione in accordo con il loro ordine k (lordine 0 corrisponde ai
picchi isotropi, k positivi per le spinning sideband ad bassa frequenza e con segno
negativo quelle a alta frequenza). Le sidebands per ciascun sito chimico giacciono
diagonalmente nello spettro 2D (mostrato in contour plot nel prospetto C in
basso nella figura). Nello spettro 2D, lintensit relativa delle spinning sidebands
per ciascun sito la stessa che si ottiene nellesperimento 1D MAS. Mediante
lutilizzo di programmi numerici standard si pu procedere nellanalisi dei diversi
pattern di spinning sideband, separati dalla sequenza 2D-PASS e facilmente
assegnabili ai vari picchi isotropi presenti per ottenere utili informazioni sulla
CSA.
57


Figura 10: a) Spettro 1D CP-MASS dellAmpicillina registrato a 1030 Hz; b) spinning sidebands
separate lungo la seconda dimensione in accordo con il loro ordine k; c) spettro 2D-PASS in cui
tre righe non contengono segnale.





58
2.4.5 HETCOR
Le tecniche di correlazione eteronucleare sono molto importanti per poter
migliorare la risoluzione nella spettroscopia NMR multidimensionale. La
risoluzione ottenuta con questo metodo offre promettenti possibilit di sviluppo
sia per l'assegnazione dei segnali in un uno spettro sia per la determinazione
strutturale delle molecole prese in esame. Recentemente sono state sviluppate
sequenze bidimensionali di correlazione eteronucleare
1
H-
13
C (HETCOR),
eseguite ad alta velocit di rotazione, che fanno uso di particolari sequenze per
mediare la forte interazione dipolare
1
H-
1
H [21, 22]. Generalmente, in tali spettri,
sono presenti pi picchi di correlazione (cross peak) assegnabili agli atomi di
idrogeno, per ciascun atomo di carbonio, che possono essere estremamente utili
per linterpretazione degli spettri. Tali sequenze possono essere utili anche per
ottenere informazioni sulle distanze intermolecolari e e spaziali tra gli atomi di
idrogeno e carbonio [23]. In figura 11 rappresentata la sequenza di impulsi 2D
eteronucleare di correlazione dipolare
1
H-
13
C.


Figura 11: Sequenza di impulsi per lesperiminto HETCOR
1
H-
13
C allo stato solido.
In questa sequenza viene analizzata levoluzione dellintesit del segnale di uno
spin S (
13
C) nel tempo, durante una Cross Polarization mentre si irradiano gli spin
I (
1
H) usando la sequenza Frequency-Switched Lee-Goldburg (FSLG). La
magnetizzazione del protone evolve durante il tempo t
1
sotto l'efficace
soppressione dell'interazione dipolare omonucleare
1
H-
1
H per mezzo
dell'irradiamento FSLG. Questo si basa sullapplicazione di un campo a radio-
frequenze off-resonance, cioe' lontano dal campo di risonanza dei protoni, sugli
59
spins I in modo tale che il campo effettivo percepito da questi sia inclinato di un
angolo pari a 54,7, angolo magico, rispetto all'asse z del campo magnetico statico
B
O
. Questo fa si che gli spins, invece di precedere attorno all'asse z di B
0
,
comincino a precedere attorno ad un'asse inclinato all'angolo magico esattamente
come si stesse ruotando il campione in un normale esperimento MAS. In altre
parole poich non possibile far ruotare il campione ad una velocit maggiore di
30-40 KHz , necessaria per mediare a zero linterazione dipolare omonucleare
1
H-
1
H, lidea quella di far ruotare gli spin protonici attorno ad un asse inclinato
allangolo magico. Come si vede in figura 11, la sequenza inizia con un impulso
(/2 +
m
) sul canale protonico (dove
m
e' il magic angle pulse cio un impulso
a 54.7 gradi) immediatamente seguito da due frequenze di impulso FSLG a fasi
invertite (-LG e +LG). Dopo il periodo di evoluzione t
1
, la magnetizzazione del
protone richiamata per mezzo di un singolo magic angle pulse
m
che far
ruotare tutte le componenti perpendicolari allimpulso della LG nel piano xy e
porter le componenti bloccate lungo l'impuso della FSLG sullasse z. A questo
punto viene applicata una sempilice Cross-Polarization necessaria per aumentare
la sensibilit del
13
C. Si procede, poi con lacquisizione del segnale di
questultimo durante il tempo di acquisizione t
2
disaccoppiando sul canale del
protone con una sequenza di impulsi chiamata TPPM. Poiche' in questo tipo di
esperimenti la comunicazione tra gli spin, il cos detto mixing, avviene durante
la cross-polarization, un parametro estremamente importante nella sequenza
FSLG-HETCOR il tempo di contatto (contact time) utilizzato durante la CP.
Infatti impostando tempi di contatto inferiori a 100 s solo le correlazioni
1
H-
13
C
forti [23, 24, 25] come quelle presenti in legami diretti C-H, possono essere
registrati negli spettri, mentre se gli esperimenti sono fatti con tempi di comtatto
pi lunghi (compresi tra 100 e 500 s) possono essere osservate le correlazione tra
atomi
1
H-
13
C maggiormente distanziati nello spazio [22, 24, 25]. In figura 12
riportato lo spettro 2D-FSLG-HETCOR per un campione di L-Tirosina [24], in
cui si riescono a vedere le forti correlazioni tra gli atomi di carbonio e i protni
direttamente legati. Inoltre possibile osservare sia le correlazioni intramolecolari
che quelle intermolecolari con i protoni distanti attraverso lo spazio, usando un
basso livello di intensit dei cross-peak.
60

Figura 12: Spettro 2D-FSLG-HETCOR di un campione di L-Tirosina registrato ad una velocit
di rotazione di 13 KHz.






















61
Bibliografia capitolo 2


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Groot, J. Am. Chem. Soc., 2000, 122, 3465.




















63
3.1 Introduzione
Il piracetam (2-oxo-1-pyrrolidineacetammide) un agente nootropico, ovvero
una sostanza che favorisce il metabolismo e la funzionalit neuronale, ed
comunemente commercializzato dalla ditta farmaceutica UCB Pharma con il
nome Nootropil. Tale farmaco usato per trattare condizioni di declino mentale
dovuto allet avanzata, nonch in caso di alcolismo acuto e cronico associato a
sintomi di delirio[1]. Esso agisce sulle cellule nervose determinando importanti
modificazioni metaboliche, soprattutto a livello dell'acido adenosintrifosforico
(ATP), i cui tassi di produzione e di utilizzo risultano considerevolmente
aumentati per azione di tale farmaco. Questo aumento porta ad un miglior
metabolismo cerebrale nel suo complesso (sintesi dei fosfolipidi, delle proteine,
ecc.) con conseguente miglioramento delle condizioni circolatorie e di
ossigenazione locali. In figura 1 riportata la struttura della molecola di
Piracetam.

Fig. 1: Struttura del Piracetam
Di questo composto sono stati individuati e caratterizzati, mediante diffrazione a
raggi X [2, 3], tre polimorfi e nominati come forma I, II e III. Le forme I e III
hanno una struttura monoclina, mentre la forma II triclina. Come si pu vedere
la molecola possiede gruppi CO e NH
2
, di conseguenza ha la possibilit di
formare diversi motivi di legame a idrogeno a seconda del tipo di polimorfo. Tutti
e tre le forme sono state studiate mediante analisi termochimiche e si visto che
sono in relazione enantiotropica tra loro [4, 5, 6]. La gerarchia di stabilit la tra le
varie forme stata studiata mettendo in relazione la pressione di vapore di
sublimazione con tecniche DSC e si giunti alla conclusione che a temperatura
64
ambiente lordine di stabilit II > III > I, mentre al di sopra di 399 K lordine di
stabilit I > II > III [6]. Tuttavia, questi risultati sono in disaccordo con i metodi
termomicroscopici e con le misure DSC, in quanto tali studi rivelano che a
temperatura ambiente la forma III decisamente pi stabile della la forma II [5]. Il
punto di fusione della forma I 426 K con un entalpia di fusione standard di 180
J/g. La fase II converte nella forma I a 399 K con unentalpia di transizione AH
III

di 24 J/g, mentre la fase III converte nella forma I a 392 K con un AH
IIII
di 28
J/g [6]. Utilizzando particolari tecniche di cristallizzazione possibile inoltre
ottenere altre due forme polimorfiche del piracetam. In particolare, lavorando ad
alte pressioni, si ottiene la forma IV o forma ad alta pressione (che non verr
discussa in questa tesi), mentre a temperatura ambiente, possibile ricavare la
forma monoidrata (solvato) detta forma V.

3.2 POLIMORFI del PIRACETAM
Qui di seguito verranno presentate le diverse forme del Piracetam in ordine di
stabilit a temperatura ambiente e descritti i diversi network di legame idrogeno.

3.2.1 Forma III
La forma III del piracetam si pu ottenere per cristallizzazione da una
soluzione diluita di metanolo effettuata a temperatura ambiente [7].


Fig. 2: Pattern di legame idrogeno presente nella forma III del Piracetam.

65
Analizzando le strutture a raggi X (figura 2), si osservano due tipi di legame
idrogeno intermolecolare: uno coinvolge latomo di ossigeno O(1) del carbonile
dellanello e latomo di idrogeno del gruppo NH
2
O(1)HN (ON 2.928 A),
mentre il secondo coinvolge latomo di ossigeno O(2) del carbonile del gruppo
amidico e uno degli idrogeni del medesimo gruppo di una molecola spazialmente
vicina, O(2) H---N (ON 2.894 A).
Per quanto riguarda invece la conformazione dellanello del pirrolidone,
presente una distorsione del ciclo, il quale risulta essere non planare, come si pu
chiaramente vedere in figura. 3.

Fig. 3: Distorsione dellanello del pirrolidone della molecola del Piracetam.

3.2.2 Forma II
La forma II ottenuta mediante lenta evaporazione di una soluzione diluita di
Piracetam da una miscela di isobutanolo-acqua 95-5 [7]. Il pattern di legami
idrogeno uguale a quello presente nella forma III, come si pu vedere in figura
4, ma cambiano le lunghezze del legame idrogeno.

Fig. 4: Pattern di legame idrogeno presente nella forma II del Piracetam.
66
Limpaccamento risulta meno compatto con distanze tra gli atomi pesanti di 2.963
A per linterazione O(1) H-N e di 2.942 A per il legame O(2) H-N. Anche in
questo caso lanello del pirrolidone, presenta una distorsione come nella forma III.

3.2.3 Forma I
La forma I del Piracetam ottenuta scaldando a 410 K per trenta minuti la
forma II o la forma III e successivamente raffreddata velocemente (20K/s)
mediante azoto liquido, tecnica comunemente chiamata quencing [8]. In questa
forma l architettura dei legami idrogeno decisamente differente rispetto alle due
forme precedentemente descritte, come evidenziato dalla figura 5.


Fig. 5: Pattern di legame idrogeno presente nella forma I del Piracetam.
In questo caso la lunghezza di legame tra O(1)H-N di 2.945 A, mentre per
linterazione O(2) H-N di 2.971 A. Nonostante le differenze anche in questo
caso lanello del pirrolidone, presenta una distorsione gi osservata nelle due
forme sopra citate.

3.2.4 Forma Idrata (Forma V)
Il Piracetam esiste, come detto in precedenza, anche in forma monoidrata o
forma V. Solitamente tale fase la si ottiene effettuando una cristallizzazione da
una soluzione acquosa diluita [7]. Dalla fase monoidrata possibile ottenere la
forma II per semplice deidratazione sotto vuoto a 293K completata da un
riscaldamento a 333K. Come si pu osservare in figura 6, il pattern di legame
idrogeno di questa forma differisce dalle precedenti: infatti le molecole dacqua
67
sono parte integrante dellimpaccamento in quanto partecipano attivamente ai
legami idrogeno. La struttura cristallina di tale fase caratterizzata da un network
di legame idrogeno bidimensionale non lineare ripetuto in maniera traslazionale,
ed ogni piano connesso per mezzo di interazioni di Van der Walls.


Fig. 6: Pattern di legame idrogeno presente nella forma IV (idrata) del Piracetam.
In questa particolare forma, ogni molecola di Piracetam pu dare cinque legami
idrogeno differenti, dove latomo di ossigeno O(2) agisce da doppio accettore.
Due dei cinque legami idrogeno O(2) H-N (con distanze di 2.957 e 2.887 ),
sono responsabili dellunico contatto diretto tra le molecole di piracetam,
formando un anello tra i due gruppi amidici, che d origine ad un dimero
centrosimmetrico, presente anche nelle forme III e II. Le rimanenti tre interazioni,
O(w)-HO(2) (2.774 ), O(w)-HO(1) (2.735 ), O(w)H-N (2.957 ) (dove
O(w) latomo di ossigeno dellacqua) sono coinvolte in contatti con molecole
dacqua dando origine ad ulteriori due distinti anelli.
In questo capitolo verranno descritti i metodi di cristallizzazione dei tre
polimorfi (I, II, III) e della forma idrata, e la loro completa caratterizzazione
mediante l NMR allo stato solido. Infatti la caratterizzazione delle varie forme
molto importante in quanto in funzione del polimorfo preso in considerazione
possono cambiare le propriet della molecola quali: fisiche, termodinamiche,
spettroscopiche, cinetiche, chimiche e di superficie. Inoltre dal punto di vista
industriale la completa conoscenza della forma cristallina fondamentale, perch
68
le caratteristiche finali di un determinato prodotto rispondano a ben determinati
standard. Inoltre verranno descritte le varie possibilit di interconversione tra una
forma e laltra usando tecniche di macinazione e kneding.

3.3 Risultati e discussione
Tutte e quattro le differenti forme del Piracetam sono state cristallizzate e
caratterizzate mediante diverse tecniche. In particolare lottenimento della forma
desiderata stato controllato confrontando lo spettro di diffrazione a raggi X di
polveri (XRPD) sperimentale con quello calcolato, come lesempio riportato in
figura 7, e mediante spettroscopia FTIR. Inseguito, la caratterizzazione vera e
propria, stata effettuata tramite esperimenti NMR allo stato solido.
10 20 30 40 50
Forma III calcolata
Forma III sperimentale
2 Theta

Fig. 7: Confronto tra la fase III calcolata (nero) e sperimentale(rossa) del piracetam
3.3.1 Ottenimento dei diversi polimorfi del Piracetam
Come mostrato in figura 7, dal confronto tra lo spettro di polveri calcolato
della fase III e lo spettro sperimentale del prodotto Sigma-Aldrich, si potuto
affermare che la fase commercializzata del Piracetam la fase III. La forma II si
ottenuta scaldando un campione di fase III a 393 K per trenta minuti e
raffreddandola velocemente utilizzando azoto liquido. Per quanto riguarda la
forma I del Piracetam, stata ottenuta portando un campione di forma III a 415 K
per 35 minuti e raffreddandolo rapidamente mediante azoto liquido. Infine la fase
69
Idrata si ottenuta per mezzo di una cristallizzazione da una soluzione acquosa
diluita di Piracetam. Gli spettri XRD di polveri ottenuti per tutte le forme del
Piracetam, sono riportati in figura 8.
10 20 30 40 50 60 70
FASE III
FASE Idrata
FASE II
FASE I
2 Theta

Fig 8: Spettri XRD di polveri delle diverse fasi del Piracetam.
3.3.2 Caratterizzazione Infrarossa (IR)
Sono inoltre stati registrati gli spettri IR di tutte e tre le forme anidre(I, II, III)
e di quella Idrata (V) in modo da poterli confrontare con quelli trovati in
letteratura ed avere unulteriore prova di aver ottenuto le fasi desiderate. Gli
spettri ottenuti sono riportati in figura 9.
3200 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400
Fase I
Fase II
Fase III
Cm-1
Fase Idrata

Fig. 9: Spettri IR delle diverse forme del Piracetam.
Le sezioni che meritano attenzione per distingure i quattro tipi di polimorfi sono
quelle tra 2900-3000 cm
-1
in cui cadono gli stretching alifatici dei gruppi CH,
70
quelle tra 1100-1250 cm
-1
in cui cadono i segnali assegnati alle vibrazioni
dellanello del pirrolidone e quelle tra 600-700 cm
-1
in cui sono presenti i bending
fuori dal piano del C=O del gruppo amidico primario. Inoltre, sono interessanti le
bande assegnate ai CO che cadono tra 1700 e 1600 cm
-1
, che presentano degli
shift differenti nelle quattro forme, dovuti alle diverse inteazioni legame idrogeno
in cui sono coinvolti i gruppi carbonilici nei polimorfi [9, 10, 11].

3.3.3 Caratterizzazione NMR allo Stato Solido
Le analisi NMR allo stato solido (NMRSS), sia
13
C che
15
N, sono state fatte
su tutti e quattro i polimorfi del Piracetam e gli spettri ottenuti sono riportati in
figura 10, mentre i chemical shifts con le rispettive assegnazioni sono riassunti in
tabella 1. Come si pu chiaramente vedere, per quanto riguarda gli spettri
13
C, si
possono distinguere in tutti e quattro gli spettri due gruppi di segnali, a basse
frequenze attribuibili ai diversi CH
2
e ad alte frequenze attribuibili ai due
carbonili. I tre CH
2
dellanello, C(2), C(3) e C(4) risuonano rispettivamente
intorno a 31, 18 e 44 ppm mentre il CH
2
della catena (C5) d origine ad un
segnale compreso tra 48-49 ppm. Il picco assegnato al C(1) cade in un range
compreso tra 176-179 ppm a seconda del tipo di interazione in cui coinvolto.
Mentre fra 171 e 173 ppm c il segnale attribuito al carbonio amidico.

Fig. 10: Spettri NMR CPMAS registrati ad una rotazione di 12KHz delle quattro forme del
Piracetam.
71


Fig. 11: Spettro NMR CPMAS registrato ad una rotazione di 12 KHz: in gradimento della zona
dei carbonili.









Tab 1: Assegnazioni NMR
13
C e
15
N delle quattro forme del Piracetam.
Dai dati sopra riportati, si pu vedere che gli spettri presentano delle differenze
utili a distinguere i vari polimorfi. Anche se in alcuni casi sono minime, esse
risultano comunque significative. Si pu, inoltre, osservare che gli shift maggiori
tra le diverse forme sono mostrati dai segnali dei carbonili (figura 10 e 11): questo
abbastanza ragionevole visto che essendo entrambi coinvolti in legami idrogeno
risentono maggiormente della variazione di forza o di network dellinterazioni fra
le varie forme.
In particolare nella forma III, nella zona dei carbonili, sono presenti due
segnali, uno a 179.0 ppm e laltro a 171.9 ppm per gli atomi C(1) e C(6) coinvolti
Forma I Forma II Forma III Forma IV
CO (C1) 176.2 177.7 179.0 178.2
CO (C6) 172.1 171.8 171.9 172.4
CH
2
(C5) 48.9 48.1 48.0 48.5
CH
2
(C4) 44.6 44.4 44.3 45.0
CH
2
(C2) 30.4 31.4 30.7 32.0
CH
2
(C3)

18.2 17.4 17.5 18.0

N (1) 94.6 94.4 96.2 94.8
N (2) 80.0 81.0 82.2 81.3
72
in legami idrogeno con il gruppo NH
2
di una molecola di Piracetam adiacente
(distanze O-N 2.945 e 2.971 ). Nella forma II questi segnali sono spostati a
177.7 ppm (C1) e a 171.8 ppm il (C6) in virt del fatto che il tipo di interazione in
cui sono coinvolti la stessa ma le distanze NO sono differenti (2.963 e 2.942
). Per latomo C1 si osserva, quindi, uno spostamento ad alte frequenze in
funzione della diminuzione della distanza tra gli atomi pesanti come gi osservato
in letteratura per altri tipi di molecole [12]. Per quanto riguarda il carbonio del
gruppo amidico primario C(6), linterpretazione dello shift pi complessa in
quanto questultimo influenzato anche dalla presenza e dalla forza di legami
idrogeno sul gruppo NH
2
direttamente legato ad esso. Poich sia nella forma II
che nella III le distanze di questi legami sono molto similili (2.963 e 2.942 per
la forma II e 2.971 e 2.945 per la forma III) si giustifica il piccolo e differente
shift passando dalla forma III alla forma II. Per quanto riguarda la forma I il
legame a idrogeno O(2)HN decisamente pi corto (2.894 ) che non nelle
altre forme, ma tuttavia il segnale del C(6) non particolarmente spostato ad alte
frequenze (172.1 ppm). Questo dovuto probabilmente ad un effetto
compensativo dovuto alla minore distanza ON dei legami a idrogeno
sullammina (2.928 e 2.894 ). Lo spostamento maggiore, nella forma I, si
osserva per il picco del C1 che cade a 176.2 ppm.

O(1)H
NH2
O(2)H
NH2
Chemical-shift
13
C (C1 C6)
Forma I 2.928 A 2.894 A 176.2 ppm 172.1 ppm
Forma II 2.963 A 2.942 A 177.7 ppm 171.8 ppm
Forma III 2.945 A 2.971 A 179.0 ppm 171.9 ppm
Forma IV 2.735 2.957 178.3 ppm 173.2 ppm

Tab. 2: Distanza legame idrogeno tra CO e gruppo NH
2
con relativi chemical shift 13C dei gruppi
carbonilici.
Come detto in precedenza i segnali relativi ai gruppi CH
2
non variano di molto e
le loro assegnazioni possono essere viste in tabella 1. Lunica variazione riguarda
il C(2) che nella forma I e III risuona a circa 30 ppm mentre nella I e nella V
risuona a circa 32 ppm. Questo pu essere attribuito alla differente influenza
dellimpaccamento cristallino nelle varie fasi.
73
Dallanalisi di questi dati si pu affermare che le differenze in chemical shift sono
principalmente dovute a due motivi: a) al network ed dalla forza dei legami a
idrogeno; b) allarrangiamento cristallino. Il primo riguarda principalmente i
gruppi direttamente coinvolti nelle interazioni mentre il secondo ha uninfluenza
minore, ma agisce su tutta la molecola. E importante notare che, bench le
variazioni della distanza del legame idrogeno, che coinvolge i due carbonili delle
differenti forme anidre siano minime, cos non dal punto di vista NMR dove la
presenza di shift nei segnali assegnati a i gruppi CO sono abbastanza distinguibili
e ci permettono unanalisi approfondita del diverso network di legame idrogeno
tra una forma e laltra. Questo dimostra ulteriormente che il chemical shift
decisamente influenzato dalla presenza o meno di un legame idrogeno sullatomo
in osservazione, sebbene il
13
C non sia direttamente coinvolto in tali interazioni.
Un discorso a parte riguarda la forma idrata, in quanto l architettura delle
interazione include molecole dacqua. I carbonili cadono a 178.2 ppm e 172.4
ppm rispettivamente assegnati al C(1) e C(6). Bisogna tenere presente che il
carbonile C(1) forma un legame idrogeno con molecole dacqua, mentre il C(2)
forma due legami idrogeno uno con una molecola di acqua ed uno con il gruppo
NH
2
. Come si pu notare i segnali in questa forma sono decisamente pi spostati
rispetto a quelle anidre e questo pu essere sicuramente attribuito alla presenza
delle molecole dacqua allinterno del reticolo cristallino, ma soprattutto al
diverso pattern di legami idrogeno presente in questo polimorfo.
Per quanto riguarda gli spettri
15
N, riportati in figura 12, in tutte e quattro le
forme si possono identificare due differenti segnali attribuiti allazoto
appartenente allanello N(1) che risuonano tra 94-96 ppm e quello del gruppo
amidico N(2) che risuonano in un range tra 80-82 ppm. Perci che concerne la
forma III lN(1) cade a 94.6 ppm, mentre lN(2) cade a 80 ppm; per la forma II
N(1) cade a 94.4 ppm e N(2) a 81.0 ppm e nella forma I lN(1) cade a 96.2 ppm
mentre lN(2) a 82.2 ppm. Bisogna far presente che lazoto del gruppo amidico
porta idrogeni che sono direttamente coinvolti in legame idrogeno con i carbonili
e in particolare, se si analizzano le distanze di queste interazioni, si pu notare che
passando progressivamente dalla forma I alla III le distanze aumentano, con
conseguente spostamento verso alte frequenze dei relativi segnali NMR. Per
74
quanto riguarda lN(1), esso non legato a protoni coinvolti in legami idrogeno,
come nel caso precedente, ma direttamente legato ad un carbonile (il C(2)), il
quale viene coinvolto mediante latomo di ossigeno O(1) in legami idrogeno. Se si
osservano le distanze dei legami idrogeno di questultimo nelle tre forme anidre,
si vede che aumenta passando dalla forma I alla III. Di conseguenza, anche in
questo caso, allaumentare della distanza del legame idrogeno che coinvolge il
carbonile adiacente allN(1), i chemical shift di questultimo si spostano verso alte
frequenze. Per quanto riguarda la forma idrata, lN(2) cade a 81.3 ppm ed
coinvolto in legami idrogeno con molecole dacqua e con lO(2) carbonilico di
unaltra molecola, mentre lN(1) cade a 94.8 ppm.



Fig 12 : Spettri CPMAS
15
N registrati ad una velocit di rotazione di 8 KHz, per le diverse forme
del Piracetam.

4.1 Conversioni meccano-chimiche
Limportanza della stabilit di una forma di un farmaco durante il processo di
produzione gi stata sottolineata nellintroduzione alla tesi. Le industrie oltre a
conoscere esattamente la natura dei materiali ottenuti durante il processo
produttivo, devono venire a conoscenza della stabilit dei prodotti nel tempo ed
75
apprendere le diverse propriet chimico-fisiche, causate dalle differenti forme
cristalline. Per questo importante monitorare tutto il ciclo produttivo di un
determinato prodotto fino allo stoccaggio e alla sua introduzione in commercio.
A questo scopo pu essere utile uno studio di come le varie forme, di un
determinato composto, sono in grado di reagire quando sottoposte a forze esterne
che ne possono simulare il ciclo produttivo, per esempio nel caso di elevate
pressioni per ottenerne una forma commerciale in pastiglia piuttosto che
particolari forze a cui sono sottoposti i prodotti durate lo stoccaggio. In
particolare, per simulare tali forze si possono sottoporre le varie forme, a
macinazione e valutare come esse reagiscono. La macinazione pu essere
effettuata con mortaio e pestello o nel caso si voglia una macinazione decisamente
pi energetica si fa uso del mulino a palle. E risaputo che lenergia fornita da
tecniche di macinazione pu indurre a trasformazioni allo stato solido che
possono portare da fasi cristalline a fasi amorfe [13] o viceversa [14], nonch alla
conversione tra diversi polimorfi. La metodologia che presentiamo anche una
possibilit per ottenere specifiche trasformazioni polimorfiche, ed interessante
sia dal punto di vista del high-throughput, monitoraggio di polimorfi, sia come
una strada alternativa per ottenere le diverse forme di un composto evitando di
ricorrere a tecniche di cristallizzazione, aprendo prospettive nellambito della
chimica verde o sostenibile (green chemistry). La "Green Chemistry"
rappresenta un nuovo modo di concepire la chimica per renderla ecosostenibile.
Infatti con le tecniche meccano-chimiche vengono superati tutti i problemi legati
al recupero, lo smaltimento e lo stoccaggio dei solventi.
La macinazione pu essere effettuata a secco oppure utilizzando alcune gocce
di solvente in quantit catalitica, tecnica denominata Kneading, in grado di
attivare la conversione. Infatti recentemente si visto che, con questultima
tecnica, si aumenta la cinetica delle cocristallizzazioni [15] e si riesce ad
indirizzare la cristallizzazione di un composto verso uno specifico polimorfo [16].
Qui di seguito, in tabella 3, sono riportati i risultati di tutte le prove di conversione
meccanochimiche, a secco e con tecniche di kneading, sulle quattro forme del
piracetam.

76
FASE CONVERSIONE
FASE I + EtOH FASE II
FASE I + CH3OH Parzialmente FASE II
FASE I + H2O FASE idrata
FASE II a secco (2 h.) FASE III
FASE II + H2O FASE idrata
FASE II macinata 20 minuti Parzialmente FASE III
FASE III macinata a mano FASE III
FASE III + EtOH FASE III
FASE III + Isobutanolo FASE III
FASE III + Acetone (18 h.) FASE III
FASE III macinata a mano in CH2Cl2 FASE III
FASE III + H
2
O FASE Idrata
FASE Idrata (da fase I) FASE III
FASE Idrata (da fase II) FASE III

Tab. 3 : Conversioni meccanochimiche tra fasi differenti del Piracetam per mezzo di tecniche di
macinazione.
Come si pu notare, dopo aver effettuato le macinazioni riportate in tabella 3, la
maggior parte eseguite con tecniche di Kneading si sono verificate diverse
transizioni di fase. In particolare la forma I con gocce di EtOH in grado di
convertire in forma II, mentre con gocce di MeOH la conversione non completa
neanche dopo lunghe macinazioni. Usando gocce di H
2
O invece possibile
ottenere la forma Idrata. La forma II in grado di trasformarsi in forma III per
semplice macinazione di circa 2 ore al mulino a palle e non necessita la presenza
di particolari solventi, ma se questultima effettuata per un tempo ridotto (20
min.), la conversione non totale come si pu ben osservare in figura 13, dove
sono riportati gli spettri XRPD di monitoraggio del ciclo di macinazione. Per
quanto riguarda la forma III, n la macinazione con gocce di solvente a differente
polarit ne tantomeno la semplice macinazione in grado di farla convertire in
una delle altre fasi, tranne effettuando la macinazione con gocce di acqua che in
grado di far avvenire la transizione da fase III alla fase Idrata. Questultima
ottenuta macinando la fase I II e III con gocce di acqua e per ulteriore
macinazione di essa si ottiene in tutti e tre i casi la fase III.
77

Fig. 13 : Monitoraggi per via XRD di polveri della conversione della fase II a fase tre; a) Fase II;
b) Fase II macinata per 20 min; c)Fase II macinata due ore; d) fase III calcolata.
Facendo riferimento allordine di stabilit termodinamica, a temperatura
ambiente, riportato nellintroduzione di questo capitolo: III>II>I, si possono
giustificare i risultati ottenuti nella seguente maniera. Essendo la forma III la fase
termodinamicamente pi stabile, non riesce ad essere convertita in altre forme
tranne che nella forma idrata usando alcune gocce di acqua durante la
macinazione. Per quanto riguarda le altre fasi tutte le conversioni seguono lordine
di stabilit termodinamiche ovvero convertono sempre verso la forma pi stabile,
infatti la forma I si trasforma nella forma II oltre a quella idrata e la forma II in
forma III oltre quella idrata. Tutte le possibili conversioni meccano sono riportate
nello schema riportato in figura 14.

Fig 14: Schema riassuntivo delle conversioni meccanochimiche possibili: 1)Kneading con gocce
di acqua; 2)Macinazione per 2 h al mulino a palle; 3)Kneding con gocce di CH
3
OH.; 4)393 K per
30 min. ,5)ulterirore macinazione della fase idrata ottenuta dalla fase III; 6) 415 K per 35 min
78
Dallanalisi degli spettri NMR allo stato solido si pu stabilire che, in funzione del
tipo di polimorfo preso in esame, ci sono dei caratteristici spostamenti dei segnali,
sia
13
C che
15
N dipendenti dal diverso network di legame idrogeno in cui sono
coinvolte le molecole delle quattro forme. Effettuando prove meccano-chimiche,
si visto che sono possibili transizioni di fase, ma in ogni caso la forma pi
stabile (forma III) non riesce a convertire in nessuna delle forme anidre, ma
solamente nella forma idrata in seguito ad un ciclo di macinazione usando
tecniche di kneading con gocce dacqua. Sono invece possibili transizioni di fase:
III, IIII e IIIII. Tutte le forme anidre per macinazioni con gocce di acqua
convertono nella fase idrata e questultima per macinazione a secco converte nella
forma III.

5.1 Parte Sperimentale
Il piracetam stato acquistato dalla Sigma-Aldrich e usato senza ulteriori
purificazioni. Tramite spettro di polveri del reagente da barattolo si accertata la
presenza della forma III.
Per quanto riguarda la Difrazione a Raggi X di Polveri stato utilizzato un
difrattometro di polveri Bragg-Brentano con una sorgente a raggi X generata da
un anticatodo di Cobalto (Co) (k
u
=0.17902 nm) con una tensione dello strumento
tarata a 40 kV e una la corrente di 20 mA.
Per le analisi di spettroscopia infrarossa si utilizzato uno spettrofotometro a
trasformata di Fourier Nicolet 5700 (Thermo Electron Corporation) tramite
Attenuated Total Reflection (ATR).
Per le analisi NMR si usato uno strumento Bruker Advance II 400 MHz
Ultra-shield equipaggiato con un probe da 4mm operante a 400.23 MHz per
1
H,
100.63 MHz per il
13
C e 40.56 MHz per
15
N. Un esperimento standard di cross-
polarizzation con rampa durante il contact time per ottimizzare le condizioni di
Hartmann-Hahn ad alte velocit di rotazione del rotore stato utilizzato per
acquisire gli spettri. Generalmente contact time di 3.5 ms (
13
C) e 5.0 ms (
15
N)
sono stati usati con tempi di ripetizione da 5-60 s per un numero di scansioni di
32-64 per gli spettri
13
C e 3000-4000 per gli spettri
15
N. Tutti i campioni sono stati
impaccati in rotori di zirconia del diametro di 4 mm con un volume di circa 80 l
79
e fatti ruotare ad una velocit di 12 kHz. Il riferimento per la scala dei chemical
shift del
13
C stato fatto posizionando il segnale metilenico della glicina (usato
come standard esterno) a 43.86 ppm mentre per la scala del
15
N stata utilizzata la
risonanza del (NH
4
)
2
SO
4
(355.8 ppm rispetto alCH
3
NO
2
).




























80
Bibliografia capitolo 3

1. P. Francesca, A. Gabbiani, R. David, S. Parsone, R. Colin,
CrystEngComm, 2005, 7(29), 179.
2. G. Admiraal, J. C. Eikelenboom, A. Vos, Acta Crystallogr.Sect. B, 1982,
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16. A. V. Trask, W. D. S. Motherwell, W. Jones, Chem. Commun., 2004, 890.








81
4.1 Introduzione
La didanosina un nucleoside anologo alladenosina, che previene la
replicazione del virus HIV (human immunodeficiency Virus) inibidendone la
trascrizione inversa. Fa parte di una combinazione di farmaci usati in terapie che
hanno unalta attivit antiretrovirale. Essa somministrata in dosi limitate e
specialmente in pazienti ziduvodine-resistenti [1, 2, 3].
Di tale farmaco non si conosce lesistenza di forme polimorfiche derivate da
cristallizzazioni di soluzioni in diversi solventi. Quindi si usata la tecnica della
cristallizzazione in CO
2
supercritica per valutare se con questa nuova metodologia
sia possibile ottenerne di nuove. In questo capitolo verranno prese in
considerazione le varie forme della Didanosina ottenute per cristallizzazione in
CO
2
supercritica a diverse pressioni, inoltre verranno caratterizzate mediante
tecniche NMR allo stato solido. In figura 1 riportata la formula di struttura della
Didnosina.


FIG. 1: Struttura della Didanosina

4.2 Ottenimento dei Campioni: Precipitazione di particelle di didanosina in
CO
2
supercritica mediante il processo Supercritical AntiSolvent (SAS).
Per la precipitazione di particelle di didanosina mediante SAS stato
utilizzato lo strumento schematizzato in Figura 1:
82


Fig. 1. Schema dello strumento usato per analisi SAS. 1 contenitore di CO
2
; 2 pompa a
membrana; 3 criostato; 4 valvola di entrata; 5 valvola a tre vie; 6 colonna; 7 linea di lavaggio; 8
camera termostatata; 9 termostato; 10 valvola di uscita; 11 vessel di raccolta del solvente; 12
soluzione di didanosina; 13 pompa HPLC; 14 metanolo; 15 pompa HPLC.

La CO
2
(grado 99,9%, Sapio, Piacenza) contenuta in una bombola in forma
liquida a una pressione di circa 50bar. Per mezzo di una pompa a membrana
Speed SFE viene pompata allinterno di una cella di precipitazione posizionata in
una camera termostatata. Un criostato permette di mantenere la testata della
pompa alla temperatura di 3,2C, al fine di mantenere liquida la CO
2
pompata ed
evitare fenomeni di cavitazione. La cella di precipitazione costituita da una
colonna di 200mm di lunghezza e 14mm di diametro con un volume di 32cm
3
,
svuotata e posizionata in senso verticale con allinterno un filtro in vetro
sinterizzato sulluscita inferiore. In cima alla colonna, ovvero sullentrata
superiore, inserita una valvola a tre vie che permette un pre-mescolamento della
CO
2
supercritica con una soluzione di didanosina in dimetilsolfossido (100mg/ml)
prima dellentrata in colonna; tale soluzione pompata da una pompa per HPLC
Pharmacia LKB-2248 ad un flusso di 0.01ml/min. Il circuito si completa con un
manometro per il controllo della pressione in uscita, una valvola di espansione
micrometrica, un vessel di raccolta del solvente condensato, un flussimetro a sfera
83
(Air Products) posto a valle del vessel e un contatore per il gas posto alluscita del
flussimetro. La valvola di espansione micrometrica mantenuta a una
temperatura di 85C in modo da evitare che essa si blocchi a causa della
precipitazione di eventuale soluto disciolto in CO
2
supercritica proveniente dalla
colonna. La valvola permette di regolare manualmente il flusso di uscita di CO
2

che viene mantenuto su circa 0.03 moli di CO
2
al minuto. Lesecuzione di un
tipico esperimento prevede lottenimento della temperatura desiderata sia nella
camera termostatata che nella valvola di espansione micrometrica. In seguito si fa
fluire la CO
2
supercritica allinterno della colonna facendo equilibrare il sistema
per qualche minuto, dopodich la pressione viene portata al valore desiderato. A
questo punto si apre la valvola di espansione micrometrica in uscita e si aziona la
pompa per HPLC che manda la soluzione di didanosina in DMSO alla valvola a
tre vie. Il vessel di raccolta in uscita refrigerato con un bagno di ghiaccio-NaCl
al fine di provocare la condensazione del DMSO in uscita. Le condizioni
operative adottate prevedono una temperatura della camera termostatata di 45C,
di 85C per la valvola di espansione micrometrica e pressioni di 100, 150, 200
bar. Un lavaggio finale per circa 2 ore a un flusso di 150 ml/min con sola CO
2

supercritica delle particelle precipitate assicura la rimozione di tutto il solvente e
previene la condensazione durante la depressurizzazione.

4.3 Caratterizzazione NMR alo Stato Solido
Tutti e quattro i campioni di didanosina sono stati registrati gli spettri
13
C
CPMAS e CPPISPI per la determinazione della molteplicit degli atomi di
carbonio e gli spettri
15
N CPMAS. La numerazione degli atomi segue quella
presentata in figura 1. Lo spettro
13
C CPMAS mostrato in figura 2, mentre tutti i
chemical shift con le assegnazioni sono riportati in tabella 1.

84

FIG. 1: Spettri
13
C CPMAS dei diversi composti ottenuti in CO
2
supercritica.
Per quanto riguarda la didanosina tal quale, (TQ), quasi tutti gli atomi di carbonio
presenti nella molecola danno origine a due picchi. Questo indica la presenza di
due molecole indipendenti nellunit di cella asimmetrica. Pi difficilmente pu
essere causato da un equilibrio cheto-enolico in quanto questo influenzerebbe
principalmente i segnali degli atomi di carbonio C6, C2, C4 e C5 lasciando
praticamente invariati gli altri, cosa, per, non riscontrata. Inoltre i segnali sono
molto stretti (circa 70-80 Hz) indice di unalta cristallinit del campione.
Lassegnazione dei segnali stata fatta combinando le informazioni del chemical
shift con il segno dei segnali osservati nellesperimento di spectral editing
riportato in figura 3 (atomi di carbonio quaternari e metili positivi, CH nulli e CH
2

negativi). Il segnale del C=O, C6, cade a circa 156.9 ppm. Gli atomi di carbonio
quaternari degli anelli condensati danno origine rispettivamente a due segnali a
147.8 e 145.5 ppm per il C4 e a due segnali a 123.8 e a 122.0 ppm per il C5. Gli
atomi di carbonio C2 e C8 legati a due atomi di azoto danno origine
rispettivamente a una risonanza di intensit doppia a 149.3 ppm (C2) e a due
risonanze a 138.5 e 136.0 ppm (C8). Gli atomi C1 e C4 risuonano
rispettivamente a 85.3 e a 84.7 entrambi di intensit doppia, mentre i C2 ed i C3
generano ciascuno due segnali, a 33.9 e 30.9 ppm (C2) e a 26.5 e 23.7 ppm
(C3). Infine il C5 d un solo picco di doppia intensit a 61.7 ppm.
85

FIG. 2: Spettri
13
C Spectral editino del campine tal quale di didanosina.I segnali asteriscati
corrispondono ai gruppi CH.

Lo spettro
15
N CPMAS (figura 3) caratterizzato da 7 segnali per quattro tipi di
azoto presenti nella molecola. Fra 145 e 165 ppm cadono gli atomi di azoto N(1) e
N(9), a circa 183 ppm ci sono i segnali del atomo N(3), mentre lazoto N(7) d
origine ad un solo segnale a circa 211 ppm.

FIG. 3: Spettri
15
N CPMAS dei diversi composti ottenuti in CO
2
supercritica.
86
Gli spettri dei composti ottenuti a 100, 150 e 200 bar sono perfettamente
sovrapponibili quindi per comodit verr discritto solamente quello ottenuto a 200
bar. Lo spettro
13
C CPMAS molto simile a quello della didanosina TQ. Tuttavia
alcune piccole ma nette differenze confermano la cristallizzazione in una forma
diversa da quella conosciuta. Lentit delle disuguaglianze fa pensare alla
possibilit di aver ottenuto un polimorfo conformazionale in cui varia langolo
diedro C(4)-N(9)-C(1)-O cio si ha una leggera rotazione attorno allasse
formato dal legame N(9)-C(1). La principale differenza riguarda i segnali degli
atomi C(3): infatti in questo composto danno origine a due segnali a 25.6 e a 24.4
ppm molto meno separati rispetto al composto TQ. Le altre differenze riguardano
le risonanze del C(8) che sono shiftate a frequenze minori di circa 1.2 e 0.7 ppm,
il segnale del C(1) che in questo caso si sdoppia dando origine a due picchi a
85.0 (sovrapposto al segnale del C(4)) ed a 83.9 ppm ed, in fine, alla risonanza
del C(2) che shifta leggermente a frequenze minori andando a sovrapporsi al
segnale del C(4) (148.3 ppm).Gli altri segnali spettro non presentano differenze
rispetto al composto TQ, valgono quindi i commenti gi fatti precedentemente.
Nel caso degli spettri
15
N tutti i picchi presentano degli shift di circa 0.2-0.5
ppm rispetto al tal quale. Le differenze pi significative riguardano latomo di
azoto N(1) il cui segnale a 152.8 shifta a 153.6 e si allarga (da 48 a 57 Hz) e
latomo N(7) il cui segnale si assottiglia (da 100 a 40 Hz). In entrambi i casi la
causa della variazione della larghezza del segnale pu essere un diverso tipo o una
diversa forza delle interazioni deboli che li coinvolgono.

Atomo note TQ 100 150 200
C(6)

C(2)
C(4)

C(8)

C(5)

C(4)
C(1)

C(5)
C=O

(H)NC(H)N
C(q)

(R)NC(H)N

C(q)

CH

CH
2
OH
CH
2

156.9
155.4
149.3 (2)
147.8
145.5
138.5
136.0
123.8
122.0
85.3 (2)
84.7 (2)
61.7 (2)
33.9
156.6
155.2
148.3 (2)
148.3
145.5
137.3
135.3
123.7
121.9
85.0 (3)
83.9
61.7 (2)
33.2
156.6
155.2
148.3 (2)
148.3
145.5
137.3
135.3
123.7
121.9
85.0 (3)
83.9
61.7 (2)
33.2
156.6
155.2
148.3 (2)
148.3
145.5
137.3
135.3
123.7
121.9
85.0 (3)
83.9
61.7 (2)
33.2
87
C(2)

C(3)


CH
2

30.9
26.5
23.7
30.2
25.6
24.4
30.2
25.6
24.4
30.2
25.6
24.4

N(1)
N(1)
N(3)
N(3)
N(7)
N(9)
N(9)
NH
NH
N(q)
N(q)
N(q)
N(q)
N(q)
152.8
146.3
186.7
178.9
211.3 (2)
159.5
156.6
153.6
146.0
186.9
179.5
211.1 (2)
159.7
156.4
153.6
146.0
186.9
179.5
211.1 (2)
159.7
156.4
153.6
146.0
186.9
179.5
211.1 (2)
159.7
156.4

Tab 1: Assegnazioni
13
C e
15
N dei composti tal quale (TQ), cristallizzato a 100 bar(100),
cristallizzato a 150 bar (150) e cristallizzato a 200 bar (200). I valori tra parentesi sono relativi ai
valori degli integrali.

Dallanalisi dei risultati ottenuti si potuto accertare che per mezzo di
tecniche di cristallizzazione in CO
2
supercritica possibile ottenere una nuova
forma della Didanosina. Molto probabilmente si tratta di un nuovo polimorfo
conformazionale dovuto alla variazione dellangolo diedro C(4)-N(9)-C(1)-O,
ovvero una leggera rotazione attorno allasse formato dal legame N(9)-C1.
Questo provoca una variazione dellintorno chimico di alcuni atomi che giustifica
lo spostamento dei loro segnali verso alte o basse frequenze. Aver trovato una
nuova forma della Didanosina potrebbe avere ripercussioni importanti in campo
farmaceutico soprattutto se questa nuova forma risultasse avere propriet migliori
di quella attualmente usata in terapia.

4.4 Parte sperimentale
I campioni sono stati forniti dal gruppo di ricerca del Prof. Bettini,
Dipartimento di Farmacia, Universit di Parma.





88
Bibliografia capitolo 4
1. L.S. Velasque, R.C.E. Estrela, G. Suarez-Kurtz, C.J. Struchiner, Braz J
Med Biol Res, 2007, 1, 40.
2. R. Ferraresia, L. Troianoa, E. Roata, E. Nemesi, E. Luglia, M. Nasia, M.
Pinta, M. Calvanib, M. Iannuccellib, A. Cossarizzaa, FEBS Letters, 2006,
580, 6612.




















89
5.1 Introduzione
L'acido barbiturico un derivato della pirimidina, si ottiene per reazione
dell'urea con l'acido malonico ed il capostipite della classe di farmaci
denominati barbiturici. A temperatura ambiente si presenta come un solido bianco
ed inodore. In passato alcuni suoi derivati erano usati nella pratica clinica in modo
massiccio: il veronal (acido dietilbarbiturico) come sedativo e il pentothal (acido
metilpentilbarbiturico) come farmaco ipnotico. Data la dipendenza che questi
farmaci possono causare e relativa pericolosit che presentano, sono stati sostituiti
dalle benzodiazepine. Oggi continuano ad essere prescritti come antiepilettici e
per il trattamento traumi cranici, inoltre sono utilizzati anche in campo anestetico.
In figura 1 riportata la struttura dellacido barbiturico.

Fig. 1: Struttura dellacido barbiturico.

5.2 Polimorfi dellAcido Barbiturico
Dellacido barbiturico sono stati individuati due differenti polimorfi, forma I
e II e una terza forma diidrata (solvato), in cui allinterno del reticolo cristallino
possono essere individuate due molecole di acqua. Questultima si ottiene
cristallizzando un campione di acido barbiturico commerciale da una soluzione
acquosa a varie concentrazioni. La fase II si pu ottenere per cristallizzazione da
soluzioni diluite di diversi solventi quali metanolo, acetonitrile e acetone, mentre
la forma I si ottiene per mezzo di lenta cristallizzazione da una soluzione di
etanolo in ambiente sigillato e mantenuta a 0C per diverse settimane[1,2].
La molecola di acido barbiturico possiede gruppi CO ed N-H, i quali sono
potenziali gruppi accettori e donatori di legame idrogeno. Le tre forme, sono
90
caratterizzate da network di legame idrogeno che presentano sostanziali
differenze. In particolare, la forma I consiste in infiniti nastri formati da coppie di
molecole di acido barbiturico unite da due legami idrogeno O(1)H-N(1) di 2.880
, disposte a formare un motivo a lisca di pesce, come mostrato in figura 2. Le
catene sono generate dallinterazione tra il gruppo NH ed il gruppo carbonile di
due distinte molecole, i quali danno origine al contatto N(3)-HO(3) di 2.856 .
Unulteriore interazione di 3.029 tra i gruppi N(1)-H ed il C=O(2) di un altro
nastro unisce i piani a formare un motivo a lisca di pesce.

Fig. 2: Network di legame idrogeno della forma I dellacido barbiturico.
La forma II presenta due molecole indipendenti, A e B, nellunit di cella
asimmetrica. Esse si differenziano solo per la conformazione del CH
2
: in un caso
giacente sullo stesso piano della molecola (molecola A) nellaltro fuori dal piano (
molecola B). Le interazioni di legame idrogeno generano dei piani costituiti da
catene di molecole di acido barbiturico, in cui questultime sono ruotate rispetto
allasse perpendicolare al piano in maniera tale che i gruppi CH
2
risultano in
posizione alternata (figura 3a). Il network di legami a idrogeno formato da
interazioni N(1)
A
-HO(3)
B
e N(3)
B
-HO(2)
A
rispettivamente di 2.833 e di 2.853
91
, da legami idrogeno N(3)
A
-HO(2)
A
e O(3)
A
H-N(1)
A
entrambi di 2.868 e
da contatti O(2)
B
H-N(3)
B
e N(1)
B
-H O(3)
B
entrambi di 2.807 .


Fig. 3: Network di legame idrogeno della forma II dellacido barbiturico.

Per quanto riguarda la forma idrata, figura 4, le molecole dellacido barbiturico
formano delle catene sfruttando due legami idrogeno O(3)H-N(1) e O(2)H-
N(3), entrambi con una distanza di 2.819 ; inoltre le catene hanno i gruppi CH
2

disposti in maniera alternata come descritto per la forma II. Per ogni molecola i
gruppi non coinvolti nei legami delle catene formano interazioni con lossigeno
delle molecole dacqua (O(w)). In particolare il gruppo NH forma un legame
O(w)H-N di 2.729 , mentre il carbonile forma un legame OH-O(w) di 2.781
. Il carbonile in posizione 4 o 6 pu invece formare due diversi legami idrogeno
con altrettante molecole dacqua, OH-O(w)
y
e OH-O(w)
x
( dove X e Y sono le
due molecole dacqua) con una distanza di 2.802 e 2.861 .
92

Fig. 4: Network di legame idrogeno della forma idrata dellacido barbiturico.


5.3 Risultati e discussione
In laboratorio sono state cristallizzate la forma II e quella idrata da soluzioni
di vari solventi. In seguito, sulla forma II e su derivati dellacido barbiturico quali:
Acido 1,3-dimetilbarbiturico, Acido 5,5-dimetilbarbiturico e Acido 5-
metilbarbiturico si sono analizzati i possibili equilibri tautomerici attivati da cicli
di macinazione. Le due forme sono state controllate per mezzo di diffrazione a
raggi X di polveri nello stesso modo in cui stato descritto nel capitolo 3 per la
molecola di Piracetam. Si , poi, proceduto alla caratterizzazione vera e propria,
per mezzo di tecniche NMR allo stato solido.

5.3.2 Ottenimento dei polimorfi dellacido barbiturico
Da uno spettro XRD di polveri dellacido barbiturico commerciale, usato
senza ulteriori purificazioni, si accertata la cristallizzazione nella forma II, come
si pu vedere in figura 5 dove sono riportati lo spettro della forma II calcolato e
quello del composto commercializzato. La stessa forma si pu ottenere da
93
cristallizzazioni di soluzioni diluite in acetone e acetonitrile a temperatura
ambiente.

Fig. 5: Confronto spettri XRD di polveri della forma II calcolata e quella commerciale
La forma idrata, stata ottenuta per mezzo di cristallizzazione da soluzione
acquose a diverse concentrazioni e scaldando leggermente[3].

5.3.3 Caratterizzazione NMR allo Stato Solido
Le analisi NMR allo stato solido, sia
13
C che
15
N, sono state fatte su tutte le
forme dellacido barbiturico ottenute in laboratorio e gli spettri ottenuti sono
riportati in figura 6 e 7, mentre i chemical shifts con le rispettive assegnazioni
sono riassunti in tabella 1 e 2.


Fig. 6: Spettri
13
C della fase II e Idrata dellacido barbiturico.

94
Forma II
13
C
C(4), C(6) 171.6, 170.4(sp)
C(2) 151.9
C(5) 41.1, 39.09


Tab. 1: Assegnazione 13C per la forma II e diidrata dellacido barbiturico. Sp=spalla
Dagli spettri
13
C CPMAS si possono distinguere due zone: una compresa tra i 150
e 170 ppm in cui cadono i segnali assegnati ai carbonili presenti nella molecola e
una intorno ai 40 ppm dove risuona il CH
2
. Come si pu vedere dagli spettri
riportati, in funzione del polimorfo considerato, sono presenti significativi
spostamenti dei segnali, soprattutto per quanto riguarda i carbonili. Nella forma II,
il segnale del CH
2
, si presenta sdoppiato con chemical shift di 39.1 e 41.1 ppm e
questo riconducibile al fatto che sono presenti due molecole nellunit di cella,
che danno origine a due differenti segnali in conseguenza al diverso intorno
magnetico. Il segnale del carbonile C(2), che non coinvolto in nessun tipo di
legame idrogeno, cade a 151.9 ppm. Il C(4) e il C(6), invece, cadono a 171.6 ppm,
mentre la spalla a 170.4 ppm attribuita ai gruppi coinvolti nei legami idrogeno
pi corti, ovvero, O(2)
B
H-N(3)
B
e N(1)
B
-H O(3)
B
(2.807 ). La forma idrata, a
differenza della forma II, presenta un unico segnale a 39.1 ppm attribuito al CH
2
e
questo dovuto al fatto che in questo caso, nella cella elementare presente
ununica molecola. Per quanto riguarda la zona dei carbonili, a 153.0 ppm cade il
segnale del C(2) che a differenza della forma II coinvolto in un legame idrogeno
con una molecola dacqua. Questo giustifica lo shift ad alte frequenze di 2 ppm
rispetto alla forma anidra. Per quanto concerne il C(6) ed il C(4), essi cadono a
171.5 e 172.2 ppm il primo riferito alle interazioni OH-O(w), mentre il
secondo alle interazioni O(3)H-N(1) e O(2)H-N(3) (2.819 ).
Gli spettri
15
N sono riportati in figura 7. La forma II presenta un unico
segnale a 126.5 ppm, in accordo con lalta simmetria del network di legami e del
fatto che la forza delle interazioni in cui sono coinvolti simile, nonostante le
distanze di legame siano leggermente differenti (2.868 e 2.833 ).
Forma Idrata
13
C
C(4) 172.2
C(6) 171.5
C(2) 153.0
C(5) 39.2
95
Per la forma idrata sono presenti due diversi segnali a 126.9 e 129.8 ppm per i due
tipi di interazioni che coinvolgono gli atomi di azoto: il legame N(3)-HO(2) e
quello con lossigeno di una molecola dacqua N(1)-HO(w), le cui distanze sono
rispettivamente di 2.819 e 2.729 . Poich le distanze sono molto diverse anche le
forze delle due interazioni saranno molto differenti (con il contatto N(1)-HO(w)
pi forte dellaltro) e questo giustifica lo shift di circa 2 ppm tra i due segnali.

Fig.7 Spettri
15
N della fase II e Idrata dellacido barbiturico
.
Forma II Forma idrata
N(1),N(2) 126.5 129.8, 126.9

Tab. 2: Assegnazione
15
N per la forma II e idrata dellacido barbiturico.

5.4 Equilibri tautomerici
La forma II dellacido barbiturico stata sottoposta a macinazione per vedere
se, come nel caso del Piracetam, si verificano conversioni meccano-chimiche tra
una fase e laltra. Macinandola a secco per circa due ore , utilizzando il mulino a
palle, e monitorando tale processo per mezzo di spettri
13
C CPMAS NMR, si
inizia a vedere la graduale scomparsa dei picchi dellacido barbiturico e la
comparsa di nuovi segnali a chemical shift differenti. Continuando nel processo di
macinazione questa conversione assume sempre pi importanza e dopo circa 20
ore di macinazione la conversione completa ed il composto assume una
colorazione rosa. Confrontando gli spettri
13
C e
15
N CPMAS, della forma II
96
dellacido barbiturico e del composto ottenuto per mezzo di macinazione, riportati
in figura 10 e 11, si deduce che il prodotto ottenuto non frutto di una
conversione tra due polimorfi, ma un nuovo composto che stato identificato
come una forma tautomerica dellacido barbiturico la cui struttura riportata in
figura 8.

Fig. 8: Struttura del tautomero ottenuto per macinazione dellacido barbiturico.

Da dati di letteratura risaputo che lacido barbiturico da origine ad un equilibrio
tautomerico che coinvolge undici possibili tautomeri come mostrato in figura 9
[4]. Lacidit dellacido barbiturico comparabile con quella dellacido formico e
questo dovuto alle propriet acide attribuite al gruppo metilenico (CH
2
) e ai
gruppi NH presenti nella molecola, nonch ai gruppi ossidrilici della forma
tautomerica [5, 6]. In molte reazioni organiche e biologiche, i tautomeri dellacido
barbiturico sono citati come intermedi di reazioni, ma fino ad adesso, al meglio
della nostra conoscenza, sono stati riportati solo calcoli teorici sulle varie forme
tautomeriche. Lunica prova sperimentale della presenza di un equilibrio
tautomerico riportata per la forma in cui presente in posizione 4 dellanello un
gruppo OH. Essa appare in solventi acidi anidri, ma in ogni caso la forma
predominante comunque quella chetonica.[7]
97

Fig. 9: Possibili tautomeri dellacido barbiturico.
Per accertare il tipo di tautomero ottenuto tra gli undici possibili, si sono
combinate le informazioni ottenute dagli spettri
13
C,
15
N CPMAS e dalle sequenze
bidimensionali, quali 2D-PASS, per lanalisi dellanisotropia dei gruppi C=O, C-
OH, CH e CH
2
e 2D FSLG-HETCOR per valutare le eventuali correlazioni tra
atomi di carbonio e idrogeno mediate dallinterazione dipolare.
Confrontando gli spettri
13
C CPMAS della fase II e del tautomero, figura 10
si osserva uno shift del picco del C(5) (CH
2
) da circa 39 a 79.5 ppm caratteristico
di un gruppo CH di un anello aromatico. Nella regione dei carbonili si osservano
tre segnali invece di due: in particolare il segnale a 152.6 ppm assegnato al C(2),
mentre quelli a 164.7 e 171.1 ppm sono attribuiti agli atomi di carbonio C(4) e
C(6). Non avendo a disposizione la struttura a raggi X, non possibile risalire al
tipo di legame idrogeno in cui sono coinvolti quindi difficile attribuire il segnale
a un gruppo C=O oppure C-OH.
Per quanto riguarda lo spettro
15
N, riportato in figura 11, sono presenti due
segnali, attribuiti agli atomi N(1) e N(3,) a differenza della forma II in cui
presente un solo segnale, inoltre cadono a chemical shift decisamente diversi
ripetto alla forma II. Sulla forma tautomerica si sono effettuati esperimenti NQS
(Non Quaternary Suppression) ovvero esperimenti in cui si osservano solamente
gli atomi di azoto quaternari. Nel nostro caso i segnali osservati sono due, il che
dimostra che entrambi gli atomi di azoto N(1) e N(3) sono quaternari quindi non
98
sono direttamente legati ad atomi di idrogeno, anche se non esclusa la presenza
di legami a idrogeno.

Fig. 10: Spettri
13
C della fase II dellacido barbiturico e del tautomero ottenuto per macinazione
di questultmo.

Fig. 11: Spettri
15
N della fase II dellacido barbiturico e del tautomero ottenuto per macinazione
di questultimo.
Il confronto tra le anisotropie degli atomi di carbonio C(2), C(4) e C(6) calcolate
dallanalisi dei patter di spinning sideband ottenuti per mezzo dellesperimento
2D-PASS, sia per la forma II che per il tautomero (figura 12 e 13), purtroppo non
consentono di distinguere tra C=O e C-OH. Infatti i dati sulla CSA riportati in
tabella 3 non mostrano differenze significative n nei tensori
11
,
22
, e
33
n
nellanisotropia . Questo probabilmente dovuto alla uguale ibridazione
dellatomo di carbonio (sp
2
) in entrambi i gruppi, che rappresenta il fattore pi
significativo nel determinare lanisotropia. Resta per molto evidente la differenza
di anisotropia per il C(5) (CH
2
) dellacido barbiturico (=19.9 ppm forma II) e
99
C(5) (CH) del tautomero (=84.0 ppm). E risaputo, infatti, che latomo di
carbonio ibridato sp
3
sempre associato ad una bassa anisotropia grazie allalta
simmetria data dalla disposizione tetraedrica dei leganti attorno al nucleo. Al
contrario un carbonio sp
2
non essendo cos simmetrico molto pi influenzato
dallorientazione rispetto al campo magnetico, dando origine ad un pattern di
spinning sidebands pi ampio.



100

Fig. 12: Spettri 2DPASS della fase II dellacido barbiturico: a)2DPASS; b)rappresentazione dei
diversi pattern di spinning sidebands per ogni segnale


101



Fig. 13: Spettri 2DPASS della specie tautomerica dellacido barbiturico: a)2DPASS;
b)rappresentazione dei diversi pattern di spinning sidebands per ogni segnale

FASE II o
11
o
22
o
33
oiso Ao
170.4 ppm 251.6 190.9 68.4 170.3 152.9
151.9 ppm 216.3 132.8 106.1 151.8 68.5
39.1 ppm 50.5 40.9 25.8 39.1 19.9
TAUTOMERO
171.1 ppm 249.5 181.4 83.9 171.6 131.5
164.7 ppm 255.4 160.4 77.5 164.4 130.4
152.6 ppm 225.4 139.9 91.7 152.3 91.0
79.5 ppm 128.5 85.9 23.2 79.2 84.0

Tab. 3 :Valori ottenuti dellanisotropia del chemical shift.
Dal momento che dallanalisi delle anisotropie dei gruppi C=O e C-OH non si
riusciti ad ottenere informazioni tali da poter distinguere i due gruppi, si sono
effettuati esperimenti 2D-FSLG-HETCOR. In questi esperimenti si vanno a
valutare le eventuali correlazioni tra gli atomi di carbonio e quelli di idrogeno, che
essendo spazialmente vicini interagiscono. In funzione della durata del mixing
102
time, che in questo caso il contact time durante la cross-polarization, si possono
osservare correlazione
1
H-
13
C a distanze differenti. Per contact time corti (35-60
s) si osservano solo le correlazioni dirette C-H mentre per contact time pi
lunghi (100-150 s) possibile ottenere correlazioni anche per atomi di carbonio
e idrogeno non direttamente legati. Per quanto riguarda il tautomero abbiamo
effettuato tre esperimenti diversi usando un valore di contact time pari a 35, 60 e
150 s e i risultati ottenuti sono riportati in figura 13.


103

Fig. 13: Esperimenti 2D-FSLG-HETCOR per il tautomero ottenuto da macinazione dellacido
barbiturico a dversi valori di contact time: 35 s(a), 60 s (b) e 15 s 0 (c).
Come si pu osservare dagli spettri 2D-FSLG-HECTOR del tautomero, con un
contact time di 35 s ( figura 13 a ), le uniche correlazioni che si osservano sono
quelle tra gli atomi di idrogeno metilenici ed il carbonio direttamente legato ad
essi C(5). Aumentando il contact time a 60 s ( figura 13 b ) si osservano le
correlazioni tra gli idrogeni ossidrilici e gli atomi di carbonio C(2), C(4) e C(6)
oltre alla correlazione degli idrogeni del CH
2
descritte prima. Passando a 150 s
( figura 13 c ) di contact time, aumentano notevolmente le correlazioni
intramolecolari tra atomi
1
H e
13
C e compaiono nettamente anche quelle tra atomi
pi distanti come il CH. Per essere sicuri che le correlazioni che si osservano
nellesperimento con un contact time di 60 s siano quelle tra gli OH e gli atomi
di carbonio C(2), C(4) e C(6) si fatto lo stesso esperimento sulla forma II
dellacido barbiturico. Questultimo essendo nella forma chetonica non ha gruppi
ossidrilici, di conseguenza non si dovrebbero osservare correlazioni. Infatti, se si
osserva lo spettro 2D riportato in figura 14 a, non si osservano correlazioni se non
quelle attribuite ai segnali degli idrogeni dei CH
2
, che correlano con gli atomi di
carbonio direttamente legati ad essi. Se si aumenta il contact time a 150 s,
104
( figura 14b ) si iniziano a vedere correlazioni
1
H-
13
C tra gli atomi C(4) e C(6) con
gli idrogeni del gruppo CH
2
e del C(2) con gli atomi di idrogeno del gruppo N-H.


Fig. 14 : Esperimenti 2D-FSLG-HETCOR perla forma II dellacido barbiturico a diversi valori
valori di contact time: 60 s (A) e 150 s (B).
105
Sono anche stati registrati spettri
1
H NMR in soluzione del tautomero, variando i
solventi in funzione della polarit e della proticit. Il risultato finale, comune a
tutte le prove, che la forma tautomerica in soluzione converte immediatamente
nella forma chetonica. Infatti lo spettro protonico che si ottiene quello dellacido
barbiturico tal quale. Inoltre la tipica colorazione rosa, del tautomero, in soluzione
svanisce istantaneamente dando una soluzione incolore. Questo dimostra che la
forma pi stabile in soluzione quella chetonica e non enolica, che invece
isolabile allo stato solido. Tutte tre le forme (I, II e idrata) sottoposte al
trattamento di macinazione convertono nella stessa maniera.
A questo punto si sono effettuate prove su campioni con struttura simile, per
vedere se questa propriet era presente solamente nella molecola di acido
barbiturico o si estendeva anche ai suoi derivati. Si sono, quindi, acquistati due
derivati dellacido barbiturico: lacido 5,5-dimetilbarbiturico e lacido 1,3-
dimetilbarbiturico. Il primo porta due sostituenti metili sullatomo di carbonio C5,
mentre il secondo sostituito su entrambi gli atomi di azoto con un gruppo CH
3
.
Le strutture dei due composti sono riportate in figura 15.

Fig. 15: Strutture dellacido 5,5-dimetillbarbiturico e lacido 1,3-dimetillbarbiturico.

Sottoponendo questi due composti a macinazione a secco o in presenza di diversi
solventi quali acetone, acetonitrile, etanolo, metanolo, butanolo ed eptano nelle
medesime condizione e tempistiche adottate per le forme dellacido barbiturico,
non si hanno evidenze della presenza di equilibri tautomerici. Quindi si supposto
che le condizioni necessarie perch si verifichi la conversione alla forma enolica,
siano la concomitante presenza di almeno un atomo di idrogeno sul carbonio C5 e
uno su un atomo di azoto N(1) o N(2). Si preso quindi in esame il derivato
106
monosostituito sul C(5): lacido 5-metilbarbiturico (figura 16), il quale essendo
difficilmente reperibile in commercio, si deciso di sintetizzarlo. Tale composto
si ottiene per reazione tra il metildietilmalonato e lurea, in presenza di EtO
-
Na
+
(ottenuto da reazione in situ tra sodio metallico ed etanolo).

Fig. 16: Strutture dellacido 5-metilbarbiturico.
Una volta sintetizzato, si proceduto alla registrazione di uno spettro
13
C CPMAS
NMR (figura 17), uno spettro
13
C in soluzione (figura 19, talquale) e uno spettro

1
H in soluzione i cui dati sono riportati nella parte sperimentale.


Fig. 17: Spettro
13
C CPMAS dellacido 5-metilbarbiturico.

Macinando tale composto in presenza di quantit catalitiche di EtOH il colore
cambia progressivamente da incolore a giallo e dopo diverse ore (24 h) il
composto assume una colorazione viola. La macinazione stata monitorata
tramite spettri
13
C CPMAS NMR (figura 18) che presentano un progressivo
allargamento dei picchi fino a segnali decisamente allargati e difficilmente
interpretabili, indice o di un disordine statico o di una mobilit del sistema.

107

Fig. 18: Monitoraggio mediante spettri
13
C CPMAS registrati a diversi momenti del ciclo di
macinazione dellacido 5-metilbarbiturico.

Al contrario, preziose informazioni si possono ottenere dagli spettri
1
H e
13
C in
soluzione (DMSO-d6). Nello spettro protonico si osservano dei rilevanti
cambiamenti rispetto allo spettro della specie non sottoposta a macinazione: esso
infatti caratterizzato da un nuovo segnale a 6.189 ppm attribuito allossidrile
mentre il metile shifta a 1.434 ppm e gli N-H a 11.193 ppm. Il cambiamento pi
evidente dallo spettro
13
C NMR (figura 19, spettro 48 ore), in cui sono conservati i
tipici segnali dellacido 5-metilbarbiturico, ma compaiono nuovi segnali
attribuibili alla nuova forma le cui assegnazioni, insieme a quelle
1
H sono
riportate in tabella 4. Lasciando tale composto in DMSO per qualche giorno (2-3
d) si pu osservare che la conversione nella nuova specie totale (figura 19,
tautomero).
108

Fig. 19: Monitoraggio mediante spettri
13
C in soluzione della conversione dellacido 5-
metilbarbiturico al tautomero.






Tab. 4: Assegnazione
1
H e
13
C degli spettri NMR allo stato liquido del tautomero ottenuto dalla
macinazione dellacido 5-metilbarbiturico .
Dallanalisi di questi spettri e dalle successive prove effettuate per mezzo di
esperimenti bidimensionali HMQC e HMBC (figura 21) si potuto stabilire che,
in seguito al ciclo di macinazione avvenuta la conversione nella forma enolica,
riportata in figura 20.

Fig. 20: Struttura del tautomero ottenuto per macinazione dellacido 5-metilbarbiturico.
1
H (DMSO)
13
C (DMSO)
Tautomero
dellacido 5-metilbarbiturico
1.434 (CH
3
)
3.336 (H
2
O)
6.189 (OH)
11.193 (NH)
173.00 (C(6)-OH)
150.52 (CO)
71.65 (C5)
25.37 (CH
3
)
109



Fig. 21: Esperimenti 2D-HMQC (a) e HMBC(b) del tautomero ottenuto da macinazione dellacido
5-metilbarbiturico.
Queste tecniche bidimensionali sono in grado di osservare le correlazioni tra
atomi di idrogeno e carbonio direttamente legati, nel caso di sequenze HMQC, e
quelle tra atomi non direttamente legati nel caso di sequenze HMBC. Nella
sequenza HMQC lunica correlazione che si osserva quella che coinvolge gli
atomi di idrogeno del metile e il carbonio dello stesso gruppo. Passando invece
alla sequenza HMBC le correlazioni osservate sono maggiori. In particolare
lidrogeno dell ossidrile (6.189 ppm) d origine a due correlazioni: una con il
C(7) e laltra con il C(6), mentre gli idrogeni del metile (1.434 ppm) danno
110
correlazione con latomo di carbonio C(5) e latomo di carbonio C(6). Per
lidrogeno ossidrilico, non viene osservata la correlazione con il carbonio in
posizione C(5) perch ha una costante di accoppiamento minore rispetto a quella
con il C(7). Sul campione totalmente convertito si fatto uno spettro
13
C CPMAS
allo stato solido i cui segnali sono molto larghi. Esperimenti di temperatura
variabile non mostrando differenze rispetto allo spettro acquisito a temperatura
ambiente hanno confermato la presenza di disordine statico. Risulta importante
notare che, lasciando dellacido 5-metilbarbiturico in DMSO per diversi giorni
senza averlo precedentemente macinato, non si osserva nessun cambiamento n
nella colorazione n negli spettri
1
H e
13
C. Risulta quindi evidente come la
macinazione giochi un ruolo fondamentale nellattivare lequilibrio tautomerico.
Sembra, in oltre, che il solvente, una volta attivata la macinazione, favorisca la
forma enolica piuttosto che quella chetonica spostando lequilibrio tautomerico.
Allo stato solido, invece, le specie stabili sono molteplici o si arrangiano in
maniera disordinata al punto da non favorirne una specifica.
Dalla valutazione dei dati ottenuti e sopra riportati si pu dedurre che in
funzione del polimorfo considerato si osservano differenze negli spostamenti dei
segnali, i quali possono essere attribuiti al diverso coinvolgimento, dei gruppi
funzionali C=O e N-H diversamente coinvolti nel network di legame idrogeno.
Analizzando le conversioni meccano-chimiche si potuto osservare che a
differenza del Piracetam in cui possibile ottenere conversioni tra le diverse fasi,
nellacido barbiturico si attivano degli equilibri tautomerici che permettono di
isolare allo stato solido la forma completamente enolica. Questo stato provato
mediate esperimenti NMR allo stato solido in cui sono state usate sequenze
bidimensionale innovative che permettono di ottenere risultati molto interessanti, i
quali confermano in modo inequivocabile che il composto isolato effettivamente
la forma enolica dellacido barbiturico. Successive prove su derivati dellacido
barbiturico: lacido 5,5-dimetilbarbiturico acid e lacido 1,3-dimetilbarbiturico,
non hanno portato ai rispettivi tautomeri, mentre per lacido 5-metilbarbiturico la
tautomeria evidente, ma solamente in soluzione. Spettri
13
C CPMAS di
questultimo hanno invece evidenziato che allo stato solido pu presente un
111
possibile disordine statico piuttosto che la possibilit di avere pi forme stabili
contemporaneamente.

6.1 PARTE SPERIMENTALE
La sintesi dellacido 5-metilbarbiturico stata eseguita secondo procedure
riportate in letteratura. A 10 mmol di dietilmetilmalonato sono aggiunti 25 ml di
una soluzione di etossido di sodio ( i quali corrispondono a 10 mmol di NaOEt).
Immediatamente vengono aggiunti 10 mmol di urea, precedentemente disciolti in
10 ml di di EtOH assoluto e il tutto portato a riflusso. Dopo 1.5 ore si fa
raffreddare la soluzione e si acidifica con HCl 3 M controllando il pH con la
cartina indicatrice. A questo punto si rotovapora la soluzione in maniera tale da
ridurre il volume a circa met di quello di partenza e si immerge in un bagno di
ghiaccio. In questultimo passaggio si ha la precipitazione dellacido 5-
metilbarbiturico. La resa stata del 71 %.
1
H NMR 400 MHz, Acido 5-metilbarbiturico (DMSO): o = 11.079 (s, 2 H, N-
H), o = 3.645 (q, 1 H, C-H, J = 7.32), o = 1.267 (d, 3 H, CH
3
, J = 7.32).
Tutti gli spettri NMR allo stato liquido sono stati registrati con uno spettrometro
Jeol EX 400 (B
0
= 9.4 T, frequenza di lavoro
1
H = 399.78 MHz) operante a 25
0.5C. Le soluzioni campione sono state preparate usando DMSO-d
6
. Tutti gli
spettri sono riferiti al segnale del solvente non deuterato presente. Nella
descrizione degli spettri sono state utilizzate le seguenti abbreviazioni: s,
singoletto; d, doppietto; t, tripletto; q, quartetto. Gli spostamenti chimici () sono
espressi in ppm e le costanti di accoppiamento (J) sono riportate in Hz.
Per le analisi NMR allo stato solido si usato uno strumento Bruker Advance II
400 MHz Ultra-shield equipaggiato con un probe da 4mm operante a 400.23 MHz
per
1
H, 100.63 MHz per il
13
C e 40.56 MHz per
15
N. Un esperimento standard di
cross-polarizzation con rampa durante il contact time per ottimizzare le condizioni
di Hartmann-Hahn ad alte velocit di rotazione del rotore stato utilizzato per
acquisire gli spettri. Generalmente contact time di 3.5 ms (
13
C) e 5.0 ms (
15
N)
sono stati usati con tempi di ripetizione da 5-60 s per un numero di scansioni di
32-64 per gli spettri
13
C e 3000-4000 per gli spettri
15
N. Tutti i campioni sono stati
112
impaccati in rotori di zirconia del diametro di 4 mm con un volume di circa 80 l
e fatti ruotare ad una velocit di 12 kHz.
Per la scala dei chemical shift del
13
C si usato come riferimento il segnale
metilenico della glicina (usato come standard esterno) a 43.86 ppm mentre per la
scala del
15
N si usata la risonanza del (NH
4
)
2
SO
4
(355.8 ppm rispetto al
CH
3
NO
2
).
I principali componenti del tensore di chemical shift sono stati estratti tramite
simulazione computazionale (HBA-graphical) del diagramma delle spinning
sideband ottenuto per rotazione a bassa velocit ed usando per la simulazione
lalgoritmo di Herzfeld e Berger. Il tensore di chemical shift stato riportato
seguendo la convenzione standard dove
11
>
22
>
33
e
iso
=(
11
+
22
+
33
)/3 e =

33
(
11
+
22
)/2.




















113
Bibliografia capitolo 5

1. C. T. Lewis, A. D. Tocher, L. S. Price, Cryst. Growth. Des., 2004, 4, 979.
2. S. G. Nichol, W. Clegg, Acta Crist. Sec. B, 2005, B61,464.
3. D. Braga, M. Cadoni, F. Grepioni, L. Maini, K. Rubini, CrystEngComm,
2006, 8, 756.
4. K. Senthilkumar, P. Kolandaivel, J. Comput.-Aid. Mol. Des., 2002, 16,
263.
5. J. R. Keeffe,, A. J. Kresge, , N. P Chepp., J. Am. Chem. Soc., 1990, 112,
4862.
6. Y. Chiang, A. J. Kresge, Science, 1991, 253, 395.
7. T. J. Bojarsky, J. L. Mokrosz, H. J. Barton, M. H. Palchowska, Adv.
Heterocyclic Chem., 1985, 38, 229.



















114
Conclusioni
In questa tesi si sono studiati e caratterizzati i polimorfi del Piracetam, dalla
Didanosina e dallAcido Barbiturico. La scelta di queste molecole dettata
principalmente dalla presenza di gruppi adatti a formare legami idrogeno, in
particolare gruppi C=O e N-H. Infatti gli atomi osservati sono
13
C,
15
N e
indirettamente, per mezzo di tecniche bidimensionali, anche i protoni che sono
direttamente coinvolti nei legami idrogeno. Oltre lutilizzo della tecnica NMR allo
stato solido si sono usate tecniche complementari quali XRD di polveri e lIR,
necessarie per poter accertare lottenimento della la fase desiderata di un
determinato composto. LNMR allo stato solido risulta molto sensibile alla
presenza di legami idrogeno e di conseguenza ai diversi polimorfi di una sostanza,
i quali sono generalmente caratterizzati da un network di legami idrogeno
differente. I parametri che variano maggiormente in funzione delle caratteristiche
del pattern di interazioni sono il chemical shift, lanisotropia del tensore di
schermo e laccoppiamento dipolare e i tempi di rilassamento.
Nel caso del piracetam si sono analizzate le quattro forme cristalline (I, II, III
e idrata) per mezzo di esperimenti
13
C e
15
N CPMAS. Dal confronto degli spettri
ottenuti si possono osservare degli spostamenti dei segnali, verso alte o basse
frequenze, in funzione del polimorfo considerato. Questo dipende dal tipo e dalla
forma dei legame idrogeno in cui sono coinvolti gli atomi di carbonio dei
carbonili e gli atomi di azoto (N-H) che, seppure non direttamente legati al
protone, sono ugualmente influenzati da queste interazioni. Dalle informazioni
ottenute dallanalisi di questi spostamenti, combinate con quelle ottenute
dallanalisi dalla struttura a raggi X, si potuto affermare che in funzione della
distanza dei legami idrogeno presenti nel network, lintorno chimico dellatomo in
osservazione pu essere pi o meno influenzato. Inoltre si sono effettuate prove
meccano-chimiche per valutare la possibilit di interconversione tra polimorfi e si
osservato che in seguito a cicli di macinazione possono avvenire transizioni di
fase tra le varie forme, pur sempre seguendo lordine di stabilit.
Per quanto riguarda la Didanosina, usando tecniche di cristallizzazione
innovative, quali la CO
2
supercritica, si potuto osservare ed accertare la
comparsa di una nuova forma prima sconosciuta. Sono attualmente in corso, in
115
altri laboratori, studi sulle propriet chimico-fisiche di questa nuova forma, per
valutare se questultime sono migliori di quelle che possiede la forma gi
conosciuta.
Sulla molecola dellacido barbiturico sono stati fatti studi per osservare se a
seconda del diverso coinvolgimento dei gruppi C=O e N-H in legami idrogeno
cera una correlazione con gli spostamenti osservati negli spettri
13
C e
15
N.
Un aspetto molto importante stato lutilizzo della macinazione come metodo per
attivare ed influenzare gli equilibri tautomerici dellacido barbiturico e di alcuni
suoi derivati. In particolare dopo un ciclo di macinazione di un paio dore
effettuato sul campione di acido barbiturico talquale, si ottiene la forma
completamente enolata stabile ed isolabile allo stato solido.
Esperimenti NMR mono e bidimensionali sono serviti per accertare il tipo di
tautomero ottenuto. In soluzione, invece, la forma tautomerica converte
nuovamente nella forma chetonica sia in solventi protici, aprotici e anfiprotici. Le
medesime prove sono state fatte su derivati dellacido barbiturico, in particolare
sullacido 5,5-dimetilbarbiturico e sullacido 1,3-dimetilbarbiturico ma non ci
sono evidenze dellattivazione di nessun tipo di equilibrio tautomerico. Mentre
sullacido 5-metilbarbiturico si ha nuovamente lattivazione di un equilibrio
tautomerico che non coinvolge tutta la molecola, ma solamente parte di essa,
dando origine al tautomero con il gruppo ossidrilico in posizione 6. A differenza
del tautomero ottenuto partendo dellacido barbiturico, questo stato osservato e
caratterizzato in soluzione, ma non visibile chiaramente in esperimenti NMR
SS, probabilmente per la presenza di disordine statico o perch sono presenti pi
forme stabili contemporaneamente.
Dai risultati ottenuti si pi arrivare alla conclusione che la tecnica NMR allo
Stato Solido sta assumendo sempre pi importanza nel campo del polimorfismo.
Non solo perch in grado di distinguere polimorfi diversi, cosa che pu essere
fatta anche per mezzo di altre tecniche, ma in grado di approfondire in maniera
pi accurata tale fenomeno. In particolare pu individuare quale sito molecolare
pi o meno fortemente coinvolto in legami idrogeno, oltre a capire lintorno
chimico di un determinato gruppo. Inoltre grazie a tecniche bidimensionali
innovative che sono state usate in questo lavoro, si riescono a trarre conclusioni
116
molto interessanti, che vanno oltre la semplice caratterizzazione della molecola.
Infatti con sequenze 2DPASS si riesce ad analizzare l anisotropia del chemical
shift e quindi capire pi a fondo la natura di un gruppo funzionale, piuttosto che il
suo intorno chimico; con sequenze 2D FSLG HETCOR, invece, si in grado di
stabilire se un protone direttamente legato ad un carbonio oppure coinvolto per
mezzo di legame idrogeno. Quindi tale tecnica estremamente sensibile alla
distanza e alla forza di questultimo, inoltre applicabile anche su sistemi che non
presentano cristalli perfetti o addirittura su campioni amorfi, situazioni che
escludono a priori lutilizzo di altri tipi di tecniche. Di conseguenza lNMR allo
stato solido, con i progressi fatti negli ultimi anni, si pu candidare di diritto come
una delle tecniche principe nel riconoscimento, caratterizzazione e studio pi
approfondito del fenomeno del polimorfismo.






























117