08/03/21

Tecniche spettroscopiche
Spettrofotometria UV-VIS
Tutte le tecniche spettroscopiche sfruttano le interazione tra luce (radiazione
elettromagnetica) e materia. Queste tecniche possono fornirci:

•Informazione qualitativa (su elementi, composti)

•Informazione quantitativa (informazioni riguardanti la concentrazione della
sostanza presa in esame)

Classificazione delle tecniche spettroscopiche

•In base al meccanismo:

–assorbimento
–emissione
–fluorescenza

•In base alla regione spettrale impiegata:

–raggi 𝜸 (0.01 Å) ⟹PIGE

–raggi X (0.01 Å –100 Å) ⟹XRF, PIXE

–UV-Visibile (UV: 10-350 nm, Visibile: 350–800 nm) ⟹AAS, ICP-AES

–IR (800 nm –0.4 mm) ⟹FT-IR

–microonde(0.4 mm –0.25 m) ⟹EPR

–radiofrequenze (> 0.25 m) ⟹NMR

•In base alla specie interessata:

-atomica

-molecolare

L’analisi spettrofotometrica è basata sullo studio dello scambio di energia

(interazioni) tra la radiazione elettromagnetica e la materia.
Questo tipo di interazioni sono evidenti ad occhio nudo nel caso di radiazioni che
cadono nel campo visibile; ad esempio un fascio di luce bianca visto attraverso
una soluzione di solfato di rame (II) appare blu perché le particelle in soluzione
interagiscono, assorbendole, con alcune radiazioni, e quindi il fascio di luce
risulterà mancante di tali radiazioni, con un conseguente effetto colore (in questo
caso blu).
Concludendo, nel campo delle radiazioni visibili, possiamo affermare che c'è stata
interazione con la materia se si nota un cambiamento di colore oppure una
semplice diminuzione di intensità del fascio di radiazioni.
Quando vediamo un oggetto colorato o una soluzione è perché queste assorbono
alcune radiazione, mentre non ne assorbono altre.

Natura delle radiazioni elettromagnetiche

Un possibile approccio semplificato alle radiazioni elettromagnetiche fa uso di una
doppia rappresentazione, si rappresenta cioè la radiazione come un’onda
elettromagnetica (natura ondulatoria) e come una serie di pacchetti discreti di
energia, i fotoni (natura corpuscolare).
Le due rappresentazioni non sono in contrasto: una si adatta bene al mondo
macroscopico (onda) e l’altra al mondo atomico e molecolare (fotoni).

Dal punto di vista ondulatorio, le radiazioni (o onde) elettromagnetiche consistono

in una forma di energia che si propaga, anche nel vuoto: sono la simultanea
propagazione nello spazio delle oscillazioni di un campo elettrico e di un campo
magnetico, oscillanti su piani perpendicolari tra loro e perpendicolari alla direzione
di propagazione.

Il numero d’onda (wave number) corrisponde a 1/𝜆

La frequenza è una grandezza costante per ogni radiazione e nel campo del visibile
caratterizza il colore della luce.
Frequenza e lunghezza d’onda sono INVERSAMENTE PROPORZIONALI: 𝜆 = c/𝜈

Energia di una radiazione elettromagnetica

Una radiazione elettromagnetica consiste in ‘pacchetti discreti’ di energia, chiamati
FOTONI, la cui energia dipende dalle frequenza, secondo l’equazione:
E = h• 𝜈
Dove h indica la costante di Planck: h = 6,63 x 10-34 J•s
L’energia di un fotone viene a volte espressa anche in electron-volt (1eV =
1,6x10-19 J) .
I quanti o fotoni sono particelle di massa nulla che possono essere assorbite o
emesse durante l’interazione della radiazione con la materia.

Quindi: Energia e frequenza sono direttamente proporzionali, radiazioni con

elevata energia hanno elevate frequenze e basse lunghezze d’onda. Viceversa,
radiazioni con bassa energia hanno bassa frequenza e grande lunghezza d’onda.

Lo spettro elettromagnetico
Lo spettro elettromagnetico (abbreviato spettro EM) è l'insieme di tutte le
possibili frequenze della radiazione elettromagnetica. I vari intervalli dello spettro
elettromagnetico sono sfruttati a scopo analitico per ottenere informazioni
strutturali quali-quantitative sulla materia analizzata.
I diversi tipi di radiazione elettromagnetica
Esistono quindi diversi tipi di radiazione elettromagnetica, che differiscono per la
loro lunghezza d’onda (e di conseguenza per la loro frequenza ed energia); sono
riassunti nello spettro delle radiazioni elettromagnetiche:

La luce visibile
Come appena visto, la radiazione visibile rappresenta solo una piccola parte dello
spettro elettromagnetico:

Alle diverse radiazioni visibili, che differiscono per la loro lunghezza d’onda (e di
conseguenza per la loro frequenza ed energia) corrispondono i diversi colori.
Luce monocromatica e policromatica

È noto che quando un raggio di luce

bianca colpisce un prisma di vetro viene
scomposto in diversi colori.

Quello che accade è analogo a quanto si

osserva nell’arcobaleno o guardando
obliquamente la superficie di un CD.

La scomposizione (‘dispersione') in diversi colori tramite un prisma si spiega in

quanto:
•la luce “bianca” è in realtà un miscuglio di radiazioni di diversa frequenza e quindi
corrispondenti a tutti i colori;
•quando un raggio di luce passa da un mezzo ad un altro viene deviato (fenomeno
detto“rifrazione”): l’entità della deviazione dipende dalla lunghezza d’onda del
raggio incidente.

(La dispersione che osserviamo invece per riflessione sulla superficie di un CD si

basa su un altro fenomeno: la diffrazione, collegata all’interferenza delle
radiazioni).

Una radiazione caratterizzata da un’unica lunghezza d’onda o frequenza, in

cui tutti i fotoni hanno la stessa energia, viene detta: MONOCROMATICA

Analisi qualitativa e quantitativa

L’analisi spettrofotometrica consiste in misurazione di radiazioni

elettromagnetiche per ottenere analisi chimiche; è in grado di fornire
informazioni sia qualitative che quantitative.
Possiamo far passare attraverso una soluzione che contiene il nostro analita tutte
le radiazioni, una ad una, del vicino UV o del visibile per ottenere lo spettro di
assorbimento. Infatti ogni sostanza assorbe o emette radiazioni di lunghezza
d’onda ben determinata:
–l’analisi dello spettro permette allora di individuare la natura della sostanza in
esame;
-la misura dell’intensità delle radiazioni assorbite permette di risalire alla quantità di
sostanza analizzata.
Tutto questo è possibile in relazione al fatto che sono in gioco fenomeni di tipo
quantistico.
Nella regione visibile ed UV dello spettro le radiazioni elettromagnetiche
possiedono una quantità di energia sufficiente a produrre transizioni elettroniche
degli elettroni di valenza o molecolari (10-100 kcal/mole); in questo caso
l’elettrone viene elevato da uno stato fondamentale S0 ad uno stato a maggior
energia.
Se alle molecole viene fornita una minore energia (dell’ordine di 1-10 kcal/mole)
quale quella della regione dell’infrarosso e delle microonde, essa è in grado di
produrre rotazioni o vibrazioni dell’intera molecola o di singoli gruppi, se esistono
tipi adatti di legami.

Transizioni energetiche
Nella figura è riportato un grafico relativo a due livelli energetici di una molecola
associati agli elettroni di legame. Non sono riportati i livelli degli elettroni interni
perché tali energie sono molto grandi e riguardano essenzialmente la
spettroscopia atomica.

Come possiamo vedere ogni livello elettronico non è semplice in quanto associato
a vari livelli vibrazionali, anche questi non semplici in quanto a loro volta associati a
diversi livelli rotazionali.

Le molecole tendono a porsi negli stati fondamentali, cioè di più bassa energia, e
possono raggiungere uno degli stati superiori quando ricevono una radiazione con
frequenza tale che l’energia dei fotoni sia uguale alla differenza energetica tra lo
stato fondamentale e lo stato eccitato (e che inoltre esiste probabilità che ciò
possa avvenire: le cosiddette “regole di selezione”, sulle quali non ci
soffermeremo).
Studiando lo spettro di assorbimento di una molecola notiamo che esse
forniscono degli spettri a campana, e non degli spettri a righe (come nell’immagine
in basso sulla sinistra).

SPETTROSCOPIA DI ASSORBIMENTO

La spettroscopia di assorbimento permette, attraverso lo studio delle radiazioni

assorbite e dell’intensità dell’assorbimento delle varie sostanze, di effettuare
rapide e precise analisi sia qualitative sia quantitative.

Si possono analizzare più molecole in soluzione contemporaneamente; si fa

passare attraverso la soluzione una radiazione monocromatica e si misura con uno
spettrofotomentro l’assorbanza della soluzione o si monitora lo spettro di
assorbimento della soluzione stessa.
Spettrofotometria UV-visibile
Il campione è irraggiato con un intervallo più o meno ampio di 𝜆; le 𝜆 assorbite,
aventi energia sufficiente a promuovere transizioni elettroniche, corrispondono ai
gruppi funzionali delle molecole. La risposta è visibile sotto forma di spettro di
assorbimento.

Gli spettrofotometri UV-visibile sono molto

diffusi per la loro semplicità di utilizzo e
versatilità e per il basso costo; quasi tutte le
sostanze organiche presentano assorbimenti
nel range strumentale (200-800nm).

Analisi qualitativa
Per effettuare analisi qualitative si fa uso di raggi policromatici a spettro continuo,
poi separati tramite monocromatori nelle varie componenti (radiazioni
monocromatiche).
In pratica le singole radiazioni monocromatiche di tale raggio si fanno passare,
una alla volta, attraverso la sostanza in esame, la quale assorbirà in modo diverso,
cioè con diversa intensità, le diverse radiazioni.

Riportando perciò i valori registrati in un grafico assorbimento-lunghezza d’onda,

si ottiene lo spettro di assorbimento della sostanza esaminata.

Questa soluzione è colorata e infatti

assorbe nel visibile; per le soluzioni
incolore se c’è l’assorbimento sarà
nell’UV.
Spettri di assorbimento del DNA e delle proteine

Il DNA e le proteine assorbono nell’ultravioletto

perché alcuni dei loro costituenti mostrano
assorbimento nell’UV. Per il DNA abbiamo un
massimo di assorbimento a circa 260 nm per la
presenza di sistemi aromatici nelle basi azotate;
per le proteine abbiamo un massimo a 280 nm.
Entrambe le molecole assorbono fortemente al
di sotto di 220 nm.

Analisi quantitativa

Per eseguire analisi quantitative si fa uso di raggi monocromatici, cioè costituiti da

radiazioni di una sola frequenza. In pratica, date le difficoltà di avere raggi dotati di
questa proprietà, si impiegano fasci di radiazioni comprendenti una banda molto
ristretta dello spettro (banda passante), ossia fasci quasi monocromatici.

Le determinazioni quantitative sono basate sul fatto che, quando una radiazione
attraversa una soluzione, viene assorbita più o meno intensamente a seconda
della concentrazione; in altre parole l’assorbimento dipende dalla
concentrazione.
Disponendo quindi di strumenti in grado di misurare l’assorbimento si risale
facilmente alla concentrazione della soluzione.

In particolare nella spettroscopia di assorbimento si utilizzano due grandezze

(misurate strumentalmente): TRASMITTANZA e ASSORBANZA.

Appositi dispositivi (i rivelatori) sono in grado di misurare l’intensità di flusso

luminoso; in particolare vengono misurate:

-I0: intensità del flusso luminoso all’ingresso della cella con il campione
-I: intensità del flusso luminoso all’uscita della cella con il campione
 Dalla
misura dei flussi I0 e I gli strumenti forniscono direttamente i valori di trasmittanza
e assorbanza, che rappresentano le grandezze caratteristiche della spettroscopia
di assorbimento.

Il rapporto tra l’intensità del raggio uscente e quella del raggio entrante si chiama
TRASMITTANZA:
T = I/I0
Questa grandezza esprime quale frazione della luce incidente ha attraversato il
campione senza essere assorbita. T può assumere valori compresi tra 0 (indica
che la radiazione è stata completamente assorbita) e 1 (non c’è stato alcun
assorbimento).
Comunemente si usa pero’ la TRASMITTANZA PERCENTUALE, che assumerà
quindi valori compresi tra 0 e 100:
T% = T x 100
T% = 100 significa che il raggio non ha subito alcun indebolimento, cioè non vi è
stato alcun assorbimento da parte della sostanza; T% = 0 significa che è stato
completamente assorbito.
La trasmittanza diminuisce in modo esponenziale con la concentrazione e dipende
anche da altri parametri, proprio per questo è stata introdotto un’altra unità di
misura: l’assorbanza.

Altra grandezza di fondamentale importanza è l’ASSORBANZA, detta anche

“densità ottica” o “estinzione”:
A = -log T
L’assorbanza è molto utilizzata nelle analisi quantitative, poiché risulta direttamente
proporzionale alla concentrazione.

Trasmittanza, trasmittanza percentuale e assorbanza sono dimensionali (numeri,

senza unità di misura).
Il detector misura direttamente l’assorbanza

La quantità di radiazioni assorbite può essere misurata in diversi modi:

-TRASMITTANZA: T = I / Io
-%T= 100 T
-ASSORBANZA: A (E) = log10 I0/I = 2 -log10%T
Quest’ultima equazione ci permette di calcolare con semplicità il valore di
assorbanza dai dati di trasmittanza percentuale la cui correlazione viene
schematizzata nel grafico seguente.

La scala della trasmittanza è in percentuale, mentre la scala dell’assorbanza è una

scala logaritmica.

Legge dell'assorbimento (legge di Lambert-Beer)

Prendendo in considerazione una cella, contenente una sostanza in soluzione,

attraversata da un raggio di luce monocromatica, si dimostra che:
A=ε d C
dove:
A = assorbanza o estinzione (non ha unità di misura)
ε = coefficiente di estinzione molare, caratteristico della sostanza (L mol-1cm-1)
d = cammino ottico (cm), cioè lo spessore della soluzione
C= concentrazione molare della sostanza (mol L-1)
Attraverso questa legge, essendo noto 𝜀, è evidente che da un valore di
assorbanza possiamo risalire alla concentrazione della soluzione analizzata. Per
alcune soluzioni non si può riportare 𝜀 perché non si conosce o siamo di fronte a
delle specie macromolecolari polidisperse, per cui non abbiamo una massa
molecolare da considerare e quindi non si può esprimere la concentrazione in
moralità.
La stessa legge in cui però C si esprime in g/L comporterà, al posto di ε, un
diverso valore k (in g-1 L cm-1) denominato 'assorbività specifica’. Quest’ultima è
l’assorbività di una soluzione che contiene 1 g per litro di soluzione quando il
percorso ottico è sempre di 1 cm.
La legge di Lambert-Beer descrive i fenomeni di assorbimento di radiazioni
elettromagnetiche ed è valida per radiazioni monocromatiche e soluzioni diluite.

La proporzionalità diretta tra assorbanza e concentrazione permette di

effettuare analisi quantitative

L’equazione A = 𝜀 d C rappresenta una retta passante per l’origine degli assi, in cui
𝜀 è il coefficiente angolare.

La legge di Lambert-Beer è una legge addittiva

Se in soluzione sono presenti più specie molecolari assorbenti, l’assorbanza della

soluzione a ciascuna lunghezza d’onda sarà data dalla somma delle assorbanze a
quella 𝜆 delle singole specie molecolari.
Pertanto, anche lo spettro di assorbimento di una miscela complessa sarà uguale
alla somma degli spettri dovuti ai singoli componenti.
 Per una miscela costituita dai composti X e Y si
distinguono 2 casi:
a) le bande di assorbimento di X e Y puri si
sovrappongono ovunque in modo significativo

b) vi sono zone dove le sovrapposizioni sono di

piccola entità. In questo caso a ogni 𝜆 misuriamo
un’assorbanza di X e Y, se sono noti i due
coefficienti di estinzione molare alle due 𝜆, allora è
possibile calcolare le loro concentrazioni.

Procedimento per l’analisi di una miscela i cui componenti presentano spettri

risolti

Se gli spettri dei componenti di una miscela sono risolti sufficientemente (come nel
caso di 𝜆1 e 𝜆2), le concentrazioni della miscela si determinano risolvendo una
sistema di due equazioni

Ove A’ e A’’ sono l’assorbanza rispettivamente a 𝜆’ e 𝜆’’

Applicabilità della legge di Lambert-Beer e deviazioni
I grafici seguenti evidenziano i limiti della legge di Lambert-Beer in funzione della
concentrazione:

La legge di Lambert-Beer non solo è additiva ma è anche una legge limite, quindi
vale per soluzioni sufficientemente diluite. Al crescere della concentrazione del
soluto si verificano deviazioni notevoli con conseguente scarsa attendibilità del
dato analitico.

Deviazioni dalla legge di Lambert-Beer

Le cause di non osservanza della legge possono essere sia di tipo chimico che
strumentali

☞Cause chimiche:
1)ci possono essere modificazioni delle proprietà di assorbimento (𝜀) per
cambiamento della struttura molecolare della sostanza assorbente (formazione di
polimeri)
2) aggregazione e scattering (dispersione)
3) variazioni grado di dissociazione e/o pH (variazione 𝜀 )

☞Cause strumentali:
Letture di assorbanza comprese tra 1 e 2 corrispondono a variazioni di
trasmittanza percentuale tra 10% e 1% (errore piuttosto elevato), letture superiori a
2 non sono attendibili (trasmittanza percentuale tra 1% e 0%).

Un’altra causa strumentale può essere la selezione sbagliata di 𝜆 e un’ampiezza

grande della banda passante.

Un’altra condizione di validità della legge di Lambert-Beer è che le radiazioni

luminose che devono attraversare la soluzione in esame siano monocromatiche.
In realtà le radiazioni impiegate non sono mai rigorosamente monocromatiche a
causa soprattutto di difficoltà strumentali. E’ comunque sufficiente, per ottenere
risultati corretti, che la banda continua di radiazioni, centrata attorno ad un valore
nominale, sia la più ristretta possibile (ampiezza banda passante, ampiezza
selezionabile dallo slit).

Riassumendo:
La legge di Lambert-Beer sarà seguita se:
•la luce incidente è monocromatica
•l’assorbimento del solvente è trascurabile rispetto a quello del soluto
•la concentrazione del soluto è contenuta entro limiti adatti
•non si verificano reazioni chimiche delle molecole di soluto tra loro, con altre
sostanze o con il solvente

Scelta della lunghezza d’onda

Nell'analisi quantitativa lo spettro è essenziale per la scelta della lunghezza d'onda
più appropriata da utilizzare.
In genere verrà scelta una lunghezza d'onda in modo che:
• l'assorbimento sia massimo (per motivi di sensibilità: se l'assorbimento è alto è
possibile rilevare quantità piccolissime di sostanza)
• l'assorbimento sia al centro di un picco 'largo' (per motivi di precisione, in modo
che piccole variazioni di lunghezza d'onda comportino errori minimi sulla misura
dell’assorbanza)
• In generale dipende dal tipo di analisi che stiamo effettuando. Talvolta, anziché
scegliere i massimi di assorbimento, si può scegliere di lavorare su un
assorbimento più basso perché magari in questo modo si esclude l’assorbanza
di altre sostanze che possono interferire con l’analisi. Infatti, nel caso di miscele
di sostanze, la scelta, per la determinazione di una sostanza, cadrà su una
lunghezza d'onda dove le altre sostanze assorbono il meno possibile.

Spettri di assorbimento

Analisi qualitativa

Per il fatto che ogni sostanza ha il suo spettro di assorbimento, l’esame di tali
spettri permette di identificare una sostanza (per confronto diretto con campioni
noti o tramite banche dati di spettri) o di controllarne il grado di purezza.

In realtà le tecniche che meglio si prestano alle analisi qualitative (soprattutto

organiche) sono la spettroscopia infrarossa, in cui ogni sostanza presenta
numerose bande caratteristiche ben separate, e soprattutto la risonanza
magnetica nucleare, che fornisce serie di picchi direttamente collegabili alla
struttura della molecola.
Questi spettri di assorbimento sono di due nucleosidi monofosfato, il coefficiente
di estinzione molare è diverso per tutti e come lunghezza d’onda si sceglie 260 nm
che è vicina al massimo assorbimento di tutti.

Spettroscopia nel visibile e nell’ultravioletto

Questa spettroscopia, come già detto, si occupa delle transizioni fra diversi stati
elettronici della molecola.
Queste transizioni sono generalmente accompagnate a transizioni sia vibrazionali
che rotazionali, per cui gli assorbimenti sono costituiti da moltissime righe molto
vicine tra loro, tanto da apparire un continuo, cioè una banda. La ‘struttura fine’
dovuta alle transizioni rotazionali e vibrazionali non è generalmente rilevabile, se
non nel caso di spettri elettronici di gas rarefatti eseguiti con spettrografi ad alta
risoluzione.
Le sostanze organiche contengono nella molecola legami prevalentemente di tipo
covalente, formati cioè da coppie di elettroni in comune tra i vari atomi.

Esistono elettroni di legame:

-di tipo sigma (σ), costituiti da una nube elettronica addensata lungo l’asse di
unione dei nuclei degli atomi interessati al legame (i legami semplici sono di tipo
σ);
–di tipo pi-greco (π) , costituiti da coppie di elettroni la cui maggior densità
elettronica è situata al di fuori dell’asse di unione dei nuclei (come accade nei
legami doppi o tripli). Questi sono più facilmente eccitabili degli elettroni sigma.

In generale con il crescere del numero di doppi legami e del loro grado di
coniugazione la quantità di energia necessaria per far avvenire transizioni
elettroniche diminuisce (aumenta la lunghezza d’onda). Le molecole con gruppi
aromatici in genere mostrano delle assorbanze a lunghezze d’onda maggiori.

Un corpo, investito da luce bianca, ci appare colorato perché assorbe alcune

radiazioni e trasmette o riflette le altre, le quali ci appariranno con un colore
che è la risultante delle radiazioni non assorbite. (In realtà la visione dei colori è
un fenomeno assai complesso, sia a livello chimico-fisico, sia a livello neurologico).
Come già detto, gli spettri nel visibile sono dovuti agli elettroni di legame 𝜋 più o
meno ampiamente delocalizzati; questa delocalizzazione può essere estesa a tutta
la molecola oppure può risultare limitata a raggruppamenti particolari, separati fra
di loro nella molecola da un insieme di legami completamente saturi.

Nel primo caso lo spettro di assorbimento è unico e difficilmente interpretabile

secondo regole semplici; nel secondo caso, invece, può essere considerato come
la somma di assorbimenti dovuti ai vari gruppi insaturi che vengono chiamati
“cromofori”.

Si intende quindi per ‘cromoforo' un raggruppamento chimico insaturo

responsabile di un assorbimento situato nella regione delle lunghezze d’onda
comprese tra 180 e 1000 nm.

I cromofori più semplici sono i gruppi etilenici, acetilenici, carbonilici, carbossilici,

azoici, nitrici, nitrosi,...
La posizione e l’intensità dei massimi di assorbimento di questi cromofori può
variare sia con la natura della parte satura sia con quella del solvente. Si possono
di conseguenza avere degli spostamenti dello spettro di assorbimento verso
lunghezze d’onda maggiori (‘effetto batocromico’ o “redshift”) oppure minori
(‘effetto ipsocromico’ o “blueshift”).
La saturazione di un gruppo insaturo, che provoca l’accorciamento del sistema 𝜋,
produce uno spostamento verso 𝜆 minori.

Analogamente si possono avere effetti sull’intensità degli assorbimenti, sia nel

senso di una diminuzione (‘effetto ipocromico’), sia nel senso di un aumento
(‘effetto ipercromico').
Un effetto che produca una variazione del coefficiente di estinzione molare (𝜀)
viene definito IPERCROMICO o IPOCROMICO ,a seconda che la variazione sia
positiva o negativa.
Spettro di assorbimento delle basi degli acidi nucleici

Un esempio che viene fatto

per l’effetto ipercromico è
quello che si verifica quando
viene denaturato il DNA.

[Le basi azotate degli acidi

nucleici hanno tutte un
massimo di assorbimento
intorno a 260 nm].

La presenza dell’adenina fa sì che ci sia

un assorbimento a 260 nm.
Il NADH è un coenzima coinvolto in molte reazioni di ossidoriduzione. Nelle
reazioni di riduzione quello che cambia nella struttura del NADH è l’anello
nicotinammidico, che diventa una struttura di tipo chinonoide (struttura priva della
carica sull’azoto), questa struttura mostra un assorbimento intorno a 340 nm.
Questa situazione è analoga sia per il NADH che per il NADPH, questo è
importante perché questo coenzima ha spettri decisamente diversi nella forma
ossidata e ridotta (massimo a 340 nm che non è presente nella forma ossidata).
Questo può essere sfruttato per monitorare la velocità delle reazioni che
coinvolgono le deidrogenasi nicotinammidiche (ne parleremo meglio nei dosaggi
enzimatici).
Spettri di assorbimento di alcuni aminoacidi

Spettri di assorbimento degli aminoacidi aromatici

Come tutti gli altri amminoacidi assorbono

fortemente sotto 220 nm, poi hanno un
massimo di assorbimento intorno a 280
nm per tirosina e triptofano e a 260 nm per
la fenilanalina.
Anche se il triptofano è poco frequente
nelle proteine, esso comunque
contribuisce al fatto che tutte le proteine
mostrino un assorbimento a 280 nm per
via della presenza degli amminoacidi
aromatici.

Se osservando uno spettro troviamo un

picco a 280 nm, allora sarà sicuramente
presente un amminoacido aromatico,
questo però non può essere sfruttato per
le analisi quantitative. Se siamo in
presenza di una miscela di proteine e non
disponiamo di un 𝜀 per quelle proteine, l’assorbanza a 280 nm viene usata in
modo semiquantitativo.
Quando abbiamo proteine che assorbono nel visibile è perché sono proteine
coniugate a un complesso, cioè hanno una porzione non amminoacidica che
assorbe nel visibile, altrimenti assorbono solo nell’ultravioletto. Quindi, la porzione
amminoacidica della proteina non assorbe nel visibile.

Spettri di assorbimento del DNA e delle proteine

Per quantificare l’emoglobina in soluzione si sceglie di convertirla tutta in meta-
emoglobina, in questo modo abbiamo un 𝜀 che non risente della saturazione
dell’emoglobina.

Ossi-emoglobina = emoglobina che lega l’ossigeno

Deossi-emoglobina = l’emoglobina presenta un sito libero (sito = stessa posizione
di coordinazione dell’atomo di ferro che si trova al centro del gruppo eme)
Meta-emoglobina = il sito è occupato dall’acqua

[Ricorda: La metaemoglobina è una proteina simile all'emoglobina, da cui si

differenzia per il diverso stato di ossidazione del ferro. In effetti, il ferro presente nel
gruppo -EME della metaemoglobina è ossidato a ione ferrico (Fe3+), mentre
nell'emoglobina si trova sotto forma di ione ferroso (Fe2+). Il passaggio di
ossidazione del ferro da uno stato bivalente ad uno stato trivalente, rende la
metaemoglobina incapace di trasportare l'ossigeno nel nostro organismo.
All'interno del globulo rosso, in condizioni normali, si formano sempre delle piccole
quantità di metaemoglobina, prontamente eliminate da particolari sistemi
enzimatici.]

Determinazione della concentrazione della sostanza in esame

La maggior parte degli strumenti sono dotati (come rivelatori) di cellule

fotoelettriche che producono un segnale elettrico dipendente dall’intensità
luminosa. Il segnale elettrico viene poi trattato in via elettronica, fino ad ottenere
una lettura analogica o digitale di A e/o T.
Una volta ricavata l’assorbanza (con il solito azzeramento contro il bianco) della
soluzione in esame, per risalire alla concentrazione si possono seguire diversi
metodi, sempre ricordando che (per concentrazioni ‘non troppo alte’) assorbanza e
concentrazione sono direttamente proporzionali:
A= 𝜀 d C
Si possono seguire essenzialmente due strade: il metodo diretto ed il metodo della
curva (o retta) di lavoro.

Metodo diretto

Dalla relazione A = 𝜀 d C , si ricava:

C = A / (𝜀 d)
Essendo d noto (dimensioni della cuvetta) si deve disporre del valore di 𝜀 relativo
alla sostanza in esame.
Se è noto (da precedenti esperienze o perché tabulato in letteratura) non ci sono
problemi, altrimenti è possibile ottenerlo misurando l'assorbanza Ast di una
soluzione a concentrazione nota:
𝜀 = Ast/ (d • Cst)
A questo punto è quindi possibile effettuare tutte le analisi che si desiderano su
campioni a concentrazione incognita calcolando poi direttamente le
concentrazioni. Il controllo negativo in questo caso è il bianco reagenti e il
controllo positivo sono soluzioni a concentrazione nota di quella sostanza.

Questo metodo prevede però di essere certi che si sta lavorando in situazione di
proporzionalità diretta (retta passante per l'origine) tra Assorbanza e
Concentrazione.

Esempio di calcolo
Determinare la concentrazione dell’ATP in tampone PBS a pH 6,0 sapendo che:
Dati: A260= 0,83
d = 1,0 cm
𝜀260= 16600 M-1cm-1 (Epsilon cambia a seconda della lunghezza d’onda)
Calcoli: A = 𝜀 d C
C = A/(𝜀 d)
C(mol L-1) = 0,83 / 16600 = 5,0•10-5 M

Metodo della curva (o retta) di taratura

Spesso però non si può essere certi delle condizioni di proporzionalità diretta
(linearità) tra A e C, ed è quindi preferibile utilizzare un metodo più sicuro, anche
grafico.
Si preparano quindi un certo numero di soluzioni contenenti la sostanza in esame a
concentrazioni diverse e note e si misura la loro assorbanza.
Si avranno quindi una serie di valori di concentrazione (C1, C2, C3, C4, ...)
associati ai rispettivi valori di assorbanza (A1, A2, A3, A4, ...); riportando questi
valori in un grafico cartesiano si ottiene la curva (o retta) di lavoro:
Se la sostanza in esame segue la legge di Lambert-Beer, la curva che si ottiene è
una retta. Ottenuta la retta di lavoro, essa viene utilizzata per soluzioni di qualsiasi
concentrazione, purché comprese nell'intervallo in cui la curva è stata tracciata.

Per calcolare Cx si misura Ax e graficamente si risolve il problema.

Naturalmente, la costruzione del grafico con la retta 'più probabile' e l'ottenimento
del valore Cx può essere comodamente effettuata con l'utilizzo di un foglio di
calcolo.
Se il valore di Ax risulta superiore al massimo valore di A dell'intervallo della curva,
sarà necessario diluire la soluzione (tenendone poi conto all'atto dei calcoli per il
risultato finale!) oppure preparare soluzioni a concentrazione nota più elevata per
ampliare l'intervallo (prolungando così la retta).

Esercizio 1. Una soluzione 50 mM di ATP mostra a 260 nm, in una cuvetta di 1 cm,
A=0,83.
Calcolare il coefficiente di estinzione molare.
Dati: A260= 0,83
d = 1,0 cm
C = 50 mM
Calcoli: A260 = 𝜀260 d C
𝜀260= A/ d C
𝜀260(L mol-1cm-1) = 0,83 / 5,0•10-5 = 16600

Esercizio 2. L’assorbimento molare del NADPH a 340 nm è 6,22•103 L mol-1cm-1.

Calcolare la concentrazione di una soluzione la cui estinzione a 340 nm in una
cuvetta con percorso ottico di 1 cm è 0,311.
Dati: A340= 0,311
d = 1,0 cm
𝜀340= 6220 M-1cm-1
Calcoli: A = 𝜀 d C
C = A/(𝜀 d)
C (mol L-1) = 0,311 / 6220 = 5,0•10-5 M

Esercizio 3. L’assorbimento specifico (1 g L-1) del DNA a doppio filamento a 260

nm è 20.
Calcolare la concentrazione di una soluzione di DNA che ha una estinzione di 0,35
a 260 nm in una cuvetta con percorso ottico di 1 cm
Dati: A260= 0,35
d = 1,0 cm
𝜀1g/L= 20 g L-1 cm-1
Calcoli: A260= 𝜀260 d C
C = A/𝜀 d
C (g L-1) = 0,35 / 20 = 0,075

Per verificare se è rispettata la legge di Lamber-Beer è utile il metodo

colorimetrico. Talvolta è necessario utilizzare dei reagenti (generalmente usato un
cromogeno) che portano alla formazione di sostanze colorate complessandosi con
la molecola in esame. Oltre all’uso del cromogeno possono essere utilizzati vari
passaggi che portano alla formazione di un complesso colorato.

ANALISI QUANTITATIVE
Preparazione del campione
L'analisi può essere condotta direttamente sulla soluzione della sostanza solo se
questa presenta il massimo di assorbimento nell'intervallo delle lunghezze d'onda
dello strumento (metodo diretto), altrimenti si ricorre ad opportune reazioni
chimiche tra la sostanza in esame e opportuni reagenti che portano alla
formazione di composti con massimi di assorbimento nell'intervallo di lunghezze
d'onda richiesto (metodo colorimetrico), tenendo conto dei seguenti requisiti:
1. L'assorbimento ottenuto in seguito all'uso di un reattivo deve essere
caratteristico della sostanza oggetto di esame, pertanto dovranno essere assenti
altre sostanze in grado di formare, con quel reattivo, composti con assorbimenti
analoghi.
2. Il reattivo 'colorante' deve reagire con tutta la sostanza da determinare
formando con essa un composto ben definito, in altri termini deve essere nota la
stechiometria della reazione perché se è nota questa possiamo usare il reattivo in
eccesso rispetto alla molecola da dosare.
3. Il reattivo non deve reagire con il solvente o con altre sostanze presenti in
soluzione oltre la sostanza da esaminare.
4. Il composto che si forma deve essere stabile, almeno per il tempo necessario
per la misura.
5. L'intensità di assorbimento del composto che si forma deve essere la più alta
possibile, a beneficio della sensibilità del metodo.
6. Il composto che si forma, e quindi l'assorbimento collegato, non deve risentire
di piccole variazioni di pH e di temperatura.

[Ricorda: Sensibilità del metodo = capacità del metodo di determinare piccole

quantità.]

Possiamo stimare le proteine in modo semiquantitativo con l’estinzione della

soluzione a 280 nm, però se si vuole fare un dosaggio delle proteine dobbiamo far
avvenire una serie di reazioni che siano una misura delle quantità di proteine
presenti a prescindere della loro qualità. Se abbiamo una miscela di proteine
diverse, ciascuna proteina ha la sua composizione amminoacidica e l’estinzione a
280 nm che leggiamo è la somma di tutte le estinzioni di tutti i tipi proteici presenti
contemporaneamente; dovremmo fare un dosaggio colorimetro che risenta il meno
possibile della composizione delle proteine, ma che invece sia una misura della
quantità totale delle proteine.

Dosaggio colorimetrico delle proteine (metodo di Bradford)

Esempio di retta di taratura ottenuta mediante un foglio di calcolo Excel

BSA = albumina bovina

Le corrispondenti assorbanze
sono lette a 595 nm perché col
metodo di Bradford si utilizza
un colorante, il blu di
Coomassie, che si lega alle
proteine e questo complesso
ha uno spettro diverso rispetto
al colorante libero.

Si prepara il bianco reagenti

che terrà conto
dell’assorbanza del colorante
libero presente in soluzione e
poi si misura a 595 nm
l’assorbanza del complesso
blu di Coomassie-proteina.

Il test di Bradford delle proteine è uno dei numerosi metodi semplici

comunemente usati per determinare la concentrazione proteica totale di un
campione. Il metodo si basa sul legame proporzionale del colorante Coomassie
alle proteine. Inoltre, il dosaggio è colorimetrico: all’aumentare della
concentrazione proteica, il colore del campione diventa più scuro. Il Coomassie
assorbe a 595 nm, per cui la concentrazione delle proteine può venire stimata con
l’aiuto di uno spettrofotometro.

Attraverso questi dati costruiamo la retta di taratura, calcolare poi la

concentrazione di un campione il cui valore di estinzione (= assorbanza) è 0,5
utilizzando l’equazione della retta trovata.
Calcoli: y = 0,9111x + 0,05 y=0,5
x = (0,5 - 0,05)/0,9111 = 0,5 M

Supponiamo di avere un campione del quale vogliamo determinare la

concentrazione la cui estinzione sia 1,5, posso sempre utilizzare questa retta? No,
perché è un valore che non rientra nel range dei valori con i quali abbiamo tarato il
sistema. Questo campione molto concentrato può essere diluito e così facciamo in
modo che rientri nel range del sistema.

Come u'lizzare excel per costruire una re3a di taratura:

Una volta raccolti i dati aprire il programma Excel. Subito vi apparirà la nota griglia
con celle identificate dalla combinazione di lettere e numeri. Costruire una tabella a
due colonne nelle quali inserire i valori. Un esempio è quella che relaziona
l'assorbanza (Abs, variabile dipendente) e la concentrazione (C, variabile
indipendente): in cui avrete il valore di assorbanza letto dallo strumento in relazione
alla concentrazione nota degli standard.

Selezionare i dati della tabella e "cliccare" su INSERISCI (in alto nella barra
applicazioni). Scegliere il grafico desiderato, in genere il migliore per due set di
valori è il grafico A DISPERSIONE, dopo scegliere la visualizzazione desiderata. A
questo punto comparirà un grafico con una serie di punti più o meno sparsi sul
piano cartesiano. Ciò che ci serve per permetterci di estrapolare i valori di nostro
interesse da tale grafico è l'equazione matematica alla base della retta che meglio
interpola i punti rappresentati (linea di tendenza). Per visualizzare sia la linea di
tendenza che l'equazione della retta cliccare su uno dei punti rappresentati con il
tasto destro del mouse e selezionare AGGIUNGI LINEA DI TENDENZA. Si aprirà
una finestra in cui è necessario spuntare le opzioni VISUALIZZA L'EQUAZIONE
SUL GRAFICO e VISUALIZZA IL VALORE R QUADRATO SUL GRAFICO.

Con questo processo la nostra retta di taratura sarà completa, l'R al quadrato ci
darà un indicazione della dispersione dei dati intorno alla linea di tendenza e
l'equazione della retta ci permetterà di ricavare dati per semplice estrapolazione.
R2 = 1 quando tutti i punti sono tutti sulla retta, più i valori di R2 si avvicinano a 1 e
più i punti ottenuti sono vicini alla retta ottenuta.
Partendo da una variabile "x" (il valore di assorbanza misurato) è possibile ricavare
il valore della variabile "y" ad esso associato (ad esempio la concentrazione della
sostanza analizzata).

Comparirà anche opzione IMPOSTA INTERCETTA, questa opzione ci permette di

ottenere una retta passante per lo zero, ma per quando riguarda l’assorbanza non
bisogna imporre il passaggio per lo zero perché in un dosaggio colorimetro a
concentrazione 0 può essere che si sia un valore di assorbanza diverso da 0.