ISOLAMENTO DEGLI ACIDI NUCLEICI

Prima di operare sugli acidi nucleici e’ necessario

purificarli con un grado di purezza che dipende dallo
scopo della preparazione.

DNA:

Il DNA viene facilmente danneggiato dalle forze frizionali

che possono rompere il DNA ad alto peso molecolare in
frammenti piu’ corti.

Altri danni possono essee dovuti alla presenza di

desossiribonucleasi, DNasi, enzimi Mg dipendenti che
digeriscono il DNA.
Il DNA e’ estratto usando metodi di estrazione blandi ed
in presenza di EDTA che chela i metalli.

Per rompere le cellule si usano:

detergenti o enzimi (lisozima nel caso di batteri);

se si debbono usare forze fisiche si evitano le

forze frizionali;

processo e’ eseguito a 4 °C;

si usa vetreria autoclavata per evitare

contaminazioni da DNasi.
Dopo il rilascio degli acidi nucleici dalle cellule, si procede
alla rimozione dell’RNA per trattamento con ribonucleasi
(RNasi) precedentemente trattata al calore per distruggere
la meno termostabile DNasi.

I campioni sono quindi trattati per la rimozione delle

proteine:

miscele di fenolo saturo di acqua

fenolo/cloroformio che denaturano le proteine e

non gli acidi nucleici.

Le proteine denaturate si posizionano all’interfaccia tra

solvente organico ed acqua mentre il DNA e’ presente nella
fase superiore acquosa.
Si procede quindi ad una seconda estrazione di proteine,
dopo di che il DNA e’ precipitato a –20 °C mediante
aggiunta di 3 volumi di etanolo assoluto freddo.

Il DNA cosi’ ottenuto dopo centrifugazione e’ sciolto in un

tampone contenente EDTA ed e’ conservato a 4 °C o a –20
°C, ricordando che continui cicli di
congelamento/scongelamento possono danneggiare la
molecola.

Questa procedura e’ valida per estrarre tutto il DNA

cellulare.

Nel caso si voglia isolare DNA da un organello, si procede

prima alla separazione di questo.
L’integrita’ del DNA isolato e’ poi verificata mediante
elettroforesi su gel di agarosio.

La concentrazione e’ invece determinata

spettrofotometricamente a 260 nm: ricordando che un
valore di Abs di 20 corrisponde ad una concentrazione di
DNA = 1 mg/ml.

E’ possibile verificare anche la presenza di contaminanti

facendo una scansione spettrofotometrica tra 340 e 240
nm, e calcolando il rapporto di Abs tra 260 e 280 nm. Se
questo rapporto e’ superiore a 1.8 vuol dire che il campione
non e’ contaminato di proteine.
RNA:

Le tecniche sono le stesse usate per il DNA. Essendo però le

molecole di RNA meno lunghe di quelle del DNA e a singolo
filamento si possono usare metodi più drastici di rottura
delle cellule.

Ci si deve però difendere dalle RNasi abbondantemente

presenti nei laboratori e rilasciate dalla pelle. Quindi si
lavora con guanti ed in presenza di detergenti per
denaturare le RNasi.

La deproteinizzazione è più rigorosa che con il DNA in

quanto spesso RNA è associato a proteine. DNasi sono
usate per rimuovere il DNA e l’RNA è precipitato con
etanolo.
 ANALISI FISICA DEL DNA

Elettroforesi

L’elettroforesi su gel di agarosio o di poliacrilamide è il

metodo più comune per separare qualitativamente e
quantitativamente DNA in base alle dimensioni.

Il gel di agarosio è usato per DNA di dimensioni

superiori alle 100bp. Per DNA più piccoli, è necessario
usare gel di poliacrilamide.

Il DNA è visualizzato attraverso la colorazione con

bromuro di etidio una molecola fluorescente in grado di
intercalarsi tra le basi appaiate.
Bromuro di Etidio
 SOUTHERN BLOT

Una tecnica molto usata nella manipolazione del DNA è

quella del Southern blot.

Con questa tecnica il DNA è trasferito in condizioni

denaturanti dal gel ad una carta di nitrocellulosa posta
in contatto con esso, elettroforeticamente o facendo
passare grandi volumi di tampone. Il foglio di carta sarà
stampo rispetto al gel. Il DNA così ottenuto può essere
trattato con cDNA sonda in esperimenti di
ibridizzazione.

Una tecnica analoga è il Northern blotting per l’RNA,

mentre il Western blotting per le proteine