Metode DNK analize

Seminarski rad iz predmeta

Molekularna forenzička genetika

Student: Čamdžić Zerina

 Onečišćenost DNK uzorka
• DNK se u ćeliji ne nalazi u čistom obliku već je
udružena i okružena brojnim dr.molekulama.
U forenzičkim tragovima su prisutne i materije koje
su naknadno u njih dospjele.
• Što duže neki trag provede na određenom lokalitetu
on u sebe inkorporira veći brojrazličitih supstanci iz
okoline koje mogu negativno da utiču na uzorak
DNK.
• Pri izdvajanju DNK,stanice se razbijaju te se oslobađa
sadržaj u kojem se nalaze molekule
ugljikohidrata,proteina,masti i dr.
• Prilikom prekida ćelijske cjelovitosti u svrhu izolacije
DNK,ona se u početku oslobađa iz jezgre i
hromosomskog kompleksa,i odmah se u sljedećem
koraku oslobađa i od veće količine proteina pomoću
upotrebe posebnih enzima.
• Metode izolacije se mogu svesti na nekoliko koraka:
 liza ćelija
 purifikacija i uklanjanje PCR inhibitora
 prikupljanje uzorka u željenom volumenu.
• U rutinskom radu se koristi nekoliko metoda izolacije,ali prije
navođenja tih metoda važno je ukazati na neke važne činjenice:

 Veliki broj slučajeva koji dolaze u laboratorij na analizu sadrži

minimalne količine DNK i svaka nepotrebna manipulacija može
uticati na kvalitet i kvantitet DNK
 Sve osobe uključene u proces analize DNK moraju biti upoznate s
mogućnošću kontaminacije postojeće DNK s nekom drugom DNK
 Neke od tvari koje se koriste pri izdvajanju DNK potencijalno su
štetne za DNK ako se pravovremeno i u potpunosti ne odstrane
 Uzorci ili izdvojena DNK moraju biti pohranjeni po strogo
propisanim uvjetima,koji obuhvaćaju kako tehničke postupke tako i
postupke osiguravanja tajnosti uzorka.
 Izdvajanje DNK pomoću organskih otapala
• Uz pomoć fenol-hloroform ekstrakcija odstranjuje se
velika količina proteina i ostalih molekula koje se
oslobađaju pri izdvajanju DNK.
Izdvojena DNK je čistija nego kod ostalih metoda.
U prvoj fazi ovog protokola dodaju se različiti
digestivni puferi koji su različiti na osnovu sastava
hemikalija npr.TRIS-a,NaCl,SDS,EDTA.
PROTEINAZA K

PUFER STVARANjE UVJETA

DIGESTIJA
PROTEINA
 Razgradnja membranskih kompleksa

genomska DNK “slobodno pliva“ u suspenziji

 Prvo centrifugiranjem,a zatim kombinovanim fenol-hloroform tretmanom

dolazi do solucije koja sadrži “čistu DNK“.
 Zatim se pristupa precipitaciji DNK –može se koristi alkoholna ili Centricon®
metoda.
Prva metoda se bazira na izmjeničnom ispiranju apsolutnim i 70%
alkoholom,ili na kratkoj inkubaciji -20ᵒC (veliki broj uzoraka).
Druga metoda se bazira na ispiranju “DNK rastvora“ nastalog u fenol
hloroform fazi kroz ultra membranu-pora membrane zadržava DNK,a tečna
faza prolazi kroz nju,zatim se dodaje TE pufer ili dest.voda gdje se na taj
način spira DNK u tubicu.Ovaj metod se korisi rjeđe,uglavnom za uzorke
koji sadrže male količine DNK.
 Izdvajanje DNK “Chelex® 100“ metodom
 Brza
Koristi se uglavnom za za izdvajanje DNK iz uzoraka
 Jeftina u kojima se očekuje postojanje minimalne količine
 Jednostavna DNK i visoke konc. PCR-inhibitora.
 Izdvajanje DNK “Qiagen“metodom
• Qiagen® sistem kitova je jedan od
najpouzdanijih,ali i najjednostavnijih
ekstrakcionih setova.Proizvodi se u više
varijanti prilagođenih za različite vrste
uzoraka.Izuzetno je uspješan u purifikaciji
genomske i mitohondrijalne DNK iz količinski
malih tragova.
• Ova metoda izolacije kombinira princip selektivnoga vezivanja DNK
molekule na silika membranu i ispiranja te membrane različitim puferima.
Ova metoda se odvija u 4 koraka:
 liza ćelijskoga lipo-proteinskog kompleksa i oslobađanje DNK koja
se postiže inkubacijom traga zajedno sa enzimom proteinaza K na
temperaturama od 56-70ᵒC ;
 vezivanje DNK molekula za silika membranu pod utjecajem
centifugalnih sila ;
 ispiranje kontaminirajućih supstanci kombinovanim djelovanjem
centrifugalnih sila i komercijalnih ispirajućih pufera ;
 eluiranje DNK molekula u čistu tubicu kombinovanim djelovanjem
centrifugalne sile i komercijalnoga eluirajućeg pufera ili DNA-free
destilovane vode.
 Promega IQTM System
• Ovaj DNK izolacijski test je dizajniran isključivo za
upotrebu u forenzičkoj DNK analizi i testiranju
očinstva.
• Zasniva se na magnetnoj separaciji,tj.kombiniranoj
upotrebi različitih rastvora i paramagnetnih
partikula kojima se uklanjaju PCR
inhibitori i izolira DNK
izuzetno podobna u
analizi STR
molekularnih markera.
 Ostale metode izdvajanja
 Metoda ispiranja –analiza nespornih tragova
(bukalne sluznice ili krvne mrlje) prikupljenih na
FTATM kartici,a sastoji se od sukcesivnog ispiranja
ddDNK-free vodom,centrifugiranja i treskanja
izdvojenih dijelova kartice.
 Metod isoljavanja-zasnovan je na separaciji
proteina,tj.principu da su proteini manje rastvorljivi
pri većim koncentracijama soli (Milerov protokol).
 Diferencijalna izolacija-modificirani “fenol-
hloroform“ protokol.
 Metode kvantificiranja DNK
• Spektrofotometrija-se temelji na mjerenju
transmisije svjetla kroz tečnost (pri valnim
dužinama u intervalu 220-300nm),na osnovu
čega se može utvrditi približna konc.DNK i
dr.primjesa.
• DNK bilježi maksimalnu adsorbancu na valnoj
dužini 260nm,za razliku od UH 230nm i
proteina na 280nm.
 Agarozna gel elektroforeza
• Gel elektroforeza predstavlja skup tehnika
koje se promjenjuju za separaciju bioloških
molekula,baziranu na njihovim fizičkim
osobinama,kao što su
veličina,oblik,izoelektrična tačka molekule...
• Najčešće se primjenjuje u analitičke svrhe,za
separaciju i analizu DNK fragmenata različite
veličine.
• Gel predstavlja crosslink polimer čija
kompozicija i poroznost omogućavaju
separaciju.Molekula DNK putuju ka
pozitivnoj elektrodi (anodi),zbog negativnog
naboja koji nosi DNK molekula.
• Nakon završene elektroforeze,separirani DNK
fragmenti se mogu vizualizirati primjenom
fluorescentnih boja kao što su etidium bromid
i coomassie blue.
 Hibridizaciona (slot blot ) metoda
• Donedavno jedna od najraširenijih metoda
kvantificiranja izolirane DNK u forenzičkoj genetici.
• Ovom se metodom mogu utvrditi iznimno male količine
DNK.DNK izdvojena iz uzorka prvo se imobilizira na
membrani te se nakon toga veže s DNK probom dužine
od oko 40bp specifičnom za humanu DNK,ali i za DNK
viših primata.Dobiveni rezultati uspoređuju je s
pozitivnom kontrolom za koju postoje poznate
koncentracije DNK.
QuantiBlot® Human DNK Quantitation Kit

• Najčešće korišteni komercijalni hibridizacijski

kit
• Zasniva se na hibridizacijskoj probi
komplementarnoj sa primat-specifičnom alfa
satelitnom sekvencom 17.hromosoma.
• Izuzetno je senzitivan i uspješno detektira
količine DNK i do 150pg.
 AluQuant® Human DNA
Quantitation System
• Humano specifična
• Posebno napravljene sonde vežu se na
visokoponavljajuće Alu-sekvence koje su specifične
za ljudsku DNK,ali nakon što se DNK
denaturira.Zasniva se na vizualnom mjerenju
produkovane količine ATP-a,koja ovisi o količini
prisutne DNK,u nizu izazvanih reakcija.
 QRT-PCR kvantifikacija
• Princip mjerenja zasniva se se na detekciji i kvantifikaciji
fluorescentno obilježenog reportera,čiji signal raste u
direktnoj ovisnosti o povećanju broja kopija produkata u
PCR reakcijskoj smjesi tokom eksponencijalne faze same
reakcije.
• Postoji više modela na osnovu kojih se odvija real-time
PCR reakcija,a u komercijalnim kitovima to je TaqMan®
tehnologija.
• Ona se zasniva na introdukciji boja,vezanih za specifičnu
probu,koje imaju visok afinitet ka vezivanju unutar
dvolančane DNK molekule.TaqMan® probe su najčešće
obilježene dvijema fluorescentnim bojama koje emitiraju
svjetlost različitih talasnih dužina.
 Quantifiler Duo DNA Identification Kit
• Ovaj multipleksni real-time PCR kit se koristi za
simultanu kvantifikaciju ukupne humane i mupke
humane DNK u uzorku i baziran je na TaqMan®
tehnologiji.Koristi 2 specifična humana regiona kao
ciljne sekvence i to RPH1 kao ciljnu sekvencu za
ukupnu humanu DNK,te SRY kao ciljnu sekvencu za
humanu mušku DNK.Prilikom postavljanja reakcije u
svaki uzorak se dodaje i interna PCR kontrola-IPC.
• U cilju detekcije rezultata kvantificiranje različitih
kontributora u reakciji se odvija različitim
bojama,ukupna humana DNK-zelena,humana muška-
plava i IPC-žutom bojom.
 Plexor® HY System

• Četverobojni multiplex real-time PCR sistem

koji se zasniva na simultanoj kvantifikacije
ukupne autosomalne humane i muške humane
DNK.
• Akumulacija amplificiranoj produkta mjeri se
smanjivanjem fluorescencije,koje je
proporcionalno količini PCR produkta.
• Plava boja (Fluorescein dye) se koristi za detekciju
ukupne humane DNK,a ciljna sekvenca (99bp) je
locirana na 17.hromosomu.
• Narandžasta boja (The CAL Fluor Orange 560
dye) služi za detekciju humane muške DNK,a
ciljna sekvenca (133bp) je locirana na Y
hromosomu.
• IPC,koja monitorira prisustvo inhibitora u
reakciji,detektuje se crvenom bojom,i ovaj
amplifikat je dug 150bp.
 PCR
 In vitro amplifikacijska metoda pomocu koje se iz
male kolicine heterogene pocetne DNA dobija
relativno velika kolicina specificne DNA sekvence
(~105 kopija)
 Velika senzitivnost reakcije (uspjesna
amplifikacija iz samo 1 celije)
 Brza dijagnosticka identifikacija i analiza DNA,
 omogucuje istrazivanje celularnih i molekularnih
procesa onima koji se ne bave molek. bio.
 uveliko doprinjeo uspjesnom sekvencioniranju
ljudskog genoma
 Sastoji se od niza od 20-40 ponavljanja (tzv.
Cycles) i svaki od njih se sastoji od 2-3
temperaturna koraka
1. Pocetni korak
zagrijavanje reakcije do ~90ᵒC
(trajanje 1-9 min)
2. Denaturacija
zagrijavanje reakcije do ~90ᵒC
(trajanje 10-30 sek)
DNA template se topi – hidrogenske veze izmedu
komplementarnih baza popustaju, dolazi do
denaturacije DNA i stvaranja jednolancane DNA
molekule
3. Sparivanje pocetnih oligonukleotida (engl. primer)
smanjenje temp reakcije (~ 50ᵒC, 20-40 sek)
Spajanje prajmera sa jednolancanom
DNA.Polimeraza se spaja sa primer
template hibridom i zapocinje formacija
DNA.
4. Produzavanje lanca - Elongacija
temp zavisi od enzima -najcesci Taq
polimeraza (optimalna aktivnost na 75-80ᵒC)
DNA polimeraza sintetizira novi DNA lanac
komplementaran pocetnom DNA lancu tako sto dodaje
dNTP koji je komplementaran templatu u
5’→ 3’smejru. Duzina trajanja koraka zavisi od
DNA polimeraze i duzine DNA fragmenta koji se
amplificira
5.Finalna Elongacija
Temp reakcije ~70ᵒC (~5-15min)
Da se kompletna jednolancana
DNA elongira do kraja
6.Finalno drzanje
Temp 4-15ᵒC neodredeni vremenski
period