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Corso di Biologia Molecolare

AA15/16

Docente: Alessandra Coiana


acoiana@medicina.unica.it
tel 07052965654

Laboratorio di Genetica Molecolare Ospedale Microcitemico


riceve gli studenti tutti i giorni previo appuntamento
Lezioni
Lun-Mer-Ven ore 9:00-11:00
Laboratorio
comunicazione date durante il corso

Modalità Esame: Esame finale: orale

Materiale didattico: people.unica.it/alessandracoiana/lezioni 2016


PW BIOLMOL14
el II anno):

Testi consigliati:
- J.D.Watson et al.“Biologia Molecolare del gene”VII edZanichelli
- F.Amaldi et al. ”Biologia Molecolare” II ed Casa Editrice Ambrosiana
- T.A. Brown “Genomi 3” ed Edises
Cronologia dei risultati di biochimica, genetica e biologia
molecolare sino agli anni '50
Tabella 1.1 Cronologia dei risultati della Genetica, della Biochimica e della Biologia Molecolare sino alla
fine degli anni cinquanta.

Amaldi, Benedetti, Pesole, Plevani Biologia molecolare - 2a edizione 2014 © CEA - Casa Editrice Ambrosiana
978-88-08-18567-9
Tabella 1.1 Cronologia dei risultati della Genetica, della Biochimica e della Biologia Molecolare sino alla
fine degli anni cinquanta.
Tabella 1.1 Cronologia dei risultati della Genetica, della Biochimica e della Biologia Molecolare sino alla
fine degli anni cinquanta.
Tabella 1.1 Cronologia dei risultati della Genetica, della Biochimica e della Biologia Molecolare sino alla
fine degli anni cinquanta.

Amaldi, Benedetti, Pesole, Plevani Biologia molecolare - 2a edizione 2014 © CEA - Casa Editrice Ambrosiana
978-88-08-18567-9
BIOLOGIA “MOLECOLARE”
BIOINFORMATICA

GENETICA MOLECOLARE
BIOCHIMICA

FUNZIONEdel GENE

BIOLOGIA CELLULARE
FISIOLOGIA

BIOCHIMICA STRUTTURALE
Argomenti di biologia molecolare
Metodologie di Biologia Molecolare
Acidi nucleici:
DNA (acido desossiribonucleico)
RNA (acido ribonucleico)
Struttura primaria degli acidi nucleici

polinucleotidi
(polimeri lineari costituiti da unità ripetitive: i nucleotidi)
Componenti dei nucleotidi

- Base azotata
(purinica o
pirimidinaca)

-Gruppo
fosfato

-Pentoso
(Ribosio/
Deossiribosio)
Struttura dei nucleotidi:pentoso

RNA

DNA
Basi Azotate Puriniche

Anelli eterociclici planari a doppio anello

Adenina: 6 ammino purina

Guanina: 2 ammino-6 ossi purina


Basi Azotate Pirimidiniche

Anelli eterociclici planari a singolo anello

Timina: 2,4 diossi-5 metil pirimidina


(oppure 5 metil uracile)

Citosina: 2 ossi-4 ammino pirimidina

Uracile: 2, 4 diossi pirimidina


Le basi azotate sono unite al C1’ del pentoso con un legame glicosidico

(con N1 nelle pirimidine e N9 nelle purine)

1’

1’
Nucleoside e Nucleotide
Figura 2.4 Nomenclatura dei gruppi fosfato in un nucleoside trifosfato.

Amaldi, Benedetti, Pesole, Plevani Biologia molecolare - 2a edizione 2014 © CEA - Casa Editrice Ambrosiana
978-88-08-18567-9
Legame fosfodiesterico tra i nucleotidi
Il gruppo funzionale PO4
conferisce agli ac. nucleici le
proprietà di un acido
Per convenzione le
sequenze degli acidi
nucleici si indicano in
direzione 5' – 3'

5'ATG3'

5'UGC3'
Struttura secondaria degli acidi nucleici:

DNA due catene polinucleotidiche due


RNA catena polinucleotidica a filamenti avvolte su se stesse
singolo filamento (ds=double strand)
(ss=single strand)
Appaiamento delle basi azotate
(secondo Watson e Crick)

A-T (2 legami idrogeno)


C-G (3 legami idrogeno)
La formazione delle
interazioni complementari
tra le coppie AT e GC
conferiscono alla molecola
del DNA un carattere
autocodificante
Ciascuna base azotata può assumere due conformazioni
tautomeriche, in equilibrio tra loro

La capacità di formare un tautomero alternativo può essere causa di


errori durante la sintesi del DNA
Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005
Struttura secondaria del DNA
Due catene polinucleotidiche allineate secondo un
orientamento opposto (antiparallelo)

5'ACTG3'
3'TGAC5'

.
L'orientamento
antiparallelo
delle due
semieliche è una
conseguenza
stereochimica
del modo in cui
sono appaiante
le basi.
Stabilità termodinamica della molecola di DNA

1) legami idrogeno tra le basi


2) attrazioni di van der Waals
tra le basi impilate
DNA forma B
Il solco maggiore dellla doppia elica del DNA
fornisce maggiori informazioni di tipo chimico

A:accettori di legami idrogeno


D:donatori di legami idrogeno
*gruppi metilici
*idrogeno non polare
Il riconoscimento di specifiche sequenze di DNA da parte di proteine è
dovuto alla interazione tra i gruppi chimici esposti dal solco maggiore del
DNA ed aminoacidi presenti in particolari dominii funzionali
Figura 2.17 Le proteine interagiscono generalmente con il solco maggiore del DNA.

Amaldi, Benedetti, Pesole, Plevani Biologia molecolare - 2a edizione 2014 © CEA - Casa Editrice Ambrosiana
978-88-08-18567-9
Conformazioni del DNA

Forma B: in soluzione con alto grado di umidità (95%)bassa salinità. Più simile alla struttura
fisiologica
Forma A. in soluzione a basso grado di umidità (75%) alta salinità. Complessi DNA.Proteina.
RNAds
Forma Z: sequenza con purine-pirimidine alternate.Alto MgCl2alta umidità bassa salinità
Parametri strutturali della doppia elica del DNA
• Conformazione ad elica sinistrorsa che
DNA Z • si instaura in sequenze con alternanza
purina/pirimidina (CGn) in cui le basi
assumono conformazioni alternate syn/anti.

Figura 2.21 Le due posizioni syn e anti della deossiguanosina nelle forme A e Z del DNA.

Amaldi, Benedetti, Pesole, Plevani Biologia molecolare - 2a edizione 2014 © CEA - Casa Editrice Ambrosiana
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Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005
Figura 2.22 Nella stessa molecola di DNA possono coesistere tratti di DNA B e di DNA Z.

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DNA a tripla elica

DNA duplex di Appaiamenti di


20-30 coppie di Hoogsteen
basi
con un filamento
composto di sole
pirimidine e
l'altro di sole
purine.

Figura 2.23 DNA a tripla elica.

Amaldi, Benedetti, Pesole, Plevani Biologia molecolare - 2a edizione 2014 © CEA - Casa Editrice Ambrosiana
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Non è stato dimostrato un ruolo naturale per questa struttura


Il quartetto di G :intramolecolare o intermolecolare

appaiamenti di Hoogsteen

4 tratti di DNA o RNA che


contengano ciascuno 3 o più G
consecutive si affiancano a
formare una struttura
“quadruplex” (a quattro
filamenti) tenuti insieme ma
appaiamenti di Hoogsteen
Es: telomeri cromosomi
eucariotici

Figura 2.24B Il quartetto di G.

e, Plevani Biologia molecolare - 2a edizione 2014 © CEA - Casa Editrice Ambrosiana


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Ripetizioni invertite di una stessa sequenza
con orientamento opposto

sequenza palindromica

sequenza ripetuta e invertita


Figura 2.25 Sequenze ripetute e invertite e palindromi.

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Struttura Cruciforme
Un tratto di DNAds che contiene una sequenza ripetuta e invertita
può assumere una struttura cruciforme con appaiamenti
intramolecolari

Figura 2.28 Visualizzazione di una struttura cruciforme.

Figura 2.26 Struttura cruciforme. Amaldi, Benedetti, Pesole, Plevani Biologia molecolare - 2a edizione 2014 © CEA - Casa Editrice Ambrosiana
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Pesole, Plevani Biologia molecolare - 2a edizione 2014 © CEA - Casa Editrice Ambrosiana
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Struttura a forcina (hairpin)

Figura 2.27 Struttura a forcina.

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Tratto di RNA (o DNAss) che contiene una sequenza ripetuta invertita può
assumere una struttura a forcina costituita da
uno stelo a doppia elica e una ansa a singolo filamento
DNA intrinsecamente curvo

Es: AT-AT
repeats ogni
10bp (1 giro
d'elica)

Figura 2.29 DNA intrinsecamente curvo (o piegato).

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La denaturazione del DNA
Le due semieliche del DNA possono
denaturarsi ....in vivo
duplicazione
Le due semieliche del DNA possono denaturarsi
e riassociarsi.....in vivo
trascrizione
Le due catene del DNA possono denaturarsi e
rinaturarsi.....in vitro

- DNA doppia elica bassa Assorbanza 260 nm


- DNA singola elica aumento Assorbanza 260 nm
- Nucleotidi liberi massima Assorbanza 260 nm
Temperatura di melting (TM)
Temperatura a cui è denaturato il 50% delle molecole di
DNA presenti nel campione
Aumenta
 Quanto più è elevata la % di basi G-C nella sequenza

Diminuisce
 In presenza di reagenti che possono formare legami H con i
nucleotidi (urea, formammide)
In presenza di reagenti che aumentano la solubilità delle basi
(metanolo) o distruggono il rivestimento di H2O indebolendo le
interazioni idrofobiche
: Denaturazione del DNA
In condizioni fisiologiche gli ioni Na+ formano nuvole
cariche intorno ai fosfati neutralizzandoli

Per diminuita concentrazione di sali i due filamenti del


DNA subiscono una repulsione elettrostatica dovuta ai
fosfati con carica negativa.
Denaturazione alcalina del DNA

ApH elevato la carica di diversi gruppi


cambia. Le basi non formano legami H

A pH 11,9 tutti i legami idrogeno sono


eliminati (con NaOH)
Rinaturazione del DNA:
condizioni necessarie

- Concentrazione salina abbastanza elevata da evitare


la repulsione elettrostatica
- Temperatura stringente:sufficientemente elevata da
evitare legami idrogeno tra singoli filamenti ma non
troppo per favorire il riappaiamento
Il DNA non si riappaia nei due filamenti
originali, ma casualmente con altri
filamenti omologhi

IBRIDAZIONE
Due campioni di DNA da confrontare sono
denaturati completamente mediante
riscaldamento

Quando le due soluzioni sono mescolate e


la miscela viene raffreddata lentamente,
le catene di ogni campione si riassociano
con le loro catene complementari e
riacquistano la struttura a doppia elica

Se i due diversi DNA hanno


un’omologia di sequenza
significativa, essi tenderanno a
formare duplex o ibridi l’uno con
l’altro.

Quanto più alto sarà il grado di omologia,


tanto maggiore sarà il numero di ibridi che si
potranno formare
Ibridazione del
DNA su filtro
Ibridazione e sonde molecolari
Reazione di ibridazione in situ su cromosomi in
cellule in metafase
(FISH)
Reazioni di bridazione degli acidi nucleici :
DNA sonde – RNAsonde -
Sonde oligonucleotidiche

-Southern /Northern blot:sonde marcate con isotopi


radioattivi

-Ibridazione in situ di cromosomi in metafase (FISH)


sonde marcate con molecole fluorescenti

-Ibridazione inversa su filtro: sonde coniugate con


biotina-avidina (rivelazione enzimatico-colorimetrica)