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L'organizzazione del laboratorio

di biologia molecolare:
gli spazi, i percorsi, i controlli

dott.ssa Sara Masci


Quando si progetta un
laboratorio di BM bisogna
rispettare dei criteri di
sicurezza che tutelino
l'OPERATORE e che al
tempo stesso garantiscano
l' EFFICIENZA DEI
RISULTATI.
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La prima cosa da fare per ridurre il
rischio di contaminazione (FP) è
SUDDIVIDERE l'ambiente di lavoro
in due blocchi separati: una zona di
PRE-AMPLIFICAZIONE e una zona
di POST-AMPLIFICAZIONE.
Le due zone possono essere
mantenute distinte ad es. con aree
diverse e dedicate, non comunicanti
distribuite lungo un corridoio
comune.
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Le aree di lavoro:
AREA PRE AREA POST

Area prep. Area


Area post
Reagenti estrazione Area di
Amplificaz.
E mix di Acidi amplificaz.
E lettura
amplificaz. nucleici

Il lavoro va organizzato seguendo il sistema


di flusso a senso unico dalla zona PRE alla
zona POST amplificazione.
CONTROLLO DELLE
CONTAMINAZIONI
La sensibilità della PCR talvolta può
essere un problema (amplifica la
sequenza bersaglio generando
trilioni di copie). Il saggio infatti è
pericolosamente sensibile alla
presenza nell'ambiente,
sull'operatore o sugli strumenti di
molecole di DNA provenienti da
precedenti amplificazioni.
Tipi di contaminazioni in
“agguato”
• Carry-over: l'apertura di una
provetta contenente l'amplificato
può dar luogo ad un aerosol che
rende l'ambiente inutilizzabile per
l'allestimento di una nuova reazione
• DNA esogeno: nel caso in cui
vengano amplificate regioni del
genoma umano anche l'operatore
può essere fonte di contaminazione
(cell. di desquamazione, capelli...)
• Cross-contaminazione: si verifica
durante l'allestimento della reazione,
un campione positivo ne contamina
uno negativo generando quindi un
falso positivo.
PRECAUZIONI GENERALI:
Per minimizzare il rischio di falsi positivi
in seguito a contaminazione è
necessario prendere una serie di
precauzioni:
1) GLI AMBIENTI
_ Tenere separate l'area di PRE-
Amplificazione da quella di POST-
amplificazione
_Utilizzare strumenti, materiali e
reagenti distinti
_ I campioni di DNA o RNA devono essere
preparati in un'area distinta da quella in cui
vengono manipolati i reagenti e da quella
in cui vengono analizzati gli amplificati.
2) REAGENTI: è buona norma aliquotare i
reagenti utilizzati per la PCR ( tampone,
primers, nucleotidi, enzima)
_ tutti i reagenti devono essere preparati,
aliquotati e conservati in un'area in cui non
ci sono prodotti amplificati.
3) PIPETTE: le normali pipette per
puntali monouso usate comunemente
in laboratorio sono fonte di
contaminazione. Si possono formare
infatti aerosol contenenti frammenti di
DNA che possono essere trasportati in
campioni negativi. Per eliminare
questa cross-reazione è necessario
l'uso di pipette con puntali contenenti
un filtro (barriera tra campione e
pipetta) o pipette ad espulsione
positiva con puntali dotati di pistone .
N.B. E' ASSOLUTAMENTE
INDISPENSABILE UTILIZZARE SET DI
PIPETTE DISTINTI NELLE DIVERSE
AREE.
4) TECNICA LABORATORISTICA
In tutte le varie fasi:
• Cambio frequente guanti
• Apertura attenta provette per
minimizzare aerosol ( short spin)
• Aggiungere il campione come ultimo
ingrediente della mix
• Chiudere la provetta dopo aver
dispensato il campione e prima di
passare al successivo
• Pulire le superfici di lavoro con
prodotti detergenti specifici.
CONTROLLI
Come in tutte le tecniche
laboratoristiche è necessario
allestire sia un C+ che un C- per
evidenziare eventuali falsi positivi.
• IL CONTROLLO POSITIVO
Non deve avere troppe copie
bersaglio o costituirebbe una
pericolosa fonte di contaminazione (
generando quantità enormi e non
necessarie di sequenze di DNA)
CONTROLLI
Generalmente il controllo positivo è
costituito da un plasmide
contenente la sequenza bersaglio
e sono sufficienti 100-1000
molecole per ottenere un segnale
positivo dopo l'amplificazione.
• IL CONTROLLO NEGATIVO
Nell'allestimento di ogni reazione è
necessario aggiungere uno o più
controlli negativi, interposti fra i
campioni.
_Nell'allestimento del controllo negativo
vanno messi tutti i componenti della
miscela di PCR tranne il DNA
bersaglio. Oltre questi, può essere
aggiunto un campione sicuramente
negativo.
_Per controllare la specificità, può
essere utile includere anche controlli
contenenti sequenze di DNA che non
corrispondono alla sequenza da
amplificare.
INATTIVAZIONE DEL DNA
AMPLIFICATO
Può avvenire a due livelli: durante
l'allestimento di una nuova reazione
(inattivazione pre-PCR) o al termine
della reazione, prima della fase di
rivelazione dei prodotti amplificati
(post-PCR)
• INATTIVAZIONE pre-PCR
Una di queste strategie è basata sui
sistemi di restrizione-modificazione
e di taglio-riparo delle cellule. Per
poter distinguere il DNA bersaglio
da quello derivante da precedenti
PCR, nella miscela di reazione la
deossitimidinatrifosfato (dTTP)
viene sostituita con la
deossiuridinatrifosfato (dUTP) che
viene incorporata nel DNA
amplificato.
Nell'allestimento di una nuova reazione
viene aggiunto l'enzima N-glicosilasi
(UNG) che prima dei cicli di
amplificazione catalizza la rottura del
legame fosfodiesterico dell'uracile dal
deossiribosio nel DNA contaminante(
eventualmente presente) lasciando
intatto il DNA nativo contenente dTTP.
• Il DNA risultante, privo degli uracili, è
suscettibile all'idrolisi in soluzione
alcalina (Tampone) e alle alte t°.
Altri metodi di inattivazione pre-
PCR
• Irradiazione della miscela di reazione con
raggi UV a bassa lunghezza d'onda (tra
254 e 300 nm per 20 min.)
• Digestione con DNAsi I o con enzimi di
restrizione che taglino all'interno del
frammento contaminante
Tuttavia tali sistemi hanno dei limiti:
• Non efficaci per quantità superiori a 10³
molecole
• La miscela di reazione non deve
contenere né la DNA polimerasi né il
campione.
INATTIVAZIONE POST-PCR
• Inattivazione tramite modificazione
fotochimica del DNA dopo
l'amplificazione:
la presenza nel filamento stampo di
una base alterata, per via
fotochimica, blocca l'estensione della
Taq polimerasi. Alla miscela possono
essere aggiunti reagenti in grado di
rimanere stabili durante la PCR e
poi, una volta foto-attivati, di formare
degli “adducts” che impediscono al
DNA di fare da stampo.
BIBLIOGRAFIA
1. Marin MG, ed. Diagnostica di laboratorio. Tecniche di
amplificazione genica: dal laboratorio alla pratica clinica.
Milano: Sorbona publ., 1999.
2. Verna R. La diagnostica di laboratorio con i metodi della
biologia molecolare. Padova: Piccin Editore, 1998.
3. DNA Learning Center Academy (sito internet).
4. Labinformatica (sito internet)
5. Istruzione operativa del laboratorio di biologia molecolare
dell' ospedale di Teramo.
GRAZIE
PER
L'ATTENZIONE!
Leggi e norme ISO applicabili ai
laboratori di biologia molecolare
Recepimento dec. Com. 2000/608/CE concernente le note orientative
per la valutazione del rischio di cui all.to III della Direttiva
90/219/CEE sull’impiego confinato di microrganismi geneticamente
modificati. - Decreto 25/09/2001
Integrazione Allegato II parte B Decreto lgs 206/2001 concernente
l’impiego confinato di microrganismi geneticamente modificati.-
Gazzetta Ufficiale 20/04/2006
Attuazione delle direttive 2004/9/CE e 2004/10/CE concernenti
l’ispezione e la verifica della buona pratica di laboratorio (BPL). -
Decreto Legislativo n.50 del 2/03/2007
Sistemi di Gestione per la Qualita’- Fondamenti e Terminologia UNI EN
ISO 9000
Sistemi di Gestione per la Qualita’- Requisiti UNI EN ISO 9001
Sistemi di Gestione per la Qualita’-Linee guida per il miglioramento
delle prestazioni UNI EN ISO 9004
Linee guida per gli audit dei sistemi di gestione per la qualita’ e/o di
gestione ambientale UNI EN ISO 19011
Gestione per la Qualita’- Indicatori e quadri di Gestione per la
Qualita’. Linee guida generali. - UNI 11097
Sistemi di Gestione per la Qualita’- Linee guida per la
soddisfazione del cliente e per la misurazione degli indicatori del
processo. - UNI 11098
Sistemi biologici per la prova della sterilizzazione e dei processi di
sterilizzazione. Sistemi particolari per sterilizzatrici a calore umido.
- UNI EN 866-3
Biotecnologie. Guida per la valutazione della purezza, dell’attività
biologica e della stabilità dei prodotti a base di microrganismi. -
UNI EN 12689
• Biotecnologie. Laboratori di ricerca, sviluppo e analisi. Livelli di
contenimento di laboratori microbiologici, aree di rischio, situazioni
e requisiti fisici di sicurezza. - UNI EN 12128
• Requisiti generali per la competenza dei laboratori di prova e
taratura UNI CEI EN ISO/IEC 17025
• Biotecnologie. Laboratori di ricerca, sviluppo e analisi. Linee
guida per le operazione dei laboratori di biotecnologie. - UNI EN
12741
• Biotecnologie. Laboratori di ricerca, sviluppo e analisi. Linee
guida per il trattamento, l’inattivazione ed il controllo dei rifiuti. - UNI
EN 12740
• Biotecnologie. Attrezzature. Guida sulle procedure per il
campionamento e l’inoculazione. - UNI EN 13092
• Biotecnologie. Criteri di prestazione per le prestazioni di
sicurezza microbiologica. - UNI EN 12469
• Biotecnologie. Criteri di prestazione per gli elementi filtranti e per
i filtri. - UNI EN 13091
• Biotecnologie. Attrezzature. Linee guida nelle procedure di prova
per la tenuta. - UNI EN 12298
• Biotecnologie. Criteri di prestazione per recipienti. Dispositivi di
protezione alla pressione. - UNI EN 13311-2