IL LINGUAGGIO DELLA VITA

B2
Esperimenti di
Griffith (1928)

Un principio
trasformante
converte il
ceppo R in S
Lesperimento
di Avery

Nel 1944 si capisce che il

fattore di trasformazione
dellesperimento di Griffith
(1928) il DNA.

3
DNA COME MATERIALE GENETICO:
ESPERIMENTI DI HERSHEY E CHASE (1952)

Struttura del Infezione del batteriofago T2

batteriofago T2

Testa
(capside)

DNA
Coda

Fibre DNA
della coda

Canale attraverso
il quale viene
Iniettato il DNA
 Ciclo biologico del batteriofago T2

I componenti virali vengono

assemblati a formare nuove
particelle fagiche

Adsorbimento Iniezione Sintesi Liberazione

dellacido nucleico
 Le fasi della moltiplicazione dei batteriofagi

1. Adsorbimento

2. Iniezione dellacido nucleico

4. Replicazione del genoma virale

3.

5. Sintesi delle proteine capsidiche

4.

6. Assemblaggio del capside e impacchettamento del genoma virale

5.

6. Rilascio dei virus maturi (lisi)

7.
Moltiplicazione del batterio E.coli in presenza di radioisotopi Quale parte del fago, il DNA o
la componente proteica, il
materiale genetico ?

Infezione dei batteri radioattivi con I fagi

ESPERIMENTI DI HERSHEY E
CHASE(1952)

Infezione dei batteri co I fagi radioattivi, agitazione, centrifugazione

e misurazione della radioattivit
Involucri proteici
Vuoti radioattivi

Radioattivit nel
surnatante

Radioattivit nel
sedimento

Radioattivit concentrata
nelle cellule batteriche
STRUTTURA CHIMICA DEGLI ACIDI NUCLEICI

Gruppo Zuccheri Basi azotate

fosfato pentosi Purine Pirimidine

Componenti dei nucleotidi nel DNA e nellRNA: gruppo fosfato, zuccheri pentosi e basi
azotate.
I biochimici gi sapevano che il DNA era un polimero di nucleotidi

Ogni nucleotide formato da:

una molecola di zucchero (desossiribosio );
un gruppo fosfato;
una base azotata.
La cristallografia ai raggi X (1952 R. Franklin) ha rivelato la natura
elicoidale della struttura del DNA

La posizione degli atomi nel DNA pu essere dedotta dal quadro di diffrazione dei raggi
X che lo hanno attraversato

L immagine di diffrazione ottenuta compatibile con una struttura elicoidale

 Erwin Chargaff
Per primo misur accuratamente la percentuale dei
quattro nucleotidi nel DNA
 Le regole di Chargaff

La composizione in basi del DNA varia da una specie allaltra

Molecole di DNA isolate da tessuti diversi di una stessa specie hanno la stessa
composizione in basi

Questa non si modifica con la nutrizione, et o modificazioni dellambiente

In tutte le molecole di DNA il numero di residui di T uguale a quello di A, e il numero di

residui di G uguale a quello di residui di C .Quindi la quantit di purine uguale alla
quantit di pirimidine: [A]+[G] = [T]+[C]
Watson e Crick descrissero la struttura della doppia elica del
DNA nel 1953.
DIAMETRO UNIFORME: 2 nm

A DOPPIO FILAMENTO APPAIAMENTO COMPLEMENTARE

DELLE BASI

Legame idrogeno
La larghezza di 2 nm si concilia solo con l appaiamento fra
una purina ed una pirimidina
 estremit 5
La struttura del DNA
Watson e Crick descrissero la struttura estremit 3
della doppia elica del DNA nel 1953.

A DOPPIO FILAMENTO

DIAMETRO UNIFORME: 2 nm

AVVOLGIMENTO DESTROGIRO:
Osservandola dallalto pare
avvolgersi in senso orario

larghezza:2 nm

estremit 3 estremit 5
La struttura del
DNA

ANTIPARALLELA: Le due
catene hanno direzione
opposta
I nucleotidi allinterno di
ciascuna catena sono uniti
da LEGAMI COVALENTI,
mentre quelli che uniscono i
due filamenti appaiati sono
LEGAMI A IDROGENO.
Il modello di Watson e Crick suggeriva
che una duplicazione del DNA di tipo
semiconservativo

Filamento
originale

Filamento
stampo

Filamento
originale
LA REPLICAZIONE DEL DNA

POSSIBILI
IPOTESI
ALTERNATIVE

Quale dei tre modelli quello reale??

 La risposta stata data da
Meselson e Stahl

Matthew Meselson Franklin Stahl

Come possibile distinguere il DNA
parentale da quello neosintetizzato???

Il DNA costituito da nucleotidi.

Le basi azotate contengono azoto.

La forma pi comune di azoto 14N con 7 protoni

e 7 neutroni
15N detto azoto pesante, poich possiede 8
neutroni.

Il trucco dellazoto leggero-pesante ci consente di avere a disposizione un mezzo per

distinguere le molecole di DNA.
Infatti: possiamo fare in modo di avere il DNA di partenza in cui lazoto presente
solo sottoforma di azoto pesante, mentre il DNA neosintetizzato presenta solo azoto
leggero
 Escherichia coli
Cellule batteriche di facile coltivazione in
laboratorio.
Si replicano ogni 20 minuti.
Nessun problema di estrazione di DNA
(abbondante e facile da ottenere)

Escherichia coli si coltiva in laboratorio in beute, in cui si

mette lopportuno terreno di crescita.

Se il terreno contiene solo azoto pesante, i batteri

incorporeranno solo azoto pesante. In altre parole: i batteri
avranno un DNA pesante. E viceversa.
 1958. Meselson e Stahl dimostrano che il DNA si replica
in maniera semi-conservativa
Trasferimento
Coltivazione dei batteri in
dei batteri in terreno Replicazione in Replicazione in
terreno contenente14N terreno con 14N terreno con 14N
contenente
15N

si misura la
densit delle
molecole di DNA

tutte catene tutte catene met intermedie,

pesanti intermedie met leggere
 Escherichia coli: Meselson e Stahl
Crescita in terreno
contenente 15N

Prima replicazione in terreno contenente 14N

Replicazione Replicazione Replicazione
conservativa semiconservativa dispersiva

Risultati attesi dalla I generazione

(banda intermedia)

Si formano 2 bande Si forma 1 banda Si forma 1 banda

In centrifugazione In centrifugazione In centrifugazione
(NON osservato) ( osservato) ( osservato)

Seconda replicazione in terreno contenente 14N

Risultati attesi dalla II generazione

(banda intermedia banda leggera)

Si formano 2 bande Si forma 1 banda

In centrifugazione In centrifugazione
( osservato) (NON osservato)
Conclusioni: la replicazione non pu essere
n conservativa n dispersiva
 La replicazione richiede numerosi enzimi e fattori proteici.
Il complesso chiamato REPLISOMA

I protagonisti della replicazione del DNA

Elicasi: svolge la doppia elica

Topoisomerasi: impediscono al DNA di aggrovigliarsi (operano i
tagli e poi risaldano i filamenti, levano i superavvolgimenti)
SSB proteins :si legano ai filamenti singoli per evitare che si
ricostituisca la doppia elica
RNA Primasi: aggiunge piccoli primier di RNA al filamento
stampo
DNA polimerasi III: lega nuovi nucleotidi per formare il filamento
stampo
DNA polimerasi I: rimuove lRNA primier per formare il filamento
corretto
DNA Ligasi: congiunge i frammenti di DNA adiacenti
La duplicazione del DNA inizia presso specifici punti
detti punti di origine della duplicazione

punto di origine della duplicazione

DNA a doppia elica

Apertura dellelica di DNA

Bolla di replicazione
4.12 REPLICAZIONE DEL DNA

Figura 4.25
(A) Replicazione bidirezionale
del DNA di un cromosoma
batterico circolare;
(B) replicazione bidirezionale
del DNA di un cromosoma
eucariotico lineare.
Negli eucarioti vi sono diverse origini di replicazione, altrimenti la
replicazione di un intero cromosoma richiederebbe moltissime ore

punto di origine
della duplicazione

Bolla di
replicazione
Bolla di
replicazione

Forcella replicativa
I protagonisti della replicazione del DNA
Topoisomerasi:
impedisce al DNA
DNA polimerasi III: di aggrovigliarsi

Elicasi: apre la
doppia elica

SSB proteins :si legano ai

filamenti singoli per evitare
RNA Primasi: che si riformi la doppia
sintetizza un elica
primier
DNA polimerasi III:
La separazione dei filamenti di una struttura elicoidale
genera dei superavvolgimenti che devono essere rimossi
per non rallentare ed infine bloccare il processo di
duplicazione.

superavvolgimenti
Le topoisomerasi (o DNA girasi)
rimuovono i superavvolgimenti , prodotti
dallapertura del DNA,tagliando e
risaldando i filamenti di DNA
Le DNA polimerasi si lega al filamento stampo
Ha una forma simile ad una mano semiaperta:
Nel palmo c il sito attivo dellenzima dove il substrato si avvicina allo stampo
Le dita riconoscono la forma delle 4 basi
La polimerizzazione del DNA avviene sempre in direzione 5-3:
i nucleotidi vengono aggiunti sempre allestremita 3-OH del
filamento che si sta sintetizzando
Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2006
 SSB
Topoisomerasi forcella di
duplicazione.

Elicasi

Direzione della forca replicativa

La duplicazione del DNA inizia da una specifica sequenza di nucleotidi detta punto di
origine della duplicazione.
Un particolare enzima, detto elicasi, rompe i legami idrogeno tra i nucleotidi, aprendo la
doppia elica come una cerniera lampo, si forma cos un struttura a Y, detta forcella di
duplicazione.
Proteine di legame (SSB) si legano ai filamenti singoli per evitare che si riformi la doppia
elica.
 filamento veloce

Topoisomerasi

Elicasi
Primasi

filamento lento
La DNA polimerasi non in grado di iniziare la sintesi ex novo di catene
polinucleotidiche, ma deve sempre trovare un frammento di catena con un OH
libero in posizione 3a cui attaccare il nucleoside successivo... quindi, ha
bisogno di un . innesco (primer) per dare inizio alla sintesi.

La primasi si lega al filamento stampo e sintetizza un RNA primer.

Quando il primer completato, la RNA primasi viene rilasciata.
 filamento veloce

DNA polimerasi III

filamento lento

La DNA polimerasi III si lega e aggiunge deossiribonucleotidi al primer di RNA

 filamento veloce

frammenti di Okazaki

filamento lento

La sintesi del filamento veloce continua in direzione 5 3

La sintesi del filamento lento produce frammenti in direzione 5 3 chiamati

frammenti di Okazaki

Sul filamento lento sono sintetizzati molti primer seguiti da frammenti di Okazaki
 DNA polimerasi III DNA polimerasi I

La DNA polimerasi I rimuove gli RNA primers e sintetizza i frammenti di DNA

mancanti.

La DNA ligasi unisce i frammenti di Okazaki

LA REPLICAZIONE DEL DNA
filamento guida
LA REPLICAZIONE DEL DNA

(5-14 nucleotidi) filamento lento

I due filamenti antiparalleli vengono replicati
simultaneamente in entrambe le direzioni

Direzione del movimento

della forca di replicazione

Filamenti di
nuova sintesi

Filamento veloce: sintetizzato senza interruzione nella stessa

direzione in cui si sposta la forcella di duplicazione.

Filamento lento: sintetizzato in direzione opposta alla forca di

replicazione.
Bolla di replicazione

Origine di replicazione

Filamento
veloce Filamento
lento

Replicazione Replicazione
continua discontinua

Replicazione Replicazione
discontinua continua

Filamento
Filamento veloce
lento
 E alla fine?
La replicazione terminale del
filamento lento rimane incompleta

Manca lestremit 3OH utilizzabile

per colmare il gap lasciato dalla
rimozione dellinnesco

Rischio catena sempre pi corta ad

ogni evento replicativo
 Telomeri
Sequenze ripetute allestremit dei
cromosomi
costituiti da alcune migliaia di
ripetizioni di sequenze brevi
nelluomo: (TTAGGG)n
Proteggono il cromosoma dalla
degradazione ad opera di nucleasi
 Telomeri
Nelle cellule germinali e nelle cellule
staminali la lunghezza dei telomeri
rimane costante ad ogni divisione
cellulare grazie allattivit della
telomerasi
Nelle cellule somatiche differenziate ad
ogni replicazione del DNA il telomero
subisce un accorciamento
La riduzione dei telomeri dopo n
divisioni provoca arresto della crescita
cellulare e apoptosi
La telomerasi aggiunge alle estremit cromosomiche
blocchi ripetuti della sequenza telomerica

a) Estremit cromosomica con

interruzione in 5 lasciata dalla
rimozione del primer

b) Legame della telomerasi alla

sequenza telomerica sporgente alla
fine del cromosoma

c) Sintesi di un segmento di DNA di tre

nucleotidi allestremit del
cromosoma, usando laRNA stampo
della telomerasi

d) La telomerasi si muove in modo che

lo stampo di DNA pu legarsi alla
sequenza TTG neosintetizzata in modo
diverso
e) La telomerasi catalizza la sintesi
di una nuova ripetizione telomerica
usando lo stampo di RNA. Il
processo viene ripetuto per
aggiungere pi ripetizioni
telomeriche

f) Dopo che la telomerasi si

dissociata , viene sintetizzato un
RNA primer e la DNA polimerasi pu
riempire il gap

g) Il risultato un cromosoma pi
lungo
I meccanismi di riparazione del DNA
Correzione di bozze:
le proteine del complesso di duplicazione correggono
gli errori a mano a mano che la DNA polimerasi li compie.
I meccanismi di riparazione del DNA
Riparazione dei disappaiamenti:
delle proteine controllano il nuovo filamento di DNA e
correggono gli errori di appaiamento.
I meccanismi di riparazione del DNA
Riparazione per escissione:
appositi enzimi intervengono per eliminare e sostituire
i pezzi difettosi del nuovo filamento.