Zoologia generale

La duplicazione del DNA

La prova che un gene è formato da DNA

Negli anni ’20 si sapeva che i cromosomi consistevano di DNA e proteine.

Un nuovo colorante (Feulgen – si pronuncia folghen) marcava specificatamente il DNA ed ha

fornito evidenze circostanziate sul fatto che il DNA sia il materiale genetico.

- La colorazione più forte si trovava nucleo facendo risaltare l’organizzazione dei cromosomi;

- Variava tra le specie -> differenze nell’intensità del colore delle bande dei cromosomi;

- Giuste quantità -> cellule diploidi (somatiche) e aploidi (gameti).

Le prove sperimentali provengono da lavori su batteri e virus.

Ipotesi: una sostanza contenuta nelle cellule batteriche morte è in grado di trasformare
geneticamente cellule batteriche vive.

Esperimento effettuato da Griffith nel 1920.

Utilizzò un batterio, causa della polmonite, iniettandoli in ratti sperimentali.

Esistevano dei ceppi virulenti, che causavano la morte del ratto infettavo, e dei ceppi non virulenti,
ovvero che non uccidevano il ratto.

Ciò che fece fu quello di unire i batteri non virulenti con dei batteri virulenti morti per un eccesso
di calore.
I batteri non virulenti che sono stati in contatto con i batteri virulenti morti, quando iniettati,
causavano la morte del soggetto interpretazione: una sostanza chimica proveniente da un
batterio virulento ha infettato, ovvero è stata trasferita, i batteri non virulenti facendo acquisire la
capacità di generare malattia -> caratteristica dei batteri virulenti.
Per identificare questa sostanza, Oswald Avery ha trattato i campioni per distruggere diverse
molecole.

Proteine distrutte -> sì trasformazione

RNA distrutto -> sì trasformazione
DNA distrutto -> NO trasformazione

Nel 1944 si dimostra così che il fattore genetico è costituito dal DNA e non dalle proteine.

Il materiale genetico è nel DNA o nelle proteine?

Esperimento fatto da Hershey e Chase realizzato nel 1952.
Dimostrano che il DNA e non le proteine costituiscono il materiale genetico.

Hanno utilizzato dei virus particolari, i “fagi”, costituiti da una struttura esterna proteica e
all’interno si ritrova un tratto di DNA.
I Fagi T2 infettano dei batteri (gli Escherichia coli).
Chi ha scoperto la struttura del DNA?
Tra il 1951 e il 1953 la ricercatrice Rosalind Franklin studiò con la tecnica di diffrazione a raggi X la
struttura tridimensionale dei cristalli di DNA.
I suoi risultati rivelarono che il DNA aveva una struttura elicoidale.

Gli esperimenti con la cristallografia ai raggi X fornirono la prova decisiva per comprendere la
struttura della molecola di DNA.

La fotografia permise grazie a Watson e Crick di dedurre la struttura a doppia elica del DNA.

La specificità dell’appaiamento delle basi del DNA del modello a doppia elica ha subito suggerito ai
ricercatori quale poteva essere il possibile meccanismo per la replicazione dell’informazione
genetica.

Si è capito che uno dei due filamenti poteva servire da stampo per la sintesi del filamento
complementare.

Nei primi anni ’50 Erwin Chargaff notò che in qualsiasi campione di DNA la quantità di purine era
uguale a quella delle pirimidine.
 Grazie alle immagini di Franklin
sappiamo di avere delle basi interne e
che esiste uno scheletro di zucchero-
fosfato esterno.

Nel 1953 Watson e Crick proposero il

modello tridimensionale del DNA.

STRUTTURA DEL DNA

Gli scheletri dei due filamenti di DNA sono più vicini tra loro su un lato della doppia elica ->
formazione solco minore
Rispetto all’altra -> formazione del solco maggiore

Ci sono quattro possibili configurazioni delle coppie di basi nelle scanalature.

STRUTTURA E FUNZIONE DEL DNA

Struttura doppia elica -> fondamentale per la funzione del DNA;

1. Memorizza le informazioni genetiche: con milioni di nucleotidi, le sequenze di base

memorizzano un enorme quantità di informazioni;

2. Suscettibile alle mutazioni: alterazioni nelle sequenze di base;

3. L’informazione genetica è espressa come la sequenza fenotipo – nucleotidica determina la

sequenza di aminoacidi nelle proteine;

4. Precisamente replicato nella divisione cellulare per associazione complementare delle basi.

LA REPLICAZIONE DEL DNA

Il meccanismo di replicazione è stato confermato replicando il DNA in una provetta. L’importante è
che ci siano gli elementi costitutivi:

- Deossiribonucleosidi trifosfati dATP, dCTP, dGTP e dTTP;

- Le molecole di DNA servono come modelli per la sequenza di nucleotidi;

- Enzima DNA polimerasi ;

- Dev’esserci equilibrio tra sali e un tampone di pH.

Questi esperimenti hanno confermato che il DNA contiene le informazioni necessarie per la
propria replicazione.

I modelli
1) Semiconservativo: ogni filamento originario è un
modello. Le nuove molecole hanno un filamento vecchio
e uno nuovo.

2) Conservativo: la molecola originale funge da stampo.

3) Dispersivo: gli stampi sono frammenti di DNA -> vecchie e

nuove parti sono assemblate in nuove molecole.
L’esperimento, quindi, concluse che :

LA REPLICAZIONE DEL DNA

Prima che una cellula si divida e formi due nuove cellule, il suo DNA viene DUPLICATO in modo che
ogni nuova cellula riceva una copia completa dell’informazione genetica della cellula originaria.

La struttura a doppia elica offre un sistema intrinseco per copiare correttamente l’informazione
genetica.

Se le due catene di una molecola di DNA vengono separate, ognuna di esse può essere usata come
modello per produrre un filamento complementare.

La duplicazione (replicazione) del DNA coinvolge un elevato numero di enzimi ed altre proteine,
che agiscono in maniera COORDINATA.

La doppia elica dev’essere svolta e i due filamenti devono essere separati attraverso la rottura dei
legami idrogeno delle basi appaiate.
Ciascuna catena vecchia funziona come stampo per la sintesi di una nuova.

I nuovi nucleotidi vengono assemblati in una nuova catena complementare rispetto quella vecchia.

I legami che collegano i gruppi fosfato dei nucleosidi trifosfato si rompono rilasciando ENERGIA
che guiderà la reazione.

La DNA polimerasi catalizza l’aggiunta di un nucleoside trifosfato all’estremità 3’ di un filamento di

DNA in accrescimento con liberazione di 2 gruppi fosfato.
Nelle cellule umane, la DNA polimerasi , aggiunge 50 nucleotidi al secondo, nei batteri invece 500
nucleotidi al secondo.

La perdita di 1 nucleotide su 1000 è sufficiente a rendere non un funzionale un gene. Questo vuol
dire che se è presente un errore verrà a mancare un enzima causando così la non funzionalità di
un gene.
La replicazione del DNA richiede l’azione congiunta di molti enzimi e proteine ed è un meccanismo
molto complesso, ancora non del tutto chiaro.

La replicazione del DNA inizia quando un grande complesso proteico, il complesso di PRE-
REPLICAZIONE, si lega a una regione chiamata Origine di replicazione. (ori)

Punto di origine, è presente il complesso di replicazione.

Inizia in punti specifici della molecola del DNA chiamati “origini di replicazione” dove la doppia
elica si svolge.

Nel batterio E. coli, il DNA viene svolto e la replicazione procede in entrambe le direzioni,
formando due forcelle di replica.

Le DNA elicasi sono gli ENZIMI che aprono la doppia elica utilizzando l’energia derivante
dall’idrolisi dell’ATP.

I due filamenti si replicano contemporaneamente e si forma una struttura a Y chiamata forca di

replicazione.

Una volta che l’elicasi ha aperto la doppia elica si legano ai due singoli filamenti le proteine SSB
(single strand biding proteins) che stabilizzano tali filamenti in posizione aperta.

In un filamento si procede normalmente con la sintesi 5’ -> 3’ mentre nel altro si ha tutte le volte
una deposizione di un primer e una deposizione di una parte di filamento sempre in direzione 5’ -
>3’.
Nel primo, la direzione di sintesi segue quella di apertura del filamento, nell’altro caso trattandosi
di filamenti che vanno in maniera opposta, la sintesi che avviene sempre da 5’->3’ comporta un
avanzamento di tipo retrogrado che non è continuo.
La DNA polimerasi richiede un primer, un filamento di innesco…solitamente RNA da 5 a 14
nucleotidi.

Il primer è complementare al DNA stampo ed è sintetizzato da un enzima chiamato primasi.

La DNA polimerasi, quindi, aggiunge nucleotidi all’estremità 3’ fino a quando quella sezione è
completa e il primer viene degradato.

Le DNA polimerasi sono più grandi dei loro substrati, i dNTP e il DNA del modello.
L’enzima ha la forma di una mano destra aperta: il “palmo” mette in contatto il sito attivo e i
substrati.
Le “dita” riconoscono le basi nucleotidiche.
Alla forcella di replicazione, il DNA si apre come una cerniera in una direzione.

Il filamento guida (leading strand) cresce con continuità mentre la forcella si apre in direzione 5’ ->
3’.

Il filamento ritardato (lagging strand) richiede la sintesi di corti frammenti (ciascuno in direzione
5’->3’) detti di Okazaki. Ogni frammento richiede il suo primer
IL FILAMENTO RITARDATO

La DNA polimerasi I sostituisce quindi il primer con il DNA.

Il legame fosfodiestere finale tra i frammenti è catalizzato dalla DNA ligasi.

La DNA polimerasi funziona velocemente perché:

a. Sono processive, catalizzano molti legami ogni volta che si legano al DNA (idem per RNA
polimerasi);
b. Il complesso DNA pol- DNA è stabilizzato da una pinza scorrevole, una proteina che
mantiene l’enzima e il DNA a stretto contatto.
Negli eucarioti, il complesso di replicazione, rimane fermo mentre il DNA scorre (entra nel
complesso come una molecola a doppio filamento ed emerge come due molecole a doppio
filamento.

I frammenti di Okazaki comprendono 1000/2000 nucleotidi nel batterio E.coli e 100/200 nucleotidi
negli eucarioti.

I TELOMERI

I telomeri sono zone ripetute di DNA che possono essere molto lunghe.

I cromosomi degli eucarioti hanno sequenza ripetitive alle estremità chiamate TELOMERI.
Nell’uomo la sequenza è TTAGGG, ripetuta circa 2500 volte.
Impedisce al sistema di riparazione del DNA di interpretare la fine del cromosoma come una
rottura.

Su filamenti in ritardo, quando viene rimosso il primer Okazaki terminale, nessun DNA può essere
sintetizzato per sostituirlo (nessuna estremità 3’).

Il breve frammento di DNA viene rimosso e il cromosoma diventa più corto ad ogni replicazione.
Dopo diverse divisioni, i geni possono essere persi e la cellula muore.

La telomerasi catalizza l’aggiunta di telomeri persi.

GLI ERRORI
La DNA polimerasi commette errori mentre replica il DNA, per questo motivo si sono sviluppati
meccanismi di correzione dei nucleotidi collocati nel posto sbagliato.
Quando non funzionano bene possono verificarsi gravi malattie.

Le DNA polimerasi inizialmente fanno molti errori e il DNA può essere danneggiato da sostanze
chimiche quali radiazioni UV ed altre minacce.

Il tasso di errore e 1 ogni 100.000 basi  60.000 mutazioni a ciclo.

Le cellule hanno 3 meccanismi di riparazione:

1) Correzione di bozze;
2) Riparazione degli appaiamenti scorretti;
3) Riparazione per escissione.
CORREZIONE DI BOZZE

Poiché la DNA polimerasi aggiunge un nucleotide a un filamento in crescita, può riconoscere

coppie non corrispondenti.
Se le basi sono accoppiate in modo errato, il nucleotide viene rimosso.

RIPARAZIONE DEGLI APPAIAMENTI SCORRETTI

Il DNA appena replicato viene scansionato per errori da altre proteine e i disallineamenti possono
essere corretti.
Se la riparazione fallisce, il DNA risulta alterato.

RIPARAZIONE PER ESCISSIONE

Gli enzimi analizzano costantemente il DNA per le basi danneggiate: vengono asportati e la DNA
polimerasi I aggiunge quelli corretti.
La mancanza di meccanismi di riparazione per l’escissione può portare a tumori della pelle.
La riparazione del DNA è possibile perché è una molecola costituita da due filamenti
complementari.
Finché una delle due catene resta illesa, potrà essere usata come stampo dagli enzimi di
riparazione per sostituire una regione alterata nella catena complementare.

Se invece sono alterati entrambi i filamenti, la lesione NON è riparabile.

In questo caso avremo delle mutazioni nel corredo genetico dell’individuo.
Le mutazioni sono CAMBIAMENTI ereditabili che alterano le molecole di DNA.