I.

Judul Praktikum: Isolasi DNA Epithelial Mulut

II. Hari/ Tanggal Praktikum: Rabu/ 21 November 2018
III. Waktu Praktikum: 09.30 - 12.00 WIB
IV. Tujuan Praktikum: mampu mengerjakan isolasi DNA sesuai prosedur, dengan
sampel DNA yang diambil dari sel epithelial mulut.
V. Dasar Teori:
Pengertian dan Fungsi DNA

DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan

berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan.
DNA terdapat di nukleus, mitokondria, dan kloroplas. DNA memiliki struktur
helix utas ganda, yang mengandung komponen-komponen gula pentosa
(deoksiribosa), gugus fosfat, dan pasangan basa. Satu sel memiliki DNA yang
merupakan materi genetik dan akan diturunkan pada keturunannya (Tim, 2018).

Gambar 1. Struktur DNA

DNA mempunyai fungsi-fungsi yang sangat penting bagi tubuh kita. Hal
tersebut dikarenakan DNA merupakan molekul kehidupan utama di dalam sel
makhluk hidup. fungsi-fungsi tersebut adalah:

1. Tempat menyimpan dan menyalurkan informasi genetik suatu makhluk

hidup.
2. Fungsi heterokatalis, yaitu fungsi untuk melaksanakan pengaturan
pembuatan molekul-molekul lain yang penting dalam tubuh dan fungsi
 autokatalis, yaitu fungsi DNA untuk mereplikasi dirinya sendiri (Priyani,
2004).

Replikasi DNA

Reaksi perpanjangan rantai yang dikatalisis oleh DNA polimerase

merupakan suatu serangan nukleofilik ujung 3'-OH pada untai pemula (primer)
terhadap atom fosfor paling dalam dari deoksiribonukleosida trifosfat. Sebuah
jembatan fosfodiester terbentuk dan secara bersamaan pirofosfat dilepaskan.
Selanjutnya hidrolisis pirofosfat oleh pirofosfatase anorganik, yaitu enzim yang
tersebar luas, mendorong terlaksananya polimerasi. Perpanjangan rantai DNA
berlangsung arah 5  3' (Gambar 3.7). DNA polimerase mengkatalisis
pembentukan ikatan fosfodiester hanya bila basa pada nukleotida yang masuk
merupakan komplementer terhadap basa pada untai cetakan. Kemungkinan untuk
membentuk ikatan kovalen sangat rendah kecuali bila basa yang masuk membentuk
tipe pasangan basa Watson-Crick dengan basa pada untai cetakan (Rosana, 2014).

Gambar 2. Replikasi DNA

Isolasi DNA

Prinsip dasar isolasi total DNA/RNA dari jaringan adalah dengan

memecah dan mengekstraksi jaringan tersebut sehingga akan terbentuk
ekstrak sel yang terdiri atas sel-sel jaringan, DNA, dan RNA. Kemudian
ekstrak sel dipuri-fikasi sehingga dihasilkan pelet sel yang mengandung
DNA/RNA total (Faatih, 2009).
Terdapat 2 prinsip kerja isolasi DNA, yaitu sentrifugasi dan presipitasi.
Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan
berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga
substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang
lebih ringan akan terletak di atas. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di
dalam sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan
yang bervariasi, contohnya 2500 rpm (rotation per minute) atau 3000 rpm
(Faatih,2009)
Prinsip utama dari presipitasi adalah pertama, menurunkan kelarutan
asam nukleat dalam air. Hal ini dikarenakan molekul air yang polar
mengelilingi molekul DNA di larutan aquoeus. Muatan dipole positif dari
air berinteraksi dengan muatan negatif pada gugus fosfodiester DNA.
Interaksi ini meningkatkan kelarutan DNA dalam air. Isopropanol dapat
bercampur dengan air, namun kurang polar dibandingkan air. Molekul
isopropanol tidak dapat berinteraksi dengan gugus polar dari asam nukleat
sehingga isopropanol adalah pelarut yang lemah bagi asam nukleat; kedua,
penambahan isopropanol akan menghilangkan molekul air dalam larutan
DNA sehingga DNA akan terpresipitasi; ketiga, penggunaan isopropanol
dingin akan menurunkan aktivitas molekul air sehingga memudahkan
presipitasi DNA (Faatih, 2009).
Isolasi DNA memiliki beberapa tahapan, yaitu:
(1) Isolasi sel
(2) Lisis dinding dan membran sel
(3) Ekstraksi dalam larutan
(4) Purifikasi
(5) Presipitasi.
 Isolasi sel dari sel bukal dapat dilakukan dengan beberapa metode,
seperti cytobrush, mouthwash dan lain-lain. Pada metode cytobrush dapat
dilakukan dengan menggosok-gosokan cytobrush pada bagian sel epitel
bukal selama 15 detik dan dimasukan sel yang diperoleh ke dalam cryotube.
Untuk metode mouthwash dapat dilakukan dengan berkumur 10 mL air
yang steril selama 10 detik dan dimasukan ke dalam tabung sentrifuge
(Mulot, dkk; 2005)
Lisis dinding/ membrane sel diawali dengan proses perusakan atau
penghancuran membran dan dinding sel. Pemecahan sel (lisis) merupakan
tahapan dari awal isolasi DNA yang bertujuan untuk mengeluarkan isi sel.
Tahap penghancuran sel atau jaringan memiliki beberapa cara yakni dengan
cara fisik seperti menggerus sampel dengan menggunakan mortar dan pestle
dalam nitrogen cair atau dengan menggunakan metode freezing-thawing
dan iradiasi. Cara lain yakni dengan menggunakan kimiawi maupun
enzimatik. Penghancuran dengan menggunakan kimiawi seperti
penggunaan detergen yang dapat melarutkan lipid pada membran sel
sehingga terjadi destabilisasi membran sel. Sementara cara enzimatik
seperti menggunakan proteinase K seperti untuk melisiskan membran pada
sel darah serta mendegradasi protein globular maupun rantai polipeptida
dalam komponen sel (Lubis, 2013)
Pada tahapan ekstraksi DNA, seringkali digunakan chelating agent
seperti Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) yang berperan
menginaktivasi enzim DNase yang dapat mendenaturasi DNA yang
diisolasi, EDTA menginaktivasi enzim nuklease dengan cara mengikat ion
magnesium dan kalsium yang dibutuhkan sebagai kofaktor enzim DNAse.
DNA yang telah diekstraksi dari dalam sel selanjutnya perlu dipisahkan dari
kontaminan komponen penyusun sel lainnya seperti polisakarida dan
protein agar DNA yang didapatkan memiliki kemurnian yang tinggi (Lubis,
2013).
Ditahap purifikasi, dilakukan suatu proses sentrifugasi untuk
memisahkan komponen dalam campuran. Setelah sentrifugasi akan
terbentuk 2 fase yang terpisah yakni fase organik pada lapisan bawah dan
fase aquos (air) pada lapisan atas sedangkan DNA dan RNA akan berada
pada fase aquos setelah sentrifugasi sedangkan protein yang terdenaturasi
akan berada pada interfase dan lipid akan berada pada fase organic. Pada
tahapan ini ditambahkan pula buffer. Konsentrasi dan pH dari buffer yang
digunakan harus berada dalam rentang pH 5 sampai 12. Larutan buffer
dengan pH rendah akan mengkibatkan depurifikasi dan mengakibatkan
DNA terdistribusi ke fase organik selama proses deproteinisasi. Sedangkan
pH larutan yang tinggi di atas 12 akan mengakibatkan pemisahan untai
ganda DNA. Fungsi larutan buffer adalah untuk menjaga struktur DNA
selama proses penghancuran dan purifikasi sehingga memudahkan dalam
menghilangkan protein dan RNA serta mencegah aktivitas enzim
pendegradasi DNA dan mencegah perubahan pada molekul DNA. Untuk
mengoptimalkan fungsi larutan buffer, dibutuhkan konsentrasi, pH,
kekuatan ion, dan penambahan inhibitor DNAase dan detergen (Lubis,
2013).
Setelah proses purifikasi, DNA yang didapat dapat dipekatkan
melalui presipitasi.Pada umumnya digunakan etanol atau isopropanol dalam
tahapan presipitasi. Kedua senyawa tersebut akan mempresipitasi DNA
pada fase aquoeus sehingga DNA menggumpal membentuk struktur fiber
dan terbentuk pellet setelah dilakukan sentrifugasi. Presipitasi juga
berfungsi untuk menghilangkan residu-residu kloroform yang berasal dari
tahapan ekstraksi (Faatih, 2009).
Pada tahapan presipitasi ini, DNA yang terpresipitasi akan terpisah
dari residu-residu RNA dan protein yang masih tersisa. Residu tersebut juga
mengalami koagulasi namun tidak membentuk struktur fiber dan berada
dalam bentuk presipitat granular. Pada saat etanol atau isopropanol dibuang
dan pellet dikeringkan dalam tabung, maka pellet yang tersisa dalam tabung
adalah DNA pekat. Proses presipitasi kembali dengan etanol atau
isopropanol sebelum pellet dikeringkan dapat meningkatkan derajat
kemurnian DNA yang diisolasi. Pencucian kembali pellet yang dipresipitasi
oleh isopropanol dengan menggunakan etanol bertujuan untuk
menghilangkan residu-residu garam yang masih tersisa. Garam-garam yang
 terlibat dalam proses ekstraksi bersifat kurang larut dalam isopropanol
sehingga dapat terpresipitasi bersama DNA, oleh sebab itu dibutuhkan
presipitasi kembali dengan etanol setelah presipitasi dengan isopropanol
untuk menghilangkan residu garam (Faatih, 2009). Setelah dilakukan proses
presipitasi dan dilakukan pencucian dengan etanol, maka etanol kemudian
dibuang dan pellet dikeringkan, perlakuan tersebut bertujuan untuk
menghilangkan residu etanol dari pelet DNA (Rosana, 2014).

Gambar 3. Fasa dalam proses presipitasi DNA

Struktur mukosa mulut

Secara histologis mukosa mulut terdiri dari 2 lapisan. Yang pertama adalah
lapisan epitelium, yang melapisi di bagian permukaan luar, terdiri dari berlapis-
lapis sel mati yang berbentuk pipih dimana lapisan sel-sel yang mati ini selalu
diganti terus-menerus dari bawah, dan sel-sel ini disebut dengan stratified
squamous epithelium. Struktur epitel rongga mulut dari arah luar ke dalam adalah
stratum keratinosum,stratum granulosum,stratum spinosum,stratum basalis. Yang
kedua adalah lamina propria ini terdapat ujung-ujung saraf rasa sakit, raba, suhu
dan cita rasa (Putri, 2013).
Gambar 4. Struktur mukosa mulut

Berdasarkan strukturnya, sel bukal cukup baik jika digunakan sebagai

sampel sel. Karena dapat dengan mudah dikumpulkan. Menurut Feigelson, dkk
(2001) untuk melakukan proses pengumpulan sel dengan metode mouthwash
disarankan bagi relawan untuk makan dan minum setidaknya 1 jam sebelum
pengumpulan sel untuk menghindari adanya kontaminan dari sisa makanan dan
mikroorganisme lainnya. Serta tidak disarankan pula untuk menggosok gigi
sebelum pengumpulan sel karena akibat dari menggosok gigi akan menyebabkan
berkurangnya hasil DNA yang diperoleh sebanyak 40% (Putri, 2013).

VI. Alat dan Bahan

a. Alat:
- Gelas kimia 100 mL Iwaki glass 3 buah
- Gelas ukur 1 mL Iwaki glass 1 buah
- Pipet mikro Iwaki pyrex 1 buah
- Pro pipet 1 buah
- Tabung mikrosentrifuge 1 buah
- Mikrosentrifuge 1 buah
- Pipet 3 buah
- Tabung reaksi Iwaki glass 3 buah
- Mikropipet 1 buah
- Vortex 1 buah
b. Bahan:
- Aquades secukupnya
 - Air mineral secukupnya
- Minuman isotonic secukupnya
- Buffer Tris-EDTA secukupnya
- NaCl 2,5 M secukupnya
- Etanol secukupnya
- Sampel DNA secukupnya
VII. Alur Percobaan
1. Pengumpulan sel-sel
2. Pemecahan sel ( lisis sel) dan Pencernaan Protein

1. Pengendapan DNA