LA MUTAGENESI MIRATA AGLI OLIGONUCLEOTIDI CON DNA PLASMIDICO

In realtà l’efficienza è bassa

50/50?
METODO PER ARRICCHIRE IN PLASMIDI MUTAGENIZZATI

NaOH

Klenow+T4+lig
 LA MUTAGENESI CASUALE CON INNESCHI OLIGONUCLEOTIDICI
DEGENERATI

Permette di generare tutti i possibili cambiamenti di un amminoacido in un certo sito

Si usa quando non sono note le sostituzioni in grado di modificare la proteina bersaglio

VANTAGGI

Non è necessario conoscere in dettaglio il ruolo

di particolari aminoacidi nel funzionamento
di una proteina

Si possono ottenere mutanti inattesi dotati di

proprietà utili, poiché vengono sostituiti più
amminoacidi
Problema nell’utilizzo di vettori di espressione per procarioti per la
produzione di proteine da cDNA

Difficoltà nell’eseguire determinate modificazioni post-traduzionali

(glucosilazione= addizione di zuccheri a ser o asn
addizioni agli aminoacidi all’interno della proteina = fosforilazione, acetilazione,
carbossilazione γ, miristilazione, palmitilazione )

Si deve ricorrere a sistemi di espressione eucariotici

lievito cellule di insetto cellule di mammifero

 La produzione di proteine ricombinanti nelle cellule eucariote
permette:

-Di avere la produzione di proteine a partire da DNA contenente introni

-Di avere le corrette modificazioni post-traduzionali

Formazione di legami disolfuro
Processazione proteolitica
Glucosilazioni
Addizioni agli aa all’interno delle proteine

-Di studiare il ruolo biologico di una proteina

niente
 Un generico vettore di espressione per cellule eucariote

Elementi per la costruzione e per la propagazione in E.coli: ORIE

marcatore di selezione (Ampr)
multicloning site (CS)

Elementi per l’espressione del gene nella cellula eucariota: promotore

segnale di arresto e di poliA
Elemento per la replicazione in cellule eucariote (facoltativo): ORIeuk
Marcatore di selezione per cellule eucariote (con p e t)
 Saccharomyces cerevisiae

Vantaggi
-E’ innocuo
-Facile da coltivare
-Se ne conosce perfettamente la genetica
-Si ottengono facilmente mutanti
-Riesce a fare alcune modificazioni post-traduzionali
-Secerne poche proteine proprie (agevolazione nel recupero)
-Esiste un plasmide che cresce nel lievito
Alcuni vettori di clonazione ed espressione per lievito

(non ha ORI
per lievito)

Ha l’ORI di 2µm

Ha l’ARS e il
centromero
 Un derivato del plasmide 2µm

Terminazione e poliA
Marcatore di selezione

promotore

Grazie alla possibilità di avere facilmente mutanti per vie metaboliche importanti, come marcatori
si usano geni codificanti enzimi per il ripristino delle stesse
L’esportazione all’esterno del lievito, oltre a favorire il recupero delle proteine, aiuta ad
effettuare alcune modificazioni post-traduzionali, come le glicosilazioni

METODO PER INDURRE LA SECREZIONE DELLA PROTEINA BERSAGLIO

DNA per il codoni per gene estraneo

Peptide leader Lys-Arg

Peptide leader: peptide segnale per l’esportazione del Fattore α1

del tipo coniugativo del lievito

Lys-Arg: dipeptide riconosciuto da un’endopeptidasi del lievito

Durante l’esportazione la proteina

subisce le modificazioni post-
traduzionali
 Alcune proteine di interesse applicativo per l’uomo prodotte in S. cerevisae

Svantaggi:

-Poco efficiente nello splicing (cDNA)

-Può effettuare delle errate modificazioni post-traduzionali (es. iperglicosilazioni)
 I Vettori di Espressione per cellule di insetto: il BACULOVIRUS

Cellule mesenteriche di Spodoptera frugiperda

Il BACULOVIRUS (AcMNPV): fornisce le sequenze necessarie

per la produzione di una proteina in cellule di insetto

Virus della Poliedrosi Nucleare Autographa californica

Multipla
Larva deceduta per
Infezione da MNPV

Diffusione del baculovirus

durante lo sviluppo larvale
Tracciante: gfp
 Il ciclo vitale del BACULOVIRUS

FORMA INFETTIVA
(fase precoce) FORMA DI RESISTENZA
(fase tardiva)

Il virione infetta una cellula. I virioni formano un POLIEDRO=

Si moltiplica. L’infezione si virioni intrappolati nella POLIEDRINA
diffonde alle cellule adiacenti Le cellule si lisano e la larva muore

FASE PRECOCE
poliedri
FASE TARDIVA

Virioni occlusi
nella poliedrina
 La POLIEDRINA è sotto controllo di un PROMOTORE eccezionalmente FORTE eTARDIVO:
inizia a funzionare dopo 36-48 ore e continua fino a 4-5 giorni dall’infezione.

Si elimina il gene della poliedrina e si sostituisce col gene eterologo mediante “Gene Targeting”

Organizzazione dell’unità di
espressione di un vettore di
trasferimento del baculovirus

Pp = promotore
Pt = terminatore e poliA

cs = sito di clonaggio

Sequenze a monte e a valle

Si tratta di un vettore navetta del gene della poliedrina
propagabile in E. coli
COSTRUZIONE DI BACULOVIRUS RICOMBINANTI

Le placche di lisi del virus

ricombinante sono riconoscibili
Alcune proteine ricombinanti di interesse applicativo per l’uomo prodotte in cellule di insetto
 I vettori di espressione per cellule di MAMMIFERO

VETTORI PLASMIDICI: VETTORI VIRALI:

-produzione -studio della funzione delle proteine
-studio della funzione delle proteine -terapia genica

IN NATURA NON ESISTONO PLASMIDI SPECIFICI PER LE CELLULE DI MAMMIFERO

Devono essere costruiti artificialmente

 I PLASMIDI COME VETTORE DI ESPRESSIONE PER CELLULE DI MAMMIFERO

CONTENGONO:

Elementi per la costruzione e per la propagazione in E.coli: ORIE

A marcatore di selezioneE (Ampr)
multicloning site

Regione di controllo
Promotori,elementi a monte
dei geni
del promotore ed enhancers

Segnali di terminazione e
di poliA
DNA
Segnali di splicing non codificante

B Una o più unità di trascrizione che vengono ORI EUK (facoltativo)

espresse solo in cellule di mammifero

Marker di selezione EUK

DNA
Gene estraneo codificante
 MODULO DI ESPRESSIONE RICONOSCIUTO DALLE CELLULE DI MAMMIFERO CHE CONTIENE
TUTTI GLI ELEMENTI RICHIESTI PER L’ESPRESSIONE DEL DNA ESOGENO

REGIONE DI CONTROLLO DEI GENI : Brevi sequenze di DNA che interagiscono con specifiche proteine cellulari coinvolte
nella trascrizione

TATA box

Assemblaggio dei fattori

di inizio della trascrizione
Promotore: e dell’RNApolII

Fino a -200 bp dalla TATA BOX

Elementi a monte Controllano l’efficienza di utilizzo
del promotore della stessa
Enhancer

Possono essere localizzate anche

a migliaia di bp dal gene che
controllano (a monte, a valle,
dentro gli introni)

Aumentano la trascrizione di un gene anche

di 1000 volte

Agiscono indipendentemente dall’orientamento

Possono essere inducibili (da ormoni, metalli, ecc.)

Le sequenze che regolano l’accesso dell’RNApolII alla TATA box delle cellule di mammifero possono
essere cellulo-specifiche o poco forti. Si possono però utilizzare per i vettori quelle di virus che
infettano cellule di mammifero:
SONO POTENTI E POCO SPECIFICHE

pSV40

SP1
SV40

VIRUS DEL SARCOMA DI ROUS LTR

Citomegalovirus

pCMV
 VANNO
Sequenze non codificanti in 3’: -Si rimuovono nel DNA genomico (destabilizzanti) INSERITE
-Non sono presenti nei cDNA
NEL VETTORE
a valle dell’MCS

Sito di poli-Adenilazione

Sito di terminazione: l’endogeno si può trovare anche a centinaia

di basi dal sito di poliA
 Segnale di Splicing

L’RNAm esce complessato con

una serie ordinata di proteine
Che ne indicano la corretta
maturazione, tra cui proteine
che si dispongono alla giunzione
tra esoni. Solo in questo modo
il complesso del poro lo riconosce
e può attraversare il poro
nucleare.

Le proteine legate all’RNAm che marcano

eventi di splicing corretti funzionano da
Fattori di esportazione dell’RNAm

ORIEUK: permette la replicazione episomale

ANCHE TUTTE QUESTE SEQUENZE VENGONO PRESE DA VIRUS CHE INFETTANO LE CELLULE
DI MAMMIFERO
 MARCATORI DI SELEZIONE PER CELLULE DI MAMMIFERO

1) ENZIMI PER IL RIPRISTINO DI VIE METABOLICHE INTERROTTE

Si usa per cellule

TK-/- o HPRT-/-

Timidina cinasi (TK di HSV)

Sono enzimi che permettono la sintesi dei nucleotidi derivati
Oppure dalla timidina (TK) o dalla Ipoxantina (HPRT) attraverso la
via di sintesi di “emergenza”, quando la via “de novo” è
bloccata dalla Amminopterina. Se espressi in cellule difettive,
Ipoxantina Guanina Fosforibosil ne Permettono la crescita selettiva in terreno HAT (Ipoxantina,
Trasferasi (HPRT) Amminopterina, Timidina)

2) MARCATORI DI ORIGINE BATTERICA PER LA RESISTENZA AD ANTIBIOTICI

neor: Aminoglicoside-fosfotrasferasi (APH): inattiva il G418, inibitore di

sintesi proteica
hygr: conferisce la resistenza all’Igromicina
 TRASFEZIONE: STABILE O TRANSIENTE?

Transitoria: Stabile:

si usa quando si devono

Si usa per saggi a
fare esperimenti di lunga
breve termnine o
durata, quando si vuole
quando non è possibile
maggiore riproducibilità
ottenere cloni stabili
quando l’efficienza di
trasfezione in transiente
è troppo bassa.

E’ necessario un marcatore
di selezione.

Non è necessario un ORIeuk

CLASSIFICAZIONE IN BASE AL N°° DI COPIE DI DNA BERSAGLIO

1) Vettori plasmidici SEMPLICI PRIVI DI ORIEUK

Possono dare cloni stabili solo se integrati in un cromosoma

 2) Vettori plasmidici CON ORIEUK

L’ ORIEUK permette di incrementare

il n°° di copie del plasmide.

Il plasmide viene mantenuto anche

in forma episomale

E inducibile da glucocorticoidi’

Si può utilizzare per la

trascrizione in vitro
 3) Vettori plasmidici che permettono L’AMPLIFICAZIONE DELLE SEQUENZE

GENOMICHE INTEGRATE NEL GENOMA DELL’OSPITE

DHFR= Diidrofolato Reduttasi

DHFR
acido diidrofolico acido folico
DHFR
Coenzima nelle acido diidrofolico acido folico
reazioni di tra-
sferimento di Coenzima nelle
-CH3 E -CHO reazioni di tra-
da alcuni aa sferimento di
-CH3 E -CHO
da alcuni aa
MTX

Sintesi di
purine e
pirimidine
X
Sintesi di
purine e
pirimidine

MTX= metotrexato

Nell’amplificare il gene DHFR

si amplificano anche sequenze
adiacenti
FINALITA’ POSSIBILI DELLA TRASFEZIONE IN CELLULE DI MAMMIFERO

-Verifica dell’identità di un gene isolato dalla library mediante saggio immunologico o

funzionale della proteina espressa

-Espressione di geni che codificano proteine che richiedono modificazioni post-traduzionali

esclusive dei mammiferi

-Produzione su larga scala di proteine normalmente poco rappresentate

-Studio della biosintesi, del trasporto intracellulare e della localizzazione subcellulare

di una proteina

-Studio delle relazioni struttura-funzione mediante analisi delle proprietà delle proteine
normali e mutate

-Espressione di sequenze genomiche contenenti introni

-Identificazione e catatterizzazione di sequenze di DNA coinvolte nel controllo della

espressione genica

-Studio degli effetti biologici prodotti dalla accensione o dalla soppressione dell’attività
di una proteina
Le principali metodiche di trasfezione di cellule di mammifero

1) La PRECIPITAZIONE CON FOSFATO DI CALCIO

2) La LIPOFEZIONE
3) La ELETTROPORAZIONE