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: 1 08/2003

HBcAb
Dosaggio Immunoenzimatico (ELISA)
competitivo per la determinazione
degli anticorpi anti antigene “core”
del Virus dell’ Epatite B
in sieri e plasmi umani.

- Solo per uso diagnostico “in vitro” -

DIA.PRO
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REF. BCAB.CE
96 Tests
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HBcAb
A. INTENZIONI D’USO
Dosaggio Immunoenzimatico (ELISA) competitivo per la
determinazione degli anticorpi anti antigene “core” del Virus
delll’ Epatite B (o HBV) in sieri e plasmi umani. Il kit può essere
usato per lo screening di unità di sangue e follow-up di pazienti
infetti da HBV. Solo per uso diagnostico “in vitro” .
B. INTRODUZIONE
L’ Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) definisce l’
epatite B come segue:
“L’Epatite B è una delle più gravi malattie dell’umanità ed è
un serio problema di salute pubblica globale. Epatite
significa infiammazione del fegato, e la causa più comune è
l’infezione da parte di uno dei 5 virus, chiamati epatite
A,B,C,D e E. Tutti questi virus possono causare una malattia
acuta con sintomi che possono durare diverse settimane
incluso l’ingiallimento della pelle e degli occhi (itterizia);
urine scure; estremo affaticamento; nausea; vomito e dolori
addominali. Possono trascorrere da diversi mesi ad anni
prima di sentirsi ancora in forma. Il Virus dell’Epatite B può
causare infezioni croniche in cui il paziente non riesce a
liberarsi del virus e dopo molti anni sviluppa cirrosi del
fegato o cancro al fegato.
L’HBV è il tipo più serio di epatite virale e il solo tipo che
causa epatite cronica per cui è disponibile un vaccino.Il virus
dell’Epatite B è trasmesso per contatto con sangue o fluidi
corporei di una persona infetta nello stesso modo che per il
virus da immunodeficienza umano (HIV), il virus che causa
l’AIDS. Comunque, l’HBV è 50-100 volte più infettivo
dell’HIV. I modi principali di infettarsi con HBV sono: (a)
perinatale (dalla madre al figlio alla nascita); (b)
trasmissione da bambino a bambino; (c) iniezioni e
trasfusioni non sicure; (d) contatti sessuali.
Nel mondo, la maggior parte delle infezioni avvengono da
madre a neonato, per I contatti da bambino a bambino nelle
faccende domestiche, e dal riutilizzo di aghi e siringhe non
sterilizzati. In molti paesi in via di sviluppo, quasi tutti i
bambini vengono infettati dal virus. In molti paesi
industrializzati (Europa occidentale, Nord America) il
modello di trasmissione è diverso.In questi paesi la
trasmissione madre-figlio o bambino-bambino conta solo per
un terzo delle infezioni croniche prima che fossero introdotti i
programmi di vaccinazione infantile per l’epatite B.
Comunque, la maggioranza delle infezioni in questi paesi
sono avvenute durante la giovinezza per l’attività sessuale
non protetta e l’uso di droghe iniettabili. Inoltre, il virus
dell’Epatite B è la più grave malattia professiobnale degli
operatori sanitari, e la maggior parte di tali operatori ha
ricevuto il vaccino dell’Epatite B.
Il virus dell’Epatite B non si diffonde attraverso cibi o
bevande contaminate, e non può essere diffuso casualmente
nel luogo di lavoro. Alti tassi di infezione cronica da HBV
sono trovati anche in Europa centrale e dell’Est. In Medio
Oriente e nel sub-continente indiano, circa il 5% della
popolazione è infetto. L’infezione è meno comune in Europa
occidentale e Nord America dove meno dell’1% è
cronicamente infetto.
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I ragazzi che vengono infettati con HBV la maggior parte
svilupperanno l’infezione cronica. Circa il 90% dei neonati
infettati durante il primo anno di vita e dal 30% al 50% di
bambini infettati tra gli 1 e 4 anni d’età sviluppano
l’infezione cronica. Il rischio di morte da cancro o cirrosi
legati ad HBV è approssimativamente del 25% tra persone
che diventano cronicamente infette durante l’infanzia.
L’Epatite B cronica in qualche paziente è trattato con farmaci
quali interferone e lamivudina. Pazienti con cirrosi sono
talvolta sottoposti a trapianto di fegato, con successo
variabile. E’ preferibile prevenire questa malattia con il
vaccino piuttosto che tentare di curarla..
Il vaccino dell’Epatite B a un rilevante primato di sicurezza
ed efficacia. Dal 1982, più di un miliardo di dosi del vaccino
dell’Epatite B sono state usate in tutto il mondo. Il vaccino è
somministrato come una serie di tre dosi intramuscolari. Gli
studi hanno mostrato che il vaccino è efficace nel prevenire in
bambini e adulti lo svilupparsi dell’infezione cronica se non
sono ancora stati infettati. In molti paesi dove dall’8% al 15%
di bambini tendono ad infettarsi cronicamente con HBV, il
tasso d’infezione è stato ridotto a meno dell’1% in gruppi di
bambini immunizzati. Dal 1991, l’OMS, ha richiamato tutti i
Paesi ad aggiungere la vaccinazione per l’Epatite B nei loro
programmi di immunizzazione nazionali.”
L’Antigene core del Virus dell’ Epatite B (HBcAg) è il maggiore
componente delle particelle del core dell’ HBV.
HBcAg è composto di un singolo polipeptide di circa 17 kD che
è rilasciato dalle particelle del core che si disgregano; l’ antigene
contiene almeno un determinante immunologico.
Sopra l’ infezione primaria, gli anticorpi anti HBcAg sono uno dei
primi markers dell’HBV che appare nel siero del paziente,
leggermente dopo dell’ HBsAg, l’ antigene virale di superficie.
Gli anticorpi anti HBcAg sono prodotti normalmente ad alti titoli
e la loro presenza è rilevabile anni dopo l’ infezione. Isolati
HBcAb, in assenza di altri markers dell’ HBV, sono stati
osservati in unità di sangue infette suggerendo l’ uso di questo
test per lo screening HBV, in aggiunta a quello dell’ HBsAg.
La determinazione dell’ HBcAb è diventata importante per la
classificazione dell’ agente virale, insieme con la rilevazione
degli altri markers dell’ infezione HBV, in sieri e plasmi.
C. PRINCIPIO DEL TEST
Il saggio è basato sul principio di competizione dove gli anticorpi
nel campiona competono con un anticorpo monoclonale per una
fissata quantità di antigene presente sulla fase solida.
Un antigene ricombinante HBcAg purificato è adeso sulle
pozzetto. Il siero o plasma dei pazienti viene aggiunto alla
pozzetto insieme con un additivo in grado di bloccare le
interferenze presenti nel campione.
Nella seconda incubazione dopo lavaggio, si aggiunge un
anticorpo monoclonale, coniugato con Perossidasi di Rafano
(HRP) e specifico per HBcAg che si lega al rec-HBcAg libero
adeso sulla plastica.
Dopo l’ incubazione, i pozzetti sono lavate per rimuovere
qualsiasi coniugato non legato e in seguito si aggiunge il
cromogeno/substrato. In presenza dell’ enzima per ossidasi
legato il substrato incolore è idrolizzato ad un prodotto finale
colorato.
L’ intensità di colore è inversamente proporzionale alla quantità
di anticorpi anti HBcAg presenti nel campione.
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D. COMPONETI
Ogni kit contiene reagenti sufficienti per eseguire 96 tests.
1. Micropiastra MICROPLATE
n° 1
8x12 strips di microcelle coattate con ricombinante HBcAg e
sigillate in una busta con essiccante. Permettere che la
micropiastra raggiunga la temperatura ambiente prima dell’
apertura. Risigillare le strips non utilizzate nella busta con l’
essiccante e conservare a 2..8°C.
2. Controllo Negativo CONTROL -
1x1.0ml/fiala
Controllo pronto all’uso. Contiene albumina di siero bovino al
5%, tampone fosfato 10mM a pH 7.4+ /-0.1, 0.09% di Na-azide,
e 0.1% di Kathon GC come conservanti. Il controllo negativo è
codificato di colore giallo pallido.
3. Controllo Positivo CONTROL +
1x1.0ml/fiala. Controllo pronto all’uso. Contiene albumina di
siero bovino al 5%, anticorpi anti HBcAg ad una concentrazione
di circa 10 PEI U/ml (calibrato su PEI HBc materiale di
riferimento n° 82), tampone fosfato 10mM a pH 7.4+ /-0.1,
0.09% di Na-azide, e 0.1% di Kathon GC come conservanti.
Il controllo positivo è codificato con colore verde.
4. Calibratore CAL ….
n° 1 fiala
Liofilo. Sciogliere con acqua EIA-grade come riportato
nell’etichetta. Contiene siero bovino fetale, anticorpi umani anti
HBcAg ad una concentrazione di 2 PEI U/ml +/-10% (calibrato
su PEI HBc Materiale di Riferimento n° 82) e 0.1% Kathon GC
come conservante.
Nota: Il volume necessario per sciogliere il contenuto della
fiala può variare da lotto a lotto. Si prega di usare il corretto
volume riportato sull’ etichetta.
5. Soluzione di lavaggio concentrata WASHBUF 20X
2x60ml/flacone
Soluzione concentrata 20X. Una volta diluita, la soluzione di
lavaggio contiene tampone fosfato 10mM a pH 7.0 +/-0.2,
0.05% tween 20 e 0.1% di Kathon GC.
6. Coniugato Enzimatico CONJ
1x16ml/fiala. Soluzione pronta all’uso. Contiene albumina di
siero bovino al 5%, tampone Tris 10 mM a pH 6.8 +/-0.1, Per
ossidasi di Rafano coniugata con anticorpo all’ HBcAg
monoclonale di topo in presenza di 0.3 mg/ml di gentimicina
solfato e 0.1% di Kathon GC come conservante. Il componente
è colorato di rosso.
7. Cromogeno/Substrato SUBS TMB
1x16ml/flacone.
Contiene tampone citrato-fosfato 50 mM a pH 3.6+/-0.1, dimetil-
solfossido al 4%, 0.03% di tetrametil-benzidina (TMB) e 0.02%
di perossido d’idrogeno (H2O2).
Nota: Deve essere conservato protetto dalla luce in quanto
sensibile alla forte illuminazione.
8. Diluente Campione DILSPE
4x3ml/fiala. Soluzione tamponata di Tris 10 mM a pH 8.0 +/-0.1
contenente 0.1% Kathon GC per il pre-trattamento di campioni e
controlli in piastra, atto a bloccare le possibili interferenze.
Nota: Usare tutto il contenuto di una fiala prima di aprirne
una seconda. Il reagente è sensibile all’ossidazione.
9. Acido Solforico H2SO4 O.3 M
1x15ml/fiala
Contiene una soluzione 0.3 M di H2SO4.
Attenzione: Irritante (Xi R36/38; S2/26/30).
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10. Copripiastra : n° 2
11.Inserto: n° 1
E. MATERIALI RICHIESTI MA NON FORNITI
1. Micropipette calibrate (100ul e 50ul) e puntali usa e getta.
2. Acqua di grado EIA (distillata o deionizzata, trattata con
carbone per rimuovere agenti ossidanti usati come
disinfettanti).
3. Timer con intervallo di tempo di 60 min o più.
4. fogli di carta assorbente.
5. Incubatore termostatico calibrato per micropiastre ELISA in
grado di fornire una temperatura di +37°C, capace di fornire
agitazione a 1300 rpm+/-150.
6. Lettore calibrato di micropiastre ELISA con lettura a
450nme possibilmente con filtri a 620-630nm per la
determinazione del bianco.
7. Lavatore calibrato di micropiastre ELISA.
8. Vortex o similari strumenti per miscelare.
F. AVVERTENZE E PRECAUZIONI
1. Il kit deve essere usato solo da personale tecnico
specializza e correttamente addestrato, sotto la supervisione del
medico responsabile del laboratorio.
2. Quando il kit è usato per lo screening di unità di sangue e
componenti del sangue, deve essere usato in un laboratorio
certificato e qualificato dall’autorità nazionale in quel campo
(Ministero della Sanità o simili) per eseguire questo tipo di
analisi.
3. Tutto il personale coinvolto nell’esecuzione del saggio
deve indossare abiti protettivi da laboratorio, guanti in lattice
senza talco e occhiali. L’uso di ogni dispostivo appuntito (aghi) o
tagliente (lame) dovrebbe essere evitato. Tutto il personale
coinvolto dovrebbe essere addestrato sulle procedure di
sicurezza personale, come raccomandato dal Centro per il
Controllo delle Malattie di Atlanta, US. E riportato nella
pubblicazione dell’Istituto Nazionale di Sanità: “ Biosalvaguardia
nei Laboratori Microbiologici e Biomedici”, ed. 1984.
4. Tutto il personale coinvolto nel maneggiare i campioni
dovrebbe essere vaccinato per HBV e HAV, per cui i vaccini
sono disponibili sicuri ed efficaci.
5. L’ambiente di laboratorio dovrebbe essere controllato cosi
da evitare contaminazioni da polvere e agenti microbiologici
nell’aria, quando si aprono le fiale e la micropiastra del kit e
quando viene eseguito il test. Proteggere il
cromogeno/substrato dalla luce forte ed evitare vibrazioni del
banco di lavoro una volta iniziato il test.
6. Dal ricevimento, conservare il kit a 2- 8°C in un frigorifero o
camera fredda a temperatura controllata.
7. Non scambiare i componenti tra differenti lotti del kit. E’
raccomandato non scambiare i componenti di due kit dello
stesso lotto.
8. Controllare che i reagenti siano limpidi e non contengano
grosse particelle o aggregati. Se ciò accade allertare il
supervisore del laboratorio per iniziare le necessarie procedure
per la sostituzione del kit.
9. Evitare contaminazioni incrociate tra i campioni(sieri o
plasmi) usando puntali monouso e cambiandoli dopo ogni
10. Evitare contaminazioni incrociate tra i reagenti del kit
usando puntali monouso e cambiandoli per l’uso di ogni
componente.
11. Non usare il kit dopo la data di scadenza impressa sulla
confezione esterna e sull’ etichetta di ogni singola fiala
all’interno. Studi condotti su un kit aperto non hanno rilevato
alcuna perdita significativa di reattività fino a 6 riutilizzi in 3 mesi.
12. Trattare tutti I campioni come potenzialmente infetti. Tutti i
sieri umani dovrebbero essere maneggiati secondo il Livello 2 di
Bio-Sicurezza, come raccomandato dal Centro per il Controllo
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delle Malattie CDC, Atlanta, US. Insieme con quanto riportato
nella pubblicazione dell’Istituto di Sanità: “Bio-Sicurezza nei
laboratori Microbiologici e Biomedicali”, ed. 1984.
13. L’uso di contenitori di plastica monouso è raccomandato
per la preparazione dei componenti liquidi o per i componenti
trasferiti nelle postazioni automatizzate, questo per evitare
contaminazioni incrociate.
14. I prodotti di scarto durante l’uso del kit devono essere
scaricati secondo le direttive nazionali e le leggi riguardanti i
rifiuti di sostanze chimiche e biologiche di laboratorio. In
particolare, gli scarichi liquidi generati dalla procedura di
lavaggio, da avanzi dei controlli e dai campioni devono essere
trattati come materiali potenzialmente infetti e inattivati prima di
essere eliminati. Si suggerisce di inattivare per trattamento con
una soluzione di ipoclorito di sodio al 10% per 16-18 ore o
disattivazione a caldo in autoclave a 121°C per 20 minuti.
15. Rovesciamenti accidentali dei campioni durante le
operazioni devono essere assorbiti con fogli di carta imbevuti di
ipoclorito di sodio e poi sciacquati con acqua. I fogli di carta
vanno poi gettati nell’apposito contenitore dei rifiuti per materiali
biologici di laboratorio/ospedalieri.
16. L’acido solforico è irritante. In caso di rovesciamento lavare
la superficie con abbondante acqua.
17. Altri materiali di scarto generati dall’uso del kit ( ad
esempio: I puntali usati per controlli e campioni, micropiastre
usate) dovrebbero essere maneggiate come potenzialmente
infetti e riposti in accordo alle direttive nazionali e alle leggi
concernenti lo smaltimento dei rifiuti di laboratorio.
G. CAMPIONI: PREPARAZIONE E RACCOMANDAZIONI
1. Il sangue è estratto asetticamente per prelievo in vena e I
plasmi o sieri sono preparati usando le tecniche standard di
preparazione dei campioni per analisi cliniche di laboratorio.
Nessuna influenza è stata osservata nella preparazione del
campione con citrato, EDTA o eparina.
2. Evitare ogni aggiunta di conservanti ai campioni;
specialmente sodio azide che può influenzare l’attività
enzimatica del coniugato, generando risultati di falsi negativi.
3. I campioni devono essere chiaramente identificati con codici
o nomi per evitare confusione nell’interpretazione dei risultati.
4. Campioni emolizzati (rossi) e visibilmente iperlipemici
(lattiginosi) devono essere scartati perché potrebbero generare
risultati falsi. I campioni contenenti residui di fibrina o grosse
particelle o filamenti e corpi microbiologici dovrebbero essere
scartati perché potrebbero dare origine a risultati falsi.
5. Sieri e plasmi possono essere conservati a +2°…*8°C fino a
5 giorni dopo il prelievo. Per conservazioni più lunghe , i
campioni possono essere congelati a –20°C per diversi mesi.
Qualsiasi campione congelato non può essere congelato e
scongelato più di una volta perché questo genera particelle che
possono influenzare il risultato del test.
6. Se sono presenti delle particelle centrifugare a 2000 rpm per
20 minuti o filtrare con filtri a 0.2-0.8um per pulire il campione da
testare.
H. PREPARAZIONE DEI COMPONENTI E AVVERTENZE
Studi condotti su un kit aperto non hanno mostrato alcuna
rilevante perdita di attività fino a 6 riutilizzi dello stesso materiale
in 6 mesi.
1.Micropiastra:
Permettere che la micropiastra raggiunga la temperatura
ambiente (almeno 1h) prima di aprire la busta. Controllare che
l’essiccante non sia diventato verde scuro, indicando un difetto
di produzione.In questo caso chiamare il servizio clienti Dia.Pro.
Le strips non utilizzate devono essere riposte nell’apposita
busta, in presenza dell’essiccante fornito, sigillate fermamente e
conservate a +2°…+8°C.
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Dopo la prima apertura le strips residue sono stabili fino a
quando l’indicatore di umidità presente all’interno della busta
dell’essiccante vira da giallo a verde pallido.
2. Controllo Negativo:
Pronto all’uso.Miscelare su vortex prima dell’uso.
3. Controllo Positivo:
Pronto all’uso.Miscelare su vortex prima dell’uso.
4. Calibratore:
Sciogliere attentamente il contenuto liofilo della fiala con il
volume di acqua di grado ELISA riportato sulla sua etichetta.
Miscelare su vortex prima dell’uso.
Nota: Una volta sciolto il calibratore non è stabile. Conservare in
aliquote a –20°C.
5. Soluzione di lavaggio concentrata:
L’intero contenuto della soluzione concentrata 20X deve essere
diluito con acqua bidistillata fino a 1200 ml e miscelata
gentilmente prima dell’uso.
Nella preparazione evitare di generare schiuma perché la
presenza di bolle può diminuire l’efficacia del lavaggio.
Nota: Una volta diluita, la soluzione di lavaggio è stabile per una
settimana a +2°…+8°C.
6. Coniugato Enzimatico:
Pronto all’uso.Miscelare su vortex prima dell’uso.
Prestare attenzione per non contaminare il liquido con ossidanti
chimici, polveri o microbi presenti nell’aria. Se questo
componente deve essere trasferito usare solo contenitori di
plastica possibilmente sterili.
7. Chromogeno/Substrato:
Pronto all’uso.Miscelare su vortex prima dell’uso.
Prestare attenzione per non contaminare il liquido con ossidanti
chimici, polveri o microbi presenti nell’aria.
Non esporre a forte illuminazione, agenti ossidanti e superfici
metalliche. Se questo componente deve essere trasferito usare
solo contenitori di plastica possibilmente sterili.
8. Diluente Campione
Pronto all’uso.Miscelare su vortex prima dell’uso. Usare tutto il
contenuto di una fiala prima di aprirne una seconda. Il reagente
è sensibile alle ossidazioni.
9. Acido Solforico:
Pronto all’uso.Miscelare su vortex prima dell’uso.
Attenzione: Irritante (Xi R36/38; S2/26/30)
Legenda: R 36/38 = Irritante per gli occhi e la pelle.
S 2/26/30 = In caso di contatto con gli occhi, sciacquare
immediatamente con acqua e consultare il medico.
I. STRUMENTAZIONE USATA IN COMBINAZIONE CON IL
KIT
1. Le micropipette devono essere calibrate per rilasciare il
corretto volume richiesto dal saggio e devono essere
sottoposte a regolare decontaminazione (alcool denaturato,
candeggina al 10%, soluzione disinfettante ospedaliera) di
quelle parte che potrebbero accidentalmente entrare in
contatto con il campione. Esse dovrebbero essere tenute
controllate per mostrare una precisione dell’1% e una
correttezza di +/-2%.
2. L’incubatore ELISA dovrebbe essere tarato a 37°C
(tolleranza di +/-0.5°C) e regolarmente controllato per
assicurare il mantenimento della temperatura corretta.
Entrambi incubatori a secco e bagni ad acqua sono
utilizzabili per le incubazioni se gli strumenti sono
convalidati per l’incubazione di tests ELISA.
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3. Il lavatore ELISA è estremamente importante per la totale
riuscita del saggio. Il lavatore deve essere validato con
attenzione e correttamente ottimizzato usando apparati di
controllo e kit di riferimento, prima di utilizzarlo per gli esami
di routine. Di solito sono sufficienti 4-5 cicli di lavaggio (
aspirazione + dispensazione = 1 ciclo) per assicurare che il
saggio dia il risultato aspettato. E’ suggerito un intervallo di
soaking di 20-30 secondi tra i cicli. Per stabilire
correttamente il loro numero , è raccomandato di far correre
un test di prova con i controlli del kit e campioni di
riferimento ben caratterizzati come positivi o negativi, e
controllare la corrispondenza ai valori riportati sotto nella
sezione “Validazione del test” e “Prestazioni del saggio”. La
regolare calibrazione del volume erogato e la manutenzione
del lavatore (decontaminazione e pulizia degli aghi) deve
essere compiuta secondo le indicazioni del produttore.
4. I tempi di incubazione hanno una tolleranza di +/-5%.
5. Il lettore di micropiastre ELISA deve essere dotato di un
filtro di lettura di 450nm e idealmente di un secondo filtro
(620-630nm) per le operazioni del bianco. Le sue
prestazioni standard dovrebbero essere (a) ampiezza di
banda ≤ 10nm; (b) intervallo di assorbimento da 0 a ≥ 2.0;
(c) linearità ≥2.0; (d) ripetibilità ≥ 1%. Il bianco è determinato
secondo le istruzioni contenute nella sezione “Procedura del
Saggio”. Il sistema ottico del lettore deve essere calibrato
regolarmente per assicurare la corretta misurazione della
densità ottica. La manutenzione dovrebbe essere fatta
regolarmente secondo le istruzioni del produttore.
6. Quando si usa una stazione di lavoro automatizzata per kit
ELISA, tutti i passi critici (dispensazione, incubazione,
lavaggio, lettura, manipolazione dei dati) devono essere
attentamente controllati, calibrati, e regolarmente sistemati
per conservare la corrispondenza con i valori riportati nelle
sezioni “Validazione del Test” e “Prestazioni del Saggio”. Il
protocollo del saggio deve essere installato nel sistema
operativo dell’unità e validato come per il lavatore e il
lettore. In più, la parte della stazione che manipola I
componenti liquidi (dispensazione e lavaggio) deve essere
validata e correttamente impostata. Particolare attenzione
va mostrata nell’evitare il trascinamento da parte degli aghi
usati per la dispensazione e il lavaggio. Questo deve essere
studiato e controllato per minimizzare la possibilità di
contaminazione dalle celle adiacenti. L’uso di stazioni di
lavoro automatizzate ELISA è raccomandata per lo
screening di sangue quando il numero dei campioni da
testare è maggiore di 20-30 per sessione della macchina.
7. Il servizio clienti Dia.Pro offre assistenza agli utilizzatori per
l’impostazione e il controllo degli strumenti usati in
combinazione con il kit, per assicurare concordanza con le
richieste descritte. Assistenza è anche fornita per
l’istallazione di nuovi strumenti che debbano essere usati
con il kit.
L. CONTROLLI E OPERAZIONI PRE SAGGIO
1. Controllare la data di scadenza del kit, stampata
sull’etichetta esterna della scatola. Non usare se scaduto.
2. Controllare che i componenti liquidi non siano contaminati
da particelle o aggregati visibili a occhio nudo. Controllare
che il Cromogeno/Substrato sia incolore o blu pallido
aspirando un piccolo volume dello stesso con una pipetta di
plastica sterile trasparente. Controllare che nessuna rottura
della confezione è avvenuta nel trasporto e nessuna
fuoriuscita di liquido è presente all’interno della
scatola.Controllare che la busta di alluminio, contenente la
micropiastra, non sia bucata o danneggiata.
3. Diluire tutto il contenuto della soluzione di lavaggio
concentrata 20X come descritto sopra.
4. Sciogliere il Calibratore come descritto sopra e miscelare
gentilmente.
5. Permettere a tutti i componenti del kit di raggiungere la
temperatura ambiente (circa 1h) e poi miscelare come
descritto.
6. Impostare l’icubatore ELISA a 37°C e preparare il lavatore
ELISA avvinandolo con la soluzione di lavaggio diluita,
secondo le istruzioni del produttore. Impostare il corretto
numero di cicli di lavaggio come trovato nella validazione
dello strumento per il suo uso con il kit.
7. Controllare che il lettore ELISA sia acceso da almeno 20
minuti prima della lettura.
8. Se si utilizza una stazione di lavoro automatizzata,
accenderla, controllare le impostazioni e assicurarsi di usare
il protocollo corretto .
9. Controllare che le micropipette siano impostate al volume
richiesto.
10. Controllare che tutti gli strumenti siano disponibili e pronti
all’uso.
11. In caso di problemi non procedere oltre con il test e
informare il supervisore.
M. PROCEDURA DEL SAGGIO
Il saggio deve essere eseguito secondo quanto riportato sotto,
prestando attenzione a tenere lo stesso tempo d’incubazione
per tutti i campioni da testare.
1. Inserire il corretto numero di strips nel sostegno di plastica e
identificare attentamente le celle per i controlli, calibratore e
campioni.
2. Lasciare la cella A1 vuota per le operazioni del bianco.
3. Dispensare 50 ul di Diluente Campione nelle celle dei
controlli e dei campioni.
4. Pipettare 50 µl del controllo negativo in triplo, 50ul di
calibratore in doppio e 50 ul di di controllo positivo in
singolo. Poi dispensare 50ul di ciascuno dei campioni.
5. Incubare la micropiastra per 60 min at +37°C.
Nota importante: Le strips devono essere sigillate con il foglio
adesivo solo quando il test viene eseguito manualmente. Non
coprire le strips quando si usa uno strumento automatico ELISA
6. Quando la prima incubazione è terminata, lavare le
microcelle come precedentemente descritto (section I.3)
7. Dispensare 100 ul di Coniugato Enzimatico in tutte le celle,
eccetto A1, usata per le operazioni del bianco.
Nota Importante: Attenzione a non toccare la superficie
interna della cella con il puntale della pipetta. Possono avvenire
delle contaminazioni.
8. Quando la seconda incubazione è terminata, lavare le
microcelle come precedentemente descritto (section I.3)
9. Pipettare 100µl di Cromogeno/Substrato in tutte le celle, A1
inclusa.
Nota Importante:Non esporre a forte illuminazione diretta. Può
determinare fondi alti.
10. Incubare la micropiastra protetta dalla luce a temperatura
ambiente (18-24°C) per 20 minuti. Le celle dispensate con
il controllo negativo e i campioni negativi vireranno da chiari
a blu (metodo competitivo).
11. Pipettare 100µl di Acido Solforico in tutte le celle per
bloccare la reazione enzimatica, usando lo stesso schema
di dispensazione che nel punto 9 . L’aggiunta dell’acido
virerà il controllo negativo, e i campioni negativi da blu a
giallo.
12. Misurare l’intensità di colore della soluzione in ogni cella
come descritto nella sezione I.5; usare un filtro (di lettura) a
450nm e se possibile un filtro a 620-630nm (sottrazione del
fondo), porre il bianco sullo strumento in posizione A1.
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Note Importanti: Se così non fosse, non procedere ulteriormente ed eseguire i

1. Se il secondo filtro non è disponibile assicurarsi che non seguenti controlli:
siano presenti impronte di dita sul fondo della micropiastra
prima della lettura a 450nm. Tali impronte potrebbero Problem Check
generare falsi positivi. Bianco che la soluzione cromogeno/substrato si sia
> 0.100 OD450nm contaminata durante il saggio
2. La lettura deve essere eseguita subito dopo l’aggiunta della
Soluzione di Stop e comunque mai più di 20 minuti dopo Control Negativo 1. che la procedura di lavaggio e le impostazioni del
tale aggiunta. Può avvenire leggera autoossidazione del (NC) lavatore siano validate secondo gli studi di pre
< 1.000 OD450nm qualificazione;
cromogeno e portare ad un risultato di fondo alto. dopo sottrazione del 2. che sia stata usata la corretta soluzione di lavaggio e
bianco che il lavatore sia stato avvinato prima dell’uso;
3. che nessun errore sia stato commesso nella
coefficient of variation > procedura del saggio (dispensazione del controllo
20% positivo invece del negativo);
4.che non sia avvenuta nessuna contaminazione del
N. SCHEMA DEL SAGGIO controllo negativo o delle sue celle a causa di schizzi
dei campioni positivi o del coniugato enzimatico;
5. che le micropipette non siano contaminate con
Diluente Campione 50 ul campioni positivi o coniugato enzimatico;
6. che gli aghi del lavatore non siano bloccati o
Controlli&calibratore e campioni 50 ul parzialmente ostruiti.
st
1 incubazione 60 min Calibratore 1. . che le procedure siano state correttamente
Co/S < 1 eseguite;
Temperatura +37°C 2. che nessun errore è stato eseguito nella sua
Lavaggio n° 4-5 dispensazione (ad esempio dispensazione del negativo
Coniugato Enzimatico 100 ul al posto del calibratore);
nd 3. che ila procedura di lavaggio e le impostazioni del
2 incubazione 60 min lavatore siano validate secondo gli studi di pre
Temperatura +37°C qualificazione;
4.che non sia avvenuta nessuna
Lavaggio n° 4-5
Controllo Positivo 1. che le procedure siano state correttamente eseguite;
TMB/H2O2 mix 100 ul > 0.200 OD450nm 2. che nessun errore sia stato commesso nella
rd
3 incubazione 20 min distribuzione dei controlli (dispensazione del controllo
negativo al posto del positivo).
Temperatura r.t. 3. che ila procedura di lavaggio e le impostazioni del
Acido Solforico 100 ul lavatore siano validate secondo gli studi di pre
Reading OD 450nm qualificazione;
4. che non sia avvenuta nessuna contaminazione
esterna del controllo positivo

Un esempio di schema di dispensazione è riportato sotto: Se si è verificato uno dei problemi riportati sopra, informare il
supervisore per ulteriori azioni.
Micropiastra

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A BLK S2 P. CALCOLO DEL CUT-OFF
B NC S3 I risultati del test sono calcolati sulla media di un valore di cut-off
C NC S4 determinato con la seguente formula:
D NC S5
E CAL S6 Cut-Off = (NC + PC) / 5
F CAL S7
G PC S8 Nota Importante: Quando il calcolo dei risultati è fatto dal
H S1 S9 sistema automatizzato ELISA assicurarsi che sia utilizzata la
Legenda: BLK = Bianco NC = Controllo Negativo formula corretta per calcolare il cut-off e generare la corretta
CAL = Calibratore PC = Controllo Positivo S = Campione interpretazione dei risultati..

O. CONTROLLO DI QUALITA’ INTERNO Q. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI

Un controllo è eseguito sui controlli e il calibratore ogni volta che I risultati del test sono interpretati come il rapporto tra
il kit è usato per verificare che I loro valori di OD450nm o di l’OD450nm il valore del Cut-Off e quello del campione (Co/S).
S/Co siano quelli aspettati.
I risultati sono in accordo alla seguente tabella:
Assicurarsi di avere i seguenti risultati:
Co/S Interpretazione
Parametri Requisiti < 0.9 Negativo
Bianco < 0.050 OD450nm value 0.9 - 1.1 Equivoco
Controllo <0.100 valore medio OD450nm > 1.1 Positivo
Negativo (NC) dopo sottrazione del bianco
coefficiente di variazione < 20%
Calibratore Co/S > 1 Un risultato negativo indica che il paziente non è affetto da HBV.
(circa 2 PEI U/ml) Ogni paziente mostrante un risultato equivoco dovrebbe essere
Controllo Positivo < 0.200 OD450nm ritestato su un secondo campione prelevato 1-2 settimane dopo
quello iniziale.
L’unità di sangue non dovrebbe essere trasfusa.
Se I risultati del test corrispondono ai requisiti stabiliti sopra,
procedere alla prossima sezione.
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Un risultato positivo è indice di infezione da HBV e quindi il 2. SPECIFICITA’ E SENSIBILITA’ DIAGNOSTICA

paziente dovrebbe essere trattato di conseguenza o l’unità di La valutazione delle prestazioni del dispositivo è stata eseguita
sangue non dovrebbe essere trasfusa. in un trial condotto su più di 6000 campioni.

Note Importanti: 2.1 Specificità Diagnostica

1. L’interpretazione dei risultati dovrebbe essere fatta sotto la E’ definita come la probabilità del saggio di rivelare negativi in
supervisione del responsabile del laboratorio per ridurre il assenza di uno specifico analita. Sono stati esaminati un totale
rischio di errori di giudizio. di più di 5000 donatori casuali, inclusi donatori per la prima
2. Quando I risultati sono trasmessi dal laboratorio ad un volta.
centro informatico, prestare attenzione per non trasferire In un primo studio 2023 campioni sono stati testati contro una
dati errati. compagnia di riferimento americana. E’ stata trovata una
3. La diagnosi di infezione da epatite virale deve essere fatta e specificità del of 99.5% . In un secondo studio sono stati
comunicata al paziente da personale medico qualificato. esaminati contro un dispositivo europeo 1588 campioni. E’ stata
trovata una specificità del 99.7% . Nell’ultimo studio sono stati
esaminati 1565 campioni contro la stessa compagnia
Un esempio di calcolo è riportato sotto: americana, ed è stato trovato un valore del 99.8%.
Inoltre sono stati testati 206 campioni da pazienti ospedalizzati
I seguenti dati non devono essere usati ma I numeri reali contro una compagnia europea. E’ stata trovata una specificità
ottenuti dall’utilizzatore. del 99.3%.
Comunque, la specificità diagnostica era assegnata testando
Controllo Negativo: 2.000 – 2.200 – 2.000 OD450nm 164 campioni potenzialmente interferenti (altre malattie infettive,
Valore medio: 2.100 OD450nm pazienti affetti da malattie del fegato non virali, pazienti in dialisi,
Più alto di 1.000 – Accettato donne in gravidanza, emolizzati, lipemici, etc.) contro una
compagnia Europea.E’ stato assegnato un valore di specificità
Controllo Positivo: 0.100 OD450nm del 100%.
Più basso di 0.200 – Accettato Infine Per determinare la specificità sono stati usati sia plasmi,
derivati da differenti tecniche standard di preparazione (citrato,
Cut-Off = (2.100 + 0.100) / 5 = 0.440 EDTA, eparina), che sieri.
Non è stata osservata nessuna falsa reattività legata al metodo
Calibratore: 0.400-0.360 OD450nm di preparazione del campione.
Valore Medio: 0.380 OD450nm
Più basso di NC/2 – Accettato 2.2 Sensibilità Diagnostica
E’ definita come la probabilità del saggio di rivelare positivi in
Campione 1: 0.028 OD450nm presenza di uno specifico analita.
Campione 2: 1.890 OD450nm Sono stati testati 373 campioni positivi contro una compagnia
Campione 1 Co/S > 1.1 positivo europea; è stata trovata una sensibilità diagnostica del 99.7%.
Campione 2 Co/S < 0.9 negativo Infine sono stati esaminati83 campioni contro una compagnia
americana ed è stata assegnata una sensibilità diagnostica del
94.9%.

3. PRECISIONE
R. PRESTAZIONI I valori medi ottenuti da uno studio condotto su tre lotti e su due
La valutazione delle prestazioni è stata condotta in accordo a campuioni di reattività anti HbcAg differente, esaminati in
quanto riportato in Common Technical Specifications o CTS replicati in tre sessioni separate sono riportati sotto:
(art. 5, Capitolo 3 di IVD Direttiva 98/79/EC).
BCAB.CE: lot # 1202
1. LIMITE DI RIVELAZIONE:
La sensibilità del saggio è stata calcolata per mezzo della Controllo Negativo (N = 16)
preparazione di riferimento per HBcAb fornita da Paul Erlich Valori medi 1° sessione 2° sessione 3° sessione Media
Institute (PEI HBc Materiale di riferimento n° 82). Il saggio OD 450nm 1.943 1.939 1.924 1.935
mostra una sensibilità di circa 1.25 PEI U/ml. Std.Deviation 0.081 0.078 0.103 0.087
CV % 4.2 4.0 5.3 4.5
La tabella sotto riporta i valori Co/S mostrati dallo standard PEI
diluito come suggerito dal produttore per preparare una curva Calibratore (N = 16)
limitante in Siero Fetale (FCS). Valori medi 1° sessione 2° sessione 3° sessione Media
OD 450nm 0.143 0.147 0.148 0.146
Std.Deviation 0.014 0.017 0.018 0.016
PEI U/ml Lot 1001 Lot 0702 Lot 0702/2 Lot 1202 CV % 9.8 11.4 12.1 11.1
5 22.6 18.0 19.0 17.7 Co/S 2.8 2.7 2.6 2.7
2.5 8.0 5.5 5.4 5.0
1.25 1.1 1.3 1.0 1.0
BCAB.CE: lot # 0702
0.625 0.4 0.4 0.4 0.4
Controllo Negativo (N = 16)
Valori medi 1° sessione 2° sessione 3r°sessione Media
Inoltre è stato testato per determinare il suo valore Co/S OD 450nm 2.163 2.110 2.106 2.126
Accurun 1 – series 3000 – fornito da Boston Biomedica Inc., Std.Deviation 0.105 0.088 0.139 0.111
USA. I risultati sono riportati sotto: CV % 4.9 4.2 6.6 5.2

Accurun 1 – series 3000 Calibratore (N = 16)

Valori medi 1° sessione 2° sessione 3°sessione Media
OD 450nm 0.182 0.193 0.195 0.190
Value Lot 1001 Lot 0702 Lot 1202 Std.Deviation 0.018 0.023 0.019 0.020
S/Co 2.9 2.3 2.2 CV % 10.0 12.0 9.9 10.6
S/Co 2.5 2.2 2.3 2.3
Doc.: INS BCAB.CE/it Page 9 of 9 Rev.: 1 08/2003

BCAB.CE: lot # 0702/2 BIBLIOGRAFIA

Controllo Negativo (N = 16)
Valori medi 1°sessione 2°sessione 3°sessione Media 1. Aach R.D., Grisham J.W., Parker S.W..
OD 450nm 2.278 2.098 2.130 2.169 Proc.Natl.Acad.Sci..USA, 68:1956, 1971.
Std.Deviation 0.135 0.126 0.159 0.140 2. Blumerg B.S., Suinick A.I., London W.T.. Hepatitis and
CV % 5.9 6.0 7.5 6.5 leukemia: their relation to Australia antigen.
Bull.N.Y.Acad.Med.. 44:1566, 1968.
Calibratore (N = 16) 3. Boniolo A., Dovis M., Matteja R.. J.Immunol.Meth.. 49:1,
Valori medi 1° sessione 2° sessione 3° sessione Media 1982.
OD 450nm 0.193 0.190 0.199 0.134 4. Caldwell C.W., Barpet J.T.. Clin.Chim.Acta 81: 305, 1977
Std.Deviation 0.023 0.023 0.027 0.025 5. Fazekas S., De St.Groth, Scheidegger D..
CV % 12.1 12.3 13.5 12.6 J.Immunol.Meth.. 35: 1, 1980
S/Co 2.4 2.2 2.2 2.3
6. Reesink H.W.. et al.. Vox.Sang.. 39:61, 1980
7. Rook G.A.W.. Lepr.Rev. 52: 281, 1981
La variabilità mostrata nelle tabelle non è risultata nella
8. Schroder J.. Med.Biol.. 58: 281, 1981
misclassificazione dei campioni
9. Almeida J.D. et al.. Lancet, ii : 1225, 1971
10. Hoofnagle J.H. et al.. Lancet, ii: 869, 1973
11. Hoofnagle J.H. et al.. N.E.J.Med., 290: 1336, 1974
12. Katchaki J.N. et al.. J.Clin.Path., 31: 837, 1978
13. Szmuness W. et al.. Am.J.Epidem., 104 : 256, 1976
S. LIMITATIONI DELLA PROCEDURA
14. Grebenchtchikiov N. et al.. J.Immunol. Methods,
Contaminazioni batteriche o inattivazioni da calore del campione
15(2) :219-231, 2002
possono influenzare I valori di assorbanza dei campioni con
15. Schrijver RS and Kramps JA, Rev.Sci.Tech. 17(2):550-
conseguente alterazione del livello dell’analita. Questo test è
561, 1998
consigliato per testare campioni singoli e non pool.
La diagnosi di una malattia infettiva non dovrebbe essere
stabilita sulla base di un singolo test. Dovrebbero essere
considerate la storia clinica del paziente, la sintomatologia e
anche altri dati diagnostici.
Questo dispositivo è stato prodotto dalla Dia. Pro s.r.l.
sotto i controlli stabiliti da un sistema di qualità totale che
ottempera ai requisiti delle norme ISO 13485 come
verificato dall’Organismo Notificato Europeo n° 0318

Prodotto da
Dia.Pro. Diagnostic Bioprobes Srl.
via Columella n° 31 – Milano - Italia
Doc.: INS BCAB.CE Rev.: 1 08/2003

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