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Batteriofagi

Corso di formazione e di
aggiornamento in:
MICROBIOLOGIA DEGLI
ALIMENTI
Bologna, 26
ottobre 2012
Batteriofagi 1
Definizione e classificazione
Bologna, 26 ottobre 2012
Batteriofagi
I batteriofagi sono i virus che attaccano i
batteri.
Sono, in quanto virus, parassiti
endocellulari obbligati
2
Linfezione fagica porta alla lisi delle colture e quindi
interrompe la fermentazione della matrice nel processo.
ritardo nell acidificazione
alterazione della qualit del prodotto
perdita nella produzione
mancata competizione con patogeni
Effetto di un attacco fagico
Bologna, 26 ottobre 2012
Batteriofagi
3
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
0 1 2 3 4 5 6
Inhibitor or Culture Abuse
Phage
Normal
pH
Hours
Definizione e classificazione
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Batteriofagi
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Famiglia Morfologia Tipo di acido
nucleico
Myoviridae Non rivestito, coda contrattile dsDNA lineare
Siphoviridae
Non rivestito, coda lunga non
contrattile
dsDNA lineare
Podoviridae
Non rivestito, coda corta non
contrattile
dsDNA lineare
Tectiviridae Non rivestito, isometrico dsDNA lineare
Corticoviridae Non rivestito, isometrico dsDNA circolare
Lipothrixviridae
Rivestito, a forma di
bastoncino
dsDNA lineare
Plasmaviridae Rivestito, pleomorfo dsDNA circolare
Rudiviridae
Non rivestito, a forma di
bastoncino
dsDNA lineare
Fuselloviridae Non rivestito, a forma di limone dsDNA circolare
Inoviridae Non rivestito, filamentoso ssDNA circolare
Microviridae Non rivestito, isometrico ssDNA circolare
Leviviridae Non rivestito, isometrico ssRNA lineare
Cystoviridae Rivestito, sferico dsRNA segmentato
I fagi dei batteri
lattici
appartengono
allordine
Caudovirales
Il ciclo litico
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Adsorbimento del fago alla
parete cellulare
Iniezionedel genoma fagico
nella cellula ospite
Moltiplicazione (fase precoce,
intermedia e tardiva)
Lisi della parete cellulare
dellospite e liberazione delle
particelle fagiche
Il ciclo litico
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Il ciclo lisogenico
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Adsorbimento del fago alla
parete cellulare
Iniezionedel genoma fagico
nella cellula ospite
DNA fagico integrato nel
genoma batterico (integrasi)
Genoma virale (profago)
replicato con la cellula
ospite
Sintesi del repressore
Il ciclo lisogenico
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Sistema di integrazione
Linduzione
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Fattori fisici: radiazioni UV,
shock termico,
shock osmotico
Fattori chimici: mitomicina C,
norfloxacina,
perossidi
Meccanismi di
resistenza ai
batteriofagi
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CRISPR
Clustered Regularly
InterSpersed Palindromic
Repeats
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Corte sequenze
ripetute (25-50 nt)
intervallate da
singole sequenze di
dimensione similare e
con, ad una
estremit, un numero
variabile di geni cas
(CRISPR- associated
genes).
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I batteriofagi come vettori di geni
I profagi sono in grado di conferire caratteristiche
fenotipiche alla cellula ospite
tossine codificate da profagi
alterazioni della superficie della cellula ospite
inattivazione o alterazione dellespressione dei
geni dellospite
diffusione di geni attraverso TRASDUZIONE
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Trasduzione
generalizzata
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Trasduzione
specializzata
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Lorigine dei fagi nellambiente
3
4
5
6
7
8
9
10
U
F
P
/
m
l

o

g
Concentrazione di particelle fagiche in vari ambienti
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Lorigine dei fagi nellambiente
Le colture starter lisogene nel settore caseario
Lactococcus(60%)
Streptococcus(50%)
Leuconostoc (50%)
Lactobacillus(40%)
Gli pseudo fagi, cio profagi mutati che hanno
perso la capacit di completare un ciclo infettivo
dopo induzione, ma possono ricombinare.
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Lorigine dei fagi nellambiente caseario
I sottoprodotti: il siero (10
3
-10
8
UFP/ ml),
i residui di prodotto (10
3
-10
8
UFP/ ml)
Materie prime: il latte crudo (10
2
-10
4
UFP/ ml), la crema
di affioramento (10
2
-10
4
UFP/ ml)
Acqua di processo (10
2
UFP/ ml), acque di lavaggio (10
2
-
10
4
UFP/ ml)
Personale (comportamento igienico/ abbigliamento)
Aria (10
2
/ l)
Ridurre il pi possibile le operazioni che producono
aerosol (fermentatori aperti, stirring, travasi,
centrifugazioni, spray-drying)
Materiale fecale
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Lorigine dei fagi nellambiente caseario
Le attrezzature: le macchine confezionatrici, gli
scambiatori di calore, gli ultrafiltratori, le
pompe
I locali e le attrezzature utilizzati per la
preparazione degli starter
Difficolt nelle operazioni di
sanificazione
La gestione delle colture
lattiche deve avvenire in
luoghi confinati, mantenuti in
sovrappressione
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La prevenzione sulle materie prime
N la pastorizzazione LTLT
(63C per 30 min),
n la pastorizzazione HTST
(72C per 15 s),
ne la pastorizzazione flash
(85C per 3 s)
consentono di risanare il
latte dalla presenza di
batteriofagi
Occorre giungere a
trattamenti di 82C per 5
min!
Trattamento termico
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La prevenzione sullimpianto
Flusso di produzione unidirezionale
Separazione della materie prime e allontanamento rapido
e confinato dei sottoprodotti
Minimizzazione del riciclo di attrezzature e personale
Mantenimento di condizioni di asciutto / abbassamento
dellumidit relativa nellimpianto
Buona gestione dellimpianto di condizionamento dellaria
(HVAC)
Sebbene i filtri HEPA non sono certificati per eliminare i
fagi, questi sistemi sono efficaci per ridurre
significativamente la presenza di tali particelle virali, a
condizione che la portata sia adeguata e laria
rimanga a bassa UR%
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La prevenzione sullimpianto:
La sanificazione delle superfici
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La prevenzione sullimpianto:
La sanificazione delle superfici
Detergente Disinfettante
Soluzione NaOH2% a 80C Acido peracetico e acqua
ossigenata (>200 mg/L) a 40C
Soluzione H
3
PO
4
1% a 65C Vapore fluente
Cloro
> 85C per almeno 5 min
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La prevenzione attraverso la gestione
delle colture starter
Sistema della rotazione delle colture: impiego programmato
di ceppi con differente sensibilit ai fagi
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120
U
F
P
/
m
l
tempo (ore)
Soglia di
produzione
Soglia di
produzione
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La rotazione delle colture
Selezione e caratterizzazione dei ceppi
Determinazione dello stato lisogenico dei ceppi
(induzione per Mitomicina C, Norfloxacina, UV, H
2
0
2
)
Raccolta e collezione dei fagi
Determinazione dello spettro dospite (host range)
100 101 102 103 500 600 883 900 901 902 903 904
FAGO A
+ + + + +
FAGO B
+ + + + + +
FAGO C
+ + + + +
FAGO X
+ + + +
FAGO Y
+ + + + + +
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La formulazione delle colture
Associare 3-5 ceppi con differente sensibilit ai fagi
Attenzione: i ceppi lisogeni veicolano sempre fagi liberi!
Associare i ceppi in modo tale che la coltura esprima
prestazioni tecnologiche simili
Organizzare la rotazione delle colture in modo che le
sensibilit ai fagi dei ceppi che le costituiscono non si
sovrappongano
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Il controllo delle colture
Monitoraggio della presenza/ carica dei fagi nei sieri a fine
lavorazione o nei prodotti finiti (per yogurt e latti fermentati)
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Metodi di determinazione
Protocolli per il prelievo del campione
Tecnica colturale: il saggio di placca
Tecnica colturale: il test di attivit
Tecnica conduttimetrica
Tecnica molecolare
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Metodi di determinazione
Per campioni solidi in polvere (latte in polvere, siero in
polvere) diluire 1:10 in acqua distillata sterile
Per campioni solidi (formaggi, yogurt) diluire 1:10 in soluzione
di sodio citrato (2% p/ v) ed omogeneizzare
Per campioni liquidi (latte, siero, colture starter, acque di
lavaggio) procedere direttamente.
campione
aggiustamento pH
centrifugazione
filtrazione
Il pH aggiustato a 4,6 con acido lattico
(10% p/v) per precipitare le caseine
5000 g per 20 min per
allontanare i solidi
Membrana 0,45 m
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Metodi di determinazione
Tale trattamento inattiva i
fagi ma non ha effetto su
antibiotici o disinfettanti.
Costituisce il controllo
negativo nei test
Trattato
termicamente
Il campione viene
scaldato a 90C per
15 min
Campione filtrato
Non trattato
Analisi con
tecniche colturali
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Tecnica colturale: il saggio di placca
10
-1
10
-3
10
-2
Filtrato
fagico
sospetto
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Tecnica colturale: il test di attivit
3
4
5
6
7
8
0 60 120 180 240 300 360
p
H
tempo (min)
Si realizza per comparazione, in condizioni standardizzate, tra la
curva di acidificazione ottenuta con una coltura di controllo e
quella ottenuta con la medesima coltura addizionata di un
campione sospetto di contenere fagi
> 0,2 unit pH
o acidit svolta (SH) < 10%
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Tecnica colturale: il test di attivit
Protocollo in micropiastre
Incubazione controllata
Lettura e registrazione in continuo
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Tecnica conduttimetrica
Rilevazione attivit metabolica cellulare attraverso la
misurazione del cambiamento delle propriet elettriche
del mezzo di coltura
Sistema automatizzato
Risultati in < 16 h
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Tecnica
conduttimetrica
Campione filtrato
Non trattato
Diluizioni decimali
Trattato
termicamente
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Tecnica molecolare (PCR)
Geni target:
integrasi (int),
proteine della coda (antireceptor gene - regione variabile VR2),
proteina principale del capside
NTP-binding protein
elicasi
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Tecnica molecolare (PCR)
Amplification of the antireceptor VR2 variable region using bacteriophage-infected milk.
Lane M, 100-bp PCR EZ load molecular ruler (Bio-Rad); lane 1, 021-5; lane 2, CP; lane 3,
CQ210; lane 4, CQ211; lane 5, FcSth10; lane 6, Abc2; lane 7, Ly1; lane 8, Ly7; lane 9, 799-
M1; lane 10, P10.3; lane 11, P13.2; lane 12, 0BJ ; lane 13, 021-4; lane 14, P3.1; lane 15, Mi1;
lane 16, Ly4; lane 17, Sfi21; lane 18, negative control.
Limite di sensibilit 10
4
- 10
5
UFP/ml
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Tecnica molecolare (PCR)
Multiplex PCR assay with different
combinations of phage species
in the same sample. Reactions were
performed with phage titres of
106PFUml1 (L. lactisphage species)
and 107PFUml1 (L. delbrueckii
subsp. bulgaricusand S.
thermophilus phage species). Lane
1: 100 bp
molecular marker; Lane 2: negative
control (without phages); Lane 3:
P335 plus bIL170 and c2; Lane 4: YAB
plus OBJ ; Lane 5: All five phages
Determinare la presenza contemporanea
di pi fagi: Multiplex PCR
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Tecnica molecolare (QPCR)
Limite di sensibilit 10
1
UFP/ml
Protocollo basato su PCR quantitativa
qPCRanalysis of 10-fold dilutions of milk artificially infected with a Lb. delbrueckii
bacteriophage (YAB phage) (adapted from Martn et al., 2008). (A) Amplification
plot of bacteriophage DNA in serial diluted samples starting at 10 PFU/sample. (B) A
linear correlation is established between the CT value and the logarithm of the
number of phage particleson the sample
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Tipizzazione dei fagi:
osservazione microscopica
Microscopio Elettronico in Trasmissione
Colorazione con acetato di uranile
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Tipizzazione dei fagi: RFLP
Electrophoresis in a 1% agarose gel
of EcoRI restriction enzyme
digestion. M:molecular markers, 1:
GV8:, 2: GV2412, 3: L34, 4:
BR2.
Sospensione virale
concentrata
Estrazione DNA
Trattamento con enzimi
di restrizione
Separazione elettroforetica
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Tipizzazione dei fagi: MLSA
Caratterizzazione di regioni di alcuni geni basata
sullorganizzazione del genoma
Il protocollo si focalizza sullamplificazione di parecchi
geni con diversi pool di primers
I dati ottenuti sono basati sui risultati di presenza/ assenza di
amplificato PCR (senza necessit di sequenziare)
Elaborazione di una matrice evidenzia similarit tra I fagi
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Phage therapy
Impiegodi sospensioni fagiche concentrate per il controllo dei
batteri:
Applicazioni in veterinaria:
Controllo di Salmonella in allevamento avicolo e suino
Controllo di stx E.coli in allevamento bovino
Controllo di Campylobacter in allevamento avicolo
Controllo di Lactococcusgarviae ina troticoltura
Applicazioni in agricoltura:
Controllo di Pseudomonas e Xantomonasin coltivazione
pomodoro
Controllo di Erwinia su mele
Controllo di Salmonella in semi germogliati
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Phage therapy
Applicazioni in medicina:
Controllo di Staphylococcus aureussu ferite cutanee
Fagolisine come sostituzione di antibiotici
Controllo setticemia ?
Applicazioni in produzioni alimentari:
Controllo di Listeria monocytognessu melone, su salmone
affumicato, in latte e su formaggi
Controllo di Salmonella su carcasse di pollo e su formaggi
Controllo di stxE.coli su carne bovina
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Phage therapy
Le contaminazioni negli alimenti
difficilmente sono a carico di un singolo ceppo
Si selezionano naturalmente ceppi resistenti
Nellambiente e negli alimenti possono
essere presenti fattori negativi