TECNICHE DI PRELIEVO MICROBIOLOGICO

Prelievo campioni

Come si effettua prelievo

TECNICHE DI PRELIEVO ED ESAME MICROBIOLOGICO

TECNICHE DI PRELIEVO MICROBIOLOGICO:

1) È necessario scegliere il campione clinico adeguato (deve rispettare la sede del processo
infettivo, deve essere adeguato alla zona dell'infezione). È necessario dunque sapere qual è
il sito dell’infezione, perché ad esempio se si tratta di una via aerea profonda bisogna
prelevare l’espettorato, mentre se è una delle prime vie aeree si deve prelevare il tampone
faringeo. Ogni campione biologico deve rispecchiare la sede del processo infettivo. Il
campione va raccolto nel momento opportuno, ossia durante la fase acuta della malattia.
(Ricordiamo, ad esempio, riguardo le epatiti: quando ci si accorge di avere l’epatite e quindi
si ha la manifestazione sintomatica, il virus non è più nelle feci. Quindi, se sappiamo
questo, non faremo l’esame delle feci dopo aver scoperto che il paziente è affetto\
potrebbe essere affetto da epatite, per isolare il virus. In questo caso infatti conviene
ricercare gli anticorpi perché si saranno già formate le IgM e le IgG). Dunque, bisogna
conoscere l'evoluzione
delle infezioni, conoscendo i batteri e i virus che le causano.

2) Poi, bisogna raccogliere la quantità sufficiente di materiale.

3) Evitare contaminazioni esterne, che possono avvenire sia a causa di microrganismi

residenti sia a causa di strumenti\contenitori non sterili. ES urina mitto intermedio /
tampone faringeo evitando contaminazioni della flora commensale

4) Usare contenitori idonei e appropriati terreni di trasporto. (es: se si sospetta un'infezione

di una ferita profonda e si sospetta di un clostridio (Clostridium), il tampone deve essere
trasportato nella maniera più opportuna perché il clostridio è anaerobio; quindi si deve
mettere in condizioni di anaerobiosi, altrimenti morirebbe.)

5) Di conseguenza, bisogna conoscere l’eziologia della sospetta infezione.

6) Etichettare adeguatamente i campioni (sia sul contenitore che sul tappo) nome cognomen
data di nascita

7) Compilare le richieste d'esame con un numero di informazioni cliniche sufficienti e in modo

comprensibile.

8) Nel caso in cui si debbano effettuare esami particolari è necessario contattare il

laboratorio per chiarire al meglio le modalità del prelievo. È importate anche conoscere la
differenza
tra le diverse provette: la rossa dà il siero perché è una provetta asciutta e quindi si attiva
la cascata della coagulazione, si forma il coagulo, si centrifuga il campione e si forma il
siero. La provetta viola, quella azzurra e quella verde contengono tutte anticoagulanti
anche se si
 tratta di anticoagulanti diversi: l’EDTA per il tappo viola, il citrato per il tappo azzurro
ed eparina per il tappo verde che viene prevalentemente utilizzato per i marcatori
cardiaci.
9) Inviare i campioni in laboratorio rapidamente, per evitare alterazioni.
10) Prelevare il campione nel momento opportuno
11) Conservare in frigorifero per evitare la moltiplicazione
UN CAMPIONE CONTAMINATO NON POTRA’ MAI FORNIRE INFO ACCURATE PER LA
DIAGNOSI.

PRELIEVO DEI CAMPIONI:

CHE TIPOLOGIE DI CAMPIONI POSSIAMO PRENDERE A SECONDA DELLA SEDE?
Dall’APPARATO RESPIRATORIO: Espettorato, tampone faringeo, aspirato nasale, bronco-
aspirato
(o BAL: lavaggio broncoalveolare)

Dall’APPARATO GASTROINTESTINALE: Feci e Tamponi rettali

Dal SISTEMA NERVOSO: Liquor

INFEZIONE DELLA CUTE: Tamponi cutanei

Dall’APPARATO URINARIO: Tamponi uretrali o raccolta delle urine (che può avvenire in
diversi modi)
Dall’APPARATO RIPRODUTTORE: Liquido seminale solo per gli uomini, tampone vaginale
e cervicale solo per le donne, tampone uretrale per uomo e donna.

SETTICEMIA: il sangue

Per quanto riguarda il punto 4, ossia l’evitare le contaminazioni, è importante tenere a mente
che esistono zone normalmente sterili in cui non vi sono colonizzazioni microbiche e queste
sono, ad esempio, il sangue, il liquor, i tessuti profondi, le vie respiratorie inferiori, l’urina e
così via, ed altre zone invece in cui vi è una popolazione residente, come la pelle, la vagina,
l’intestino, le vie respiratorie superiori, le vie nasali.
Inoltre, bisogna evitare le contaminazioni da parte degli agenti esterni, dunque i prelievi
vanno eseguiti rispettando le regole dell'asepsi ed effettuando una corretta disinfezione nella
zona da prelevare. (questo vale anche per la raccolta delle urine; bisogna effettuare una
detersione dei genitali)
Tecnicamente per la raccolta delle urine si dovrebbe effettuare preventivamente una pulizia
dell’area vaginale e, al momento della minzione, andrebbe raccolto solo il mitto intermedio
e
non il primo gitto perché per risalita dall’uretra, colonizzata dai batteri sia nel sesso maschile
che in quello femminile, potrebbe avvenire una contaminazione. Quindi, raccogliendo il
mitto intermedio i batteri, che non aderiscono con forza, verranno eliminati dalla propulsione
dell’urina. Quindi raccoglieremo l'urina che rispecchia lo stato del genitale.

COME SI FANNO I PRELIEVI?

Ad esempio, per il tampone faringeo bisogna toccare con un cotton-fioc il faringe, ma la zona
in cui passa è ricca di batteri perché la bocca è intensamente colonizzata. Ci si può aiutare
con un abbassalingua, si tocca la gola evitando lingua, saliva e denti evitando di trasportare
microbi. Dopo averlo etichettato si può inviare in laboratorio.
Prendiamo come altro esempio l’espettorato: viene prodotto dalle vie aeree inferiori ma
passa attraverso il cavo orale, quindi si fa al mattino, a digiuno, si invita il paziente a fare dei
gargarismi di acqua, si induce un colpo di tosse e se il paziente non riesce si può nebulizzare
con della soluzione fisiologica, e si utilizzano dei recipienti sterili a bocca larga e si invia al
laboratorio.
Il BAL invece è il liquido Bronco-alveolare; è un esame molto più invasivo che si utilizza
quando il paziente non è in grado di espettorare e dev’essere effettuata la diagnosi di
un’infezione particolare. Si iniettano 50 ml di soluzione fisiologica con un broncoscopio (si fa in
sedazione) e poi, dopo aver effettuato questo lavaggio delle vie respiratorie, si aspira il liquido
e si manda in laboratorio.
Per quanto riguarda le feci, sappiamo che sono campioni ricchi di germi della flora microbica
residente e il prelievo si fa utilizzando contenitori idonei dotati di chiusura ermetica,
evitando mescolamenti con l’urina, dopodiché il campione si invia al laboratorio.
Il tampone rettale si esegue dopo aver pulito la zona anale esterna (senza utilizzo di
disinfettanti perché, se così fosse, nel momento in cui portiamo fuori il tampone, i germi
incontrerebbero il disinfettante e morirebbero impossibilitando la diagnosi), si introduce
il tampone sterile nell’ano per circa 2 cm, dopodiché si chiude e si invia in laboratorio.
Per prelevare il liquor cefalorachidiano è necessaria una puntura lombare di anestesia tra la
4° e la 5° vertebra, e viene effettuata, dopo un’accurata disinfezione, da un anestesista che va
a centrare il canale midollare e ad aspirare il liquido. Questo verrà poi distribuito nelle
provette sterili e viene rapidamente inviato al laboratorio.
Nel caso di campioni da pustole, vescicole, ferite esogene ed endogene, ad esempio, se si
sospetta un herpes si può utilizzare una siringa da insulina ed aspirare il liquido che vi è
all’interno delle vescicole, oppure nel caso di vescicole purulente si allargano leggermente
i lembi della cute per evitare la contaminazione della popolazione residente e si cerca il
prelevare il pus senza toccare il margine esterno.
L’urinocoltura va effettuata prima di qualsiasi terapia antibiotica, perché se già il paziente
sta facendo terapia antibiotica con molta probabilità i risultati saranno negativi nonostante
l’infezione vi sia.
È opportuno che il prelievo venga effettuato dalle 3 alle 6h distanza dall’ultima
minzione, generalmente infatti si effettua al mattino ed è necessaria una piccola
quantità di urina.
Vi sono diversi metodi per prelevare l’urina: ad esempio nel caso dei neonati esistono dei
sacchettini specifici che presentano anche una distinzione nel caso in cui siano per maschi o
per femmine.
Altri metodi di prelievo dell’urina sono il cateterismo e la puntura sovrapubica (da pube si
preleva l'urina in vescica), quest’ultima è più invasiva e viene effettuata solo in casi estremi.
Poi una piccola quantità dell'urino-coltura si segna sulla piastra con lo strumento sterile, si
semina in modo particolare per avere colonie isolate; e sull'urina si esegue anche l'esame
chimico- fisico, per cui si valuta se l'urina è torbida, limpida.. E osservando al microscopio si
valuta se vi sono globuli rossi, batteri, globuli bianchi ecc...
L'uretra, sia maschile che femminile, può essere contaminata sulla bassa via per risalita
dei germi; mentre le parti più interne dei genitali sono generalmente sterili.
Per quanto riguarda l’apparato riproduttivo, ricordiamo che il PH vaginale varia in base all’età
e alle condizioni di ogni donna: generalmente durante la pubertà un PH alcalino favorisce
l’instaurarsi di una flora microbica mista, l’età fertile è caratterizzata dalla presenza
abbondante glicogeno a livello vaginale che favorisce i lattobacilli e dunque un PH acido.
Durante la menopausa si ripristina ciò che accadeva in pubertà, per cui diminuisce la
quantità
di glicogeno e aumenta nuovamente la flora microbica mista.
Come si fa il tampone uretrale per ricerche come per la Clamidia o per l’HPV? Si puliscono i
genitali esterni, il prelievo va effettuato prima della minzione, perché altrimenti con la
propulsione dell’urina vengono mandati via i batteri e ciò, al contrario dell’urinocoltura,
risulta un problema per il tampone uretrale. Il tampone uretrale va inserito per 3-4 cm a
livello uretrale e risulta essere più invasivo. Anche questo va poi subito inviato in laboratorio.
Per il tampone vaginale è necessario evitare lavaggi interni il giorno precedente e non
effettuare trattamenti antimicrobici, pulire accuratamente i genitali esterni e prelevare il
tampone vaginale senza aiuto dello speculum (al contrario del tampone cervicale che va
effettuato usando lo speculum che allarga le pareti vaginali e ci permette di visualizzare il
collo dell’utero, e quindi il prelievo si effettua a livello della cervice).
I prelievi possono essere multipli a seconda del sospetto clinico: ad esempio per la prostatite,
che può essere causata da vari germi come la clamidia, l'ureoplasma, la candida, lo
stafilococco aureo...il campione clinico può essere composto da più di un campione biologico.
Facendo sempre riferimento a questo tipo di patologia ad esempio possono essere prelevati
10 ml di urina, il mitto intermedio della vescica, urina dopo l'effettuazione del massaggio
prostatico (effettuato dall'urologo nella zona rettale stimolando le ghiandole annesse in modo
tale che esse riversino nella vescica le loro secrezioni e successivamente si invita il paziente ad
 emettere l'urina che adesso conterrà pure le secrezioni delle ghiandole prostatiche).
Dunque, inglobando queste tipologie di campioni, è possibile riuscire a fare una diagnosi
completa riguardante questi germi. Questo ci fa capire che non sempre si ha un solo
campione, spesso infatti è necessario utilizzare più campioni per fare diagnosi di una
patologia.
Per quanto riguarda le setticemie, il prelievo viene effettuato sul sangue, in questo caso
l'emocoltura viene fatta quando il paziente presenta febbre alta e persistente (laviamo il braccio,
applichiamo tintura di iodio all'1-2%, usiamo l'alcol e dopo ciò vengono prelevati 10 ml (solo se
adulti, sui neonati si prelevano 1-5 ml. Il prelievo viene riversato in dei terreni liquidi necessari a
far crescere determinati batteri presenti nel sangue. Generalmente vengono effettuati 3 prelievi
consecutivi ad intervalli di 15/30 minuti dopo l'inizio del picco febbrile. I prelievi vengono
effettuati per diversi tipi di batteri [aerobi, anaerobi e miceti]. A questo punto bisogna fare
diagnosi di infezione: o dimostrando la presenza del microrganismo che ha causato la patologia
(antigene, acido nucleico, virus, batterio), oppure bisogna guardare la risposta immunitaria
dell'ospite, effettuando la ricerca degli anticorpi. Quindi o si realizza una diagnosi di tipo diretto o
di tipo indiretto.
Per l'esame colturale (dopo la crescita della colonia), vengono effettuate le varie colorazioni:
di Gram se si sospetta un batterio colorabile con la colorazione di Gram, di Ziehl Neelsen se si
sospetta un caso di Tubercolosi.
Sappiamo che le nesserie che sono dei diplococchi Gram negativi, e micobatteri invece sono acido-
alcool resistenti che vengono colorati con una colorazione differente.
Questo vuol dire che anche per fare diagnosi dobbiamo partire dal sospetto clinico. Infatti, se
sospettiamo una tubercolosi non ci facciamo una colorazione di Gram, bensì quella di Ziehl-
Neelsen; contrariamente, se sospettiamo un'infezione virale possiamo osservare l'effetto
citopatico (incubando il virus con monostrato cellulare, e possiamo vedere come si replicano i
virus nel monostrato cellulare, successivamente possiamo osservare o la modificazione che il virus
ha
indotto sulle cellule, oppure la formazione dei corpi di inclusione, se è un virus che causa la
formazione dei corpi di inclusione.
Tutto ciò per quanto riguarda l'osservazione microscopica.
Ma esiste anche l'isolamento colturale, cioè la capacità di far crescere i batteri e i virus nei
terreni sintetici: in particolare abbiamo già visto nei batteri tutti i terreni batteriologici e
com'erano classificati, mentre per i virus abbiamo visto le colture cellulari e come funzionavano.
Ricordiamo che vi sono terreni vari che potevano essere completi, complessi, arricchiti e
differenziali, con l'indicatore di ph se non con presenza di antibiotico, se non con la presenza di
un antimicotico o sostanza che induce la formazione di colonie colorati.
Per l'isolamento virale vengono utilizzate le linee cellulari come i fibroblasti, cellule allungate,
cellule epiteliali oppure cellule in sospensione adese alle fiasche, mentre ricordiamo che i
linfociti non aderiscono al substrato.
Un'altra metodologia può essere la ricerca dell'antigene (un test che permette ciò, è
l'immunofluorescenza, utilizzata spesso in laboratorio). Esistono due tipi di
immunofluorescenza: una diretta e una indiretta. Dunque, se cerchiamo l'antigene dell'herpes 1
e si procede con lo
scraping delle vesciche, bisogna utilizzare un anticorpo marcato con il fluorocromo, perché dal
momento che viene utilizzato il microscopio a fluorescenza l'antigene deve essere marcato con
un anticorpo fluorescente.
Nell'immunofluorescenza indiretta , nel momento in cui si ricerca l'antigene, viene utilizzato
un anticorpo e poi un secondo anticorpo che si lega nel FAB del primo anticorpo (la porzione
costante).
Se cerco l'antigene dell'herpes serve l'anticorpo anti-herpes , se cerco l'antigene della rosolia mi
serve l'anticorpo anti-rosolia, se cerco quello della parotite mi serve l'anticorpo anti-parotite.
Invece,con l'immunofluorescenza indiretta, dal momento che utilizziamo un secondo anticorpo
che si dirige verso il frammento costante, si può utilizzare il secondo anticorpo uguale per tutti. Per
questo motivo la tecnica dell'immunofluorescenza indiretta ha avuto maggiore sviluppo rispetto a
quella diretta, poiché comporta costi minori. Questo è dovuto al fatto che, mentre nel caso
dell'immunofluorescenza diretta è necessario prendere un anticorpo coniugato marcato con il
fluorocromo per ogni virus che cerco (antigene specifico), nel caso dell'immunofluorescenza
indiretta possiamo utilizzare lo stesso anticorpo per tutti. L'immunofluorescenza indiretta serve
inoltre per cercare gli anticorpi, perché se cerchiamo gli anticorpi nel siero e questi anticorpi nel
siero ci sono, essi si legheranno agli antigeni primariamente, a questo punto si metteranno i
secondi anticorpi coniugati e verrà evidenziato poiché esso si colorerà e diventerà
fluorescente. Tutto ciò che è marcato dall'anticorpo risulta essere fluorescente.
L' ELISA, invece, può essere utilizzato sia per cercare gli antigeni che per cercare l'anticorpo; se
cerchiamo l'antigene dobbiamo avere il pozzetto rivestito da anticorpi, quindi nel momento in
cui mettiamo il campione biologico ad incubare in questo pozzetto, se c'è l'antigene si effettua il
legame antigene-anticorpo. A questo punto si aggiunge il secondo anticorpo che stavolta non è
marcato in fluorescenza, bensì con una sostanza cromogena. Nella fase finale quindi si aggiunge
uno sviluppatore di colore che farà colorare tutto il campione. Nei pozzetti colorati la reazione è
avvenuta, nei pozzetti trasparenti la reazione non è avvenuta. In quelli colorati, la reazione è
avvenuta perché abbiamo l'anticorpo e l'antigene che si è legato al secondo anticorpo e si è
sviluppata la colorazione. Se non avessimo avuto l'antigene nel campione, il secondo anticorpo
non si sarebbe potuto legare a “sandwich” e quindi non si sarebbe sviluppata la colorazione.
Un'altra tecnica è l'agglutinazione che viene utilizzata negli streptococchi per stabilire il gruppo.
L'agglutinato si forma perché i batteri si uniscono tra di loro e si ha la precipitazione. Per
l'agglutinato si utilizza un anti-siero, ovvero un anticorpo specifico nei confronti dell'antigene.
Quindi, se nel campione biologico abbiamo ad esempio la neisseria meningitidis e la mettiamo a
contatto con il siero anti-neisseria, se c'è la neisseria si forma l'agglutinato e si ha il precipitato,
al contrario invece se non c'è la neisseria e non si ha la formazione di questa aggregazione tra
anticorpi e batteri e non si ha la formazione del precipitato, dunque la diagnosi è negativa.
Altra modalità di diagnosi diretta è la ricerca del genoma, che viene eseguita in PCR
(Amplificazione a catena) in cui il DNA a doppio filamento viene denaturato, quindi le due eliche
vengono separate con l'alta temperatura (si espone a 95 gradi e le due eliche si aprono), in
seguito si aggiungono i primers (ovvero sequenze complementari delle eliche che si andranno ad
associare una in un'elica e una nell'altra), mettiamo un enzima (Taq polimerasi che forma due
filamenti
completi) che copia la parte mancante. Tutto questo processo è determinato dal
cambiamento delle temperature:
-APERTURA DELLE ELICHE: 95 gradi
-ATTACCO DEI PRIMERS: tra i 40-60 gradi
-L'ENZIMA COPIA IL FILAMENTO: 72 gradi
La temperatura viene controllata da specifici apparecchi (software) e viene mantenuta per 30-
60 secondi massimo. Ogni reazione viene ripetuta inoltre per circa 30-40 cicli. Il risultato è che,
se partiamo da una copia e dopo il primo ciclo ne abbiamo due, dopo il secondo quattro, dopo il
30esimo\40esimo ciclo ne avremo un miliardo. Benché, quindi abbiamo inizialmente una carica
batterica bassa, a fine amplificazione avremo una quantità di DNA elevata. Questa tecnica ha
rivoluzionato la diagnostica, perché molte infezioni prima passavano inosservate, poiché, ad
esempio, per il liquor c'era poco materiale biologico, mentre in questo modo si riesce a fare
una diagnosi.
L'altra alternativa è la ricerca degli anticorpi, la risposta immunitaria indiretta.
Poiché, per ricercare gli anticorpi ci serve un prelievo di sangue (siero, ma si trovano anche nel
plasma, infatti si possono ricercare sia nella provetta asciutta, che in quella con l'anticoagulante);
bisogna inoltre conoscere l'evoluzione della risposta, dunque sapere che prima vengono prodotte
le IgM e poi c'è lo switch anticorpale sulle IgG. Questo perché dobbiamo datare l'infezione. Molte
tecniche si basano sulla chemiluminescenza (ELISA) per ricercare gli anticorpi, abbiamo quindi
queste piastre che in questo caso sono adsorbite con l'antigene specifico, mettiamo i campioni ad
incubare, se abbiamo gli anticorpi si crea il legame antigene-anticorpo e a questo punto si mette
il
secondo anticorpo diretto verso la frazione costante e quest'ultimo è marcato, dunque non
appena aggiungiamo il cromogeno avremo la colorazione. Quindi se si colora la piastra o il
pozzetto la reazione è positiva e si hanno gli anticorpi; se non si colora la reazione è negativa e non
si hanno gli anticorpi.
Se vogliamo evidenziare la siero-conversione (e vi è sospetto di infezione acuta) ricerco le IgM,
se poi vogliamo capire se il paziente ha siero-convertito non possiamo cercare le IgG nello stesso
siero, dobbiamo infatti ricercarlo nel successivo siero (almeno due settimane dopo perchè deve
avvenire lo switch anticorpale). Stessa cosa se invece vogliamo evidenziare un incremento del
titolo anticorpale: facciamo il vaccino, dopo una settimana abbiamo tramite il prelievo ne
rileviamo, ad esempio, 50, dopo due settimane ne avremo 250 o maggiore di 1000. Questo è
l'aumento del titolo anticorpale, perché il nostro sistema immunitario continua a reagire nei
confronti di quell'anticorpo e si avrà una quantità maggiore di anticorpi dopo due settimane.
Stessa cosa per i test per le IgM, anche se è un po' più complesso perché in genere si usano dei test
a cattura. Ricordiamo che le IgM sono pentameriche, quindi usiamo piastre adsorbite con gli
anticorpi che legano le IgM pentameriche, poi aggiungiamo l'antigene che si lega alle IgM
specifiche e poi il secondo anticorpo sempre marcato. Il meccanismo dunque abbiamo visto che è
sempre questo.
ESEMPI DI DIAGNOSI SIEROLOGICA:
EPATITE A
EPATITE C: La prima cosa da determinare sono gli anticorpi (cioè dimostrazione di anticorpi
anti- HCV), poi il genoma (dimostrazione diretta), poi il genotipo virale ecc ecc..
HIV: prima test di ELISA o comunque di Chemiluminescenza come test di screening, poi il
WESTERN BLOT (test di conferma) e infine la ricerca del genoma ed eventualmente l'isolamento
virale che
per l'HIV è piuttosto difficile perché va fatto sul sangue cordonale che è molto complicato
da reperire.