ITER DI PROCEDURA NEL LABORATORIO DI ANATOMIA PATOLOGICA

ESAME ISTOLOGICO : esame estemporaneo mediante uso del criostato biopsie mirate su tessuti e\o su organi prelievi autoptici ESAME CITOLOGICO : esame su versamento interstiziale esame su urine esame su striscio vaginale agoaspirato

1 2 3 4 5 6 7

FASE PROPEDEUTICA FASE PROPEDEUTICA DI LABORATORIO FASE PRE-ANALITICA FASE ANALITICA FASE POST-ANALITICA FASE INTERPRETATIVA REFERTAZIONE

1
ISTOLOGIA :

FASE

PROPEDEUTICA
CITOLOGIA : richiesta esame da reparto o divisione ospedaliera interna o da medico esterno allegate notizie cliniche e patologiche circa la motivazione della richiesta di esame contestuale invio di campione citologico o di vetrino con striscio vaginale gi eseguito dal ginecologo (preparazione ed anamnesi del paziente sottoposto ad agoaspirato in apposito ambulatorio)

richiesta esame da reparto o divisione ospedaliera interna o da medico esterno allegate notizie cliniche e patologiche circa la motivazione della richiesta di esame contestuale invio di reperto anatomico o istologico (vetrini di consulenza) esecuzione autopsia e relativi prelievi effettuata dal medico anatomopatologo

FASE PROPEDEUTICA DI LABORATORIO

ISTOLOGIA :

ricezione biopsie e reperti classificazione e numerazione reperti su apposito registro interno annuale progressivo compilazione apposito modulo di profilo mirato riduzione reperti anatomici ad opera del medico in apposite cassettine per istologia procedura di fissazione dei tessuti (autotecnico) (circa 15 h.) in processatore automatico

(accensione e preparazione del criostato negli esami estemporanei)

FASE
ISTOLOGIA :

PRE - ANALITICA

inclusione in paraffina dei reperti in precedenza fissati preparazione microtomo e bagno termostatato stendisezioni raccolta sezioni istologiche di circa 3 su vetrini; loro fissazione in stufa a secco termostatata; procedimento deparaffinazione in solventi (per esame al criostato : riduzione reperto e taglio sezioni con loro immediata fissazione in metanolo)

FASE
ISTOLOGIA :

ANALITICA

colorazione manuale o automatizzata delle sezioni su vetrino colorazione di routine E.-E. colorazioni speciali reazioni specifiche di immuno-isto-chimica montaggio vetrini in mezzo di inclusione idoneo (colorazione esame criostato) Controllo di qualit : uso di sezioni gi risultate positive in qualit di controllo positivo controlli inter-laboratorio

FASE

POST - ANALITICA

ISTOLOGIA : apposizione etichette identificative sui vetrini contenenti le sezioni colorate archiviazione in apposite rastrelliere delle cassettine per istologia contenenti le inclusioni in paraffina consegna dei vassoi contenenti i vetrini e dei moduli di profilo mirato al medico anatomo-patologo specialista archiviazione dei vetrini diagnosticati in istoteche

FASE

INTERPRETATIVA

ISTOLOGIA : osservazione dei vetrini al microscopio ottico interpretazione e diagnosi da parte del medico anatomopatologo specialista refertazione su apposito modulo di profilo mirato e relativa consegna in segreteria amministrativa Controllo di qualit : lettura vetrini incrociata tra medico lettore e medico revisore lettura alla cieca inter-laboratorio

REFERTAZIONE

refertazione su apposito modulo in segreteria amministrativa archiviazione documentazione cartacea inserimento su personal computer del referto in archivio informatico dedicato per singola area di interesse (istologia; citologia; immunopatologia) archiviazione documentazione informatica consegna del referto dalla segreteria al reparto o al medico richiedente o al paziente

DOPO IL PRELIEVO

-Tessuti Freschi inviati direttamente al patologo: perch e come. -Tessuti sotto vuoto Banche di tessuti: perch e come. Problemi connessi.

FISSAZIONE DEI TESSUTI

La diagnosi istopatologica, che si basa sullo studio della morfologia, richiede l uso di fissativi idonei a preservare nello statu quo ante migliore possibile la struttura del campione. La fissazione di un tessuto fornisce quindi una immagine statica, la quale, bench non ne rappresenti proprio le caratteristiche dell aspetto in vivo, deve tuttavia essere costantemente riproducibile. Requisiti fondamentali del fissativo ideale : sicura preservazione della morfologia di base integrit della struttura antigenica impedimento di alterazioni biochimiche nei tessuti, per aggiunta o sottrazione di componenti chimiche opposizione ai processi autolitici e putrefattivi.

Fissazione
Definizione
Trattamento chimico che porta alla immobilizzazione e alla stabilizzazione di componenti tessutali con minima dislocazione ed estrazione dei composti nativi La FORMA delle cellule e dei tessuti deve venir conservata il pi possibile simile alla condizione vitale

Fissazione
Una fissazione ideale prevede: Stabilizzazione contro modificazioni successive indotte da trattamenti susseguenti quale linclusione in paraffina Simultaneit nel campione della reazione tessuto-fissativo ( rapida penetrazione e diffusione nei tessuti ) Riproducibilit del processo di fissazione nonostante differente composizione del tessuto Assenza di anormali componenti prodotti o estrazione di componenti native Rapidit di azione ( per evitare linsorgere di autolisi ) Assenza di sovra-fissazione

Fissazione dei Tessuti

Molto importante lo spessore del campione di tessuto che non deve, in genere, superare i 3 mm, onde evitare che al centro del tessuto intervengano fenomeni degenerativi prima dellarrivo del fissativo. Una buona fissazione, atto preliminare pi importante della tecnica istologica, pena la perdita irreparabile del tessuto dipende: - dal tipo, dal pH e dalla concentrazione del fissativo usato, - dalla osmolarit e dalle forze ioniche in atto - dalla temperatura e dalla durata dellintera operazione In genere i fissativi pi usati intervengono sulle proteine e sui lipidi, mentre i glicidi, specie se a basso peso molecolare, vengono solo inclusi tra le proteine fissate e possono diffondere nellacqua.

Fissazione
Classificazione
I fissativi si dividono in due classi a seconda che agiscano per: 1) Coagulazione: denaturazione irreversibile delle proteine, con nuove stabilizzazioni tra gruppi diversi di diverse proteine che reagiscono una con laltra formando aggregati MODIFICANO in modo irreversibile la struttura terziaria 3 Modi: movimento termico con distruzione della struttura secondaria e terziaria (calore) repulsione elettrostatica tra parti diverse di una proteina (acidi forti, sali di metallo) rimozione di H2O con disidratazione (etanolo) La disidratazione con etanolo pu seguire la fissazione per Cross-link stessa

Fissazione
2) CROSS LINKING: ovvero la formazione di legami crociati tra polipeptidi allinterno di una stessa proteina o tra proteine vicine STABILIZZANO la conformazione nativa della proteina E un processo ADDITIVO, pi o meno sensibile Tipico di ALDEIDI, CARBODIMIDE Utile anche in ME, Istochimica

FISSAZIONE DEI TESSUTI

Tecniche di fissazione :

per immersione, consistente nel sommergere il tessuto nel liquido

fissativo, con rapporto volumetrico minimo tra fissativo e campione di 10 : 1

per perfusione, in assoluto la migliore da un punto di vista teorico pratico, ma limitata all animale da esperimento o ad organi asportati in loco e con vasi integri

per uso di vapori, secondo cui i tessuti si fissano grazie ai vapori che
si liberano da una soluzione fissativa riscaldata, permettendo cos una fissazione in situ (si evita in tal modo che alcune sostanze solubili possano diffondere in soluzione e disperdersi). Si usano fissativi altamente volatili come : formaldeide, glutaraldeide, acido osmico.

Fissazione dei Tessuti

La Formalina:
E il pi diffuso ed usato fissativo in istopatologia, ad un valore di pH prossimo a 7.0. La formalina diviene monomerica ed idratata, una molecola di basso peso molecolare capace di penetrate rapidamente nei tessuti, con la formazione di gruppi idrossi-metile con le proteine, e con la formazione di legami di tipo metilenico tra catene polipeptidiche (cross-linking) Formalina al 10%: formaldeide polimerizzata in soluzione acquosa satura al 40% e successivamente diluita 1:10 (detta anche formaldeide 4%) Formalina salata: 100 ml di formaldeide al 40% + 9 g di NaCl + 900 ml di H20; una soluzione isotonica che impedisce la coartazione ed il rigonfiamento cellulare Formalina nel tamponata: 100 ml di formaldeide 40% + 900 ml di H20 + 4 g di fosfato acido di sodio + 6.5 g di fosfato disodico anidro; impedisce lacidificazione dei tessuti (fenomeno dovuto alla trasformazione della formaldeide in acido formico), mantenendo il pH a 7.0.

Modi di Applicazione ( 1 )
Immersione
Il campione deve essere immerso in almeno 20 volte volume di fissativo Ottima fissazione se: dimensioni adeguate (< 3 mm di spessore) minimo intervallo tra asportazione e immersione (< 30 m ottimale) ( le cellule, tolte dallorganismo, non sono pi ossigenate e muoiono in un tempo variabile)

Modi di Applicazione
Immersione
Importante il tipo di contenitore ( a bocca larga ) e le dimensioni. Importanti le indicazioni sul recipiente (non sul coperchio) Nome, data, Numero; provenienza

Modi di Applicazione ( 2 )
Perfusione a circolazione chiusa in forma liquida (aldeidi)
Distanza tra vasi e cellule: max. 100 microns Diffusione: penetrazione del fissativo e raggiungimento della adeguata concentrazione nel tessuto. Dipende da: rapporto di diffusione del fissativo che a sua volta dipende da: Concentrazione Temperatura Natura dl fissativo Topografia del tessuto in rapporto al fissativo Tipo di tessuto Cross Link o coagulazione

Modi di Applicazione ( 3 )
Esposizione di cellule e tessuti disidratati (liofilizzati) a fissativi in forma gassosa (aldeidi) ad elevata temperatura ( 80c )
Usata solo per applicazioni particolari in istochimica per rivelare amine biogene ( noradrenalina, serotonina, dopamina)

Fissazione dei Tessuti

Fissativi alcolici Alcool etilico 95 Alcool etilico 95 ed etere etilico anaparti Alcool metilico Alcool metilico ed acetone anaparti
Lalcool di per s, per il basso potenziale di ossidazione e per la moderata capacit di penetrazione, non un buon fissativo per istologia ( ma meglio di niente ); determina eccessiva coartazione ed indurimento dei tessuti, denatura le proteine e coagula grossolanamente il citoplasma; pertanto si preferisce utilizzarlo in associazione con altre componenti onde ottenere un fissativo pi efficace ed omogeneo. Si soliti ricorrere allalcool etilico 95 o allalcool etilico 50 in egual volume al materiale prelevato come prefissaggio in citologia.

Fissazione dei Tessuti

Miscele fissatrici a base di alcool:
Liquido di Serra: composto da 2 parti di alcool etilico 95 ed 1 parte di formaldeide 40% cui si aggiungono poche gocce di acido acetico glaciale Liquido di Carnoy: costituito da 6 parti di alcool etilico 99, 3 parti di cloroformio ed 1 parte di acido acetico glaciale Liquido di Clarke: composto da 3 parti di alcool etilico 99 ed 1 parte di acido acetico glaciale Formalina alcoolica di Lillie: costituita da 9 parti di alcool etilico 99 ed 1 parte di formaldeide 40%

Fissazione dei Tessuti

Miscele fissatrici a base di acido picrico:
Liquido di Bouin: composto dalla miscela di 15 parti di acido picrico in soluzione satura acquosa, 5 parti di formaldeide 40% ed 1 parte di acido acetico glaciale Liquido di Duboscq - Brasil: costituito da 150 ml di alcool etilico 80, 60 ml di formaldeide 40%, 15 ml di acido acetico glaciale ed 1 g di acido picrico Entrambi sono fissativi molto penetranti; tuttavia, la presenza dellacido picrico e di quello acetico di ostacolo ad eventuali indagini retrospettive e di estrazione del DNA e, inoltre, scioglie facilmente la maggior parte delle calcificazioni presenti.

Rischi e precauzioni duso per i fissativi

Formaldeide : Potenziale allergenico (cancerogenicit) per inalazione e contatto. Uso di cappe aspiranti. Alcool : Rischio incendi Glutaraldeide Ac. Picrico Sali di Mercurio Tetrossido di Osmio Importante: uso di armadi dedicati e quantit limitate.

Tempi duso per i fissativi

Formaldeide 4% (= Formalina 10% ) Velocit di penetrazione = 0,5 cm in 24 Fissazione: Tempo varia a sec. delle dim. del frammento, da 3h a 24h Alcool etilico 95% : penetra lentamente nei tessuti freschi Fissazione: accettabile sono in cell. isolate e frammenti piccoli ( diam 1-2 mm)

INCLUSIONE DEI TESSUTI

Tecnica di inclusione in paraffina : Si effettua di routine su campioni privi di problemi particolari, tenendo presente che, con essa, si rendono solubili e si asportano dai tessuti i grassi. La paraffina (a punto di fusione di 58 - 60 C) chimicamente inattiva e conserva bene i tessuti che devono essere disidratati con immersione in alcool etilico (70, 95 99) e diafanizzati con solventi della paraffina (cloroformio, benzene, toluene, xilene) prima di venire impregnati in essa e successivamente inclusi in blocchetti. In genere, il processo di inclusione avviene mediante l uso di inclusori automatici, fatti funzionare in ore notturne, e di dispensatori di paraffina, utilizzati per ottenere dei blocchetti ben compatti che contengono il tessuto pronto per essere sezionato con gli appositi microtomi.

Disidratazione
ETANOLO METANOLO ACETONE PROPANEDIOLO

Chiarificazione
XILOLO BENZOLO CLOROFORMIO

Inclusione
Paraffina Gelatina / Agar

Celloidina Idrosolubili Resine

(Metacrilati)

Epossidiche

Congelamento dei tessuti

Effetti del congelamento
Sostanze Protettive Glicerolo / DMSO

Blocchi di metallo Produzione di Neve CO2

Metodi di congelamento

Ghiaccio secco Appar. Termo-elettrici Gas liquidi (N2)

METODO IDEALE FREON ISOPENTANO Conservazione di tessuti e cellule

METODI RAPIDI
Metodo
Tessuti in liquidi refrigerati
Fluido organico In gas liquido (N2) Fluido organico In ghiaccio secco Liquido organico Raffreddamento Termo-elettrico Supporto metallico Raffreddato per conduzione
a

T (C)
- 196
a

Efficienza
Il pi veloce

- 79
b

Ottimale per la maggior parte delle applicazioni in M.O scarsa scarsa

Tessuti in contatto di metalli refrigerati

- 40 - 30

a: N-esano, isopentano, miscele di butano e pentano b: giaccio secco in miscela con etanolo, metanolo o acetone

Sezionamento
Microtomo
Temp. ideali per i vari tipi di tessuto Lama Tratt. delle sezioni
1) Essicamento (+ fissazione) 2) Freeze drying o altri metodi

Rischio ambientale

Criostato

Ultra-microtomia

M.E.

Freeze Drying
(Liofilizzazione)
Principi
Condiz. di congelamento

Applicazione ai tessuti

Condiz. di liofilizzazione Temp. Tempo Trappola di N2O

Trattamento successivo
Fissazione in vapori

Inclusione in paraffina

Freeze Sobstitution

SPARAFFINATURA DELLE SEZIONI

Tecnica di preparazione delle sezioni in paraffina, di circa 3 , per essere colorate : E un procedimento atto ad assicurare che la paraffina, non miscibile con acqua ed alcool, venga eliminata ed il tessuto possa essere impregnato dal colorante. Quindi necessario utilizzare dei solventi della paraffina ed idratare gradualmente il tessuto sino all H2O distillata. Nel caso in cui il colorante sia in soluzione alcoolica ci si arresta all alcool 95.

xilolo xilolo xilolo etanolo 100 etanolo 100 etanolo 100 etanolo 95 etanolo 70 etanolo 50 H2O distillata

5 5 5 5 5 5 5 5 5

colorazione

Colorazione dei tessuti

Composizione (Gruppi reattivi SO4 / = PO4 / - COOH / - O Tipo di colorante / pH / Solventi / Additivi
Ionico (Salino elettrostatico)
/ - S/ -NH3)

Tipo di legame
tra colorante e tessuto

Covalenti (tra non metalli = elettroni condivisi tra due atomi) Complessi es. gruppi aldeidici R. Schiff (atomo centrale con 1 o 2 legami) es Ag. Diammina Intermolecolari (van der Waal)

Colorazione dei tessuti

Colorazione di macromolecole sulla base di cariche (ioniche)

Basofile Componenti tissutali Acidofile Neutrofile

Coloranti

Cationici (basici) Anionici (acidi)

COLORANTI : DEFINIZIONE CROMOGENO ( Luce visibile 400-800 mm) 400Criteri di purezza Gruppi cromofori -N | -N azo N=O nitroso N - O2 nitro Spettro c=c alkene c=o oxo (gruppi auxocromi) es: -SH
NITRO AZO CHINONICI

NOMENCLATURA

coloranti

Pratica di colorazione dei tessuti

Reattivi Purezza
Technical quality Purified / Pure / Very pure Analytical grade

Acqua Etichetta sui reattivi Conservazione Scarto / Scaricamento

Coloranti
(Assorbimento Coloranti cationici RNA (selettivo) es. col. GRAM
+ Cresyl-violetto + I2 - col. Rosso = Fucsina

colore osservato) Nuclei / Batteri

pH 3-4 per la completa ionizzazione di gruppi di fosfato DNA /

ZIEL-NIELSEN

Effetto di diversi fissativi / Concentrazione di sali

COLORANTI COMPLESSATI CON METALLI (Lacche) EMATEINA Compl. con AL ossidazione di ematossilina EMALLUME (Mayer - Carazzi) Fe EMAT. HARRIS - Lillie

progressiveprogressive - Differenziazione Ematossiline regressive - pH

Colorazione dei tessuti

Reazione di Blocco
Deboli Ossidazione Ossidanti Medi Forti Riduzione Acilazione / Alchilazione (form. di derivati acidi) Saponificazione (idrolisi di derivati acidi Deaminazione H2O2 / I2 Ac. Perform. Permanganato

COLORAZIONE DI ROUTINE IN ISTOLOGIA Ematossilina - Eosina

sezioni in H2O distillata Emallume acido di Mayer, filtrato, 7 lavare H2O di fonte soluzione satura Li2CO3 15 lavare H2O di fonte 10 10 Eosina [0.25 %], acidificata con qualche goccia di CH3COOH 1 lavare in H2O distillata 2 disidratare in etanolo 95 4 disidratare in etanolo 100 4 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada)

Risultati : nucleo blu scuro; citoplasma rosso

Colorazione con coloranti basici

La colorabilit dipende da vari fattori:
pH

disidratazione fissazione temperatura

Colorazione con coloranti basici

pH della soluzione
Tipo di colorante

Dipende da:

Tempo e temperatura Tampone Trattamento dopo la colorazione Aggregati di coloranti legati a gruppi acidi

Meccanismo:

Legame ionico + f. van der Waal es. Blu di Toluidina + -

Metacromasia

Visibile U.V.

Alcool resist.

PAS
H H C C OH OH

H H

C O C

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA ALCIAN BLU pH 2.5

sezioni in H2O distillata soluzione Alcian blu 8 GX [1% in CH3COOH 3 %] 30 lavare in H2O distillata 5 lavare in H2O distillata 5

disidratare in etanolo 95 4 disidratare in etanolo 100 4 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada)

contrasto nucleare con NFR (rosso nucleare neutro [1 %] in solfato di alluminio [5 %] a caldo e filtrato] ) 2-3

Risultati : nucleo rosso intenso; glico - proteine acide blu - verde; colorazione citoplasmatica di fondo rosa tenue

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA PAS (acido periodico di Schiff) e PAS Diastasi

sezioni in H2O distillata alcune sezioni possono essere pretrattate con E-amilasi (diastasi) [0.1 % in PBS] a 37 C 30 HIO4 (acido periodico) [0.5 - 1 % in H2O distillata] 15 lavare in H2O distillata 5 reattivo di Schiff (fucsina solforosa) 45 - 60 lavare in metabisolfito di sodio [5 %] 2 lavare in H2O di fonte 15 contrasto 5 lavare in H2O di fonte 15 nucleare con emallume

disidratare in etanolo 95 4 disidratare in etanolo 100 4 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada)

Risultati : nucleo blu scuro; glicogeno e glicoDopo proteine neutre rosso magenta. pretrattamento con diastasi il glicogeno non si colora

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA ALCIAN - PAS (VIALLI)

sezioni in H2O distillata soluzione Alcian blu 8 GX [1% in CH3COOH 3 %] 30 lavare in H2O distillata 5 HIO4 (acido periodico) [0.5 - 1 % in H2O distillata] 15 lavare in H2O distillata 5 reattivo di Schiff (fucsina solforosa) 45 - 60 lavare in metabisolfito di sodio [5 %] 2 lavare in H2O distillata 10

contrasto nucleare con ematossilina Carazzi 5 lavare in H2O di fonte 15

disidratare in etanolo 95 4 disidratare in etanolo 100 4 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada)

Risultati : nucleo blu scuro; glico - proteine acide blu - verde; glico - proteine, glicogeno e sostanze PAS+ rosso - magenta; collagene rosso; colorazione citoplasmatica di fondo rosa tenue; altre strutture giallo

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA METODO DELL OIL RED O x I LIPIDI

sezioni in H2O distillata immergere in alcool isopropilico 60 % soluzione di Oil Red O [0,5 % in 200 ml di alcool isopropilico 100] agitata a caldo e filtrata differenziare in alcool isopropilico 60 lavare in H2O di fonte eventuale colorazione nucleare con ematossilina lavare in H2O di fonte montare in glicerina e lutare 5 10 20 5 5 20

Risultati : lipidi neutri ed esteri di colesterolo rosso; fosfolipidi rosa pallido; nuclei blu - scuro

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA METODO AL SUDAN NERO B x I LIPIDI

sezioni in H2O distillata immergere in alcool etilico 55 soluzione satura di Sudan nero B in alcool etilico 55 differenziare in alcool etilico 55 lavare in H2O di fonte montare in glicerina e lutare 40 20 5 5

Risultati : lipidi neutri blu - nero; con tale metodo si colorano anche gli steridi, gli acidi grassi, i fosfolipidi e i glicolipidi. I nuclei ed i proteoglicani acidi si colorano in bruno, tuttavia ben differenziato dal colore dei lipidi

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA METODO AL SUDAN III e SUDAN IV

sezioni in H2O distillata immergere in alcool etilico 70 5 soluzione satura in parti eguali di Sudan III e IV miscelata in alcool etilico 70 ed acetone in parti eguali 10 differenziare in alcool etilico 50 lavare in H2O di fonte Emallume acido di Mayer, filtrato, lavare in H2O di fonte montare in glicerina e lutare 5 20 5 7

Risultati : lipidi neutri da rosso ad arancio; nuclei blu - scuro

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA ORCEINA x FIBRE ELASTICHE

sezioni in H2O distillata immergere in soluzione contenente Orceina [1 g + 0.4 ml acido nitrico + 100 ml alcool etilico 95 ] 24 h lavare l eccesso di colorante in alcool etilico 85 2 lavare H2O distillata 10 colorare con miscela contenente : [0.35 g Blu di alizarina acido + solfato di alluminio 10 g / 100 ml H2O distillata] 10 lavare H2O distillata 10 soluzione acquosa fosfomolibdico [5 % ] lavare H2O distillata di 20 10 acido

soluzione contenente : [Orange G 2 g + verde luce 0.2 g + CH3COOH 2 ml /100 ml H2O distillata] 10 lavare H2O di fonte chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada) 5 disidratare in etanolo 100 4 (3 cambi)

Risultati : fibre elastiche bruno - rossastro; fibre muscolari e citoplasma violetto; fibre collagene e reticolari verde; eritrociti e mielina arancione; nuclei e strutture basofile blu scuro

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA METODO DI GOMORI PER IL RETICOLO

sezioni in H2O distillata ossidare in permanganato di K ( KMnO4 ) 5 lavare in H2O di fonte 5 soluzione di acido ossalico (C2H2O4) 1 lavare in H2O di fonte 5 mordenzare in Allume ferrico [2 %] 5 lavare in H2O di fonte 5 lavare in H2O distillata soluzione di Argento nitrato (AgNO3) ammoniacale [10 %] al buio 5 - 8 lavare in H2O distillata sviluppare in soluzione di formalina [10 %] 3 lavare in H2O di fonte 5 lavare in H2O distillata differenziare in Cloruro oro (HAuCl4) [1 %] 8 - 10 lavare in sodio tiosolfato (Na2SO2O3) [5 %] 5 lavare H2O di fonte 5 contrasto nucleare con NFR (rosso nucleare neutro [1 %] in solfato di alluminio [5 %] a caldo e filtrato] ) 2-3 lavare H2O di fonte 5 disidratare in etanolo 95 4 disidratare in etanolo 100 4 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada)

Risultati : fibre reticolari nero; collagene ocra -bruno scuro; nuclei rosso intenso N. B. : non utilizzare strumenti metallici (pinzette)

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA ELASTIC - VAN GIESON

sezioni in H2O distillata ossidare con soluzione di KMnO4 (permanganato di K) 5 lavare H2O di fonte 5 soluzione di C2H2O4 (acido ossalico) 1 lavare H2O di fonte 5 soluzione di Weigert (resorcina fucsina) a 60 C 120 lavare H2O di fonte 10 Emallume acido di Mayer, filtrato, 3 lavare H2O di fonte 10 soluzione satura Li2CO3 15 lavare H2O di fonte 10 soluzione di Van Gieson (fucsina acida [1 %] 5 ml + acido picrico 95 ml) 3 lavare H2O di fonte 5 disidratare in etanolo 95 4 disidratare in etanolo 100 4 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada)

Risultati : fibre elastiche marrone scuro - nero; collagene rosa - rosso; connettivo giallo; nuclei blu scuro

MICROSCOPIA ELETTRONICA
La M.E. utilizza il potere separatore, a brevissima lunghezza d onda, delle radiazioni elettroniche emesse dal cannone elettronico (Filamento di Tungsteno e cilindro di Wehnelt) che consentono di ottenere, in modo appropriato con lenti elettro-magnetiche, ingrandimenti lineari di 30.000 x ed oltre. M.E.T. = Microscopia elettronica a trasmissione; permette di ottenere l immagine elettronica, riprodotta su lastra fotografica o su schermo fluorescente, reale ed ingrandita di una sezione di tessuto (spessa da 10 a 100 nm), i cui punti possono essere attraversati o meno da un fascio di elettroni. M.E.S. = Microscopia elettronica a scansione; permette di ottenere un perfetto esame tridimensionale della superficie di un oggetto o un pezzo anatomico o biologico, scandendo il fascio di elettroni la superficie per linee successive, come un pennello elettronico. L immagine si ottiene direttamente su tubo a raggi catodici. L ingrandimento finale da 20 a 100.000 x. Dato il potere di penetrazione molto basso degli elettroni, le sezioni devono essere ultra-sottili (60-150 nm), fissate in Tetraossido di Osmio o in Glutaraldeide, incluse in resina e colorate con sali di metalli pesanti(acetato di Uranile e citrato di Piombo), onde aumentare il contrasto dell immagine.

MICROSCOPIA ELETTRONICA METODO DI PREPARAZIONE DEI CAMPIONI

fissare un frammento di 1 mm3 in glutaraldeide [2.5 %] in buffer cacodilato o in PBS a 4 C 2-6 h lavare in PBS (3 cambi) 10 post-fissazione in tetraossido di osmio [1.30 %] a 4 C 2h lavare in PBS 20 disidratare i campioni in serie ascendente di alcool 2-3 h chiarificare in toluene o in ossido di propilene 1h resina epossidica EPON + toluene [1 : 1] RT 12 h resina epossidica EPON RT 12 h inclusione in capsule di gelatina o di plastica e polimerizzazione in stufa a 60 C 48 h taglio delle sezioni ultra-sottili con ultramicrotomo con lama di cristallo o di diamante le sezioni, di spessore appropriato, vengono raccolte su dei retini di rame circolari e di 3 mm di colorare con acetato di uranile in soluzione acquosa satura 10 lavare in H2O distillata colorare con citrato di piombo 10 lavare in H2O distillata far seguire la disidratazione secondo le tecniche usuali osservare al M.E.

Risultati : doppia colorazione con aumento del contrasto e maggior evidenza di particolari ultrastrutturali; immagini in bianco e nero e\o con tonalit di grigio.

Citologia Finalit Necessit di ottimale fissazione e colorazione delle varie componenti Modalit di preparazione

Preparati citologici
Cervice uterina Urine Versamenti Bronchi Vie bilari Polmone Mammella Tiroide Linfonodi Spazzolati Striscio - Spatole Citocentrifugati

Agoaspirati

Microbiopsie

Citologia
Automatica Analisi dimmagine Citometria di flusso Ago Spatole Anse

Strisci

Citocentrifuga Centrifugazione liquidi Inclusione di sedimenti

Filtri Millipore

Agoaspirati Sedimenti Principali Fissativi Fissazione Alcool O Formalina H- C H Inclusione

COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA PAPANICOLAOU

sezioni in H2O distillata Ematossilina di Harris, filtrata, 3 lavare H2O di fonte 5 soluzione alcool - acida a pH 3 (etanolo 70 + HCl) 10 lavare H2O di fonte 2 soluzione satura Li2CO3 15 lavare H2O di fonte 10 soluzione di etanolo 70 2 soluzione di etanolo 95 2 Colorare in Orange G 6 etanolo 95 (2 cambi) Colorare in EA 50 etanolo 95 (2 cambi) disidratare in etanolo 95 4 disidratare in etanolo 100 4 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada) 3 20 3 20

Risultati : nucleo blu scuro; citoplasma variante tra il blu-verdastro (basofilia) ed il rosaarancione\rosso chiaro (eosinofilia)

Col. Papanicolau Vantaggi ed eventi determinanti

-Definizione dei dettagli nucleari -Corretta fissazione -Buona col. Nucleare -Coloranti con sol. altamente alcooliche -Adeguata diafanizzazione -Colorazione policromatica

-Trasparenza citoplasmatica

-Differenziaione dei vari tipi cellulari

Problemi di colorazione con Papanicolau 1) Coloraz. Nucleare pallida -Insufficente rimozione di fissativi a pellicola (polietilen-glicole + alcool etilico) -azione decolorante di HCl -striscio parzialmente asciugato prima della fissazione

Problemi di colorazione con Papanicolau 1) Coloraz. Nucleare pallida (2) -pH dellacqua corrente poco alcalino -colorante troppo vecchio

Problemi di colorazione con Papanicolau 2)Coloraz. Nucleare troppo intensa -fissazione con alcool >95% -tempo di immersione in HCl troppo breve -striscio troppo spesso che trattiene il colore (N.B. possibile decolorare)

Problemi di colorazione con Papanicolau 3)Coloraz. Citoplasmatica insoddisfacente -permanenza in alcool 70% troppo lunga = decolorazione -asciugatura dello striscio prima della fissazione = tutto rosa

Problemi di colorazione con Papanicolau 3)Coloraz. Citoplasmatica insoddisfacente -striscio di alterno spessore -tempo di coloraz. scarso o non scuotimento del cestello -scarsa col. con verde luce = sostituire o pH non 4,5-5

Problemi di colorazione con Papanicolau 4) Riscio di inquinamento e trasporto di cellule -filtrare i coloranti

COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA GIEMSA

sezioni in H2O distillata Giemsa puro diluito in H2O al [10 o 20 %] 60 differenziare in CH3COOH diluito (0.4 ml acido acetico glaciale \ 100 ml H2O) 10 lavare in H2O distillata differenziare in etanolo 95, controllando al microscopio 10 arrestare la differenziazione con alcool iso-propilico 2 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada) effetto Giemsa : produce una particolare colorazione viola -rossastra della cromatina del nucleo a causa dell eosinato di Azur. La soluzione di Giemsa pura formata da eosinato di Azur II, contenente eosinato di Azur B ed eosinato di blu di metilene sciolti anaparti.

Risultati : DNA e RNA blu; sostanze acidofile rosso - arancio e proteo-glicani rosso - violetto * specialmente elettiva per le cellule del sangue *

COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA GIEMSA modificato

sezioni fatte essiccare allaria post-fissazione in metanolo 15 lavare in H2O di fonte 5 soluzione di Giemsa puro diluito al [15 %] in buffer fosfato a pH 6.8 (22 ml 0.5 M Na2HPO4 + 32 ml 0.5 M KH2PO4 / 1000 ml H2O distillata) 15 lavare in H2O distillata (3 cambi) fare asciugare a secco chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada)

Risultati : DNA e RNA blu; sostanze acidofile rosso - arancio e proteo-glicani rosso - violetto (eseguito specie su strisci)

COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA GRAM

sezioni in H2O distillata cristalvioletto o violetto di metile [1 %] 1 - 2 scolare eccesso di colorante soluzione di Lugol 3 0 lavare in H2O di fonte differenziare in soluzione di alcool acetone 20 lavare in H2O di fonte fucsina basica o rosso neutro [1 %] 1 - 2 lavare in H2O di fonte e tamponare con carta bibula disidratare in etanolo 100 1 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada)

Risultati : Batteri Gram + blu scuro; batteri Gram - rosso; colorazione di fondo rosa N. B. : porre attenzione alla differenziazione

COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA ZIEHL - NEELSEN (KOCH)

sezioni in H2O distillata fucsina basica [10 ml di soluzione al 10 % in etanolo 100 ] in acido fenico [+100 ml fenolo 5 % in H2O distillata e filtrato]; flambare le sezioni sul bunsen sino a farle fumare lavare in H2O distillata differenziare in soluzione alcool acida [HCl 3% in etanolo 70] finch le sezioni non cedono pi colore lavare in H2O di fonte 10 blu di metilene [1 % in H2O distillata] 5 - 10 lavare in H2O di fonte disidratare in etanolo 100 sino a che le sezioni non divengono blu pallide 2 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada)

Risultati : Bacilli alcool - acido resistenti rosso; flora batterica e tessuti vari blu N. B. : porre attenzione alla differenziazione

INCLUSIONE DELLE CELLULE

Tecnica di allestimento dei preparati citologici in celloidina : E un procedimento atto ad assicurare che tutto il materiale cellulare sia conservato durante i passaggi analitici, raccogliendo le cellule in un film di celloidina cos da renderle compatte e non dispersibili. celloidina 10 % : sciogliere 10 g. di celloidina in fiocchi in 50 ml di alcool etilico 99 e poi aggiungere 50 ml di etere (conservare in recipiente di vetro ben sigillato) riempire di celloidina 10 % una provetta in propilene, svuotarla, capovolgerla per allontanarne l eccesso onde ottenerne uno strato di 20 - 50 . di spessore (cell - bag) riempire la provetta di cloroformio che indurisce la celloidina e svuotarla di quest ultimo prima dell uso riempire la provetta con la sospensione cellulare, tappare e centrifugare allontanare il surnatante, estrarre delicatamente il cell - bag, ridurne le dimensioni per facilitarne l alloggiamento nelle cassettine citologiche ed includere in paraffina.

COLORAZIONE DI ROUTINE IN CITOLOGIA Ematossilina - Eosina

sezioni in H2O distillata Ematossilina di Harris, filtrata, 3 lavare H2O di fonte soluzione alcool - acida a pH 3 (alcool 70 + HCl) 10 lavare H2O di fonte soluzione satura Li2CO3 15 lavare H2O di fonte 10 2 5 Eosina [0.25 %], acidificata con qualche goccia di CH3COOH 1 lavare in H2O distillata 2 disidratare in etanolo 95 4 disidratare in etanolo 100 4 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada)

Risultati : nucleo e batteri gram + blu scuro; citoplasma ed emazie rosa-rosso.

COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA ARGENTO - METENAMMINA x I MICETI

sezioni in H2O distillata ossidare le sezioni in HIO4 [0.5 % in H2O distillata] 15 lavare in H2O distillata 5 mettere le sezioni al buio a 60 C nella soluzione argentica pre-riscaldata (10 ml di metenammina [3 %] + 0.5 ml di AgNO3 [5 %] + 1.2 ml di Borace [5 %]) 60 - 90 lavare in H2O di fonte 5 - 10 HAuCl4 (cloruro oro) [1 %] 2-3 sodio tiosolfato [3 %] 2 - 3 lavare in H2O di fonte 5 - 10 verde di metile [1 %] 5 - 10 disidratare in etanolo 95 4

disidratare in etanolo 100 4 (3 cambi)

chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada)

Risultati : miceti in nero; nucleo verde intenso

COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA ARGENTO - METENAMMINA - PAS

sezioni in H2O distillata soluzione Ammoniaca [2 %] in etanolo 95 overnight ossidare le sezioni in HIO4 [0.5 % in H2O distillata] 15 lavare in H2O distillata 5 mettere le sezioni al buio a 60 C nella soluzione argentica filtrata e preriscaldata : (25 ml H2O distillata + 2 ml di Borace [5 %] + 25 ml soluzione stock : (100 ml di metenammina [3 %] + 5 ml di AgNO3 [5 %]) controllare al microscopio 30 - 40 lavare in H2O distillata 5 HAuCl4 (cloruro oro) [0.2 %] 2-3 lavare in H2O di fonte 5 sodio tiosolfato [2 %] 2 - 3 lavare in H2O distillata 5 liquido di Bouin a 60 C 30 lavare in H2O di fonte 10 lavare in H2O distillata 5 soluzione di acido Fosfotungstico [2 %] 1 - 2 lavare in H2O di fonte 10 soluzione di cromotropo 2 R : (100 ml. HCl 0.1M + 0.3 g. cromotropo 2 R) 15 lavare in H2O distillata 5 disidratare in etanolo 95 3 disidratare in etanolo 100 3 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione neutro

Risultati : miceti in nero; membrane basali in nero; background in rosso

COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA METODO DI MANN - DOMINICI

sezioni in H2O distillata soluzione di Lugol 5 decolorare in iposolfito di sodio [5 %] 2 lavare in H2O di fonte lavare in H2O distillata soluzione Dominici (Orange G [1 %] + eritrosina [0.2 %] + 0.05 ml CH3COOH) 10 - 15 lavare in H2O di fonte lavare in H2O distillata 5 5 soluzione di blu di toluidina [0.5 %] 2 - 3 lavare in H2O di fonte 3 differenziare in CH3COOH sino a che le sezioni virano al rosa disidratare in etanolo 95 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada) 4 disidratare in etanolo 100 4

Risultati : nuclei blu scuro; eritrociti giallo arancio; connettivo rosso; granulociti eosinofili rosso; granulociti neutrofili viola; granulociti basofili blu elettivo per il tessuto emopoietico, i linfomi ed i midolli

COLORAZIONE IN CITO-GENETICA METODO ALL ORCEINA ACETICA

sezioni in H2O distillata soluzione contenente Orceina acetica [ 2 %] ( 90 ml CH3COOH puro + 2 g orceina + 100 ml H2O distillata lavare in CH3COOH [45 %] lavare in alcool butilico terziario soluzione di xilolo ed alcool butilico terziario 1 : 1 chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada) 2 2 30 1

Risultati : i cromosomi si colorano in rosso - porpora una variante con l aggiunta di fast green e ripetuti ed accurati passaggi in alcool a vario grado utilizzata per identificare la cromatina sessuale che si colora in rosso ed il citoplasma in verde chiaro.

Microscopia a fluorescenza
Piccole quantit Illuminazione con luce a P breve Emissione nel visibile Eccitazione / Sbarramento Caratt. Spettro di Assorbimento Caratt. Spettro di Emissione

Fluorescenza Filtri Fluoroforo

(Fluorocromo)

Fosforescenza

Tipi di Fluorescenza
Autofluorescenza
- fibre elastiche - LIPOFUSCINE - NADH2 - Porfirine - Vit. A - Farmaci
O

Tetracicline Adriamicina Chinacrine Benzopirene

Fluorescenza indotta - Amine biogane + C

F carboline
H N

Fluorocromi - effetto QUENCNING - vantaggi caratteristici

DNA ACRIDINE ORANGE (verde) concentrazione RNA Rosso polimeri 1 maggiore METACROMASIA A.O. Citologia

METACROMASIA MASCHERATA

Reagenti di SCHIFF

Fluorescenti

ALDEIDI

FUCSINA BASICA (para-rosanilina) Tioflarina T AMILOIDE PROCION yellow cellule (neuroni) BANDEGGIO CROMOSOMICO COL. SOPRAVITALE cell sorting

IMMUNOFLUORESCENZA Problemi di DECADENZA Liq. di montaggio VETRI

Lampade FOTOGRAFIA

XENON MERCURIO

Gruppi reattivi dimostrabili su sezioni

Importanza in patologia diagnostica

Acidi Nucleici
Coloraz. con coloranti basici M.O. Ordinaria M. Fluorescenza (Acridina Orange) Metacromasia Valutazione Quantitativa (Microspettrofotometria) Controlli con trattamento enzimatico (RNAsi - DNAsi)
Reaz. Di FEULGEN

Metodi per la dimostrazione di acidi nucleici

Metodi qualitativi quantitativi Interesse in patologia Distribuzione del DNA Met. Feulgen VIRUS

COLORANTI COMPLESSATI CON METALLI (Lacche) CROMO-GALLOCIANINA CROMO Reaz. di FEULGEN per legame purina - Desossiriboso Idrolisi acida Concentrazione HCl Temperatura Formaz. di gr. aldeidici Frammentazione del DNA Sensibilit Specificit di - reazione - localizzazione

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA FEULGEN reazione

sezioni in H2O distillata idrolisi in HCl 1 N a 60 C per un tempo ottimale in relazione al fissativo usato da 4 a 25 (usare anche HCl 5 N a RT) (10) lavare in HCl 1 N freddo e poi in H2O distillata reattivo di Schiff 40 - 60 lavare in metabisolfito di sodio [5 %] 2 lavare in H2O di fonte 15 contrasto citoplasmatico con verde luce [1 %] 1 2

lavare in H2O di fonte disidratare in etanolo 95 4

disidratare in etanolo 100 4 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada)

Risultati : il DNA si colora in modo elettivo in rosso magenta; citoplasma verde

Metodi per la dimostrazione di acidi nucleici

Metodi qualitativi quantitativi Interesse in patologia Distribuzione del DNA Met. Feulgen VIRUS

Valutazione quantitativa
Principi
Luce Cell

Variazione di assorbimento Lunghezza donda

Metodi alternativi
BRDU TIMIDINA TRIZIATA TRIZ - Ibridizzazione in situ - Immunocitochimica - Autoradiografia - Citofluorimetria cell sorter
Laser

Autoradiografia
Principi Potere di risoluzione Stripping Emulsione

Marcatori H3 / P4 / S

Tempo di Esposizione

Timidina H3 Principi Ibridizzazione in situ Legame di affinit

(Conteggio granuli / fondo)

Ibridizzazione in situ (ISH)

Dimostrazione di geni su cromosomi (FISH) mRNA specifico - gene espressione (vantaggi rispetto a ICC) RNA / DNA virale Metodi - Sonde
Riboprobes Oligos Marcatura - Raidoatt. Auto-radiografia Non radioatt. Biotina Digoxiganina Fluorescina ICC -S -H - pH

IBRIDIZZAZIONE IN SITU ISH

Questa tecnica consente di identificare specifiche sequenze di DNA ed RNA e di rivelare in quali cellule tali sequenze sono espresse. La metodica si basa sulla capacit della doppia elica del DNA di dissociarsi (quando riscaldata a 80-100C, o esposta ad ambiente basico a pH 13)[DENATURAZIONE] per poi ricostituirsi, partendo da due singole eliche complementari [IBRIDIZZAZIONE]. Se una delle due emieliche marcata, si pu rendere visibile l avvenuta ibridizzazione di doppie eliche neoformate costituite da probe e da acidi nucleici ad esso complementari. La marcatura del DNA avviene chimicamente per inserzione di un gruppo sulfone in 5 sull anello della Citosina che reagisce con un AbMc antisulfone, e quindi con un 2 Ab coniugato a fosfatasi alcalina (N.B. : inibire la fosfatasi alcalina endogena con esposizione ad 80 C x 5). Il trattamento con DNasi e\o RNasi elimina la comparsa di positivit, mentre quello con solo uno dei due enzimi evidenzia selettivamente un unico tipo di acido nucleico.

Ibridizzazione in situ (ISH)

Sensibilit

Problemi

Localizzazione (Definizione) Conservazione strutturale

Esami genico su singole cellule prelevate da sezioni Sistemi laser / catapulta

(necessit di identificazione del tipo di cellule)

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA METODO DI GOMORI PER LA MELANINA

sezioni in H2O distillata trattare in soluzione di Lugol 10 5 sodio tiosolfato [3 %] 2 - 3 lavare in H2O di fonte 5 - 10 contrasto nucleare con NFR (rosso nucleare neutro [1 %] in solfato di alluminio [5 %] a caldo e filtrato] ) 2-3 disidratare in etanolo 95 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada) 4 disidratare in etanolo 100 4

lavare in H2O distillata

mettere le sezioni al buio a 60 C nella soluzione argentica pre-riscaldata (10 ml di metenammina [3 %] + 0.5 ml di AgNO3 [5 %] + 1.2 ml di Borace [5 %]) 60 - 90 o 18-24 h. al buio RT lavare in H2O di fonte 5 - 10 HAuCl4 (cloruro oro) [1 %] 2-3

Risultati : granuli di melanina nero; cheratina arancio; nuclei rosso intenso

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA PERLS x IL FERRO

sezioni in H2O distillata soluzione di Ferrocianuro di K [10 %] 5 soluzione di Ferrocianuro K [10 %] + HCl [10 %] (70 ml + 30 ml) 25 lavare H2O di fonte lavare H2O distillata 5 lavare H2O di fonte disidratare in etanolo 95 4 disidratare in etanolo 100 4 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada) 5

contrasto nucleare con NFR (rosso nucleare neutro [1 %] in solfato di alluminio [5 %] a caldo e filtrato] ) 2-3

Risultati : i depositi di ferro si colorano in blu; i nuclei in rosso intenso N. B. : non utilizzare strumenti metallici (pinzette)

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA PER IL RAME

sezioni in H2O distillata soluzione di lavoro di Rhodanina [0.3 % in etanolo 100] (6 ml / 100 ml H2O distillata) a 60 C 120 - 180 lavare H2O di fonte lavare H2O distillata 5 lavare in soluzione di Borace [0.5 %] (tetraborato di sodio) 2 lavare H2O distillata disidratare in etanolo 95 4 disidratare in etanolo 100 4 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada)

contrasto nucleare con ematossilina Carrazzi 1 lavare H2O distillata

Risultati : depositi di rame color rosa - rosso; nuclei blu scuro

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA METODO DI Von KOSSA x IL CALCIO

sezioni in H2O distillata soluzione acquosa di AgNO3 (nitrato Argento) [3 %] 60 sviluppare in una idrochinone [0.5 %] lavare H2O di fonte soluzione 3 5 di contrasto nucleare con NFR (rosso nucleare neutro [1 %] in solfato di alluminio [5 %] a caldo e filtrato] ) 2-3 lavare H2O di fonte disidratare in etanolo 95 4 disidratare in etanolo 100 4 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada) 5

fissare in una soluzione di tiosolfato di sodio [5 %] 3 lavare H2O di fonte lavare H2O distillata 5

Risultati : sali di calcio (fosfati e carbonati) nero; nuclei rosso intenso N. B. : non utilizzare strumenti metallici (pinzette)

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA DI FOUCHET x LA BILE

sezioni in H2O distillata soluzione di lavoro secondo Fouchet : (acido Tricloroacetico (C2HCl3O2) [25 %](50 ml) + Cloruro ferrico (FeCl3) [10 %]( 5 ml) 5 - 10 lavare H2O distillata soluzione di Van Gieson (fucsina acida [1 %] 5 ml + acido picrico 95 ml) 3 lavare H2O distillata disidratare in etanolo 95 4 disidratare in etanolo 100 4 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada)

Risultati : biliverdina color verde; collagene rosa - rosso; connettivo giallo

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA LUXOL FAST BLUE

sezioni in H2O distillata soluzione di Luxol Fast Blue 2 G [0.1 % in alcool isopropilico] 60 disidratare in alcool assoluto 5 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in mezzo dinclusione (Entellan o balsamo Canada) isopropilico Tale colorazione, sebbene poco specifica per i fosfolipidi, li colora in modo soddisfacente, specie se disciolti in alcool isopropilico e quindi fornisce ottima colorazione della mielina integra (costituita dalla membrana cellulare della cellula di Schwann).

Risultati : la mielina appare in blu

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA ISTOCHIMICA - ENZIMATICA : CLORO - ACETATO ESTERASI

PREPARAZIONE SOLUZIONI sol. A : Naftolo AS-D Cloroacetato [10 mg.] + Dimetilformamide [1 ml.] sol . B : buffer fosfato0.1 M [30 ml.] sol. C : Pararosanilina - HCl : Pararosanilina idrocloride [2 g.] + HCl 2n [50 ml] (sciogliere a caldo, raffreddare e filtrare) sol. D : Sodio Nitrato [400 mg.] + H2O distillata [10 ml.] sol. E : working Pararosanilina - HCl : sol. C [0.4 ml.] + sol. D [0.4 ml.] sezioni in H2O distillata soluzione substrato : ( 0.8 ml. sol. E + 30 ml. sol. B; sistemare il pH a 6.3 e aggiungere la sol. A; mescolare e f iltrare) 1 - 2 lavare con H2O distillata 5 Emallume acido di Mayer, filtrato, 5 lavare H2O di fonte 10 soluzione satura Li2CO3 15 lavare H2O di fonte 10 disidratare in etanolo 95 4 disidratare in etanolo 100 4 (3 cambi) chiarificare in xilolo (3 cambi) montare in resina sintetica

Risultati : lattivit enzimatica dell esterasi appare in rosa - rosso; i nuclei in blu - scuro

SICUREZZA IN LABORATORIO
CONSIDERARE OGNI CAMPIONE BIOLOGICO COME POTENZIALMENTE INFETTO
SOTTOPORSI ALLE PRINCIPALI VACCINAZIONI USARE CAMICI, GUANTI, CALZARI E MASCHERE PROTETTIVE USARE GUANTI ED OCCHIALI APPOSITI NEL MANEGGIARE AZOTO LIQUIDO USARE GUANTI ANTI-TAGLIO AL MICROTOMO E AL CRIOSTATO USARE CAPPE DI ASPIRAZIONE CON FILTRI SPECIFICI PER FORMALDEIDE E PER XILENE USARE GUANTI E LAME MONOUSO PER DISSEZIONE USARE MASSIMA CAUTELA NELL IMPIEGO DI ULTRA-CENTRIFUGHE, FORNO A MICROONDE, AUTOCLAVE, STIRRER ED APPARECCHIATURE ELETTRICHE DA LABORATORIO IN GENERE EVITARE DI CONTAMINARE IL PROPRIO POSTO DI LAVORO E TENERLO IL PIU PULITO POSSIBILE CONTROLLARE PERIODICAMENTE IL SISTEMA ANTI-INCENDIO, I SISTEMI DI ALLARME GAS E L ACCESSO ALLE VIE DI FUGA OSSERVARE CORRETTA VENTILAZIONE E RICAMBIO ARIA LOCALI NON FUMARE E NON CONSERVARE O CONSUMARE CIBI IN LABORATORIO

RISCHI AMBIENTALI IN LABORATORIO

RISCHIO BIOLOGICO : TUBERCOLOSI; BATTERI PIOGENI PER AEROSOL; VIRUS EPATITE - HBV - HCV-; HIV (AIDS); INFEZIONI DA LEGIONELLA E DA BLASTOMYCES; DERMATITI. RISCHIO CHIMICO : ESPOSIZIONE A FORMALDEIDE (oltre 1 ppm) e\o GLUTARALDEIDE; ESPOSIZIONE TOSSICA VERSO SOLVENTI ORGANICI (Xilene, Toluene, Benzene, Cloroformio, Alcool....); ESPOSIZIONE VERSO AMINE AROMATICHE(principali coloranti : ponceau,verde luce, fast red, sudan IV, blu toluidina.......); ESPOSIZIONE VERSO LA DAB (benzidina - derivato); ESPOSIZIONE VERSO I METACRILATI (resine per inclusione in M.E., tossiche e corrosive); ESPOSIZIONE ALLERGICA VERSO IL LATTICE. RISCHIO NUCLEARE : ESPOSIZIONE VERSO ISOTOPI RADIOATTIVI USATI NEL MARCARE I PROBES (3H, 14C, 45Ca, 32P, 90Sr, 35S, 131I). RISCHIO FISICO : PUNTURE, TAGLI, LACERAZIONI ED ABRASIONI CUTANEE(nell uso del microtomo o nella dissezione in sala anatomica); ESPLOSIONI ED INCENDI ACCIDENTALI (nella preparazione di reattivi o nello stoccaggio degli alcool), ATTI DOLOSI E CADUTE ACCIDENTALI.

ARTEFATTI ISTOLOGICI
Definizione Difetti o anomalie dei tessuti, da riferire non ad un processo naturale (fisiologico o patologico) ma allintroduzione di materiali estranei, a procedure non corrette di fissazione, inclusione, sezionamento, colorazione, montaggio dei vetrini. E importante riconoscere gli artefatti, per evitare di interpretarli (e diagnosticarli) come un processo patologico o una malattia del paziente.

ARTEFATTI ISTOLOGICI
1)Artefatti causati prima del prelievo: 1.1. Polvere di talco 1.2. Materiale di sutura 1.3. Effetto da termocauterio 1.4. Effetto da agenti chimici 1.5. Particelle di carbone 6. Garza 1.7. Essicamento

ARTEFATTI ISTOLOGICI
2) Artefatti causati nellintervallo tra il prelievo ed il trattamento istologico 2.1. Effetti di schiacciamento 2.2. Essiccazione 2.3. Congelamento 2.4. Chinatura 2.5. Introduzione di materiali estranei quali grani di polvere

ARTEFATTI ISTOLOGICI
3) Artefatti durante la fissazione 3.1. Autolisi durante la fissazione 3.2. Fissazione inadeguata o incompleta 3.3. Effetti da fissazione con Fiss. di Zenker (coartazione) 3.4. Deposito di cristalli di Sublimato mercurico 3.5. Effetti di estrazione da fissazione in formalina 3.6. Depositi di Emateina acida da fiss. in formalina

ARTEFATTI ISTOLOGICI
4)Artefatti legati a procedure di inclusione 4.1. Inadeguata fissazione 4.2. Inadeguata disidratazione 4.3. Presenza di residui di liquidi chiarificanti 4.4. Inadeguata infiltrazione di paraffina 4.5. Uso di paraffina troppo calda

ARTEFATTI ISTOLOGICI
5) Artefatti legati alle procedure dinclusione 5.1. Inclusione di frammenti multipli di diversa durezza 5.2. Orientamento scorretto dei frammenti 5.3. Prolungata esposizione a paraffina sciolta

ARTEFATTI ISTOLOGICI
6)Artefatti da sezionamento erroneo 6.1. Angolo di taglio sbagliato 6.2. Lama o blocchetto mal fissati (effetto tende alla veneziana) 6.3. Lame poco affilate 6.4. Raccolta di frammenti di tessuto anomalo pesci

ARTEFATTI ISTOLOGICI
7) Errori nella raccolta delle sezioni sui vetrini 7.1. Contaminazione dei vetri da muffe o pollini 7.2. Uso di quantit eccessive di adesivo 7.3. Raccolta di frammenti di altri blocchetti 7.4. Pieghe nelle sezioni 7.5. Bolle daria sotto le sezioni 7.6. Uso di acqua troppo calda per stendere le sezioni

ARTEFATTI ISTOLOGICI
8) Artefatti da colorazione I 8.1. Mancata sparaffinatura 8.2. Effetti di bolle tra sezione e vetro 8.3. Sbagli nella colorazione con: 8.4. Ematossilina di Harris 8.5. Emallume di Mayer 8.6. Eosina 8.7. Imperfetta disidratazione prima del montaggio

ARTEFATTI ISTOLOGICI
8) Artefatti da colorazione II Sbagli nelle colorazioni speciali: 8.5. PAS 8.6. PAS-diastasi 8.7. Rosso Congo 8.8. Giemsa 8.9. Feulgen 8.10. Metenamina-argento per i funghi

ARTEFATTI ISTOLOGICI
9) Errori nel montaggio con coprioggetto 9.1. Contaminazione del liquido di montaggio 9.2. Uso di coprioggetto troppo piccoli 9.3. Erroneo posizionamento del vetrino 9.4. Intrappolamento di bolle daria 9.5. Montante troppo abbondante 9.6. Montante troppo scarso

ARTEFATTI IN CITOLOGIA
c.1.) Errori nella raccolta delle cellule c.1.1. Cellule sovrapposte c.1.2. Cellule troppo rade c.1.3. Eccessiva quantit di sangue c.1.4. Mancato uso di adesivo c.1.5. Effetto da citocentrifuga c.1.6. Contaminazione batterica (nelle urine) c.1.7. Stiramento delle cellule per compressione

ARTEFATTI IN CITOLOGIA
c.2.) Errori nella fissazione delle cellule c.2.1. Effetti di essiccamento prima della fissazione (nella col. di Papanicolau) c.2.2. Effetti di essiccamento troppo lento (nella col. di Giemsa)

ARTEFATTI IN CITOLOGIA
c.3) Errori nella colorazione delle cellule con la col. di Papanicolau c.3.1. Col. Nucleare troppo debole c.3.2. Col. Nucleare troppo intensa c.3.3. Col. con Orange G troppo debole c.3.4. Col. con Orange G troppo intensa c.3.5. Col. con Verde luce troppo debole c.3.6. Col. con Verde luce troppo intensa

ARTEFATTI IN CITOLOGIA
c.4) Errori nel montaggio con coprioggetto c.4.1. Contaminazione del liquido di montaggio c.4.2. Uso di coprioggetto troppo piccoli c.4.3. Erroneo posizionamento del vetrino c.4.4. Intrappolamento di bolle daria c.4.5. Montante troppo abbondante c.4.6. Montante troppo scarso