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PROCESSAZIONE CAMPIONE ISTOLOGICO

1) PRELIEVO E STRISCIO SUL VETRINO


Per ottenere buoni preparati, necessario che il prelievo avvenga rapidamente, che il materiale sia
molto fresco e che i pezzi non superino 1 cm di diametro, e che siano refrigerati prima di procedere
ai trattamenti successivi.
2) FISSAZIONE
Tutti i fissativi devono necessariamente essere preparati come soluzioni isotoniche e a pH 7.4, per
impedire fenomeni di collassamento o di rigonfiamento dei campioni, legati agli stress osmotici. La
fissazione minimizza la degradazione dei tessuti, conseguente alla rimozione del tessuto dal suo
ambiente vitale. noltre la fissazione protegge dall!azione dei microrganismi che, asportato il
tessuto, invadono il materiale biologico e consente al preparato di sopportare gli stress fisici e
chimici insiti nelle successive fasi. La fissazione poi interrompere velocemente e completamente i
processi autolitici, che si sviluppano nella cellula e nei tessuti non pi" nutriti ed ossigenati,e
conserva al meglio la morfologia strutturale del tessuto e dellacellula.
La scelta del fissativo dipende# dalle dimensioni del campione$ dalla natura dei costituenti chimici
della cellula che si desiderano conservare %ad esempio, le strutture proteiche sono facili da
preservare, mentre gli zuccheri semplici sono piuttosto labili&$ dal grado di preservazione strutturale
richiesto dalle caratteristiche di risoluzione del microscopio ottico usato.
La durata della fissazione varia a seconda della natura del campione biologico in esame, della
velocit' di penetrazione del fissativo, ma soprattutto in base allo spessore del pezzo#ad esempio uno
spessore di 4 mm richiede dalle 1( alle (4 ore a temperatura ambiente. Prolungando i tempi, il
fissativo tende ad indurire i pezzi e coartare i vasi linfatici e sanguigni eventualmente presenti.
)alla fissazione dipende la buona riuscita di un preparato istologico poich* permette di mantenere il
pi" possibile inalterato il +uadro strutturale dei tessuti.
fissativi si dividono in#
, Fissativi Primari coagulati, in grado di coagulare le proteine fra cui l-acido acetico che ha un
eccellente potere di penetrazione, non solubilizza i grassi, fa precipitare le nucleoproteine, provoca
rigonfiamento del collagene e alterazioni dei mitocondri.
, !issativi "rimari o coagulati #$aturati% Tra cui la formaldeide che un fissativo aldeidico,
un gas incolore tossico usato in soluzione ac+uosa detta formalina, molto solubile in ac+ua$ agisce
lentamente, possiede un elevato grado di penetrazione, non provoca eccessivo indurimento dei
tessuti, non dissolve i lipidi. .on coagulante, infatti, rispetto alle proteine agisce come un additivo
perch* si unisce ai gruppi .H( in modo tale che i gruppi idrofili delle proteine conservino il loro
rapporto con le molecole d-ac+ua$
, Fissativi S$m"lici, contenenti oltre al composto primario anche dei sali indifferenti$
, &isc$l$ Fissativ$ costituite da due o pi" fissativi primari mescolati in precise proporzioni. l
fissativo pi" usato il li+uido di /ouin, molto penetrante, si usa per fissare anche pezzi
voluminosi e permette l-uso di +uasi tutti i metodi di colorazione.
') (ISI(RATAZIONE
0on la disidratazione si sottopone il tessuto ad un passaggio graduale nella serie degli alcoli a
concentrazione progressivamente crescente, per tempi di permanenza in ciascuna concentrazione
variabili a seconda delle dimensioni del pezzo
P120H 3 45 L5 )3)25T567.18 Perch* le sostanze includenti hanno lo svantaggio
d-essere apolari, idrofobiche, insolubili nell-ac+ua di cui sono costituite le cellule dei tessuti.
5ffinch* il mezzo d-inclusione possa penetrare nel tessuto, necessario eliminare dal tessuto
l-ac+ua.
)) INCLUSIONE
nfiltrazione del mezzo di inclusione#
consiste nell-immersione del pezzo disidratato nel mezzo d-inclusione allo stato li+uido per un
periodo sufficientemente lungo da consentirne la penetrazione nei pi" profondi interstizi del
campione.
ndurimento del mezzo di inclusione
permette di intrappolare, ossia includere, il campione in un materiale abbastanza duro e omogeneo
tale da poter essere tagliato in sezioni di spessore solitamente non superiore a 19 :m. mezzi
d-inclusione fungono dun+ue da sostegno evitando che durante la fase di taglio, le sezioni perdano
la consistenza necessaria per il loro mantenimento e per la successiva l!osservazione microscopica.
l mezzo di inclusione piu usato la Paraffina che una miscela di cere a vari punti di fusione.
l-inclusione in paraffina permette generalmente di ricavare sezioni aventi spessore minimo pari a 1,
( :m$ inoltre insolubile sia in ac+ua che in etanolo %per +uesto occorre inserire, dopo la
disidratazione, la fase di chiarificazione con ;ilolo& e garantisce migliori dettagli morfologici,. La
paraffina, prima dell-uso, deve essere sciolta alla temperatura di circa <7,<= >0, e poi filtrata per
eliminare eventuali impurit'. )opo la fase di infiltrazione, i campioni vengono alloggiati in
contenitori in cui fatta colare paraffina li+uida ed il tutto lasciato solidificare a temperatura
ambiente. 5 completa solidificazione avvenuta, il blocchetto solido viene estratto dal contenitore e
processato per la successiva fase di sezionamento. tempi minimi d-infiltrazione sono di tre ore$
non esistono tempi massimi, perch* il campione, una volta infiltrato dalla paraffina, non si
deteriora.
)) SEZIONA&ENTO
consiste nella riduzione del campione, incluso in un blocchetto solidificato, in fette da 1,(9
micrometri, mediante un microtomo, in modo da avere sezioni del campione penetrabili alla luce e
dun+ue osservabili al microscopio.l microtomo pu? essere rotativo o a slitta. l microtomo rotativo
ha la lama fissa e il pezzo procede in direzione verticale. 5l contrario il microtomo a slitta ha la
lama che si muove in senso orizzontale con il pezzo fisso.
*) COLORAZIONE
La 0olorazione un procedimento che aumenta il contrasto presente tra diverse strutture cellulari,
tale da permetterne il riconoscimento delle sezioni istologiche, data la loro trasparenza$
coloranti usati in microscopia sono#
, aturali se si trovano in natura d-origine animale o vegetale %l-ematossilina vegetale&
, sit$tici che si distinguono in basici e acidi. 3ono basici %es.# ematossilina, blu di metilene& se
legano molecole acide come il ).5 oppure sono acidi %es.# eosina& se legano molecole basiche
come gran parte delle proteine citoplasmatiche e sostanze connettive.
Le colorazioni possono essere#
, (ir$tt$, +uando le sezioni prendono direttamente il colorante dalla soluzione$
, I#ir$tt$, +uando il colorante si unisce al substrato grazie all-intervento di sostanze dette mordenti
che hanno il compito di rendere possibili i legami tra colorante e tessuto e di fissare stabilmente il
colore. La maggior parte dei mordenti sono forti ossidanti o allumi
, Progr$ssiv$ +uando si lascia agire il colorante nelle sezioni fino a che non si raggiunto il giusto
grado di colorazione$
, R$gr$ssiv$, +uando la sezione viene in un primo tempo sovraccolorata per poi asportarne
l-eccesso$
, S$m"lici, +uando prevedono l-utilizzo di un solo colorante. 5 seconda della struttura colorata sono
dette nucleari o citoplasmatiche. Per la natura del colorante sono invece distinte in
monocromatiche se le strutture colorate hanno la stessa tonalit' del colorante, e colorazioni
metacromatiche se le strutture fanno variare le tonalit' del colore. coloranti che possiedono +uesta
propriet' di viraggio tintoriale sono detti metacromatici, mentre le sostanze che subiscono il
fenomeno, sono dette cromotrope. principali coloranti metacromatici sono basici e sono ad
esempio il 0ristal violetto,la 3afranina. @n 1sempio di sostanza cromotropa la cartilagine.
, Com+iat$, +uando prevedono l-impiego di pi" coloranti in successione. 7gni colorante agisce per
proprio conto fissando determinate strutture.
L-azione di un colorante dipende da fattori insiti nel tessuto# affinit' chimica fra colorante e
costituenti del tessuto$ concentrazione dei costituenti e la loro permeabilit'.
*) (ISI(RATAZIONE E C,IUSURA VETRINO
si deve effettuare una disidratazione perch +uasi tutti i coloranti usati sono a base ac+uosa e +uindi
bisogna disidratare di nuovo il campione.
a colorazione terminata, si versa una o due gocce di soluzione AmontanteB sul vetrino portaoggetti e
lo si copre con il vetrino coprioggetti imbevuto di ;ilene. 3iattende che il montante si sia distribuito
uniformemente tra i due vetrini, eventualmenteesercitando una lieve pressione, si lascia asciugare a
temperatura ambiente.
-) ACCENNO (I I&&UNOISTOC,I&ICA
una tecnica in grado di individuare specifiche molecole o strutture del compartimento intra ed
e;tra cellulare. La tecnica immunoistochimica si basa sul principio di coniugazione antigene,
anticorpo in addizione poi con sistemi di rivelazione %enzimatici, fluorescenti& che ne rendono
visibile l-avvenuta reazione al microscopio. 1sistono metodiche dirette o indirette. .elle metodiche
dirette si utilizza un unico anticorpo diretto contro la molecola da ricercare e +uesto stesso anticorpo
lega una sostanza colorata che ne permette la visualizzazione. .elle metodiche indirette si
utilizzano due anticorpi# il primo diretto contro la molecola da ricercare, il secondo, coniugato con
la sostanza colorata, andr' a legarsi al primo anticorpo.