IL LABORATORIO

DI ANATOMIA

Anatomia Microscopica
 Dichiarazione di copyright
L'utilizzo dei contenuti della lezione sono riservati alla fruizione personale degli
studenti iscritti ai corsi dell’Università di Camerino. Sono vietate la diffusione intera o
parziale di video o immagini della lezione, nonché la modifica dei contenuti senza il
consenso, espresso per iscritto, del titolare o dei titolari dei diritti d'autore e di
immagine.

Copyright notice
The contents of this lesson are subject to copyright and intended only for personal use
by students enrolled in courses offered by the University of Camerino. For this reason,
any partial or total reproduction, adaptation, modification and/or transformation of
the contents of this lesson, by any means, without the prior written authorization of
the copyright owner, is strictly prohibited.
Allestimento di un campione biologico per l’analisi al
microscopio
Organizzazione di un laboratorio di anatomia
patologica

Da:
U.C.O. di Anatomia e Istologia Patologica

https://www.youtube.com/watch?v=xeylG6kGIaA
Tecniche di colorazione
 Scopo e modalità
 Hanno lo scopo di permettere la visualizzazione di
componenti chimiche presenti in un campione
 Si basano sulle proprietà di alcuni reagenti di formare
con le sostanze presenti nei vari campioni dei
prodotti di reazione colorati o colorabili (nella
visualizzazione di enzimi, non viene messo in
evidenza l’enzima, ma il suo prodotto di reazione)
 Requisiti

 Presuppongono che:
- la reazione sia specifica per la sostanza in
esame
- il prodotto di reazione non subisca
dislocazioni
 COLORAZIONI
MORFOLOGICHE
 Scopo

 Hanno lo scopo di permettere la

visualizzazione di strutture presenti in un
campione aumentandone il contrasto
 Modalità

 Utilizzano sostanze denominate coloranti che sono

formate da un cromoforo (gruppo che conferisce il
colore) e da un auxocromo (gruppo in grado di
stabilire un legame tra la struttura del campione e il
cromoforo)
 Si basano sull’affinità di sostanze presenti in una
struttura per coloranti acidi (sostanze acidofile) e per
coloranti basici (sostanze basofile)
 Classificazione
 Comprendono:
- colorazioni per l’evidenziazione del nucleo
- colorazioni per l’evidenziazione del citoplasma
- colorazioni per l’evidenziazione del connettivo
che si realizzano mediante colorazioni semplici,
combinate e tricromiche
 Tutte le tecniche di colorazioni che vengono effettuate su un
tessuto incluso in paraffina, prevedono prima una
spraffinatura ed una idratazione del tessuto.
Xilolo I 10 min
Xilolo II 5 min
Alcool Etilico-Xilolo 5min
Alcool Etilico assoluto 5min
Alcool Etilico Assoluto 5min
Alcool Etilico 95° 5 min
Alcool Etilico 70° 1 min
Acqua di Fonte 10 min
Acqua distillata passaggio veloce

COLORAZIONE
 Dopo la colorazione per la conservazione del tessuto si deve
procedere con una disidratazione e quindi un montaggio, da
effettuare con un vetrino coprioggetto ed un montante
sintetico, che la peculiarità di presentare lo stesso indice di
rifrazione del vetro e quindi non da problemi nell’analisi al
microscopiao
 Alcool Etilico 95° 1 min
Alcool Etilico assoluto 1 min
Alcool Etilico Assoluto 1 min
Alcool Etilico-Xilolo 5min
Xilolo I 5 min
Xilolo II 5 min

Montaggio con vetrino coprioggetto e montante sintetico

 Colorazione con Ematossilina – Eosina
L’emallume acido di Mayer si prepara sciogliendo in acqua distillata diverse
componenti: ematossilina, allume di potassio, iodato di sodio, cloralio idrato
ed acido acetico. La componente principale è l’ematossilina, di origine
vegetale, in quanto estratta dal legno di una leguminosa presente in America
del Sud. L’ematossilina non è il colorante vero e proprio, ma lo diventa
per ossidazione ad emateina. L’emateina esercita un’attività tintoriale solo in
presenza di un mordenzante (ponte tra tessuto e colorante); nella miscela
dell’emallume acido di Mayer è l’allume di potassio. In base al mordenzante
utilizzato, vi sono diversi tipi di ematossilina. L’ematossilina è un colorante
basico, colora in blu/viola le componenti cariche negativamente (basofile),
quali acidi nucleici, presenti a livello del nucleo.

Struttura chimica
dell’ematossilina
 Colorazione con Ematossilina – Eosina
L’eosina è un derivato della fluoresceina e si presenta sotto forma di polvere
cristallina di colore rosso, solubile in acqua ed in alcool. Al contrario
dell’ematossilina, l’eosina è un colorante acido, colora in rosso/rosa le
componenti cariche positivamente (acidofile), quali proteine cellulari,
presenti a livello citoplasmatico. L’eosina al 2% invece, è utilizzata
come disinfettante della cute, in quanto favorisce la cicatrizzazione. Oltre
all’eosina comune, ossia l’eosina Y, esiste anche l’eosina B, polvere cristallina
bruna solubile in acqua. L’eosina B si differenzia da quella comune per la sua
struttura chimica, in quanto vi è la presenza di due gruppi nitrici al posto di
due dei quattro atomi di bromo.

Struttura chimica dell’eosina

 Colorazione con Ematossilina – Eosina
• Sparaffinatura e idratazione
• H2O di fonte per 5 min
• 3 Lavaggi veloci in H2O distillata
• Ematossilina per 8 min
• H2O di fonte per 5 min
• 3 Lavaggi veloci in H2O distillata
• Eosina per 30”
• Lavaggio veloce in H2O distillata
• Disidratazione (partendo da alcool 95°),
chiarificazione e montaggio
 Colorazione
Ematossilina – Eosina
Passaggi fondamentali da eseguire per
la colorazione Ematossilina-Eosina

https://www.youtube.com/watch?v=2D0rj0m6dVs

https://www.youtube.com/watch?v=26OLI6n_1pI
 Sezione di epididimo di ratto 10X Sezione di epididimo di ratto 20X

Sezione parete intestino tenue 20X Sezione miocardio20X

Da notare le cripte intestinali ed un
ganglio del plesso mienterico
Sezione della ghiandola salivare parotide 20X
Sezione di pancreas. Particolare il un isolotto del Langherans 40X
Sezione di rene. Particolare il un glomerulo 40X
Sezione di Fegato. 10X
Sezione di Fegato. 20X
 COLORAZIONE DEL TESSUTO NERVOSO MEDIANTE
SOLUZIONE DI NISSL
Principio: Il metodo di Nissl viene utilizzato tanto a livello citologico per
lo studio della sostanza tigroide che a livello istologico per identificare
la topografia dei neuroni. È indispensabile la fissazione in alcool a 95°.
La sostanza tigroide o zolle di Nissl è costituita da granuli di acido
ribonucleico.

Sparaffinatura ed idratazione
Incubazione nella soluzione di Nissl 0,75%: 8 min
Cresil Violetto 1,5 g
Acqua distillata 98 ml
Acido acetico 1M 1 ml
Incubazione in etanolo 95°: 1 min ( controllare le sezioni perché
perdono il colorante)
Disidratazione
Corteccia cerebrale di ratto 5X
Corteccia cerebrale di ratto 40X

Corteccia cerebellare di ratto 10X

 Colorazione
TRICROMICHE
Ai coloranti specifici per il nucleo e per
il citoplasma, viene aggiunto un terzo
componente per le fibre connettivali

Permettono in un organo di
evidenziare sia la componente del
parenchima che dello stroma
 Colorazione tricromica sec. Masson
• Sparaffinatura e idratazione
• H2O di fonte per 5 min -3 lavaggi in H2O distillata
• Soluzione di ematossilina ferrica 8 min
• Soluzione di Acido picrico (soluzione alcoolica satura) 4 min
• Breve lavaggio in H2O distillata per asportare l’eccesso di
colorante
• Soluzione di fucsina acida 2 min
• Breve lavaggio in H2O distillata per asportare l’eccesso di
colorante
• Soluzione all’0,8% di acido fosfomolibdico 10 min
• Soluzione di blu di anilina: 4 min
• Breve lavaggio in H2O distillata per asportare l’eccesso di
colorante
• Disidratazione montaggio del vetrino
 Colorazione tricromica sec. Masson
Principio: Il metodo associa una colorazione nucleare ottenuta con
ematossilina ferrica di Weigert, una colorazione delle emazie con acido
picrico e una colorazione del connettivo con coloranti acidi

Ematossilina Nucleo nero-violaceo

Fucsina acida Citoplasma,
fibre muscolari rosso
Blu di anilina Fibre connettivali blu
Colorazione tricromica sec. Masson

https://www.youtube.com/watch?v=RJgLryj__fk

https://www.youtube.com/watch?v=0L-pHIxVsC8
Sezione di Colon 5X

Sezione di Colon 10X

Sezione di
Colon 20 X
 Colorazione tricromica sec. Gomori
• Sparaffinatura e idratazione
• H2O di fonte per 5 min -3 lavaggi in H2O distillata
• Ematossilina per 7min
• H2O di fonte per 5 min- 2 lavaggi veloci in H2O distillata
• Miscela Tricromica* per 12 min
• Breve lavaggio in H2O distillata per asportare l’eccesso di
colorante
• Lavaggio in H2O acidula* che rende i colori più delicati e
trasparenti
• Disidratazione, chiarificazione e montaggio
 Colorazione tricromica sec. Gomori
La miscela tricromica è una soluzione acquosa di cromotropo
R, fast green o verde luce, acido fosfotungstico e acido acetico
glaciale.
Sia il cromotropo R che il fast green o il verde luce sono coloranti
acidi che colorano, in modo più o meno elettivo, rispettivamente
il citoplasma e le fibre collagene grazie all’azione esercitata
dall’acido fosfotungstico

*L’acqua acidula si ottiene aggiungendo 0.2 ml di acido acetico

glaciale a 99.8 ml di H2O
Colorazione tricromica sec. Gomori
Sezione di Colon 20X
COLORAZIONE MEDIANTE WEIGERT VAN GIESON
PER FIBRE ELASTICHE E CONNETTIVO

Principio: Il metodo si basa sull’affinità per le fibre

elastiche del colorante ottenuto facendo reagire resorcina
e fucsina basica in presenza di ferro percloruro. L’elettività
del metodo non è assoluta, altre strutture quali collagene e
membrane basali possono colorarsi; è quindi importante
una accurata differenziazione per ottenere una colorazione
marcata e selettiva delle fibre elastiche. Il contrasto con la
colorazione tricromica di Van Gieson permette di
differenziare il collagene dal connettivo visualizzando nel
contempo anche i nuclei.
COLORAZIONE MEDIANTE WEIGERT VAN GIESON PER
FIBRE ELASTICHE E CONNETTIVO

•Sparaffinatura ed idratazione
•Incubare le sezione nel reattivo A ( soluzione di acido periodico):
5 min.
•Lavare in acqua distillata
•Incubare nel reattivo B (Weigert fucsina resorcina): 30 min.
•Lavare in acqua distillata.
•Incubare nel reattivo C (Tampone acido di differenziazione):
2 min.
•Lavare in acqua di fonte: 5 min
•Lavare in acqua distillata.
•Disidratazione e montaggio
 COLORAZIONE MEDIANTE WEIGERT VAN GIESON PER
FIBRE ELASTICHE E CONNETTIVO
Sezione di Aorta 20X

Sezione di Intestino 10X

Le freccie indicano la colorazione

specifica della reazione
COLORAZIONE MEDIANTE WEIGERT VAN GIESON PER
FIBRE ELASTICHE E CONNETTIVO
Sezione di Intestino 20X

Le freccie indicano la colorazione specifica della reazione

 Tecniche di evidenziazione degli
eteropolisaccaridi
 Sono basate sull’identificazione dei radicali
presenti in queste molecole e sull’uso di
reazioni di blocco e digestioni enzimatiche per
verificarne la specificità
 Reazioni di gruppo

 I glicosaminoglicani sono PAS negativi pur

possedendo dei gruppi vic-glicol liberi di
reagire. Una spiegazione potrebbe essere che
la loro carica elettrica fortemente negativa
impedirebbe il contatto con l’acido periodico,
anch’esso a carica negativa, e quindi la
trasformazione dei gruppi vic-glicol in gruppi
aldeidici capaci di reagire con il reattivo di
Schiff
 Reazioni di gruppo
 Le numerose reazioni di gruppo sono basate
sull’affinità dei GAG per i coloranti basici
(basofilia) grazie alla presenza di radicali acidi
quali i carbossilici e i solforici che devono
risultare dissociati (a pH 2.5 si presentano
dissociati i gruppi fosforici, i gruppi carbossilici
e i solforici mentre a pH inferiore a 1.8 solo i
gruppi solforici sono ancora dissociati)
 Reazioni di gruppo

Sono:
 Metodo all’Alcian blue
 Metodo di Hale
 Metodo con diamine
 Metodi metacromatici
 Alcian-blu

 L’Alcian blu è la forma solubile della ftalocianina

rameica sostituita che, possedendo 4 gruppi
cationici, si comporta come un colorante basico
 L’Alcian blu ha affinità, per i diversi gruppi acidi,
dipendente dal pH della reazione
 Normalmente si può operare a :
-pH 2,5 e in tal caso la colorazione è dovuta sia ai
radicali carbossilici sia ai radicali solforici

- pH 1,0 e in tal caso la colorazione è dovuta solo ai

radicali solforici
Rappresentazione della molecola di Alcian blu
Colorazione ALCIAN BLUE pH 2.5

• Sparaffinatura e idratazione
• H2O di fonte per 5 min -3 lavaggi in H2O distilla
• Incubare le sezioni in una Acido acetico 3%: 2 min.
• Incubare in soluzione di Alcian-blue pH 2.5: 30 min.
• Incubare in una soluzione allo 0,3% di Na2CO3: 15
min
• Passaggio veloce in acqua distillata
• Differenziazione in Etanolo 95° veloce
• Disidratazione e montaggio
Alcian blu pH 2.5: digiuno ratto 10X

Alcian blu pH 2.5: colon ratto 20X

 Reazione acido periodico e reattivo di Schiff (PAS)
Per la dimostrazione dei glicidi si utilizza la reazione PAS (dell’acido periodico
di Schiff). Il metodo si fonda sul seguente principio: i polisaccaridi (semplici e
mucopolisaccaridi), quando ossidati a mezzo dell’a­cido periodico, danno
origine ad aldeidi. I gruppi aldeidici vengono quindi rivelati istologicamente a
mezzo del reattivo di Schiff (acido bis-N-aminosolfonico). Questo consta di
fucsina basica (di colorito rosso) trattata con un eccesso di acido solforico
che la rende del tutto incolore (leucofucsina).
Peraltro, quando viene a trovarsi in presenza di gruppi aldeidici, essa dà luogo
ad un’intensa reazione rossa o rosso-violacea (rosso magenta). Quindi, in
definitiva, le strutture contenenti polisaccaridi assumono tale colorazione.
La reazione del PAS è comune a tutti i polisaccaridi: ciò vale in particolare per
il glicogeno, la cui presenza può essere accertata trattando fette successive di
un medesimo frammento, in parte, diretta-mente con la reazione del PAS, in
parte, dopo dige-stione con saliva, con amilasi o con diastasi. In caso positivo
la ptialina contenuta nella saliva, come pure gli altri due enzimi, inducono
negatività della reazione del PAS per effetto della scissione del glicogeno.
BIOPSIE
Colorazione Mediate PAS

• Sparaffinatura e idratazione
• H2O di fonte per 5 min -3 lavaggi in H2O distilla
• Incubare le sezioni in una soluzione di acido periodico al 10%
per 10 min.
• Lavaggio in H2O di fonte: 10 min e passaggio veloce in H2O
distillata
• Incubazione con soluzione di Schiff: 20 min
• Lavaggio con acido solforos al 15%: 3 lavaggi per 2 min
• Passaggio veloce in acqua distillata
• Differenziazione in Etanolo 95° veloce
• Disidratazione e montaggio
 Vantaggi
 Esame non solo della morfologia citologica,
ma anche dell’impalcatura strutturale

 Possibilità di una indagine morfologica

dettagliata
 Impiego
Sono d’obbligo quando il prelievo citologico:
 non si può eseguire (l’organo non è raggiungibile: es.
stomaco)
 non darebbe informazioni esaurienti (es. presenza di
materiale esfoliativo che “sporca” il preparato)
In alcuni casi (es. fegato) si può fare sia il prelievo
citologico (es. in caso di neoplasia) che bioptico (es.
in caso di epatite o cirrosi)
 ESEMPIO DI
BIOPSIA OSSEA
 Modalità di esecuzione
 Si esegue con una speciale siringa a livello di
alcune ossa (es. parte prossimale del femore e
dell’omero, sterno o cresta iliaca che è
preferibile perché in questa sede il midollo
osseo è più “rappresentativo”)
 Allestimento dei preparati

 Tra i fissativi è particolarmente usato il B5

(formalina + HgCl2) che dà luogo a precipitati
neri di mercurio solubilizzabili con alcool a 70°
per 30min (o a tempo indeterminato)
 La decalcificazione viene effettuata con EDTA per
2,30h
 L’inclusione viene fatta in paraffina
 Scopo

1. Individuazione di patologie a livello del

midollo osseo

2. Individuazione di popolazioni sostitutive

(metastasi) a livello del midollo osseo
 Individuazione di patologie a
livello del midollo osseo
La popolazione cellulare midollare, in
condizioni normali, è costituita da:
• Megacariociti: 1% (si possono individuare
immunocitochimicamente grazie alla presenza
del fattore VIII)
• Plasmacellule: < 10%
• Mieloblasti-eritroblasti: (il rapporto serie
mieloide/serie eritroide è 2-3 : 1).
 Individuazione di patologie a livello
del midollo osseo

• Sideroblasti

• Linfociti: 5-20%

• Cellule adipose
Biopsia ossea: Giemsa
 Individuazione di patologie a livello
del midollo osseo
Lo studio comprende:

1. Un esame morfologico mediante

ematossilina-eosina o Giemsa
 Individuazione di patologie a livello
del midollo osseo
2. Una evidenziazione immunoistochimica
della mieloperossidasi (positiva in tutta la
serie mieloide). La sua evidenziazione
permette di valutare la distribuzione della
serie mieloide (normalmente è localizzata
vicino alle trabecole ed è mescolata con la
serie eritroide) e il suo rapporto con la
serie eritroide
Biopsia ossea:
Evidenziazione
immunoistochi-mica
della mieloperossidasi
 Individuazione di patologie a livello
del midollo osseo

3. Un esame delle fibre reticolari basato sulla

loro argentofilia. Le fibre reticolari possono
variare in quantità e spessore in alcune
malattie come la mielofibrosi. In alcuni casi
arrivano a sostituire completamente il
midollo
 Individuazione di patologie a livello
del midollo osseo

4. Una visualizzazione del ferro presente in

sideroblasti e in macrofagi. Tale studio
permette di valutare la riserva di ferro
dell’organismo. Si può avere un aumento (es.
nelle anemie refrattarie con alterazione nella
produzione dei globuli rossi per cui il ferro si
deposita a livello dei sideroblasti) o una
diminuzione (es. nelle anemie microcitiche
dovute ad emorragie)
METODO GIEMSA
 Procedimento
1. Sparaffinare e idratare
2. Lavare in H2O distillata
3. Porre le sezioni in Giemsa diluito al 50% con acqua distillata
per 5min
4. Scolare il colorante
5. Immergere velocemente in alcool 95° per 2 volte (per
differenziare)
6. Immergere in alcool isopropilico per 2min (per arrestare la
differenziazione)
7. Immergere in xilolo
8. Montare con Eukitt
I derivati basici dell’anilina (blu di metilene, azur A, azur B,
tionina) sono in grado di formare dei sali con l’eosina
(eosinato di…)
 Procedimento

Questi sali sono utilizzati per la colorazione dei

citoplasmi e dei nuclei delle cellule del sangue
 La differenziazione (con alcooli, acidi, basi…) ha lo
scopo di eliminare il colorante in eccesso legatosi
aspecificatamente ed eventualmente fissare la
colorazione specifica.
IMPREGNAZIONE ARGENTICA
 Procedimento

1. Sparaffinare e idratare
2. Lavare in H2O di fonte. Lavaggi in H2O distillata
3. Porre sulle sezioni 5 gocce di reattivo A e 5 gocce di
reattivo B per 5min
4. Lavare con H2O distillata
5. Porre sulla sezione 10 gocce del reattivo C per 3min
6. Doppio lavaggio in H2O distillata
7. Porre 10 gocce di reattivo D per 3min
8. Doppio lavaggio in H2O distillata
9. Porre 10 gocce del reattivo E per 3min
10. Doppio lavaggio in H2O distillata
 Procedimento

11. Porre 12 gocce di reattivo del reattivo F per

5min
12. Doppio lavaggio in in H2O distillata
13. Porre 12 gocce del reattivo G per 5min
14. Lavare in acqua di fonte. Lavaggi in H2O distillata
15. Disidratare, chiarificare e montare
 Reagenti
A = soluzione di permanganato di K
B = tampone acido di attivazione
C = soluzione di acido ossalico
D = soluzione di ferro ammonio solfato
E = soluzione ammoniacale d’argento
F = soluzione di aldeide formica (sottraendo
O2 agisce da riducente)
G = soluzione iposolfito di Na
 Principio
In sintesi: la prima parte del metodo consiste
nel far depositare Fe proveniente da un sale
(sec. il metodo Gomori) sulle fibre reticolari

Nel secondo tempo, l’Ag, proveniente dalla

soluzione ammoniacale d’argento, viene
ridotto ad opera della formalina ad argento
metallico che si deposita solo nei siti in cui è
presente un metallo già precipitato
 Alla fine, l’ossido diaminoargentico non
ridotto viene asportato con iposolfito di
sodio (Na2S2O3) che con esso forma un
complesso molto solubile ma non più
riducibile
Sezioni di biospia ossea processate
mediante impregnazione argentica
L’impregnazione argentica, può essere utilizzata
anche per evidenziare le fibre reticolari che
compongono lo stroma degli organi
Sezione di rene 10X

Sezione di polmone contrastato

con esosina 10X
L’impregnazione argentica, può essere utilizzata
anche per evidenziare le fibre reticolari che
compongono lo stroma degli organi
Sezione di rene 20X
METODO DI PERLS
 Procedimento
1. Sparaffinare e idratare
2. Lavaggio in H2O di fonte. Lavaggi in H2O distillata
3. Incubare nella soluzione (A + B)* per 20min
4. Lavare bene in H2O distillata
5. Porre sulle sezioni 10 gocce di reattivo C per 5min
6. Disidratare, chiarificare e montare
 Reattivi

A = cristalli di ferrocianuro di K
B = tampone acido di attivazione
C = carmallume sec. Mayer
* A + B Vengono mescolati al momento.
 Principio
 Il ferrocianuro di K reagendo in ambiente
acido con gli ioni ferrici dell’emosiderina,
forma un sale colorato: il blu di Prussia. La
reazione, in forma ionica, è la seguente:

4Fe3+ + 3K4Fe(CN)6 + HCL 

Fe4(Fe(CN)6)3 + 12K+ + HCL
 Applicazione
 Il metodo è indicato per il ferro ferrico (ferro
ionico trivalente) reattivo presente nei
tessuti (il ferro legato all’emoglobina, alla
ferritina o ad altri pigmenti non reagisce: per
evidenziare questo ferro “mascherato”
occorre liberarlo dalle strutture che lo
legano. Non reagisce il ferro ferroso
bivalente)
 Biopsia ossea. Colorazione di Perls
Biopsia ossea. Perls negativa

Biopsia ossea. Perls positiva

ALLESTIMENTO DI UNO
STRISCIO DI SANGUE e
CONTA DIFFERENZIALE
MANUALE
ALLESTIMENTO DI UNO STRISCIO DI SANGUE
Corretta esecuzione di uno striscio di sangue
 COLORAZIONE MAY-GRÜNWALD-GIEMSA
Principio del metodo

Il metodo impiega due coloranti in successione:

- la soluzione di May Grunwald (colorante basico), costituita da eosinato di

blu di metilene che colora i nuclei in blu ed il citoplasma basofilo in rosso-
rosa.
-la soluzione di Giemsa (colorente acido), miscela complessa, costituita da
blu di metilene cloruro, blu di metilene eosinato, azzurro II eosinato, che
aumenta l’intensità della colorazione nucleare e la capacità di evidenziare
selettivamente gli elementi cellulari.
I nuclei dei leucociti e i granuli dei granulociti basofili appaiono in blu
(colorazione con coloranti basici), mentre globuli rossi e granuli di
eosinofili in rosso (a causa del colore rosso dell’ eosina). Il citoplasma dei
globuli bianchi è blu chiaro, a causa del basso concentrazione di molecole
di RNA.
 COLORAZIONE MAY-GRÜNWALD-GIEMSA
Protocollo

-Fissare il vetrino immergendo in un recipiente contenente alcool etilico al

95% o metilico per 3-5 minuti.
-Coprire il vetrino con la soluzione di May Grunwald, (Diluita 1:4) in modo
che tutta la superficie del vetrino rimanga coperta: incubazione 5 min.
- Aggiungere acqua dist. nello stesso volume del colorante: 5 min.
-Breve lavaggio in acqua dist.
- Colorazione con Giemsa (Diluita 1:10) per 10 min. E’ opportuno cambiare
la soluzione colorante ogni 2-3 min.
-Lavaggio con acqua dist.
-Lasciare asciugare il vetrino all’aria

Osservare il vetrino
I granulociti, caratterizzati dalla presenza di abbondanti granulazioni
citoplasmatiche, sono detti anche polimorfonucleati, per la forma
plurilobata del nucleo e si suddividono a loro volta in granulociti neutrofili,
eosinofili e basofili in base alle colorazioni assunte dai granuli che
contengono.

Analisi della formula leucocitaria

Le abbondanze relative sono le seguenti:
Granulociti neutrofili = 40-70 %
Granulociti eosinofili = fino al 6 %
Granulociti basofili = fino al 2%
Linfociti = 20-40 %
Monociti = fino all’8% %

L’analisi al microscopio di uno striscio di sangue permette di valutare la

presenza di anomalie patologiche degli elementi figurati del sangue e di
ottenere anche la formula leucocitaria, contando secondo un ordine a zig-
zag almeno 100 leucociti
Granulociti Neutrofili
Hanno un diametro di 12-15 µm. Nucleo formato
da più lobi, uniti l'uno all'altro. I granuli
citoplasmatici sono poco visibili in quanto piccoli e
poco colorabili, perché non sono né decisamente
acidofili né basofili.

Granulociti Eosinofili
Nucleo basofilo ed i granuli acidofili presenti nel
citoplasma: i granuli sono di colore rosa perché
colorati intensamente dall'eosina . La loro
dimensione è la stessa dei neutrofili. Il nucleo è
generalmente bilobato, ma sono stati osservati
anche nuclei con 3 o 4 lobi.

Granulociti basofili
Sono relativamente piccoli: 9-10 µm di diametro. Il
citoplasma è molto ricco di granuli che prendono una
colorazione porpora scuro. Nei basofili, la quantità di
granuli è tale da nascondere il nucleo, generalmente
bi-trilobato, che quindi è difficilmente visibile al
microscopio
Linfociti
Nei linfociti il nucleo sferico, occupa quasi
l'intero volume cellulare, lasciando visibile solo
un sottile anello di citoplasma periferico,
leggermente basofilo colorato in azzurro.
Con 8-10 µm di diametro, sono in generale più
piccoli degli altri leucociti. Il nucleo è rotondo e
grande in rapporto alla cellula e la occupa
quasi interamente. Resta comunque visibile un
po' di citoplasma, in posizione generalmente
laterale.

Monociti
I monociti, di dimensioni maggiori rispetto
agli altri leucociti. I monociti sono i
leucociti più grossi: 16-20 µm. Hanno un
grosso nucleo reniforme o a ferro di
cavallo, in certi casi anche bilobato. Il
citoplasma è trasparente, ma con aspetto
di "vetro smerigliato"
 Dichiarazione di copyright
L'utilizzo dei contenuti della lezione sono riservati alla
fruizione personale degli studenti iscritti ai corsi
dell’Università di Camerino. Sono vietate la diffusione intera o
parziale di video o immagini della lezione, nonché la modifica
dei contenuti senza il consenso, espresso per iscritto, del
titolare o dei titolari dei diritti d'autore e di immagine.
Copyright notice
The contents of this lesson are subject to copyright and intended
only for personal use by students enrolled in courses offered by the
University of Camerino. For this reason, any partial or total
reproduction, adaptation, modification and/or transformation of
the contents of this lesson, by any means, without the prior written
authorization of the copyright owner, is strictly prohibited.