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ISOLAMENTO DEL DNA DA TESSUTI

AcuradiPiergiovanniRossieRossanaBaglioni

Obiettivi: Acquisire conoscenze relative alle propriet fisiche del DNA isolandolo da tessuti viventi. Comprendere le finalit di ciascun passaggio della procedura di isolamento in relazione alle propriet fisiche e biochimichedelmaterialegenetico. Questa esercitazione si propone lobiettivo di fornireuna esperienzadiretta di isolamento e successivaestrazione delDNA,datessutivegetali.Peresempioapartiredallecipolleintere,siottieneunpreparatoabbastanzapurodi DNA,contenentemiliardidigeni.Dopolisolamento,ilDNAsipuconservareinalcooloessiccato. Materiali: Omogeneizzatori Potter, beker e beute di varie capacit, pipette graduate, bacchette di vetro, imbuti, garze,fruttaapolpamorbida,cipollaopomodoro. Soluzioneomogeneizzante:Per2ldisoluzionemescolare100gdisodiolaurilsolfato+17,54gdiNaCI+8,82gdi sodiocitrato+0,584gdiEDTA.Portarea2lconacquadistillata.ConservareaTambienteperevitarechelasoluz. diventiopaca. Procedimento: Fase A : Omogeneizzazione. Affinch si possa estrarre il DNA dai nuclei dei tessuti, si deve prima rompere le pareti cellulari, le membrane plasmatiche e nucleari. Questa operazione pu essere eseguita omogeneizzando i tessuti;ilDNAsiseparerpoidalleproteinecromosomicheutilizzandolasoluzioneomogeneizzante. FaseB:Deproteinizzazione.LeproteinecromosomicheseparatedalDNAsidevonodenaturare,precipitanocon cloroformio per essere poi allontanate dallomogeneizzato. Il cloroformio non si mischia con lomogeneizzato acquoso e perci forma una fase (strato) separata, al di sotto; dellomogeneizzato. Le proteine si raccolgono tra le duefasi,mentreilDNArimanenellomogeneizzato. FaseC:PrecipitazionedelDNA.LomogeneizzatodovrebbeconteneresoloDNA,ilqualeinsolubileinetanolo ghiacciato, perci aggiungendolo alla miscela, restano in soluzione tutte le sostanze tranne il DNA. Se le operazioni sono state effettuate correttamente, la sostanza genetica dovrebbe formare un precipitato spesso, bianco e nastriforme che si pu raggomitolare avvolgendolo su di una bacchetta di vetro. Diversamente il DNA danneggiatosipresentacomeunprecipitatobiancospezzettato. FaseA) 1)Tagliareincubettiilfruttooilvegetale.Pesarne50getrasferirliinunbekerda250ml. 2)Aggiungere100mldisoluz.omogeneizzanteelasciareilpreparatoinbagnomariaa60Cper15minutiesatti. (Questo trattamento termico ammorbidisce i tessuti e consente alla soluz. omogeneizzante di penetrarvi. Inoltre denaturamoltienzimichepotrebberodisturbarelisolamentodelDNA). 3)Raffreddarerapidamentefinoa1520Cimmergendoilbekerinacquaeghiaccio.(Questopassaggioimpedisce ladenaturazionedelDNA). 4)Versareilpreparaloinunomogeneizzatoreeomogeneizzareper45secondilentamente,poialtri30secondipi velocemente.(Questaoperazioneaprelecelluleenefauscireilcontenuto:grassi,proteine,acidinucleici). 5) Travasare tutto in un beker da 1000 ml e mantenere lomogeneizzato immerso in acqua e ghiaccio per 1520 minuti. 6)Filtrarelomogeneizzatoattraverso4stratidigarzainunbekerda500ml.Fareattenzioneanonlasciarpassare laschiuma. (a)AquestopuntodovesitrovailDNA? FaseB) 7)Versare80mldietanoloal95%inunabeutada250mlcheimmergeretecompletamentenelghiaccio.

8) Prendere solo 50 ml dellomogeneizzato filtrato e metterlo in una beuta da 250 ml, con una pipetta da 5 ml aggiungetelentamentelungoleparetidellabeuta,2mldicloroformio. 9)Fateruotaredelicatamenteilcontenutodellabeuta.(Questomovimentofaaumentareilcontattotralostratodi cloroformioelomogeneizzato,manecessariononfarlimescolare). (b) Che cos il materiale bianco che si trova nello strato tra lomogeneizzato e il cloroformio? 10) Versare lomogeneizzato in unaltra beuta da 250 ml lasciando indietro il cloroformio e lo strato di proteine. Sciacquarelabeutaeripetereloperazione(ipassaggidall8al10)altre4volte.Allaquintaripetizionesiseparer laquantitmoltopipiccoladiproteine.Eimportantechenonrimangacloroformionellomogeneizzato,quindi pu essere necessario sacrificare una piccola quantit nellultima operazione. (Se in qualsiasi momento dovesse formarsiunemulsioneseguiteleistruzionidellaschedaperiltrattamentodellemulsione.) 11)Dopoilquintotrattamentoversaredelicatamentelomogeneizzatoinunbekerda250ml. FaseC) 12) Immergere il beker contenente lomogeneizzato deproteinizzato in un bagno di acqua e ghiaccio, finch non abbiaraggiuntoi1015C. 13) Aggiungere lentamente letanolo molto freddo (mantenuto in freezer) facendolo colare lungo la parete del beker,finchnonappaiailprecipitatobiancoefilamentosodelDNA. 14) Raccogliere i fili di DNA con una bacchetta di vetro, che farete ruotare in un solo senso dentro il beker. Continuatelarotazioneemuovetelabacchettainlarghicerchiattraversotuttoilcontenutodelbecker. (c) Perch importante ruotare la bacchetta sempre nello senso? stesso

15) Se volete conservare il DNA preparato, liberatelo delicatamente dallestremit della bacchetta mettendolo in unabottigliettacontapposmerigliocontenenteetanoloal50%. Trattamentodelleemulsioni: Seaveteruotatotroppofortelabeutaformandounemulsione,dovetecentrifugareilpreparato. a) Versate lemulsione in una provetta da centrifuga e centrifugate per 5 minuti, prima lentamente poi aumentandolavelocitgradualmentefinoaraggiungerelavelocitmassima. b) Travasate attentamente lomogeneizzato dalla provetta in una beuta da 250 ml, lasciando sul fondo il cloroformioelostratodiproteine. c) Ripeteteipassaggidall8al10perilnumerodivoltecheancorarestava.

ATTENZIONE: Ilcloroformionocivoperinalazione,ingestione.Lavoraresottocappa. Glialtriprodottiimpiegatinonpresentanoparticolarepericolosit. SMALTIMENTODEIRIFIUTI: Versarenelcontenitorediraccoltaliquidi.