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ESTRAZIONE ACIDI NUCLEICI CON

PARTICOLARE RIFERIMENTO A DNA


ESTRATTO DA TESSUTI FISSATI IN
FORMALINA E INCLUSI IN
PARAFFINA (FFPE)

SALVATORE GIRLANDO

LABORATORIO PATOLOGIA MOLECOLARE


ANATOMIA PATOLOGICA
TRENTO
Estrazione acidi nucleici

• Estrazione DNA primo passo nelle applicazioni di biologia


molecolare

• Metodi si basano sul tipo di acido nucleico che si vuole estrarre


(DNA/RNA)

• Materiale di partenza ad esempio sangue o tessuti o altro materiale

• Risultato desiderato (quantità, purezza)

• Applicazione prevista post-estrazione ad esempio tipo di indagine


molecolare
Estrazione acidi nucleici

• DNA molecola molto lunga soggetta a frammentazioni

• Difficile estrarlo in forma intatta

• Frammenti di 50 – 100 kilobasi (kb) sono ottimi per effettuare tutte le


indagini di biologia molecolare

• Da materiale fissato in formalina e incluso in paraffina (FFPE) il


DNA si presenta molto degradato ed è consigliabile amplificare al
massimo frammenti di 300 bp
Estrazione degli acidi nucleici

• Può essere estratto da qualsiasi tessuto o cellula nucleata

• Da materiale fresco e/o congelato

• Da materiale fissato in formalina e incluso in paraffina

• Altro (sangue, plasma, capelli, frammenti di tessuti, ecc.)


Estrazione degli acidi nucleici
(DNA/RNA) da campioni fissati in
formalina e inclusi in paraffina (FFPE):
fasi

1. Taglio 8-10 fette da biopsie, 2-3 da pezzo operatorio dello


spessore di 10 µm

2. Sparaffinatura/digestione O.N. con tampone di lisi più proteinasi K

3. Purificazione dell’acido nucleico (più metodi)

4. Precipitazione DNA

5. Valutazione quantitativa

6. Conservazione
1. Taglio delle fette di tessuto

• Da pezzo operatorio: 3-4 fette spesse 10 µm in provetta o su vetrino

• Da biopsia: 7-8 fette sempre dello stesso spessore (10µm )

• Altri metodi prevedono lo scraping, direttamente da vetrino, di cellule


o fette di tessuto precedentemente colorate e utilizzati per diagnosi
cito o istologiche
Fase 2. Processo di Sparaffinatura

• Aggiungere 1 ml di xilene e mescolare per


10 minuti

• Centrifugare a 12000 rpm per 5 minuti

• Eliminare il surnatante facendo attenzione


al pellet

• Si ripete una seconda volta il passaggio


2. Processo di sparaffinatura

• Aggiungere 1 ml di Etanolo Assoluto

• Mescolare per 5 min

• Centrifugare a 12000 rpm per 2 min

• Eliminare l’Etanolo assoluto facendo


attenzione a non toccare il pellet

• Fare asciugare i campioni e aggiungere il


tampone di lisi (TRIS-HCl 50 mM ph 8.3) e
proteinasi K (20 mg/ml)
3. Purificazione acidi nucleici

 Metodo fenolo/cloroformio (miscela fenolo:cloroformio:


alcool isoamilico (25:24:1)

 Metodo del salting out (precipitazione delle molecole


proteiche)

 Kits commerciali (molto in uso), maggiore velocità di


estrazione
Purificazione Fenolo/Cloroformio

• Inattivazione della proteinasi K ad alta temperatura

• Purificazione con miscela fenolo: cloroformio: isoamil alcool (25:24:1)

• Separa una componete organica inferiore contenete lipidi, proteine e


estratti cellulari

• Fase acquosa superiore contenente gli acidi nucleici

• Fase intermedia proteine denaturate e in parte dissolte dal fenolo


 Precipitazione DNA
- Aggiunta etanolo assoluto (1 mL) e tampone ad alta forza ionica (50 µL)
(Na acetato 3 M pH 5.2)
- Precipitazione DNA (formazione gomitolo)
- Centrifugazione a velocità alta (12.000 rpm)
- Lavaggio pellet con etanolo 70 %(1 mL) per rimuovere sali in eccesso
- Evaporazione etanolo (potente inibitore enzimatico), per almeno
15 min a provetta aperta
- Il DNA precipitato e asciutto può essere conservato a -20°C.

 Risospensione DNA precipitato


- Il DNA viene risospeso in H2O o nel tampone previsto
dalla metodica.
- Può essere conservato a +4°C per qualche settimana o a
- 80°C per molti anni (evitare i congelamenti e scongelamenti ripetuti
che danneggiano il DNA)
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Estrazione fenolo/cloroformio

• Precipitazione del DNA in etanolo assoluto e in presenza


di Sali ad alte concentrazioni (100 – 500 mM) per
eliminare i residui di Fenolo e cloroformio

• Eliminazione surnatante e successivo lavaggio con


EtOH 70% per eliminare i cationi

• Centrifugazione ed eliminazione dell’ETOH 70%

• Risospendere il pellet con buffer TE o con H2O


Purificazione con metodica salting-out

• Dopo inattivazione della proteinasi K mediante alta


temperatura vengono aggiunte 200µl di ammonio
acetato (sale) 4 M favorendo la precipitazione delle
proteine

• Campioni vengono vortexati e centrifugati ad alta


velocità per 3 min.

• Trasferimento del surnatante in altra provetta e aggiunta


di isopropanolo (600 ul)
Purificazione con metodica salting-out

• Centrifugazione ad alta velocità per 5 min.

• Pellet lavato con ETOH 70% e centrifugazione sempre


ad alta velocità per 1 min

• Eliminazione del surnatante

• DNA sciolto in 50 µl di TE o H2O


Estrazione con kit commerciale (Qiagen)

• QIAmp DNA mini kit

• QIAmp DNA FFPE kit (specifico per tessuti paraffinati)

• Accorciamento dei tempi di estrazione

• Minore resa in termini di concentrazione di DNA (solo se si usa


sistema automatizzato)
Purificazione DNA da tessuti FFPE

• Lasciare asciugare il pellet facendo


attenzione a non seccarlo

• Risospendere in 180 µl di buffer ATL


contenente detergenti più 20 µl di
proteinasi k

• Incubare a 56°C per almeno 3 ore o


fino a che il pellet non sia
completamente digerito

• Procedere con la fase di


purificazione
Purificazione DNA da tessuti FFPE

• Aggiungere 200 µl di buffer AL


contenente agenti caotropici e incubare
per 10 min a 70°C;

• Aggiungere 200 µl di ETOH ass.

• Trasferire il tutto in una colonnina con una


base di silice, centrifugare

• Fare lavaggi con due passaggi con buffer


AW1 e AW2 per lavare il DNA legati alla
membrana

• Eluire con 50 – 200 µl di buffer AE o H2O


MACRODISSEZIONE

Blocchetto paraffina Ematossilina/eosina Fetta in bianco


MICRODISSEZIONE
Biopsia bronchiale Dopo
colorazione EE microdissezione
MICRODISSEZIONE

Agoaspirato Dopo
polmonare citologico microdissezione
BAL > 50
tumor cells
Esperienza di Modena