PROTOCOLLI LABORATORIO II MODULO ANATOMIA

 SPARAFFINATURA:
o Xilolo I 5 min
o Xilolo II 5 min
o Etanolo- Xilolo 1:1 5 min
o Etanolo assoluto I 3 min
o Etanolo assoluto II 3 min
o Etanolo 95° I 3 min
o Etanolo 70° 1 min
o Lavare in acqua di fonte 5 min.
o Lavare in acqua distillata

 COLORAZIONE MEDIANTE EMATOSSILINA-EOSINA

Principio: La colorazione citoplasmatica Eosina, in combinazione con la colorazione nucleare
Ematossilina, è il metodo più utilizzato nella routine istopatologica. Nell'Emallume Mayer la specie
chimica attiva è il complesso formato dall'emateina - forma ossidata dell'ematossilina ad opera del
potassio iodato - con l'alluminio solfato. Tale complesso ha carica positiva ed è quindi in grado di legarsi
ai siti anionici presenti nelle proteine istoniche della cromatina. L’Eosina è un colorante acido che
interagisce con le proteine citoplasmatiche ricche in amminoacidi basici per formare un complesso di
colore rosso-rosa brillante.

 Incubare 5 min in ematossilina

 Lavare 10 min. in acqua di fonte
 Incubare in Eosina per 30”
 Passaggio veloce in acqua distillata
 Differenziazione in Etanolo 95° veloce
 Disidratazione

 COLORAZIONE TRICROMICA SECONDO MASSON

Principio: Il metodo associa una colorazione nucleare ottenuta con ematossilina ferrica di Weigert, una
colorazione delle emazie con acido picrico e una colorazione del connettivo con due differenti coloranti
acidi.
Nuclei: nero
Citoplasma, cheratina, fibre muscolari, granuli acidofili: rosso
Collagene, connettivo, muco: blu
Eritrociti: giallo

 Soluzione A+B (1:1) Ematossilina Ferrica: 8 min

 Sgocciolare i vetrini
 Soluzione C ( soluzione alcolica satura di acido picrico): 4 min
 Lavare rapidamente in acqua distillata
 Soluzione D (fucsina acida): 2 min
 Lavare rapidamente in acqua distillata
 Soluzione E (soluzione di acido fosfomolibdico: 0,81 g/100 ml di H2O ~4,5 mM): 10 min
 Soluzione F (blu di anilina): 2 min
 Lavare rapidamente in acqua distillata
 Disidratazione
 COLORAZIONE TRICROMICA SECONDO GOMORRI
Il metodo associa una colorazione nucleare ottenuta con ematossilina ferrica di Weigert, una
colorazione con cromotropo R, fast green o verde luce, acido fosfotungstico e acido acetico glaciale. Sia
il cromotropo R che il fast green o il verde luce sono coloranti acidi che colorano, in modo più o meno
elettivo, rispettivamente il citoplasma e le fibre collagene grazie all’azione esercitata dall acido
fosfotungstico.

 Incubare 5 min in ematossilina

 Lavare 10 min. in acqua di fonte
 Incubare nella miscela Tricromica (Cromotropo 2R, fast green, acido fosfomolobidico) per 12 min
 Passaggio veloce in acqua distillata
 Lavaggio in H2O acidula (Soluzione al 0,2% di acido acetico)
 Differenziazione in Etanolo 95° veloce
 Disidratazione

 COLORAZIONE DEI MUCOPOLISSACARIDI MEDIANTE ALCIAN BLUE

Principio: I coloranti Alcian fanno parte del gruppo delle cuproftalocianine; si legano ai
polianioni dei mucopolisaccaridi acidi per mezzo di ponti salini.
Nel metodo a pH 2,5 il colorante viene trasformato nel pigmento monastral blue con una
soluzione di sodio tetraborato, questo pigmento è insolubile e si presta quindi ad ulteriori
manipolazioni senza peraltro diffondere nel tessuto (Alcian blu - PAS). I polianioni con i quali
l’Alcian blu reagisce sono, costituiti da radicali solforici e carbossilici (i radicali fosfati degli acidi
nucleici non reagiscono), di conseguenza reagiscono solo le mucine acide.
A pH 2,5 vengono ionizzate e colorate tutte le mucine acide.
A pH 1 vengono ionizzate e colorate le mucine fortemente solforate

 Incubare in soluzione di Alcian-blue pH 2.5: 30 min.

 Incubare in una soluzione allo 0,3% di Na2CO3: 15 min
 Passaggio veloce in acqua distillata
 Differenziazione in Etanolo 95° veloce
 Disidratazione

 COLORAZIONE DEL TESSUTO NERVOSO MEDIANTE SOLUZIONE DI NISSL

Principio: Il metodo di Nissl viene utilizzato tanto a livello citologico per lo studio della
sostanza tigroide che a livello istologico per identificare la topografia dei neuroni. È
indispensabile la fissazione in alcool a 95°. La sostanza tigroide o zolle di Nissl è costituita da
granuli di acido ribonucleico.

 Incubazione nella soluzione di Nissl 0,75%: 8 min

o Cresil Violetto 1,5 g
o Acqua distillata 98 ml
o Acido acetico 1M 1 ml
 Incubazione in etanolo 95°: 1 min ( controllare le sezioni perché perdono il colorante)
 Disidratazione
 COLORAZIONE MEDIANTE WEIGERT VAN GIESON PER FIBRE ELASTICHE E CONNETTIVO
Principio: Il metodo si basa sull’affinità per le fibre elastiche del colorante ottenuto
facendo reagire resorcina e fucsina basica in presenza di ferro percloruro. L’elettività del
metodo non è assoluta, altre strutture quali collagene e membrane basali possono
colorarsi; è quindi importante una accurata differenziazione per ottenere una colorazione
marcata e selettiva delle fibre elastiche. Il contrasto con la colorazione tricromica di Van
Gieson permette di differenziare il collagene dal connettivo visualizzando nel contempo
anche i nuclei.

 Incubare le nel reattivo A ( soluzione di acido periodico): 5 min.

 Lavare in acqua distillata
 Incubare nel reattivo B (Weigert fucsina resorcina): 30 min.
 Lavare in acqua distillata.
 Incubare nel reattivo C (Tampone acido di differenziazione): 2 min.
 Lavare in acqua di fonte: 5 min
 Lavare in acqua distillata.
 Disidratazione

 IMPREGNAZIONE ARGENTICA
Principio: Metodo di elezione per la visualizzazione delle fibre reticolari argirofile del
connettivo
Il metodo consente in tempi molto brevi una impregnazione selettiva e ben marcata.
a) Pretrattamento con ferro trivalente Dopo una ossidazione preliminare con potassio
permanganato si tratta la sezione con ferro trivalente (ferro ammonio solfato) . Gli ioni
ferrici, più reattivi degli ioni argento, si legano in modo rapido e selettivo ai gruppi
funzionali delle strutture argirofile.
b) Trattamento con soluzione ammoniacale. L’argento, presente nella soluzione
ammoniacale in forma di ossido complesso idrosolubile - [Ag (NH3)2]2 O - si sostituisce in
questa forma (di catione complesso) al ferro precedentemente legato ai tessuti. Nel
successivo passaggio l’aldeide formica agendo da riducente sottrae ossigeno al complesso
liberando argento metallico insolubile che resta depositato sulla struttura argirofila
Ag(NH3)2]2 O + HCHO = 2 Ag + 4 NH3 + HCOOH
Il catione diamminoargentico che non ha reagito viene asportato con sodio tiosolfato
(Na2S2O3) che con esso forma un complesso [Ag2S2O3) molto solubile ma non più ossidabile.

 Porre sulla sezione 5 gocce del reattivo A( permanganato di potassio) e 5 gocce del reattivo
B (tampone acido di attivazione): lasciare agire 5 minuti.
 Lavare in acqua distillata.
 Porre sulla sezione 10 gocce del reattivo C ( soluzione di acido ossalico): 3 min.
 Lavaggio in acqua distillata.
 Porre sulla sezione 10 gocce del reattivo D (soluzione di ferro ammonio solfato): 3 min.
 Lavaggio in acqua distillata.
 Porre sulla sezione 10 gocce del reattivo E (soluzione ammoniacale): 3 min.
 Lavaggio in acqua distillata.
 Porre sulla sezione 10 gocce del reattivo F (soluzione di aldeide formica): 5 min.
 Doppio lavaggio in acqua distillata.
  Porre sulla sezione 10 gocce del reattivo G (soluzione di iposolfito do sodio): 5 min.
 Lavare in acqua di fonte: 5 min
 Disidratazione

 COLORAZIONE MEDIANTE ACIDO PERIODICO – REATTIVO DI SCHIFF

La metodica permette la visualizzazione di mucine e mucopolissaccaridi acidi
I polisaccaridi e le glicoproteine, quando ossidati a mezzo dell’acido periodico, danno origine ad
aldeidi. I gruppi aldeidici vengono quindi rivelati istologicamente a mezzo del reattivo di Schiff
(acido bis-N-aminosolfonico). Questo consta di fucsina basica (di colorito rosso) trattata con un
eccesso di acido solforico che la rende del tutto incolore (leucofucsina). Peraltro, quando viene a
trovarsi in presenza di gruppi aldeidici, essa dà luogo ad una intensa reazione rossa o rosso-
violacea (rosso magenta). Quindi, in definitiva, le strutture contenenti polisaccaridi e glicoproteine
assumono tale colorazione.

 Coprire le sezione con la soluzione di acido periodico 1%: 10 min.

 Lavare in acqua di fonte per 10 minuti e quindi acqua distillata.
Incubazione con la soluzione di Schiff per 20 min al buio
 Lavaggi con soluzione di H2S03 (acido solforoso) al 15%: 3 x 2 min.
 Lavare rapidamente (2-3 secondi) in acqua distillata
 Disidratazione

 DISIDRATAZIONE
 Etanolo 95 1 min
 Etanolo assoluto 2 min
 Etanolo- Xilolo 1:1 5 min
 Xilolo I 5 min
 Xilolo II 5 min
 Montaggio dei vetrini