CENTRIFUGAZIONE DIFFERENZIALE

Una miscela di particelle eterogenee e approssimativamente sferiche ma di densità e dimensioni diverse, può
quindi essere separata mediante centrifugazione. Nell’ambito di un lisato cellulare, ad esempio, densità,
dimensione e forma delle varie componenti determinano la velocità di sedimentazione: particelle più grandi e
dense avranno tempi di sedimentazione più brevi.
La centrifugazione differenziale sfrutta la differente velocità di sedimentazione di particelle di diverse dimensioni
e densità. Le diverse componenti vengono separate mediante tappe di centrifugazione successive, aumentando
gradualmente il campo centrifugo applicato (RCF). In questo modo, ad ogni tappa, si ottiene un sedimento
contenente uno specifico tipo di particelle, ed un sopranatante contenente quelle non ancora sedimentate. In questo
modo vengono separate le varie componenti cellulari. Ad esempio: pochi minuti a 1000 g sono sufficienti a far
sedimentare cellule intere, mentre valori di RCF progressivamente più elevati sono necessari per far sedimentare
nuclei, membrane e organelli, vescicole. RCF molto più elevati sono necessari per la sedimentazione di ribosomi e
altri componenti multi molecolari.
La centrifugazione differenziale si basa sulla diversa velocità di sedimentazione di particelle tra loro diverse per
densità e dimensioni; la centrifugazione porterà inizialmente alla sedimentazione delle particelle di maggiori
dimensioni. Se le particelle hanno la stessa massa ma densità diversa, quelle con densità maggiore sedimenteranno
più rapidamente di quelle meno dense.
Nella centrifugazione differenziale, il materiale sul quale viene condotto il frazionamento viene separato in un
certo numero di frazioni mediante successive centrifugazioni, in cui aumenta di volta in volta il campo centrifugo
applicato. Ad ogni passaggio si sceglie il campo centrifugo applicato e il tempo di centrifugazione in modo che
una determinata frazione, centrifugata per un tempo prefissato, dia un sedimento di particelle e un sovranatante,
cioè una soluzione contenente il materiale che non è sedimentato. Qualsiasi particella presente all'inizio
nell'omogeneizzato potrà ritrovarsi nel sedimento o nel sovranatante o in entrambe le frazioni a seconda del tempo
e della velocità di centrifugazione e delle dimensioni e della densità della particella. Alla fine della
centrifugazione, si separa il sedimento dal sovranatante e il sedimento viene lavato più volte, risospendendolo nel
medium di omogeneizzazione e ricentrifugandolo nelle stesse condizioni. Questa procedura minimizza la
contaminazione da particelle non desiderate, migliora la separazione e fornisce una preparazione quasi pura del
materiale presente nel sedimento, ma porta, inevitabilmente, ad una riduzione della resa

CENTRIFUGAZIONE SU GRADIENTE DI DENSITA’

centrifugazione in gradiente di densità sfrutta differenze di dimensioni, forma e densità delle particelle da
separare.
Il gradiente di densità viene preparato a partire da diversi tipi di soluti, caratterizzati da buona solubilità, non
tossicità e purezza; comunemente usati sono:
 Sali di minerali pesanti, come il CsCl
 Piccole molecole organiche come il saccarosio
 Polimeri sintetici come il ficoll
 Silice colloidale come il percoll
La formazione del gradiente di densità all’interno del tubo da centrifuga può avvenire durante la centrifugazione
(gradiente autoformato), o prima (gradiente preformato). In questo caso, il gradiente può essere di tipo continuo,
se la densità del soluto cresce in maniera graduale lungo il tubo da centrifuga, o di tipo discontinuo, se la densità
cresce in modo discontinuo per effetto della stratificazione di soluzioni di densità crescente; due diversi dispositivi
sono utilizzati per la preparazione del gradiente continuo e discontinuo
Il primo passaggio nella centrifugazione zonale o a banda è la formazione di un gradiente di densità in una
provetta mediante il mescolamento in proporzioni diverse di una soluzione a bassa densità (saccarosio al
5%) con una ad alta densità (saccarosio al 20%). Si stratifica il campione da centrifugare sopra la miscela e
durante la centrifugazione le proteine si muoveranno attraverso il gradiente e si separeranno secondo i loro
coefficienti di sedimentazione. La centrifugazione viene fermata prima che la proteina più veloce raggiunga
il fondo della provetta. Si possono raccogliere le bande delle proteine separate facendo un buco sul fondo
della provetta e raccogliendo il gradiente goccia a goccia. Questa tecnica di sedimentazione separa
facilmente proteine che differiscono nel coefficiente di sedimentazione di un fattore di due o più. (Figura
4.2 - Rappresentazione schematica di centrifugazione zonale)

Non esiste un unico materiale per la preparazione di gradienti di densità valido per ogni tipo di separazione
poichè la scelta del materiale più adatto dipende dalla natura delle particelle che devono essere separate. I
materiali usati dovrebbero comunque avere le seguenti caratteristiche:

z elevata idrosolubilità, per consentire la più vasta gamma possibile di gradi di densità delle soluzioni; z
elevata purezza e costo moderato, perchè queste soluzioni possono raggiungere concentrazioni di diverse
moli per litro; z limitata o nulla tossicità nei riguardi di cellule o organuli, perchè l'utilizzabilità delle frazioni
recuperate presuppone che queste non siano state avvelenate dal processo di separazione; z limitata o
nulla assorbanza nell'ultravioletto (specie tra 260 e 365 nm) e assenza di colore nel visibile, per non
interferire con i metodi abituali di saggio per le proteine e/o coenzimi; z elevata solubilità e immunità dagli
attacchi mibrobici, perchè sia possibile conservarne le soluzioni madri per un tempo ragionevole; z minima
viscosità possibile, per ridurre al minimo la resistenza viscosa che si incontra lavorando con soluzioni ad alta
densità; z peso molecolare medio-alto, per minimizzare l'effetto osmotico sulle cellule e sugli organuli
membranosi.

I materiali comunemente usati sono cloruro e solfato di cesio, bromuro e ioduro di sodio, glicerolo,
saccarosio, destrano, etc.

CENTRIFUGAZIONE ZONALE
centrifugazione zonale consiste nella sedimentazione delle particelle in ZONE discrete. E’ usata per la separazione
di particelle di densità simile ma di massa diversa come organelli, subunità ribosomali, ibridi RNA –DNA,
proteine. Trattandosi di un metodo dinamico, la durata della centrifugazione deve essere sufficiente a determinare
la separazione delle componenti, ma inferiore al tempo necessario alla completa sedimentazione al fondo della
provetta.
Come è possibile osservare a questo link, si procede attraverso:
1. Formazione di un gradiente continuo di densità (ad esempio di saccarosio)
2. Stratificazione del campione sul gradiente
3. Raccolta di frazioni per l’analisi
CONCENTRAZIONE ISOPICNICA differenza della centrifugazione zonale, in cui si sfrutta la diversa
velocità con cui le particelle si muovono all’interno di un gradiente, la centrifugazione isopicnica è una
centrifugazione all’equilibrio, che consiste nel portare ogni componente della miscela ad un livello corrispondente
alla propria densità (figura A). Si tratta quindi di una tecnica che separa le particelle di una miscela
esclusivamente in base alla densità, e non in base alla forma ed alle dimensioni. Una volta raggiunto l’equilibrio,
questo non viene alterato dal tempo di centrifugazione.
 il gradiente viene allestito utilizzando una soluzione la cui densità massima deve essere superiore a quella
di tutte le particelle da separare
 il campione viene miscelato alla soluzione
 dopo la centrifugazione, frazioni corrispondenti ai diversi livelli di densità vengono raccolte e analizzate
Questa tecnica è tipicamente utilizzata per la separazione di acidi nucleici in gradienti di CsCl (un tipico tubo da
centrifuga contenente bande di acidi nucleici è riportato in figura B)