Anatomia patologica

L’anatomia patologica è quella branca specialistica della medicina che studia le malattie umane sulla base
dalle caratteristiche morfologiche (macroscopiche degli organi o microscopiche dei tessuti e delle cellule)
eventualmente integrate con l’analisi di specifiche caratteristiche molecolari.

-> DIAGNOSI ANATOMO-PATOLOGICA

➢CAMPI DI AZIONE

• Diagnosi
• Prognosi
• Predittività
• Prevenzione

In: Oncologia-Trapianti-Patologie infettive-Patologie degenerative, malformative, immunitarie,

infiammatorie ecc.

L'anatomia patologica è divisa in sub-specialità:

• Autopsia-> esame esterno ed interno della persona deceduta; esame macroscopico e microscopico
di tutti organi e apparati
• Istopatologia-> esame macroscopico e microscopico di organi e tessuti
• Citopatologia-> esame microscopico di cellule sospese in un liquido in monostrato
• Patologia molecolare-> analisi di molecole presenti nei tessuti o nei fluidi corporei con tecniche di
biologia molecolare.

STRUTTURA DI UN LABORATORIO DI ANATOMIA PATOLOGICA

I laboratori presenti sono:

• Laboratorio di istologia
• Laboratorio di citologia
• Laboratorio di colorazioni speciali
• Laboratorio di immunocitochimica
• Laboratorio di citogenetica
• Laboratorio di biologia molecolare
• Laboratorio di microscopia elettronica

I magazzini contengono:
 • Reagenti -> ubicati in camere fredde o in locali condizionati. Vengono conservati reagenti di uso
comune. Problemi di gestione-> scadenze e rischio incendio
• Infiammabili -> le norme di sicurezza prevedono che se possano detenere piccole quantità, pari al
fabbisogno di pochi giorni di lavoro. I liquidi infiammabili devono essere conservati in appositi
armadi.
• Gas tecnici -> Le bombole con i gas devono essere conservate fuori dal laboratorio in un’apposita
costruzione. Le bombole devono essere saldamente fissate alle pareti
• Modulistica
• Pezzi da smaltire-> riserva non campionata. Il materiale che residua da pezzi operatori dopo aver
prelevato i campioni necessari ai fini diagnostici. Conservazione: - Necessità di integrare con
ulteriori campioni quello già campionato, in caso di insufficienza o di inidoneità per la diagnosi.
− La riserva non campionata è ingombrante e deperibile
− I costi per una conservazione possono risultare elevati
− Necessità di locali adatti
− La conservazione del materiale deve essere garantita fino alla formulazione della diagnosi (utilità
diagnostica o medico legale).
− Obbligo di conservazione di almeno 15 giorni dalla data della validazione del referto diagnostico
− La conservazione deve avvenire in ambienti idonei e con sistemi adatti a garantirne la sicurezza, la
tracciabilità e la conservazione idonea per eventuali ulteriori indagini.
− Conservati in vasi contenenti formalina in armadi dotati di dispositivi di aspirazione, raggruppati per
data di accettazione per facilitarne il recupero
− Auspicale la conservazione del materiale con sistemi sottovuoto (a 4°C)

Negli archivi vengono conservate:

• Diagnosi-> Vi si conservano le copie di tutte le diagnosi con le firme originali o elettroniche del
patologo, registri di accettazione, tabulati di diagnosi, copie di sicurezza degli archivi informatizzati
• Vetrini -> Vengono conservati i vetrini. L’accesso e il prelievo dei vetrini deve essere rigidamente
controllato. Inclusioni/blocchetti-> Vengono conservate le inclusioni in paraffina. Ambiente fresco e
asciutto, per evitare la contaminazione con muffe e l’infestazione da parte di acari e altri parassiti.
L’accesso e il prelievo devono essere rigidamente controllati

--------> Vetrini /Inclusioni/blocchetti = "materiale campionato" Conservazione La conservazione di vetrini,

inclusioni e di materiale congelato solleva un gran numero di problemi etici e giuridici. Bisogna tenere
presente che il materiale è di proprietà del paziente. L’ospedale ne è semplicemente custode, e deve essere
un “custode diligente”. L’obbligo di conservazione del materiale da archivio grava sulla struttura sanitaria e
diviene più oneroso e difficile nel decorso del tempo con l’aumento progressivo del numero dei campioni e
la necessità di trovare nuovi spazi idonei. Possibilità di esternalizzare l’obbligo di conservazione ad aziende
specializzate e certificate che rispettino i requisiti previsti per la conservazione del materiale operando un
servizio di recapito in tempi concordati (costoso) Necessità di porre un termine minimo di durata
dell’obbligo di conservazione. Almeno 10 anni (dalla data della validazione del referto diagnostico). Alla
scadenza non vi è alcun obbligo di distruzione o di smaltimento del materiale. Il termine di 10 anni risulta
idoneo a tutelare il paziente per le esigenze diagnostiche e per esigenze medico-legali. Per i vetrini vi è la
possibilità di archiviazione anche in forma digitale, mediante tecniche che consentano di mantenere
inalterate le caratteristiche del materiale e le esigenze diagnostiche e medico legali.

• Materiale congelato (tissue-bank)-> Vengono conservati campioni di tessuti congelati, in genere

alla temperatura di –80°c. Deve essere predisposto un sistema di allarmi per prevenire lo
scongelamento dei materiali conservati.
• DNA/RNA -> + 4°C DNA - 20°C DNA - 80°C DNA/RNA
 • Data storage-> Server locali e Cloud

FIGURE PROFESSIONALI:

• Coordinatore tecnico
• Tecnici di laboratorio
• Personale amministrativo
• Personale ausiliario
• Medici
• Biologi
• Biotecnologi
• Genetisti
• Bioinformatici

RUOLO DEL TLB:

Riconoscimento e della identificazione della patologia (atto diagnostico) e la funzione preparatoria

finalizzata all’atto diagnostico, che può anche comprendere il riconoscimento della assenza di patologia
nello screening citologico, il campionamento macroscopico di biopsie e pezzi operatori, la collaborazione
attiva con il patologo, che esegue l’autopsia, alla dissezione e al campionamento su cadavere in sala
settoria. L’integrazione delle attività è importante anche nell’espletamento dell’esame estemporaneo
intraoperatorio.

AIPC->

Le strutture di Anatomia Istologia Patologica e Citologia Diagnostica (AIPC) sono strutture specialistiche
riconosciute, con competenza ad effettuare diagnosi isto-citopatologiche su materiale biologico asportato
dai tessuti umani e preparato secondo tecniche specifiche.

Le diagnosi isto-citopatologiche si collocano all’interno dei Percorsi Diagnostico Terapeutici nei quali hanno
la funzione di delineare, condizionare e monitorare i diversi momenti diagnostico-terapeutici, dalla
prevenzione, alla diagnosi di esordio, al follow-up. Le strutture AIPC devono garantire diagnosi isto-
citopatologiche secondo gli standard internazionali e con riferimento alle linee guida approvate dalle
Società Scientifiche accreditate secondo la vigente normativa.

Le strutture AIPC devono soddisfare i requisiti di uniformità ed appropriatezza diagnostica garantendo

controlli di qualità interni e partecipando a programmi di valutazione esterna della qualità (VEQ). È
auspicabile e raccomandato conseguire la certificazione ISO EN 9001:2015 ed eventualmente altre
certificazioni internazionali

Il laboratorio di anatomia patologica deve rispettare:

• Requisiti minimi strutturali-> • Almeno 3 locali/aree ad uso esclusivo per il campionamento, la

processazione e il taglio e la colorazione, tutti dotati di areazione adeguata e di cappe chimiche con
filtri per la formalina e gli alcoli a catena aromatica, e con eliminazione all’esterno dei vapori tossici.
• Aree per la lettura dei preparati • Aree per le attività amministrative • Aree per l’archiviazione sia
dei preparati cito-istologici che delle inclusioni in paraffina […], anche in spazi non attigui. • Area
dedicata per esami estemporanei
• Requisiti minimi organizzativi-> Nelle strutture AIPC deve operare personale prioritariamente
dedicato, comprendente figure professionali con distinte competenze in numero adeguato per la
tipologia ed il volume delle diagnosi emesse. L’organico minimo per una struttura AIPC deve essere
legato al bacino di utenza, alla tipologia della casistica (case-mix) e al carico di lavoro e deve
prevedere: · un Responsabile/Direttore laureato in Medicina con specializzazione in Anatomia
 Patologica o titolo/servizio equipollente; · un secondo Dirigente Medico; · un terzo Dirigente
Medico o un Dirigente Sanitario; · almeno quattro tecnici sanitari di laboratorio biomedico (TSLB).
Le necessità di personale devono essere valutate come Full Time Equivalent (FTE). […] Nella
struttura AIPC deve essere presente un sistema di tracciabilità e rintracciabilità dei campioni
• Volumi di attività-> La diagnostica isto-citopatologica deve essere eseguita in strutture che
garantiscano un adeguato volume diagnostico che permetta un adeguato e costante
aggiornamento delle conoscenze e delle patologie. Per garantire quanto sopra riportato è
necessario che vengano effettuate almeno 6.000 diagnosi/referti/anno per struttura a vari livelli di
complessità. […], deve essere garantito un volume di diagnosi istologiche di almeno 3.000
diagnosi/referti/anno. I suddetti volumi di attività non sono vincolanti per quelle strutture a
vocazione mono- o paucispecialistica
• Ulteriori requisiti minimi per le tecniche di Biologia Molecolare
• Tempi di refertazione
• Referto

ESAME ISTOPATOLOGICO

L’esame istologico è volto alla definizione della patologia dei tessuti a scopo di diagnosi e cura. L’esecuzione
dell’esame istologico impone dei tempi minimi standard per ottenere il prodotto finale (vetrino istologico)
e può essere necessario ricorrere a tecniche di immunoistochimica o di biologia molecolare per giungere
alla diagnosi definitiva o per integrare la stessa al fine di fornire tutti i parametri necessari per la cura della
patologia.

Il materiale sottoposto ad esame istologico è costituito da frammenti di tessuti (biopsie) o da organi o loro
parti asportati attraverso un intervento chirurgico (resezione). Prelievi per esame istologico eseguiti in
corso di riscontro diagnostico (autopsia).

Le biopsie possono essere distinte in:

• Biopsie incisionali nelle quali si asporta una parte della lesione a solo scopo diagnostico
• Biopsie escissionali nelle quali si asporta la totalità di una lesione (ad esempio un tumore cutaneo)
con finalità sia diagnostica che terapeutica.
• Biopsie endoscopiche effettuate su organi cavi (es. bronchi, stomaco, intestino) Criticità
diagnostiche: numerosità, dimensioni (e orientamento)
• Ago-biopsie o core biopsy, effettuate sotto guida strumentale (es. ecografica o radiologica TAC o
RMN) o meno su lesioni a crescita solida o organi solidi (es. fegato, prostata, mammella, tiroide
etc). Criticità diagnostiche: numerosità e le dimensioni dei prelievi. Le resezioni chirurgiche possono
essere distinte in resezioni parziali, totali o allargate a seconda che riguardino una parte o totalità di
un organo o coinvolgano più organi.

ACCETTAZIONE->

• I moderni sistemi di gestione ospedaliera prevedono che il modulo di richiesta dell'esame

istopatologico sia trasmesso per via telematica al reparto di anatomia patologica
• Il materiale può essere inviato
• privo di fissativo → i contenitori saranno posti in frigorifero e il patologo al momento del
campionamento (o prima), provvederà ad esaminare il pezzo, eventualmente a praticare alcuni
tagli e ad aggiungere il fissativo
• Sottovuoto → posti in frigorifero
• In fissativo
Il materiale viene registrato non appena perviene al laboratorio sul registro cartaceo e/o nell’archivio
computerizzato. Devono essere inseriti i seguenti dati:

• i dati anagrafici del paziente

• Il reparto di provenienza
• la tipologia del materiale
• Il numero dei contenitori
• Il materiale è identificato da un numero apposto dal servizio di a.p. secondo le modalità seguite in
quel reparto (storica o su base annuale)
• Questo numero viene stampato su etichette adesive che vengono applicate sul modulo di richiesta
e sui barattoli (non sui coperchi!)
• Il numero di identificazione dovrà seguire tutto l’iter della processazione fino alla scrittura e al
referto finale

Richiesta di esame istopatologico

• Identificazione del paziente (dati anagrafici e codici identificativi)

• Identificazione del richiedente (unità operativa, nome, cognome e firma del richiedente
• Identificazione del materiale (data prelievo, tipologia e sede)
• Numero di contenitori
• Notizie cliniche pertinenti
• Sospetto clinico
• Notifica di rischio biologico

CAMPIONAMENTO

Lo scopo del campionamento è quello di ricavare dal pezzo operatorio alcuni frammenti significativi di
dimensioni tali da poter essere processati.

MATERIALE

Esame Istologico Biopsie → deve essere esaminata al microscopio la totalità del materiale prelevato.

• Le piccole biopsie non necessitano di riduzione, date le loro ridotte dimensioni.

• È comunque necessario verificarne numero e dimensioni, e porle nella istocassetta protette da
apposite spugnette.
• Possono essere annotate a priori le colorazioni/sezioni necessarie

Resezioni chirurgiche → deve essere selezionata "l’area" da esaminare al microscopio mediante

campionamento (c.d. “riduzione dei pezzi operatori”) secondo precisi protocolli e linee guida che
consentano di definire

• la natura e la estensione delle lesioni

• l’adeguatezza della exeresi (e.g. esame dei margini di resezione)
• la stadiazione della malattia (per la patologia oncologica)

Per l'“esame macroscopico” possono essere utilizzati metodi di acquisizione delle immagini che
permettono di documentare in modo più chiaro la morfologia e le caratteristiche del pezzo operatorio e
dove sono stati eseguiti i campionamenti. Tali campionamenti possono variare in numero e tipologia in
dipendenza delle caratteristiche del materiale asportato e dei quesiti clinici connessi

• Il campionamento viene effettuato al “banco pezzi” o “cappa da taglio”.

• Tale ambiente deve essere dotato di:
 − dispositivo di aspirazione
− strumenti per il rilievo di pesi e misure dei pezzi
− strumenti per il taglio dei campioni

Il campionamento di un pezzo chirurgico deve mettere il patologo nella condizione di effettuare una
corretta diagnosi (secondo precisi protocolli e linee guida) E.g. il campionamento di un pezzo chirurgico
neoplastico deve mettere il patologo nella condizione di effettuare una corretta diagnosi e una precisa
stadiazione del tumore asportato.

La stadiazione è di importanza fondamentale per l’impostazione della terapia post-chirurgica. La

stadiazione viene in genere effettuata seguendo le indicazioni del manuale per la stadiazione delle
neoplasie. La necessità di stadiare correttamente un tumore condiziona la modalità con cui viene effettuato
il campionamento. Si confrontano accuratamente i dati riportati sul contenitore con quelli scritti sulla
richiesta quindi si toglie il pezzo dal contenitore. Un certo numero di istocassette è stato predisposto in
precedenza e su ciascuna delle quali viene riportato il numero del caso e l’identificazione del prelievo.

Sull’istocassetta sono riportati:

• l’anno - il numero del caso

• l’identificativo del contenitore/materiale
• Il numero del campione

Il codice identificativo può essere scritto o inciso. Si può anche apporre un codice a barre.

CAMPIONAMENTO DI UN ORGANO CAVO (es. RESEZIONE COLICA PER ADENOCARCINOMA)

Vengono descritti:

• la lunghezza totale del pezzo

• l’orientabilità (o meno)
• il diametro della neoplasia
• l’aspetto della neoplasia
• il livello di infiltrazione macroscopico
• la distanza della neoplasia dai margini
• la presenza di altre alterazioni al di fuori della neoplasia

Dal campione vengono effettuati i seguenti prelievi:

• tre o più campioni a livello della neoplasia, presi a tutto spessore

• uno o più campioni a livello di ciascun margine di resezione
• devono essere prelevati tutti i linfonodi periviscerali

Qualora non si riesca a reperire un adeguato numero di linfonodi, per trovarli più facilmente si può mettere
il pezzo in particolari miscele (carnoy) per diafanizzarlo e rendere più visibili i linfonodi.

Stadiazione di un tumore TNM

il TNM è un sistema di stadiazione che si basa su tre parametri:

• T (tumor): considera le caratteristiche del tumore

• N (nodes): valuta la presenza e la sede di metastasi linfonodali
• M (metastasis): valuta la presenza e la sede di metastasi a distanza

TUMOR organi cavi: livello di infiltrazione della neoplasia

TUMOR organi parenchimatosi: estensione della neoplasia

Decalcificazione

Al momento del campionamento può essere ritenuto necessario sottoporre il pezzo operatorio o alcune
parti di esso ad un trattamento decalcificante. Prima di iniziare il processo di decalcificazione è
indispensabile che il materiale sia adeguatamente fissato.

Le sostanze decalcificanti usate in istologia sono:

• sostanze acide
• resine a scambio ionico
• sostanze chelanti

Gli acidi più usati sono l’acido nitrico al 5-7.5%, l’acido formico concentrato, l’acido tricloroacetico al 5%.
Sono frequentemente usate le miscele decalcificanti.

L’uso di acidi forti può portare ad alterazioni della morfologia.

Le resine a scambio ionico sono usate assai raramente, perché la loro azione è assai lenta

Le sostanze chelanti il calcio danno una ridotta perdita di sostanze organiche. Si usa in genere l’EDTA al 5%
in tampone fosfato a pH 7.4. L’azione è molto lenta. Dovendo processare un tessuto molto duro,
l’alternativa alla decalcificazione è l’inclusione in resina, tecnica che preserva la morfologia ma che presenta
altri inconvenienti.

FISSAZIONE, PROCESSAZIONE E INCLUSIONE

Si intendono le procedure che permettono di ottenere le sezioni di tessuto che possono essere colorate
per la visione al microscopio e di mantenere le caratteristiche istologiche, citologiche e biologiche del
tessuto archiviato a lungo termine (anni).

FISSAZIONE e FISSATIVI

La fissazione é una serie complessa di eventi chimici differenti per le varie sostanze che compongono i
tessuti. Lo scopo della fissazione è quello di bloccare i processi autolitici e di attacco da parte dei batteri.

Argomento in continuo divenire, per una serie di ragioni:

• L’impiego di nuove tecniche su materiale d’archivio (e.g. biologia molecolare).

• La sempre maggiore attenzione nei confronti della salvaguardia della salute degli operatori di
laboratorio.
• I nuovi problemi medico legali legati alla conservazione dei materiali negli archivi.

In anatomia patologica la fissazione viene effettuata a priori, ossia prima delle successive lavorazioni che
portano ad avere il materiale nelle condizioni nelle quali sarà osservato. La tecnica utilizzata per la
conservazione del materiale (la fissazione) deve consentire l’uso più ampio del materiale stesso,
teoricamente anche con le tecniche che saranno messe a punto in futuro.

CLASSIFICAZIONE DEI FISSATIVI

I fissativi si suddividono in:

• fissativi fisici -> • Calore è mezzo di fissazione praticamente mai usato in anatomia patologica,
comune in microbiologia. • Basse temperature non è in genere considerato un mezzo di fissazione
ma metodi alternativi a una vera e propria fissazione (vedi esami istologici estemporanei).
 • fissativi chimici -> Sono quelli maggiormente usati in anatomia patologica. • fissativi per perfusione
• fissativi per immersione • fissativi per esposizione a vapori.

La fissazione per immersione è la tecnica più utilizzata in anatomia patologica.

Ogni fissativo è caratterizzato da una particolare velocità di penetrazione → d = k√t

→ d = profondità di penetrazione
→ k = costante propria della sostanza fissatrice
→ t = tempo la velocità di penetrazione dipende anche da: - Temperatura - Tipo di Tessuto

Differenti fissativi hanno valori di k

* acido acetico 5% k = 1.2

* formaldeide 4% k = 0.78
* etanolo 100% k = 1.0
* glutaraldeide 1.2-4% k = 0.33-0.5

Valori riferiti a temperatura ambiente

La velocità di penetrazione aumenta con il crescere della temperatura.

La temperatura ideale per la fissazione sarebbe quindi quella di 37-40°C a questa temperatura, tuttavia,
aumentano notevolmente i processi trasformativi. La temperatura “ideale” sarebbe quindi quella di 4°C,
alla quale i processi degenerativi sono rallentati e il fissativo mantiene una discreta velocità di
penetrazione.

In pratica, soprattutto per ragioni di comodità, la fissazione avviene usualmente a temperatura ambiente.

La velocità di penetrazione di un fissativo è anche legata alla natura del tessuto da fissare, in particolare alle
dimensioni e alla sua ricchezza d’acqua.

Nella fissazione per immersione è importante il rapporto volumetrico tra fissativo e tessuto che deve essere
pari a circa 10- 20:1. Questo rapporto è importante perché il fissativo tende a diluirsi per la fuoriuscita di
liquidi dal tessuto.

La durata della fissazione di un dato campione va determinata caso per caso.

Il fissativo ideale deve avere un certo PH (7.3 – 7.4) e una certa pressione osmotica (0.5 osm) in modo da
non alterare cellule e tessuti (es. pressioni alte possono portare a un raggrinzimento cellulare, pressioni
inferiori ad un rigonfiamento). L’osmolarità si corregge con l’aggiunta di NaCl, saccarosio o destrano, il PH
utilizzando sistemi tampone.

I tessuti umani sono composti principalmente da Proteine Lipidi Glucidi

Per le proteine si possono usare:

- Fissativi coagulanti / non coagulanti

- Fissativi additivi/ non additivi

Le proteine si trovano nei tessuti sono circondate da molecole d’acqua.

se invece si verifica un’alterazione chimica e fisico-chimica delle proteine si ha la cosiddetta denaturazione

delle proteine → si ha la liberazione di gruppi di aminoacidi → formazione di legami tra le molecole
proteiche (fenomeno della reticolazione) → coagulazione
durante la fase di denaturazione la sostanza fissatrice può stabilire legami con le proteine del tessuto,
ovvero non stabilirne (fissativo additivo/ non additivo).

Le proteine si trovano nei tessuti sono circondate da molecole d’acqua. - se si sottrae alle proteine il
mantello di idratazione (ad es. con la disidratazione) le molecole si raggruppano in fiocchi quindi
precipitano (flocculazione) senza subire alterazioni chimiche.

I lipidi vengono fissati solo se l’agente fissativo ne modifica la struttura chimica. La fissazione avviene
mediante il loro indurimento o con la formazione di sali

I glucidi, particolarmente quelli a basso peso molecolare, sono in pratica ben difficilmente fissabili. In
genere sono legati proteine, e quindi diffondono più o meno facilmente nell’acqua (particolarmente se il
fissativo è in soluzione acquosa)

CLASSIFICAZIONE DEI FISSATIVI (III)

• ALDEIDI (formaldeide, glutaraldeide, acroleina)

• AGENTI OSSIDANTI (tetrossido di osmio, permanganato di potassio, dicromato di potassio)
• SOSTANZE COAGULANTI DENATURANTI LE PROTEINE (alcool metilico, alcool etilico, acido acetico)
• AGENTI FISICI (calore, microonde)
• ALTRE SOSTANZE (cloruro di mercurio, acido picrico)

Le aldeidi formano legami crociati tra le proteine, legando inoltre le proteine solubili a quelle strutturali.
Questa reazione porta evidentemente ad un’alterazione della struttura proteica che può essere di scarsa
importanza per l’istologia di routine, mentre per le lavorazioni più complesse (istochimica,
immunoistochimica, microscopia elettronica) deve essere controllata; Formano legami crociati tra le
proteine, legando inoltre le proteine solubili a quelle strutturali. Tutte le aldeidi presentano problemi di
tossicità per gli operatori, e da tempo si cerca un’alternativa al loro impiego come fissativi.

Fanno parte delle aldeidi:

• La formaldeide pura è un gas che si ottiene per ossidazione controllata del metanolo su
catalizzatori metallici. È incolore, irritante, di odore penetrante, solubile in acqua. Viene
commercializzata sotto forma di soluzione acquosa al 40%, chiamata formalina o formolo.
• La formalina sulle proteine si comporta come fissativo non coagulante additivo legando tra loro le
molecole proteiche (ossia mediante reticolazione) creando ponti metilenici. Non ha alcun effetto
sui lipidi. I fosfolipidi tendono a gonfiarsi e possono anche disperdersi in acqua I glucidi vengono
disciolti in formalina, in quanto soluzione acquosa. è il fissativo maggiormente utilizzato; è un
fissativo per immersione ha un potere di penetrazione pari a circa 0.8 mm/h. La soluzione
commercializzata viene ulteriormente diluita in acqua (1 parte di formalina e 9 volumi d’acqua)
→La soluzione usata è al 4%. Pregi: basso costo-maneggevolezza-rapidità di azione. Difetti scioglie il
glicogeno-scioglie l’acido urico-può dar luogo a precipitati-è tossica.
• ALCOOL ETILICO è un liquido limpido, incolore, volatile. in a.p. si usa a 70°, a 96° o anche assoluto. -
sulle proteine agisce come fissativo coagulante non additivo ed esplica la sua azione mediante la
sottrazione del mantello di idratazione. l’alcool è un solvente dei lipidi, che estrae più o meno
completamente dal tessuto. non fissa i glucidi. ha un buon potere di penetrazione difetti ma estrae
i lipidi - coarta i tessuti - altera gli organuli subcellulari - è altamente infiammabile
• ALDEIDE GLUTARICA (GLUTARALDEIDE) - è un liquido oleoso che si trova in commercio sotto forma
di liquido in soluzione al 25-50% - è un fissativo non coagulante additivo - ha un basso potere di
penetrazione. - si deve conservare al buio a 4°c - si usa in concentrazioni tra il 2 e il 6% - ha un costo
elevato.

MISCELE FISSATRICI:
 • LIQUIDO DI CARNOY alcool + cloroformio + [Link]
• LIQUIDO DI CLARKEM alcool + ac. acetico
• FORMALINA DI LILLIE alcool + formolo
• LIQUIDO DI BOUIN ac. picrico + formolo + ac. acetico
• LIQUIDO DI ZENKER
• LIQUIDO DI HEIDENHAIN

PROCESSAZIONE E INCLUSIONE

• Il tessuto fissato, per essere osservato al microscopio, deve essere sezionato in fettine tanto sottili
(2-5 um) da consentire il passaggio della luce.
• Per poter preparare sezioni sottili il tessuto deve essere duro e compatto e deve essere quindi
incluso in un mezzo semisolido → INCLUSIONE
• Per procedere all’inclusione si fa in modo che il tessuto stesso venga prima impregnato con
l’identica sostanza che poi sarà usata per l’inclusione → PROCESSAZIONE
• La modalità standard di inclusione praticata nei laboratori di istologia è l'inclusione in paraffina-> •
è ricavata dai residui della distillazione del petrolio. • ha una consistenza plastica che varia in
rapporto al suo punto di fusione. • in commercio paraffine “dure” e paraffine “molli” - paraffine
molli (punto di fusione 45-54°c) - paraffine dure (punto di fusione 58-60°c) • data la sua inattività
chimica, i tessuti inclusi in paraffina si conservano per un tempo virtualmente illimitato, purché
tenuti lontano da fonti di calore, in ambiente asciutto. • è insolubile in acqua • solubile in etere,
cloroformio, xilolo toluolo Per far penetrare la paraffina nel tessuto è necessario prima allontanare
da esso l’acqua (disidratazione) e sostituirla con un solvente della paraffina

PROCESSAZIONE-> Per far penetrare la paraffina nel tessuto è necessario prima allontanare da esso l’acqua
(disidratazione) e sostituirla con un solvente della paraffina

1. Disidratazione= viene effettuata immergendo i tessuti in alcool etilico a concentrazioni crescenti (scala
ascendente degli alcooli) per sottrarre l’acqua dal tessuto con gradualità e evitare la coartazione del
tessuto. • I tempi variano in rapporto allo spessore e al contenuto in acqua del frammento stesso.

2. Diafanizzazione/Passaggio degli intermedi = una volta ottenuto l’allontanamento dell’acqua dal tessuto,
è necessario sostituire l’alcool con un solvente della paraffina (intermedi) cloroformio benzolo toluolo
Xilolo o alterantive meno tossiche.

• tutti questi passaggi vengono effettuati automaticamente dai processatori-> • processatore a vasche
multiple • processatore a vasca singola

i tempi e le modalità di processazione dei campioni sono molto variabili a seconda delle caratteristiche dei
materiali e anche sulla base di esperienze ed usi dei diversi laboratori.

i cicli di lavorazione devono sempre terminare in presenza del personale, che deve rimuovere i campioni
dalla paraffina calda (la programmazione viene in genere fatta impostando il giorno e l’ora della fine della
lavorazione)

PROCESSATORI "rapidi" -> a microonde che consentono di velocizzare notevolmente la tempistica

dell’inclusione di tessuti in paraffina

Il tessuto fissato, per essere osservato al microscopio, deve essere sezionato in fettine tanto sottili (2-5 um)
da consentire il passaggio della luce.

Per poter preparare sezioni sottili il tessuto deve assumere sufficiente durezza e compattezza e deve essere
quindi incluso in un mezzo semisolido → INCLUSIONE
Per procedere all’inclusione si fa in modo che il tessuto stesso venga prima impregnato con l’identica
sostanza che poi sarà usata per l’inclusione → PROCESSAZIONE

1. apertura delle istocassette

2. prelievo dei campioni

3. sul fondo della formella viene deposto un sottile strato di paraffina (pochi mm)

4. il campione viene inserito nella formella (orientandolo)

5. chiusura della formella con una parte dell’istocassetta (con il numero istologico)

6. riempimento con paraffina liquida prelevata dalla centralina di inclusione

7. inclusione manuale o con inclusore automatico

TECNICHE DI INCLUSIONE

• CELLOIDINA -> sostanza ottenuta per l’azione dell’acido nitrico diluito sulla cellulosa. La celloidina si
usa per includere pezzi di grandi dimensioni e consente l’inclusione a temperatura ambiente. la
celloidina deve essere sciolta in una miscela di alcool ed etere in parti uguali → soluzione 8%
(CELLOIDINA III) → 4% (CELLOIDINA II) → 2% (CELLOIDINA I). l’inclusione si effettua sui campioni
disidratati
• CELLOIDINA – PARAFFINA
• GELATINA
• CARBOWAX
• RESINA le resine per l’inclusione di campioni istologici sono simili a quelle usate in microscopia
elettronica. componenti: la resina base (monomero di glicolmetacrilato) l’attivatore
(benzoilperossido) l’induritore (derivato dell’acido barbiturico). prima dell’inclusione i frammenti
devono essere disidratati in alcool etilico (70°-96°). l’imbibizione dei frammenti viene effettuata
mediante immersione in una soluzione infiltrante composta da 50 ml di resina base + 0.5 g di
attivatore. i frammenti sono posti in una miscela formata da una parte di soluzione infiltrante e una
di alcool 96° per due ore; quindi, in soluzione infiltrante pura per 12 ore fino a quando i frammenti
si adagiano sul fondo. la preparazione dei blocchetti avviene riempiendo apposite formelle di
plastica con una miscela composta da 15 ml di soluzione infiltrante e 1 ml di induritore. la
polimerizzazione della resina avviene in 40-120 minuti. si possono ottenere sezioni di minor
 spessore (semifini). si possono tagliare campioni duri senza decalcificazione. richiede l’allestimento
di una “seconda linea”. può rendere problematico allestire colorazioni speciali e icc.

TAGLIO

MICROTOMI:

• MICROTOMI A SLITTA -> a lama mobile e pezzo fisso - a lama fissa e pezzo mobile
• MICROTOMI ROTATIVI-> completamente motorizzati. sono microtomi con lama fissa e pezzo
mobile; il pezzo viene avvicinato alla lama con un dispositivo a manovella, che può anche essere
motorizzato. sono i microtomi attualmente più diffusi. è possibile ottenere sezioni seriate su nastro
continuo

RACCOLTA DELLE SEZIONI

una volta tagliate, le sezioni in genere restano adese alla lama, si provvede a staccarle aiutandosi con un
pennellino, e si pongono a galleggiare in una vasca con acqua tiepida (circa 40°c). all’acqua vengono spesso
aggiunte sostanze tensioattive e adesive in modo che le sezioni si distendano immediatamente (per effetto
della tensione superficiale e della dilatazione dovuta al calore).

i vetrini con le sezioni vengono a questo punto fatti asciugare in stufa a bassa temperatura, per poi essere
avviati alla colorazione.

IL CRIOSTATO

• il criostato consente la sezione di tessuti non inclusi, in quanto il congelamento rapido dell’acqua
rende il frammento abbastanza duro da essere tagliato in sezioni discretamente sottili
• le sezioni possono contenere artefatti dovuti alla formazione di cristalli di ghiaccio nella sezione
• i frammenti da tagliare, prima di essere congelati, vengono “inclusi” in un apposito gel
• la superficie libera dei pezzi viene raffreddata con l’impiego di gas criogenici.

Il taglio al criostato si usa quando si ha:

• necessità di disporre di un preparato in tempi molto brevi

• necessità di studiare tessuti che sarebbero alterati dalla fissazione o dall’inclusione

Esame estemporaneo/intraoperatorio

➢ esame istologico eseguito immediatamente dopo l’arrivo del pezzo operatorio, mentre l’intervento
chirurgico è in atto, in modo da consentire una diagnosi provvisoria utile al chirurgo per decidere il
prosieguo dell’intervento

COLORAZIONE

• Colorazioni istochimiche
• Immunoistochimica
• Tecniche di patologia molecolare

Prima di colorare bisogna effettuare sparaffinatura e reidratazione.

SPARAFFINATURA= Rimuovere la paraffina. La paraffina non è miscibile con i solventi di quasi tutte le
soluzioni coloranti (acqua, alcool). La sparaffinatura viene effettuata mediante l’immersione in xilolo per 2-
5 minuti
REIDRATAZIONE= le sezioni sparaffinate vanno reidratate (portate all’acqua).La maggior parte dei coloranti
per istologia sono soluzioni acquose. La reidratazione si effettua con una scala discendente degli alcooli,
con vari tempi e modalità (es. 1 minuto in alcool 100, 90, 70, quindi acqua distillata e acqua di fonte)

Dopo di che viene fatta la colorazione con diverse tecniche.

Dopo la colorazione vi è la disidratazione, la diafanizzazione e il montaggio.

Disidratazione=dopo la colorazione il vetrino deve essere avviato al montaggio. La prima fase di questa
operazione consiste in una disidratazione che viene effettuata con passaggi rapidi in una scala ascendente
(alcool 95 e 100). Questo passaggio è necessario in quanto i montanti non sono idrosolubili

Diafanizzazione in xilolo per 1’(campione reso trasparente per far si che possa passare la radiazione
luminosa)

MONTAGGIO

consiste nel ricoprire le sezioni con un vetrino copri oggetto (o con un nastro di materiale plastico). si
interpone un montante (balsamo/resina montante) per incollare il copri oggetto e precludere il contatto
con l’aria

Coloratori automatici si usano per eseguire le colorazioni di routine.

Un meccanismo provoca l’avanzamento dei cestelli da una vaschetta alla successiva ad intervalli fissi di
tempo.

Dopo la colorazione il vetrino deve essere avviato al MONTAGGIO->

• La prima fase di questa operazione consiste in una disidratazione che viene effettuata con passaggi
rapidi in una scala ascendente (alcool 95 e 100).Questo passaggio è necessario in quanto i montanti
non sono idrosolubili
• Quando si vogliano colorare componenti solubili in alcool o si usano coloranti in soluzione alcoolica
non si può procedere a disidratazione. Si sostituisce il montante con la glicerina o con altro
montante [Link] fissa il copri oggetto con la tecnica della lutazione.

TECNICHE DI COLORAZIONE IN ISTOLOGIA

le sezioni istologiche hanno un contrasto dell’immagine assente o troppo scarso allora il contrasto viene
rafforzato utilizzando le caratteristiche chimico fisiche delle diverse componenti tissutali. Tali
caratteristiche consentono di assumere o meno determinate sostanze coloranti, ovvero di assumerle in
maggiore o minore quantità in relazione alle strutture che le compongono. Le sostanze colorate sono quelle
che, illuminate con luce bianca, assorbono parte dello spettro luminoso visibile. La colorazione che ne
deriva è quella data dalla parte dello spettro luminoso non assorbita.

Le Sostanze Coloranti

➢ Classificazione I

• COLORANTI ACIDI → sostanze anioniche, cariche negativamente che formano sali con le basi con
cui vengono a contatto
• COLORANTI BASICI → con carica positiva
• COLORANTI NEUTRI → unione di un colorante acido con uno basico

➢ Classificazione II

• COLORANTI ANIMALI → esempio il carminio ricavato dalla cocciniglia

• COLORANTI VEGETALI → esempio l’ematossilina derivata dal legno di una pianta sub tropicale
• COLORANTI ARTIFICIALI → esempio l’eosina

nelle sostanze coloranti è sempre presente un gruppo cromoforo. L’unione di un gruppo cromoforo con un
gruppo aromatico porta alla formazione di un gruppo cromogeno

➢ la colorazione può avvenire per:

• reazione chimica tra colorante e substrato

• meccanismo fisico per gradiente di solubilità (es. sudan)
• diffusione ed imbibizione (es. colorazioni per il connettivo)
• impregnazione (es. colorazioni all’argento)
• complesso meccanismo chimico-fisico

Colorazione - Fasi

1. sostanze mordenti (o mordenzanti) che predispongono il substrato al contatto con il colorante

2. contatto tra colorante e substrato

3. fase della differenziazione: rimozione del colorante in eccesso

Strumenti

• Coloratori automatici (colorazioni di routine)

• Colorazioni eseguite manualmente – scale di colorazione (colorazioni "speciali")

➢ EMATOSSILINA e EOSINA (H&E) -> Colorazione standard in istologia.

EMATOSSILINA-> l’ematossilina è un colorante vegetale che si estrae da una pianta originaria della regione
messicana del campeche, ora coltivata nelle indie occidentali, l’hematoxylon campechianum. È estratta
dalla corteccia con acqua calda e fatta precipitare con l’aggiunta di urea. proprietà coloranti non è
l’ematossilina, bensì un suo prodotto di ossidazione, l’emateina. l’emateina (proprietà coloranti) prodotto
di ossidazione, dell’ematossilina:

• ossidazione con ioduro di sodio (ematossilina di mayer)

• ossidazione con ossido di mercurio (ematossilina di harris)
L’emateina avrebbe un effetto assai scarso se non ci fossero nella soluzione le sostanze ad effetto
mordenzante.

le soluzioni commerciali vengono classificate in base alla natura della sostanza mordenzante che le
differenzia anche per le caratteristiche di impiego

→ ematossiline all’allume (es. ematossilina di mayer, ematossilina di harris)

→ ematossiline ferriche
→ ematossiline al tungsteno
→ ematossiline al piombo
→ ematossiline al molibdeno
→ ematossiline senza mordente

EOSINA -> le eosine sono coloranti xantenici

→ eosina y (la più comunemente utilizzata, eosina giallastra, "idrosolubile")

→ eosina etilica (eosina s, alcool solubile)
→ eosina b (eosina bluastra, eritrosina)

➢ EMATOSSILINA e EOSINA (H&E) – (sec. Bancroft, modif.)

1. sparaffinare e portare all’acqua

2. colorare con ematossilina all’allume per un tempo variabile a seconda del tipo
3. Differenziare
4. colorare in eosina
5. differenziare
6. disidratare, diafanizzare, montare

Colorazioni "speciali"

➢ COLORAZIONI PER IL CONNETTIVO

• i tessuti connettivi sono formati da una parte cellulare immersa in una componente non cellulata
• la sostanza intercellulare è a sua volta costituita da una parte amorfa (mucopolisaccaridi solfati e
non solfati) e da elementi formati (fibre reticolari ed elastiche)
• fibre collagene → si possono ritrovare isolate (nel tessuto lasso areolare) o aggregate in fasci più o
meno corposi, come nei tendini ve ne sono quattro tipi principali e diversi tipi minori
• fibre reticolari → sono fibre fini e delicate e formano una trama che sostiene la struttura di molti
organi
• fibre elastiche → sono distribuite ovunque, ma principalmente a livello dei vasi, dell’apparato
respiratorio, dei tegumenti. Sono formate da una componente amorfa, una parte proteica
(elastina) e una parte microfibrillare

COLORAZIONE FBRE COLLAGENE:

1. TRICROMICA DI VAN GIESON (VAN GIESON, 1899) -> Nuclei: viola scuro -Fibre collagene: rosso -
Fibre muscolari: giallo
• sezioni all’acqua ematossilina ferrica di weigert
• differenziazione in acqua di fonte e poi in acqua distillata
• miscela di van gieson (ac. picrico + fucsina acida)
• lavaggio rapido in acqua
• disidratazione, diafanizzazione, montaggio
AZAN MALLORY (MALLORY, 1938) -> nuclei: rosse fibre collagene: azzurro brillante fibre reticolari: azzurro
tenue fibre muscolari ed emazie: rosso-arancio

• sezioni all’acqua
• azocarminio a 56°c per 10 min.
• lavare in acqua
• differenziare in anilina alcoolica 1% e quando i nuclei sono colorati in rosso arrestare la
differenziazione con una miscela alcool-acido acetico
• in acido fosfotungstico per 3-6 ore (per mordenzare il connettivo)
• lavaggio in acqua
• in miscela di azan (blu di metilene+orange g)
• lavaggio in acqua
• disidratazione, diafanizzazione, montaggio

MASSON – GOLDNER (MASSON, 1929 – GOLDNER 1938)

• sezioni all’acqua
• ematossilina ferrica di weigert per 5 min.
• lavare in acqua
• in miscela di masson (ponceau di xilidina – fucsina acida – acido acetico glaciale) 10 min.
• lavare in soluzione acquosa 1% di acido acetico
• in soluzione di acido fosfomolibdico – orange g: l’acido fosfomolibdico provoca la decolorazione del
collagene (controllare!)
• lavare in soluzione acquosa 1% di acido acetico
• in soluzione di verde luce o fast green (5 min.)
• lavare in soluzione acquosa 1% di acido acetico
• disidratazione, diafanizzazione, montaggio

nuclei: blu-nero fibre collagene: verde fibre muscolari e citoplasmi: rosso vivo emazie: giallo arancio

COLORAZIONE PER LE FIBRE ELASTICHE

COLORAZIONE DI WEIGERT (WEIGERT, 1898)

• sparaffinare le sezioni e portarle all’alcool 96

• per 15-30 min. nella soluzione di weigert (fucsina-resorcina-cloruro ferrico)
• lavare in acqua
• controcolorare (eosina, van gieson, tricromica)
• disidratazione-diafanizzazione-montaggio

fibre elastiche: nero altre strutture: a seconda della controcolorazione

COLORAZIONE PER LE FIBRE RETICOLARI

COLORAZIONE DI GOMORI (GOMORI, 1937)

• sezioni all’acqua
• permanganato di potassio 1% per 5 min.
• metabisolfito di potassio 2% per 1 min.
• lavare in acqua per 10 min.
• allume ferrico 2% per 2 min.
• lavare in acqua distillata (più cambi)
• soluzione di gomori (nitrato d’argento e idrossido di potassio) per 1 min.
 • formalina 10% per 5 min.
• eventuale controcolorazione
• disidratazione, diafanizzazione, montaggio si può anche differenziare in cloruro d’oro

fibre reticolari: nero fibre collagene: bruno-violetto nuclei: nero

COLORAZIONI PER I CARBOIDRATI

• GLICOGENO
• MUCINE

il glicogeno è un polisaccaride semplice formato da una serie di molecole di d-glucosio. in condizioni

normali il glicogeno è intra-citoplasmatico e si trova nel fegato, nei muscoli scheletrici nel miocardio, in
varie mucose, nei neutrofili, nei megacariociti.

Le sono chiamate anche mucopolisaccaridi glicosaminoglicani, mucosostanze e, più recentemente,

glicoconiugati.

Mucine intensamente solforate del tess. connettivo (proteoglicani) reagiscono a basso PH e sono in genere
pas-negative.

Mucine intensamente solforate del tess. epiteliale che si trovano nell’epitelio intestinale e sono pas-
positive.

Le mucine debolmente solforate del tessuto epiteliale sono ampiamente diffuse, particolarmente nel colon

Mucine carbossilate sono le c.d. sialomucine

Acido ialuronico spesso prodotto da fibroblasti. si trova nel liquido sinoviale

COLORAZIONI PER IL GLICOGENO

COLORAZIONE PAS (HOTCHKISS-McMANUS, 1948)

• sparaffinare e portare all’acqua distillata

• in acido periodico per 5 min.
• lavare con diversi cambi di acqua distill.
• coprire con soluzione di schiff (15 min.)
• lavare in acqua corrente per 5-10 min.
• colorare i nuclei con ematossilina di harris, differenziando in alcool-acido
• lavare in acqua
• sciacquare in alcool assoluto
• diafanizzazione e montaggio
• il reattivo di schiff è commercializzato come soluzione di fucsina basica e metabisolfito di potassi

il glicogeno si colora in rosso magenta. Si è certi che si tratta di glicogeno se le sezioni trattate con la
diastasi o la ptialina sono [Link] trattamento con la diastasi si effettua ponendo le sezioni per un’ora in
soluzione di diastasi a 37°c

COLORAZIONI PER MUCOPOLISACCARIDI ACIDI

• I mucopolisaccaridi acidi sono costituiti da una proteina cui sono legate numerose e lunghe catene
eteropolisaccaridiche
• Costituiscono gran parte del metaplasma amorfo dei connettivi e delle secrezioni delle cellule
mucipare
 • Il fissativo ideale per queste sostanze è la formalina calcica
• Sono in genere PAS-negativi

Le colorazioni oggi in uso per i mucopolisaccaridi acidi sono basate sulla presenza delle numerose valenze
acide contenute in tali sostanze. Tali gruppi sono rappresentati da:

• gruppi carbossilici (-COOH) delle proteine

• gruppi fosforici (=HPO3) degli acidi nucleici
• gruppi solforici (-HSO4) presenti nei mucopolisaccaridi acidi solforati

I coloranti basici si legano a tali gruppi solo se questi sono dissociati: esempio COOH COO- e H+.

Il loro stato di dissociazione dipende dal pH del mezzo in cui sono posti:

• pH 4 tutti i gruppi acidi sono dissociati

• pH 2 si presentano dissociati solo i gruppi fosforici e solforici
• pH inferiore a 1.8 solo quelli solforici

COLORAZIONI PER MUCOPOLISACCARIDI ACIDI

METODO ALCIAN BLU pH 2.5

• Sparaffinare e portare all’acqua

• Colorare per 10’-1h con una soluzione 1% di Alcian blu 8 GX in acido acetico 3% (pH 2.5)
• Lavare in acqua corrente per 5’
• Eventuale colorazione nucleare di contrasto (rosso neutro 1%)
• Disidratare, diafanizzare, montare

I mucopolisaccaridi acidi appaiono in blu-verde

METODO ALCIAN BLU pH 1

• Sparaffinare e portare all’acqua

• Colorare per 30’ in una soluzione 1% di Alcian blu 8 GX in HCl 0.1N (pH 1)
• Disidratare, diafanizzare, montare

I mucopolisaccaridi acidi solforati si colorano in blu-verde

METODO ALCIAN-PAS

• Sparaffinare e portare all’acqua

• Colorare per 10’-1h con una soluzione 1% di Alcian blu 8 GX in acido acetico 3% (pH 2.5)
• Lavare in acqua corrente per 5’
• In soluzione di acido periodico per 5’
• Lavare in acqua corrente per 5’
• Reagente di Schiff per 15’
• Lavare in acqua corrente per 5’
• Ematossilina di Mayer (1 minuto)
• Disidratare, diafanizzare, montare

COLORAZIONI PER I LIPIDI

Il termine “lipidi” comprende:

• GRASSI VERI: esteri di acidi grassi e glicerolo

 • LIPIDI: fosfolipidi, cerebrosidi e cere
• STEROLI: colesterolo ed ergosterolo
• TERPENI: squalene e carotene

I lipidi possono essere suddivisi in:

• LIPIDI NON POLARI

- Lipidi non coniugati (acidi grassi, colesterolo)

- Esteri (esteri del colesterolo, mono-, di- e trigliceridi, cere)

• LIPIDI POLARI

- Fosfolipidi con glicerolo (lecitine, cefaline ecc.)

-Fosfolipidi con sfingosina (sfingomieline)

- Glicolipidi (cerebrosidi, sulfatidi, gangliosidi)

• sezioni al criostato
• porre le sezioni in alcool isopropilico 60° per 1’
• porre le sezioni per 16’ in soluzione 0.5% di oil red o in alcool isopropilico 98°
• differenziare in alcool isopropilico 60° per circa 30”
• lavare in acqua
• Evidenziare colorazione nucleare con ematossilina
• montare in glicerina e lutare

METODO AL SUDAN NERO B

• fissare in formalina calcica

• sezioni al microtomo
• sezioni in alcool etilico 55° 1’
• colorare in soluzione di sudan nero b in alcool etilico 55° per 30’
• differenziare in alcool etilico 55° per 30”
• lavare in acqua
• montare in glicerina e lutare

COLORAZIONI PER PIGMENTI E MINERALI

• Pigmenti endogeni: derivati dal sangue, non derivati dal sangue, minerali endogeni
• Pigmentazioni artefattuali
• Pigmenti e minerali esogeni

Negli endogeni derivati dal sangue abbiamo:

• Emosiderina
• Emoglobina
• Pigmenti biliari
• Porfirine

COLORAZIONI PER PIGMENTI ENDOGENI EMATOGENI

METODO DI PERLS PER IL FERRO FERRICO (1867)

• Evitare fissativi acidi

 • Funziona anche in resina
• Portare le sezioni all’acqua
• In soluzione di ferrocianuro di K per 10-30 minuti (preparata fresca)
• Lavare in acqua distillata
• Leggera controcolorazione dei nuclei con rosso neutro o nuclear fast red
• Lavare rapidamente in acqua distillata
• Disidratare, diafanizzare, montare
• Il ferro reagisce con il ferrocianuro e forma ferrocianuro ferrico (blu di prussia)

Il ferro si colora in blu

Negli endogeni non derivati dal sangue abbiamo le melanine sono un gruppo di pigmenti i cui colori variano
dal bruno chiaro al nero. Normalmente presenti nella cute, nell’occhio, nella substantia nigra del cervello e
nei follicoli piliferi. In condizioni patologiche le si trovano nei nevi e nei melanomi maligni - le melanine
derivano dalla tirosina per azione di una tirosinasi

METODO MASSON-FONTANA PER LA MELANINA (Fontana 1912, Masson 1914)

• Portare le sezioni all’acqua

• Porre le sezioni in soluzione di argento ammoniacale in una velasca ricoperta da un foglio di
alluminio per 30-40’ a 56°C
• Lavare in più cambi di acqua distillata
• In soluzione acquosa al 5% di tiosolfato di sodio per 1’
• Sciacquare in acqua corrente per 2-3’
• Leggera controcolorazione nucleare con fast red per 5’
• Sciacquare in acqua distillata
• Disidratare, diafanizzare, montare

Melanina in nero - Nuclei in rosso

COLORAZIONI PER GLI ACIDI NUCLEICI

Le nucleoproteine sono combinazioni di proteine basiche (protamine e istoni) e acidi nucleici. I due acidi
nucleici sono il DNA, contenuto in massima parte nel nucleo delle cellule e l’RNA, contenuto nei citoplasmi,
in particolare nei ribosomi.

REAZIONE DI FEULGEN PER IL DNA (Feulgen e Rossenbeck, 1924)

• Portare le sezioni all’acqua

• Sciacquarle in HCl 1M a temperatura ambiente
• Porre le sezioni in HCl 1M a 60° - [Questo passaggio serve a provocare l’idrolisi del legame purine-
desossiri-bosio. Il tempo dipende dal fissativo usato: con la formalina 8’]
• Sciacquare in HCl 1M per 1’ a temperatura ambiente
• Porre le sezioni nel reagente di Schiff per 45’
• Sciacquare in bisolfito 2’ per 3 volte
• Sciacquare in acqua distillata
• Controcolorare in verde luce per 2’ (facoltativo)
• Lavare in acqua
• Disidratare, diafanizzare, montare

DNA rosso porpora; citoplasmi verdi (se controcolorati)

COLORAZIONI PER BATTERI E MICETI

COLORAZIONE DI ZIEHL-NEELSEN PER BACILLI ALCOOL-ACIDO RESISTENTI

• Sezioni all’acqua. Se il materiale è fissato in formalina trattare con soluzione acquosa ammoniacale
allo 0.5% per 2’. Sciacquare in acqua
• Sezioni per 2 ore a 37°C in soluzione di fucsina basica in alcool etilico assoluto + soluzione acquosa
di fenolo al 5%
• Lavare in acqua
• Differenziare con soluzione di HCl 3% in alcool 70°
• Lavare in acqua
• Colorare con soluzione acquosa di blu di metilene 1%
• Lavare in acqua
• Differenziare in alcool assoluto
• Disidratare, diafanizzare, montare

I bacilli alcool-acido resistenti si colorano in rosso, la restante flora batterica e il resto in blu.

COLORAZIONE GROCOTT-METHENAMINE-SILVER (GMS) PER MICETI (Gomori 1946, Grocott 1955)

• Sezioni all’acqua
• Ossidazione in acido cromico 5% per 1 ore a 56°C
• Lavare in acqua corrente
• In sodio bisolfito 1% per 2-3’
• Lavare accuratamente in acqua corr.
• Sezioni per 1 ora a 60°C al buio in soluzione tetraborato-acqua-mete-namina argentica
• Lavare in numerosi cambi d’acqua
• Viraggio in cloruro d’oro 1% per 4’
• In tiosolfato di sodio al 3% per 5’
• Lavare in acqua corrente e contrastare delicatamente con verde luce
• Lavare in acqua corrente
• Disidratare, diafanizzare, montare

Miceti in nero; fondo in verde chiaro

COLORAZIONE PER L’AMILOIDE

METODO AL ROSSO CONGO (Bennhold, 1922 mod.)

• Sezioni sparaffinate e portate all’acqua

• In soluzione acquosa di rosso Congo 1% per 15-20’ (fette al criostato 30”)
• Per 30” in carbonato di litio 1%
• Lavare in acqua
• Differenziare con alcool 80°
• Alcool 100°, xilolo, montaggio

L’amiloide appare in rosso, con birifrangenza verde mela quando osservata al microscopio polarizzatore.

COLORAZIONI PER PER IL TESSUTO NERVOSO

Il tessuto nervoso richiede una fissazione immediata, poiché molte sue componenti vanno incontro ad
alterazioni autolitiche precoci. Con vari metodi si possono evidenziare:

• I NEURONI, LE NEUROFIBRILLE, LA SOSTANZA TIGROIDE

• LE GUAINE MIELINICHE
 • LA GLIA

COLORAZIONE DI BIELSCHOWSKY PER NEURONI E NEUROFIBRILLE (BIELSCHOWSKY, 1902)

• Sezioni all’acqua
• Le sezioni vanno poste in una soluzione fresca di nitrato d’argento
• Lavare in più cambi di formalina al 10%
• Lavare in acqua
• Asciugare il vetrino e porlo per 40” in soluzione di argento ammoniacale
• Lavare in più cambi di formalina
• Lavare in acqua e controllare il risultato
• Fissare in tiosolfato di sodio
• Lavare in acqua di fonte
• Disidratare, diafanizzare e montare

Neurofibrille in nero, nuclei in nero-marrone, fondo color bronzo dorato.

COLORAZIONE PTAH PER LA GLIA

• Sezioni all’acqua
• In bicromato acido di potassio a 50°C per 30’ o a temperatura ambiente per 12 ore
• Lavare in acqua di fonte
• In soluzione di Lugol per 10’
• Decolorare completamente in alcool etilico 96° per 15-60’
• Lavare in acqua
• Decolorare con soluzione di acido ossalico
• Lavare in acqua
• In soluzione di ematossilina fosfotungstica
• Differenziare in alcool etilico 96° fin quando la componente blu è ben evidente
• Disidratare, diafanizzare, montare

Neuroglia, nuclei ed eritrociti: blu intenso Mielina: blu chiaro Citoplasmi e fibre: rosso arancio o bruno
pallido

COLORAZIONE DI KLUVER-BARRERA PER LA MIELINA (Kluver-Barrera 1954)

Le guaine mieliniche sono costituite dalla membrana cellulare della cellula di Schwann che avvolge il
neurite ed insieme ad esso costituisce la fibra nervosa. È costituita essenzialmente da lipidi.

• Sparaffinare
• In alcool 95°
• In soluzione di Luxol fast blu a 56-60°C per una notte al buio [24h a 60°]
• Raffreddare la vaschetta
• Sciacquare in alcool 95°
• Sciacquare in acqua
• Differenziare con rapide immersioni in soluzione di carbonato di litio [30”]
• Differenziare in alcool 70° [finché la sost. Grigia sia completamente pulita. Eventualmente ripetere
la differenziazione
• Lavare in acqua
• In soluzione di cresil violetto per 6’ [aggiungere al momento dell’uso 15 gocce di ac. Acetico 10% IN
50 ml di soluzione]
• Differenziare in parecchi cambi di alcool 95° [passaggio veloce]
 • Disidratare, diafanizzare, montare

mielina in blu, nuclei in viola

COLORAZIONE GIEMSA

• Sparaffinare e portare all’acqua

• Risciacquare in soluzione tampone pH 6.8
• Colorare in soluzione Giemsa 20% per 1 ora (o in soluzione 4% overnight)
• Sciacquare in acqua distillata
• Sciacquare in soluzione acquosa di acido acetico 0.5% fino a che la sezione diventa rosa
• Sciacquare in acqua corrente
• Lasciare asciugare
• Disidratare, diafanizzare, montare

Protozoi e altri microorganismi: blu scuro Nuclei: blu Fondo: rosa o celeste

Il referto isto-patologico:

L’attività diagnostica svolta nel servizio di anatomia patologica si esplica attraverso l’emissione di un referto
che verrà comunicato al richiedente (clinico o paziente) tramite un atto scritto e firmato dal medico
anatomo patologo. Gli elementi su cui si fonda la qualità del referto sono rappresentati dall’accuratezza,
completezza e tempestività.

Il referto, redatto in conformità con le linee-guida nazionali ed internazionali, in modo chiaro, che permetta
di comprendere la diagnosi di patologia e le eventuali valutazioni di colorazioni immunoistochimiche e di
stadiazione, deve contenere obbligatoriamente le seguenti informazioni:

• Identificazione dettagliata della struttura AIPC che esegue la diagnosi

• Anagrafica completa ed univoca del/della paziente
• Identificazione della struttura che ha richiesto la diagnosi
• Identificazione del medico richiedente
• Data di esecuzione del prelievo
• Data di accettazione del campione
• Materiale biologico inviato
 • Quesito diagnostico
• Sintesi delle notizie cliniche/ motivo della richiesta (non mandatorio)
• Descrizione macroscopica del campione biologico
• Descrizione microscopica e/o diagnosi isto-citopatologica
• Eventuale descrizione delle metodiche utilizzate per particolari valutazioni diagnostiche
• Stadiazione patologica (ove previsto)
• Data del referto a conclusione della diagnosi
• Nome per esteso del/dei medico/medici che ha/hanno effettuato la diagnosi
• Firma digitale o per esteso del principale diagnosta

Patologie neoplastiche:

➢ Diagnosi
➢ Grading: definire il grado di somiglianza (o di anaplasia) rispetto alla controparte normale (G1, G2,
G3)
➢ Staging: definire l’estensione locale della malattia, la presenza di metastasi linfonodali e di
metastasi a distanza (TNM)
➢ Fattori prognostici: descrivere le caratteristiche morfologiche e biologiche di significato prognostico
che danno indicazioni sull’andamento clinico di una malattia (es. attività mitotica, ki-67, ER, PGR..)
➢ Fattori predittivi: fattori che predicono la risposta alla terapia (es.HER2)
Laboratory information systems

sistemi di gestione computerizzati che intervengono in tutte le fasi di lavorazione dei materiali,
dall’accettazione alla refertazione danno un importante aiuto anche sotto il profilo amministrativo e
gestionale.

SNOMED -> Sistema di codifica di diagnosi patologiche e cliniche messo a punto dal College of American
Pathologists. E' un sistema di codifica

− multiassiale: le diagnosi sono codificate su più assi (topografia morfologia eziologia malattia
procedure)
− gerarchico: le cifre di ciascun codice indicano dettagli sempre più fini. (T2 = APPARATO
RESPIRATORIO T28 = POLMONI T282 = POLMONE DESTRO T2821 = LOBO SUPERIORE POLM. DX
T28211 = SEGM. APICALE LOBO SUP. P.D.)

MICROSCOPIA

Microscopio ottico: si osservano sezioni normalmente colorate.

Composto da:

• Basamento-> è fatto da una robusta fusione in ferro che conferisce stabilità allo strumento. vi sono
sistemi di regolazione dell’illuminazione - la lampada (alogena) - uno specchio che devia la luce
verso l’alto - la manopola che regola l’intensità dell’illuminazione. La luce fuoriesce dal basamento
attraverso un foro dotato di un diaframma a iride. Sul foro posto un filtro blu per contrastare la
luce gialla della lampada.
• Condensatore-> concentra il raggio luminoso in una piccola area del vetrino in esame. Ha delle lenti
in cui passa la luce: una lente frontale e un diaframma di contrasto. La lente frontale ha un
movimento basculante e serve per aumentare la concentrazione del fascio luminoso. Il diaframma
di contrasto serve per aumentare il contrasto dell’immagine (chiudendo il diaframma aumenta il
contrasto). Si trovano anche delle viti di centraggio che servono per allineare il condensatore con il
vetrino. Il koheler si effettua chiudendo il diaframma e centrando il punto luminoso agendo sulle
due viti.
 • Tavolino porta vetrini-> ha un’apertura per il passaggio della luce e un dispositivo chiamato
traslatore che serve per muovere il vetrino fissato ad una molla. Il traslatore è manovrato da due
ghiere coassiali una sx e una dx che consentono di muovere il vetrino sui due assi + micrometriche-
< servono per mettere a fuoco.
• Obiettivi-> sopra il tavolino vi son obiettivi in numero variabile. Il diametro delle lenti si riduce al
crescere degli ingrandimenti. Abbiamo obiettivi 4X-10X-20X-40X-100X) Le lenti sono caricate su un
supporto chiamato revolver che si può rotare per cambiare ingrandimento. Su ciascun obiettivo vi
sono dei numeri che indicano: ingrandimento e apertura numerica. L'apertura numerica è data
dall’indice di rifrazione data dal mezzo tra la lente e il coprioggetto (A.N.= n x ½ sen α n = indice di
rifrazione del mezzo interposto tra la lente frontale e il coprioggetto (aria, olio) α= angolo di
apertura dell’obiettivo) L'apertura numerica è molto importante perché determina il potere di
risoluzione cioè la capacità di riconoscere 2 punti come distinti. è riportato anche il numero che
indica la lunghezza del percorso ottico e lo spessore del coprioggetto che in genere sono standard.
Alcuni obiettivi sono predisposti per l’uso ad immersione con olio (che fa da mezzo).

➢ RIFRAZIONE

La rifrazione è la deviazione subita da un'onda quando passa da un mezzo ad un altro, nel quale la sua
velocità di propagazione cambia; poiché la frequenza rimane costante cambia la λ

• Gli oculari-> Al di sopra degli obiettivi vi è la ghiera in cui si fissa il tubo ottico con il portaoculari che
contiene prismi e specchi per ridurre l’ingombro del microscopio. la distanza tra gli oculari (in mm)
è regolabile. l’oculare contiene una o più lenti e in genere ingrandisce 10 volte. almeno uno dei due
oculari deve avere il dispositivo di correzione dei difetti visivi dell’osservatore

L’INGRANDIMENTO FINALE: Ingrandimento dell’obiettivo x ingrandimento dell’oculare x eventuale

ingrandimento del tubo ottico

MICROSCOPIO A POLARIZZATORE: è un normale microscopio ottico dotato di filtro polarizzatore. Il filtro

polarizzatore consente il passaggio solo ai raggi luminosi aventi un determinato orientamento. La luce che
penetra in un polarizzatore si suddivide in due parti: - una parte parallela al piano di vibrazione del
polarizzatore è trasmessa (passa) - una parte non parallela ad esso è eliminata (non passa). osservando un
preparato istologico con i due filtri polarizzatori paralleli, non si osserva alcuna variazione nell’osservazione
a parte una leggera riduzione della luminosità ma, incrociando i due filtri il campo visivo si oscura
completamente e gli unici oggetti visibili sono quelli dotati di birifrangenza

MICROSOPIO A CAMPO SCURO: è dotato di un particolare condensatore che fa pervenire all’oggetto da

esaminare solo raggi luminosi fortemente obliqui rispetto all’asse ottico. se tra il portaoggetti e il
coprioggetti non vi è nulla, il campo apparirà scuro se, al contrario, in quello spazio è presente anche una
minima particella, questa devierà parte del fascio luminoso che entrerà nell’obiettivo rendendola così
visibile. Il potere di risoluzione è 10 volte maggiore rispetto al microscopio a campo chiaro.

DIGITAL PATHOLOGY

▪ utilizzo di immagini digitali in anatomia patologica:

• Immagini macroscopiche (autopsie/esame macro)→ fotocamere digitali

• Fotomicroscopia → Fotocamere digitali collegate al microscopio (microscopio integrato)
• Whole slide imaging (WSI) → whole slide scanners

Conversione di preparati cito-istologici in vetrini digitali (WSI) tramite scanners. Le slides digitali
rappresentano una copia ad alta risoluzione del vetrino originale e possono essere visualizzate attraverso
softwares dedicati (microscopi virtuali).

“DIGITAL PATHOLOGY SYSTEM”

• Acquisizione strumenti scanner

• “Lavorazione "elaborazione di immagini
• Visione e condivisione
• Analisi
• Archiviazione sistemi di storage

Applicazioni cliniche: diagnosi-consulti-incontri multidisciplinari- controlli di qualità-archivi-analisi di

immagini)

Telepatologia-> trasmissione di immagini digitali a scopo diagnostico/consulto

Applicazioni non cliniche: educazione-ricerca-biobanche.

Considerazioni per l’implementazione clinica • Infrastrutture tecnologiche • Storage e sicurezza •

Workflow/spazi dedicati • Personale e Formazione • Validazione • Costi/sostenibilità

➢ ANALISI DI IMMAGINE

Estrazione di informazioni dall’immagine (analisi delle caratteristiche dei pixel) attraverso softwares
dedicati. Software che riconoscono pattern particolari in prima e in ultima analisi per distinguere la parte
fisiologica da quella patologica.

IMMUNOFLUORESCENZA

È l’insieme di procedure atte a visualizzare la localizzazione di un antigene mediante l’uso di anticorpi

veicolanti una sostanza fluorescente che costituisce l’indicatore che permette di individuare il sito tissutale
o cellulare dove è avvenuta la formazione del complesso immune.

I traccianti sono i fluorocromi e sono legati agli anticorpi mediante coniugazione per via chimica.

Le sostanze fluorescenti più frequentemente impiegate sono:

• Isotiocianato di fluorescina
• Tetrametilrodamina
• Ficoeritrina
• Cianine
• Rosso texas
La tecnica dell’immunofluorescenza prevede l’utilizzo dimetodi:

• Diretti
• Indiretti
• Del complesso con la proteina a

Metodo diretto-> semplice e marcatura multipla

Nel metodo diretto (o primario), l’etichetta del fluoroforo viene coniugata direttamente all’anticorpo
primario che reagirà con l’epitopo bersaglio. La tecnica di immunofluorescenza diretta è utilizzata
principalmente per la ricerca di un antigene ignoto (ad esempio di un batterio) il quale, dopo essere stato
fissato al vetrino o pozzetto attraverso specifiche metodiche, viene messo a contatto con i presunti
anticorpi specifici. A questo punto lasciamo a contatto, per il tempo necessario, l’antigene con l’anticorpo
in modo tale da avere un’interazione tra le due molecole che porterà alla formazione di un
immunocomplesso. Successivamente, è opportuno lavare accuratamente il vetrino in modo da eliminare gli
eventuali antigeni che non si sono legati.

Alla fine, analizzeremo il tessuto attraverso un microscopio a fluorescenza e se notiamo la presenza di

corpuscoli brillanti significa che il siero contenente gli anticorpi fluorescenti è specifico per quell’antigene.
In questo caso, quindi, siamo in presenza di un risultato positivo.

il metodo diretto risulta il meno specifico soprattutto a causa delle possibili alterazioni indotte sugli
anticorpi dal processo chimico di coniugazione del fluorocromo.

Metodo indiretto-> prevede un processo di incubazione in due fasi:

• Un anticorpo primario si lega all’epitopo target;

• Un anticorpo secondario, marcato con fluoroforo, riconosce e si lega all’anticorpo primario;

Metodo del complesso della proteina a->

LIMITI DELL’IMMUNOFLUORESCENZA

•Scarsa diluizione anticorpi coniugati

•Estinzione del fluorocromo

•Osservazione con microscopi particolari

•Mancanza di informazioni morfologiche

•Non conservabilità dei preparati

IMMUNOCITOISTOCHIMICA

l'immunocitochimica (Accuratezza o immunoistochimica) é un insieme di particolari tecniche

istocitopatologiche che consentono di evidenziare la presenza e la localizzazione di uno o più antigeni
mediante l’uso di appropriati anticorpi.

Principio Legame antigene-anticorpo

Antigene: molecola proteica, lipoproteica o glicoproteica che ha la capacità di essere "legato" al sito di
legame dell'antigene di un anticorpo. Ogni antigene può contenere diversi "siti" (determinanti antigenici o
epitopi) riconosciuti da anticorpi differenti.

Per poter essere identificato in un campione istologico mediante indagini immunocitochimiche deve
possedere alcuni requisiti: - Insolubilità - Accessibilità - Conservabilità
Anticorpo: molecola proteica prodotta dalle plasmacellule in grado di legare in modo specifico un
determinante antigenico

Specificità di un anticorpo • La capacità di un anticorpo di legarsi in modo specifico ad un determinante

antigenico • Dipende dalla struttura del sito di legame con l'antigene.

Affinità di un anticorpo • Forza del legame tra un determinante antigenico e l'anticorpo • Dipende dalla
struttura del sito di legame con l'antigene

Avidità di un anticorpo • La somma delle forze di tutti i legami tra antigene e anticorpo.

La sensibilità di una reazione immunocitochimica è la capacità di evidenziare correttamente la più piccola

quantità di un antigene. Rappresenta la capacità di identificare tutti i veri positivi.

La specificità di una reazione immunocitochimica è la capacità di evidenziare correttamente solo ed

esclusivamente il sito dell’antigene ricercato. Rappresenta la capacità di identificare tutti i veri negativi. È
una caratteristica che dipende principalmente dalla specificità dell’anticorpo.

L'accuratezza di una reazione immunoistochimica è la capacità di evidenziare correttamente con una

tecnica tutti veri positivi e tutti i veri negativi

La riproducibilità di una colorazione immunocitochimica è data dalla corretta standardizzazione delle

tecniche e dei metodi. Es. Sistemi automatizzati

La risoluzione di una reazione immunoistochimica è la capacità di una tecnica e di un metodo di evidenziare

correttamente la sede cellulare o tissutale in cui è ubicato l’antigene ricercato.

Applicazioni

• Analisi di marcatori diagnostici → sono di supporto alla diagnosi di una specifica malattia
• Analisi di marcatori prognostici → danno indicazioni sull’andamento clinico di una malattia
• Analisi di marcatori predittivi → predicono la risposta/resistenza della malattia a una specifica
terapia

Passaggi e variabili

➢ Campione

• Tipologia
• Fissativi
• Preparazione Riattivazione antigenica (antigen retrieval) Blocco di enzimi endogeni
• Controlli positivi/negativi

➢ Reazione antigene-anticorpo

• Anticorpi monoclonali/policlonali
• Anticorpi primari/secondari

➢ Metodi

• Diretto
• Indiretto

➢ Sistemi (tecniche) di rivelazione

• Immunofluorescenza
 • Immunoenzimatica
• Immunogold

➢ Allestimento del preparato

➢ Visualizzazione e analisi

• Microscopio - a fluorescenza - ottico

• Analisi - Al microscopio – Digitale

CAMPIONE

Il materiale istologico da utilizzare per le indagini immunocitochimiche deve possedere determinati

requisiti affinché non si producano artefatti, falsi positivi e falsi negativi. Deve essere impiegata la massima
cura affinchè siano mantenuti:

• l’adeguatezza del campione

• la conservazione dell’ antigenicità

LE TECNICHE ED I METODI IMMUNOCITOCHIMICI POSSONO ESSERE APPLICATI:

• Su cellule isolate (colture cellulari)

• Su preparati istologici - Fissati - Congelati
• Su preparati citologici

Variabili: tempo di ischemia

Il tempo di ischemia è il tempo che intercorre tra il prelievo del campione e la sua fissazione. Il tempo di
ischemia del campione prima della fissazione può risultare nella degradazione di proteine, DNA e RNA,
nell'attivazione di enzimi autolitici. Variazioni nel tempo di ischemia possono inficiare il risultato di una
reazione immunoistochimica

Variabili : modi e tempi di fissazione

La fissazione previene l'autolisi dei tessuti e conserva l'antigenicità .Il tipo di fissativo dipende dal tipo di
antigene ricercato e dalla tecnica di rivelazione. Tempi e modi di fissazione possono influenzare la
riproducibilità della reazione immunoistochimica. - es. l'overfissazione può causare mascheramento di
antigeni o perdita di alcuni epitopi portando a risultati falsi negativi nelle reazioni immunoistochimiche.

Variabili : taglio e conservazione

La conservazione per lunghi periodi (oltre 2 mesi) di sezioni non colorate da blocchi FFPE può portare alla
degradazione di alcuni antigeni e alla conseguente riduzione o perdita dell'immunoreattività con il rischio di
falsi negative . Per le reazioni immunoistochimiche meglio tagliare nuove sezioni

. Preparazione del campione

• Sezioni a 3-7 um
• Aderenza delle sezioni di tessuto in paraffina ai vetrini → utilizzare vetrini a carica positiva
• Deparaffinazione e reidratazione
• Preparazione Riattivazione antigenica (antigen retrieval) Blocco di enzimi endogeni

REAZIONE IMMUNOISTOCHIMICA → legame specifico tra antigene e anticorpo

UN ANTIGENE PER ESSERE IDENTIFICABILE IN UN TESSUTO DEVE ESSERE - Accessibile - Conservato –

Insolubile
IMPEDIMENTI AL LEGAME ANTICORPO-ANTIGENE: - Mascheramento dei siti antigenici → riattivazione
antigenica - Inaccessibilità dell'antigene → permeabilizzazione - Modificazione strutturale dei siti antigenici
- Solubilizzazione dell antigene - Distruzione dell'antigene

Riattivazione antigenica Definizione

LA RIATTIVAZIONE ANTIGENICA = RIPRISTINO DELL’ANTIGENICITÀ PERSA A CAUSA DEI TRATTAMENTI

UTILIZZATI PER ALLESTIRE I PREPARATI ISTOLOGICI. Es. Nella fissazione in formalina gli antigeni possono
essere mascherati dalla formazione di legami (cross-linking) tra le proteine.

Tecniche Rottura dei legami tramite:

• TECNICHE ENZIMATICHE (Proteolytic-Induced Epitope Retrieval (PIER)) Proteinasi K - Pepsina -

Tripsina
• TECNICHE CHE UTILIZZANO IL CALORE (Heat-Induced Epitope Retrieval (HIER) Forno a microonde -
Pentola a pressione - Stufa a bagno maria

VARIABILI (I) - PH - Soluzioni Tampone - Soluzioni riattivanti - Tempo di incubazione – Temperatura -Tipo di
tessuto - Fissativo - Antigene – Anticorpo

Permeabilizzazione

L’INACCESSIBILITÀ DELL’ANTIGENE È PROVOCATA DA UN CONDIZIONAMENTO STERICO (es. Antigeni

intracellulari) O DALL’IDROFOBIA DEL MEZZO CHE LO CIRCONDA

QUANDO L’ANTIGENE RISULTA INACCESSIBILE È NECESSARIO EFFETTUARE DEI TRATTAMENTI PER -

aumentare la permeabilizzazione dei tessuti - detergenti - soluzioni acide - rendere idrofilo il mezzo
circostante.

L’INACCESSIBILITÀ DELL’ANTIGENE È PROVOCATA DA UN CONDIZIONAMENTO STERICO (es. antigeni

intracellulari) O DALL’IDROFOBIA DEL MEZZO CHE LO CIRCONDA • QUANDO L’ANTIGENE RISULTA
INACCESSIBILE È NECESSARIO EFFETTUARE DEI TRATTAMENTI PER - Rendere idrofilo il mezzo circostante -
Cloroformio /metanolo

Blocco di proteine ed enzimi endogeni -> È essenziale per prevenire colorazioni di fondo non specifiche

Dipende dal sistema di rivelazione (immunoenzimatica): - Blocco della perossidasi endogena - Blocco della
fosfatasi alcalina endogena - Blocco della biotina

Blocco di proteine-> Prevenire i legami non specifici degli anticorpi al tessuto o ai recettori delle regioni Fc
degli anticorpi

Anticorpi policlonali ->Anticorpi che legano differenti epitopi di un singolo antigene. Prodotti con
metodiche di ingegneria genetica (tecnica degli ibridomi)

ANTICORPI PRIMARI: Molecola anticorpale (monoclonale, policlonale o ibrida) diretta contro l’antigene
cellulare ricercato mediante immunocitochimica (• concentrazione/diluizione dell'anticorpo • temperatura
• tempo di incubazione)

ANTICORPI SECONDARI Molecola anticorpale (monoclonale, policlonale o ibrida) diretta contro

determinanti antigenici (abitualmente del frammento fc) dell’immunoglobulina che costituisce l’anticorpo
primario

METODI:

Diretto-> l’antigene si lega all’anticorpo primario marcato

Indiretto-> gli anticorpi secondari marcati si legano all’anticorpo primario che è legato all’antigene

TECNICA IMMUNOENZIMATICA:

La tecnica immunoenzimatica è l’insieme delle procedure atte a visualizzare la localizzazione di un antigene

mediante l'uso di anticorpi coniugati direttamente con un enzima o veicolanti un sistema enzimatico la
reazione colorata si ottiene facendo reagire l’enzima con l’appropriato substrato in presenza di una
sostanza cromogena

METODI

• DIRETTO
• INDIRETTO
• COMPLESSO IMMUNE PROTEINA A
• ENZIMA ANTI-ENZIMA (PONTE)
• PROTEINA A ENZIMA-ANTI-ENZIMA
• SISTEMI (STREPTO)AVIDINA-BIOTINA-ENZIMA
• MISTO ENZIMA-ANTI-ENZIMA COMPLESSO “ABC”
• CONIUGATI ENZIMATICI POLIMERICI

METODO DIRETTO:
METODO INDIRETTO:

• DIRETTO - POSSIBILE DEBOLE COLORAZIONE FORNITA DA UN NUMERO LIMITATO DI MOLECOLE DEL

TRACCIANTE - COLORAZIONI MULTIPLE

• INDIRETTO - AUMENTO DEL NUMERO DELLE REAZIONI - AUMENTO INTENSITA' DEL SEGNALE
ALLESTIMENTO DEL PREPARATO

• RECUPERO DELL’INCLUSIONE • TAGLIARE LA SEZIONE (3-7 um) • TAGLIARE LA SEZIONE DI CONTROLLO •

SPARAFFINATURA – REIDRATAZIONE • ANTIGEN RETRIEVAL • INATTIVAZ. DELLA PEROSS. ENDOGENA •
LAVAGGIO • ANTICORPO PRIMARIO • LAVAGGIO • ANTICORPO SECONDARIO (coniugato) • LAVAGGIO •
SUBSTRATO (H2O2) • CROMOGENO • CONTROCOLORAZIONE • DISIDRATAZIONE – DIAFANIZZAZIONE –
MONTAGGIO • ETICHETTATURA DEL VETRINO

Recupera slide 4-5-6

CONTROCOLORAZIONE Colorazione eseguita per evidenziare le varie componenti cellulari e tissutali del
campione in modo da poter localizzare le cellule immunoreattive

CONTROLLI

a. Positivo: campione che sicuramente esprime l’antigene

b. Negativo: campione che sicuramente non esprime l’antigene. (Interni ed esterni)

Applicazioni

• Analisi di marcatori diagnostici → sono di supporto alla diagnosi di una specifica malattia
IDENTIFICA: GLI ANTIGENI DI - CELLULE NORMALI E PATOLOGICHE - AGENTI INFETTIVI DIRIME:
DIFFERENTI IPOTESI DIAGNOSTICHE CARATTERIZZA: - IL FENOTIPO DI UNA LESIONE - L'ORIGINE DI
UNA METASTASI. ACTINA MICROFILAMENTO DEL CITOSCHELETRO PRESENTE IN TUTTE LE CELLULE.
VE NE SONO DIVERSE FORME, QUELLA PIÙ COMUNEMENTE UTILIZZATA È LA -ACTINA PER
MUSCOLO LISCIO (CLONE 1A4), CHE MARCA CELLULE MUSCOLARI LISCE. VIMENTINA (V9)
FILAMENTO INTERMEDIO CARATTERISTICO DELLE CELLULE MESENCHIMALI. MARKER, ABBASTANZA
ASPECIFICO, DELLE NEOPLASIE DI ORIGINE MESENCHIMALE. HMB-45 E MELAN A MARCATORI DI
NEOPLASIE DELLA SERIE MELANOCITARIA (MELANOMI)
• Analisi di marcatori prognostici → danno indicazioni sull’andamento clinico di una malattia
CITOCHERATINE PROTEINE FILAMENTOSE DEL CITOSCHELETRO. VE NE SONO 20 TIPI DIVERSI
VENGONO UTILIZZATE PER LA DIAGNOSI DIFFERENZIALE DEI TUMORI EPITELIALI. TIPI PIÙ
FREQUENTEMENTE USATI: 7 20 POOL (AE1, AE3) CAM 5.2 (8, 18), 34bE12 (1, 5, 10, 14), PAN (AE1,
AE3, CAM 5.2, 34bE12) Ki 67 (MIB-1) È ATTUALMENTE IL PIÙ UTILIZZATO TRA GLI ANTICORPI PER
VALUTARE IL NUMERO DI CELLULE IN FASE S, E QUINDI LA PROLIFERAZIONE DI UNA NEOPLASIA.
RECETTORI PER GLI ESTROGENI (1D5) ED IL PROGESTERONE (10A9) ed HER2 PER
L'INQUADRAMENTO TERAPEUTICO DELLE NEOPLASIE MAMMARIE PD-L1
• Analisi di marcatori predittivi → predicono la risposta/resistenza della malattia a una specifica
terapia ANTIGENE LEUCOCITARIO COMUNE (LCA) - CD 45 PAN LEUCO (CLONE 2B11-PD7)
MOLECOLA DI SUPERFICIE COMUNE A LINFOCITI, MACROFAGI, ISTIOCITI E GRANULOCITI. CD3
MARCATORE DI LINFOCITI T CD20 (L 26) MARCATORE DI LINFOCITI B