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Molecolare
Oscar Mapelli
1.0 Farmacocinetica
I processi che determinano le fasi della farmacocinetica sono tutti legati alla capacità di un farmaco di attraversare le
membrane cellulari, le modalità principali per l’attraversamento di tali membrane sono:
Diffusione passiva → è il processo di attraversamento di un farmaco legato al suo coefficiente di ripartizione
infatti per diffondere attraverso una cellula il farmaco deve avere un grado di idrofilia tale da tenerlo in
soluzione in liquidi acquosi etra ed intra-cellulari ed allo stesso tempo un grado di lipofilia sufficiente per
consentirne la diffusione attraverso gli ambienti lipidici come le matrici delle membrane cellulari. Il CR è pertanto
il rapporto tra le concentrazioni in fase oleosa ed acquosa, si avvicina a 0 per un composto molto idrofilo. Il CR
dipende dal pH dell’ambiente in quanto la quota ionizzata ha CR vicino a 0 e solo la quota non ionizzata potrà
penetrare nella fase lipidica, suddetta quota è data dalla differenza di pKa del farmaco e pH della soluzione.
Il flusso molare è la velocità di passaggio del soluto da un compartimento 1 a 2. In questa formula c1 e c2 sono le
concentrazioni di farmaco nel compartimento, D è il coefficiente di diffusione, A è l’area della membrana, d è lo
spessore; da questa legge si deduce che: Figura 1: Endocitosi mediata da
o Il flusso è maggiore quando la differenza di concentrazione è maggiore recettore
o Il flusso è direttamente proporzionale all’estensione della membrana
o Il passaggio è più efficiente quanto più sarà lo strato da attraversare
Endocitosi mediata da recettore → molti recettori tendono, quando hanno
effettuato il legame, ad aggregarsi ed costituire una struttura
sottomemebranaria (coat o mantello) costituita da polimerizzazione della
proteina clatrina e la formazione così di una vescicola endocitotica.
Successivamente queste vescicole perdono il mantello e si fondono a formare
strutture vescicolari più complesse (endosomi) e successivamente possono
seguire destini differenti. È possibile che il recettore venga riciclato e riportato
in superficie, è possibili altresì che il recettore torni in superficie con il ligando
oppure recettore e ligando possono essere entrambe degradati.
Trasporto attivo contro gradiente elettrochimico → è mediato da pompe e
trasportatori di membrana, è un processo saturabile in quanto il trasporto
massimo è dato dalla densità del trasportatore e dal turnover di questi ultimi.
La BEE limita l’accesso dei farmaci idrofili al SNC, per giungere li infatti i farmaci possono usufruire di due percorsi:
attraverso il sangue o attraverso il liquido cefalo-rachidiano ed in entrambe i casi le barriere sono notevoli,
caratterizzate da bassissimi livelli di eso- endo-citosi, assenza di pori di diametro idoneo, presenza di un rivestimento
quasi continuo di cellule gliali.
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A causa di ciò la composizione del liquido intersiziale denota una marcata assenza di proteine plasmatiche. Solo
farmaci con un elevato CR sono in grado di penetrare efficientemente, questi PA penetrano con grande rapidità e
tendono ad accumularsi nel tessuto dell’SNC soprattutto nella materia bianca. I farmaci idrofili non sono in grado di
penetrarvi. Pertanto si può concludere che la parmeabilità della BEE dipende da tre fattori:
1. Legame alle proteine plasmatiche: passa solo la quota libera
2. Grado di ionizzazione: la quota ionizzata è esclusa dal SNC
3. Coefficiente di ripartizione
La barriera placentare è meno efficace di quella ematoencefalica, manca la totale impermeabilità a farmaci idrofili, la
lenta circolazione del sangue materno fa si che le molecole di farmaco abbiano più tempo per penetrare pertanto il
passaggio di farmaci idrofili al feto sarà trascurabile solo proporzionalmente alle dimensioni delle molecole. Queste
considerazioni portano all’evidenza che eventuali farmaci possono essere poi presenti in concentrazione significativa
anche nel latte materno.
Il Vd dell’organismo non è altro che la somma tra il volume apparente di distribuzione di tutti i compartimenti ed
il volume plasmatico. Se il Vd di un farmaco è molto elevato significa che il farmaco tenderà ad accumularsi nei
tessuti in quanto la concentrazione plasmatica sarà bassa. Il Vd di un farmaco è solitamente espresso in litri su Kg
di peso corporeo pertanto si riduce la variabilità su individui con peso diverso.
o Legame alle proteine plasmatiche → La fase proteica funge da organo deposito pertanto la concentrazione
plasmatica di farmaco ne sarà influenzata, bisogna così distinguere tra quota libera e quota legata in quanto sarà
la prima ad entrare efficacemente nella cellula epatica per venire metabolizzata o filtrata, il legame con le
proteine è definito dal rapporto tra la concentrazione di farmaco legato e quella di farmaco libero, rapporto che
solitamente varia da 0 a 1. Se il rapporto è superiore a 0,9 il farmaco è fortemente legato. La proteina plasmatica
che più influisce su questo legame è l’albumina che lega principalmente anioni organici oltre che molte altre
molecole, un’altra è l’α1 glicoproteina acida, gli steroidi legano la trans cortina. Questo legame segue gli stessi
principi del legame farmaco-recettore.
È importante sottolineare che la frazione legata dipende dalla concentrazione del farmaco, per concentrazioni
più alte una quantità minore sarà legata e viceversa. Anche farmaci o altre sostanze endogene possono spiazzare
il farmaco dalle proteine plasmatiche andando così a modificare la quota libera, un esempio tipico è la warfarina,
pazienti trattati con questo possono andare incontro a grafi fenomeni emorragici se trattati con sulfamidici,
salicilati ecc.. il fenomeno dello spiazzamento può interessare anche sostanze endogene.
In linea di massima i processi che portano all’eliminazione seguono una cinetica di I ordine eccetto quelli per i quali
l’eliminazione si basa su processi metabolici o di escrezione saturabili. Quando è di I ordine questa disegnerà una
retta in un grafico in scala semilogaritmica, l’emivita è l’intervallo di tempo necessario al dimezzamento della
concentrazione del farmaco, ogni farmaco possiede un suo valore di emivita che può variare significativamente.
Alterazioni patologiche degli organi adibiti all’eliminazione prolungheranno l’emivita del farmaco. La clearance è il
volume di sangue virtualmente ripulito nell’unità di tempo:
La sua unità di misura è volume x unità di tempo, siccome per ogni farmaco in ogni paziente ke è costante e il Vd ha
un valore costante si deduce che la clearance ha un valore indipendente dalla concentrazione plasmatica, la
clearance permette inoltre di stimare correttamente il volume apparente di distribuzione:
La clearance può essere vista anche sotto l’aspetto di Cl d’organo cioè in funzione dell’eliminazione prodotta da un
organo specifico, la Cl totale sarà quindi la somma di tutte le Cl d’organo, nella maggior parte dei casi si parla di
Clearance renale e non renale. Le tavole farmacocinetiche riportano solitamente la Cl totale dalla quale si può
facilmente ricavare quella renale o epatica conoscendo la percentuale eliminata con le urine.
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1.3 Controllo della concentrazione plasmatica dei farmaci
La concentrazione plasmatica raggiunge un valore di picco che è in
funzione della dose e del Vd e poi decade in modo esponenziale, per
ogni intervallo pari ad un emivita la concentrazione si dimezza, dopo
circa 5 emivite è rimasto il 3% del farmaco, se avvengono
somministrazioni ripetute ciascuna dose andrà a sommarsi a quella
precedente accrescendo così la concentrazione del farmaco che verrà
quantificata come conc presente nel corpo + conc somministrata,
dopo una fase iniziale la concentrazione plasmatica si stabilizza su
uno steady state ossia un andamento periodico stabile, la salita
verso lo steady state è descritta da un andamento esponenziale con
costante di tempo uguale a quella di eliminazione. Se dopo 5 emivite
ciò che rimane è una dose trascurabile, una dose somministrata dopo
5 emivite non farà altro che rimpiazzarla, la successiva rimpiazzerà la
Figura 4: Raggiungimento steady state seconda e così via. Ogni somministrazione produce un incremento di
concentrazione pari a D/Vd, la concentrazione ad ogni
somministrazione è pari alla metà della concentrazione max indotta dalla somministrazione precedente, l’equilibrio
di somministrazione si raggiunge con concentrazioni che oscillano tra un massimo di 2 ed un minimo di 1 D/Vd. Il
tempo necessario per il raggiungimento del plateau dipende esclusivamente dall’emivita ed ad essa è legata anche la
velocità con cui la concentrazione decade una volta che la terapia è stata sospesa.
Anche l’intervallo tra le somministrazioni influenza l’entità delle oscillazioni della concentrazione plasmatica
all’equilibrio così come le cinetiche di assorbimento.
2.0 Farmacodinamica
Un recettore è una macromolecola biologica che media una determinata azione, anche se non tutti i farmaci
necessitino di recettore (es. H2O2) per molti l’attività biologica è dovuta alla formazione di un complesso con
quest’ultimo.
Questa interazione che viene a formarsi è solitamente mediata da legami chimici deboli come legami H, forze di
WdW, legami ionici tra atomi di carica opposta, interazioni idrofobiche ecc.. Per avere un tempo di legame
sufficiente all’insorgere dell’azione biologica è necessario che ci siano molti di questi legami uniti alla
complementarietà della superficie del recettore.
In base al numero ed al tipo di legami l’interazione può essere reversibile o irreversibile. Sono numerose le tecniche
per studiare le interazioni ligando-recettore si possono classificare in due categorie:
Curve Dose-Risposta → Consentono una scelta arbitraria sull’oggetto dello studio (apertura canale,
produzione di un secondo messaggero ecc..), i principali vantaggi sono: immediata valutazione della
rilevanza biologica, studi di specificità; gli svantaggi sono: ignorano molti fenomeni come metabolismo,
distribuzione ecc..
Studi di Binding → Avviene la marcatura radioattiva del ligando, si separa X da RX e si misura la quantità di
ligando che interagisce. I principali vantaggi sono: determinare la specificità farmacologica, determinare le
caratteristiche dell’interazione, localizzazione ed individuazione di recettori e sottoclassi; i principali
svantaggi sono: non si possono distinguere agonisti da antagonisti, non si discrimina con altri legami (es.
recettori non funzionali ecc..).
Tecniche di biologia molecolare
Questi studi consentono di determinare parametri essenziali come: costante di dissociazione, densità dei siti,
costanti cinetiche:
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1. Ka: costante di associazione
2. Kd: costante di dissociazione
3. Kon: velocità di formazione del complesso RX dipendente dall’accesso al sito di legame
4. Koff: Velocità di scissione del complesso RX dipendente dal numero di legami chimici deboli
5. Bmax = Rt: Densità dei siti recettoriali
Per poter arrivare a parametri utili tuttavia si deve ricavare un’equazione simile alla Michaelis-Menten, nota col
nome di Isoterma di Langmuir:
Dove B indica la concentrazione di farmaco legata al recettore dalla quale si ricavano i grafici corrispondenti:
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In presenza di sottotipi recettoriali multipli gli ordini di grandezza sull’asse delle ascisse cambiano. Inoltre se si
verificano queste condizioni cambia anche il grafico si Scatchard che da retta diventa curvilineo, nel grafico
semilogaritmico può comparire un flesso. Solitamente questi dati vengono interpretati da appositi calcolatori per
personal computer.
Farmaci diversi possono competere per il legame con lo stesso recettore, sarà dunque il farmaco che si associa più
velocemente e che si distacca più lentamente ad avere la meglio, tutto ciò dipende dalla Kd del farmaco (vincerà la
gara per il legame la molecola con Kd minore), queste affermazioni valgono nel caso di legami reversibili.
Il fenomeno della competizione modifica le curve di legame, la curva si sposta verso destra aumentando così la Kd.
Non è pratico utilizzare una concentrazione per poter definire l’efficacia di un farmaco, si è quindi studiato un
parametro adimensionale che è più facile da interpretare e paragonare ossia il pD2:
Figura 6: Nella figura a sinistra esempio di un agonista sormontabile, nella figura a destra un agonista insormontabile
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2.1.2 Teoria dell’efficacia o attività intrinseca
Prevede che i farmaci siano dotati di due proprietà intrinseche:
o Affinità per il recettore:
o Efficacia o attività intrinseca → Capacità del farmaco di dare inizio ad una risposta biologica una volta che si è
legato al recettore, correlata alla probabilità di indurre un cambiamento conformazionale.
Un ultimo tipo di agonista è l’agonista inverso: è una distinzione che avviene per quelle molecole che interagiscono
con recettori costitutivamente attivati, ossia quei recettori che naturalmente stanno in uno stato R*, l’agonista
inverso ha più affinità per R piuttosto che per R*. Questi farmaci diminuiscono l’attività basale del sistema avendo
azione opposta agli agonisti ma attivando di per se una risposta biologica.
Nel caso dei recettori costitutivamente attivati si possono quindi verificare diversi casi:
Un agonista pieno ha affinità per R*
Un antagonista a uguale affinità sia per R che per R*
Un agonista parziale ha più affinità per R* piuttosto che per R
Un agonista inverso ha maggiore affinità per R e sposta l’equilibrio su RX
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3.0 Recettori e modulazione della risposta
I recettori per le sostanze modulatorie endogene si dividono in due classi principali:
1. Recettori di membrana → Trasducono il segnale modificando concentrazioni ioniche intracellulari o
attraverso la generazione di secondi messaggeri.
2. Recettori intracellulari → Fattori di trascrizione che inducono modificazioni dell’espressione genica e della
composizione proteica.
A loro volta si possono raggruppare in grandi famiglie:
a) RECETTORI CANALE → Sono complessi macroproteici trans membrana che formano un canale ionico la cui
apertura è regolata dal legame con il neurotrasmettitore o il farmaco. Sono composti da diverse zone tra cui un
imbuto extracellulare, un canale ionico trans membrana ed una zona intracitoplasmatica sede delle
fosforilazioni.
b) RECETTORI ACCOPPIATI ALLE PROTEINE G → Sono i più numerosi, sono formati da una singola catena
polipeptidica che attraversa sette volte la membrana plasmatica e sono accoppiati a una proteina G che trasduce
una cascata di segnali:
PROTEINA G
Protein chinasi
calmodulina Effetto
dipendenti
Effetto
c) RECETTORI CON ATTIVITA’ GUANILATO CICLASICA → Sono recettori poco espressi nei mammiferi superiori
nonostante modulino importanti funzioni come la distruzione del gene per il recettore delle endotossine. Sono
costituiti da una singola catena che attraversa una sola volta la membrana plasmatica ed il dominio
citoplasmatico possiede attività proteinchinasica. Una volta attivato sintetizza cGMP.
d) RECETTORI CON ATTIVITA’ TIROSIN-CHINASICA → A questa famiglia appartengono recettori per molti fattori di
crescita e per molte citochine. Sono costituiti da una catena che attraversa una sola volta la membrana
plasmatica e possiede attività chinasica sui residui tirosinici sia del recettore stesso che di altri substrati, questo
porta ad una modifica strutturale che porta all’associazione con proteine plasmatiche.
e) RECETTORI PER L’ADESIONE CALLULARE → Sono responsabili delle interazioni tra cellule e trasducono i segnali
provenienti dalla matrice regolando crescita, motilità, forma, differenziamento in condizioni fisio/patologiche.
f) RECETTORI PER LE CITOCHINE → Sono fattori di regolazione pleiotropici che controllano diverse funzioni del
sistema immunitario ed ematopoietico, tra cui proliferazione e differenziamento:
1. I recettori di tipo I sono eterogenei e trasducono segnale attivando le vie JAK/STAT
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2. I recettori di tipo II sono costituiti da due proteine trans membrana con struttura analoga che formano il
sito per i ligandi. La trasduzione avviene previa dimerizzazione che attiva STAT/JAK
g) RECETTORI TOLL-LIKE → Recettori in grado di riconoscere complessi motivi molecolari, sono costituiti da una sola
catena peptidica che attraversa una sola volta la membrana. Nella parte esterna hanno motivi ricchi di Leucina.
Attivano NFкB (tramite MYD88), chinasi, IRAQ, TRAF6, possono attivare anche AP1e MAPK, indurre apoptosi
reclutando FADD e caspasi 8. Sono soprattutto deputati alla risposta immunitaria contro i microrganismi.
h) RECETTORI PER LIPOPROTEINE → Sono in grado di riconoscere lipoproteine e molti altri ligandi, hanno una parte
extracellulare molto estesa in cui sono presenti LDL e domini EGF. Sono tra l’altro responsabili
dell’internalizzazione dei lipidi.
i) DECOY RECEPTORS → Sono recettori che mancano del dominio intracellulare ed esistono solo per competere
con il legame agonista o antagonista.
RECETTORE
RECETTORE ENDOCITOS
β-arrestina I
β-arrestina β-arrestina P
↑Erк → MAPK
Nei recettori accoppiati ad attivazione di PLC entrano in gioco due caratteristiche differenti dai β-adrenergici:
1. Desensitizzazione esclusivamente omologa
2. Feedback Negativo di controllo dell’attività GTPasica effettuato da PLC, deplezione di PIP2 che riduce
l’attivazione di Gq.
Nella maggior parte dei recettori in cui l’attivazione comporta fosforilazione in tirosina, tale segnale funge da indice
di internalizzazione come succede ad esempio nei fattori di crescita (recettore EGF).
La up regulation può avvenire in due modi:
1. Fenomeni lenti: modulazione dell’espressione genica (es. ipersensibilità che segue alla denervazione del
muscolo scheletrico).
2. Fenomeni rapidi: accelerata inserzione molecolare di recettori contenuti nei pool di riserva.
La tolleranza farmacologica è la necessità di aumentare la dose di un farmaco per mantenerne l’intensità d’azione, è
un evento progressivo, l’esposizione cronica ad un farmaco non è l’unico requisito della tolleranza.
Quando viene interrotta bruscamente la somministrazione di un farmaco che ha generato fenomeni di tolleranza, si
può manifestare la sindrome da astinenza, caratterizzata da disturbi psicosomatici, talvolta la sindrome di astinenza
può risultare letale per l’individuo.
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I recettori attraverso cui agisce un farmaco possono essere coinvolti nei fenomeni di tolleranza, come nel caso degli
oppiacei. La down regulation può essere uno dei fenomeni attraverso il quale gli oppiacei inducono tolleranza, la
desensitizzazione da morfina che avviene nei recettori µ e δ è dovuta al disaccoppiamento dei recettori Gi dovuto
all’aumentata attività delle chinasi GRKs che fosforilano solo la forma del recettore legata all’agonista.
La plasticità sinaptica è un processo dinamico attraverso il quale le connessioni neuronali rispondono a cambiamenti
nell’attività del sistema nervoso, si può avere un aumento di attività oppure una depressione di quest’ultima.
Questi due fenomeni si possono descrivere come:
LTP (long term potentiation) → è il termine utilizzato per descrivere un potenziamento notevole e duraturo
della trasmissione sinaptica che si attua a livello di varie sinapsi del SNC dopo una breve (condizionante) e
intensa (burst) stimolazione presinaptica (circa 100 Hz).
LTD (long term depression) → viene invece indotta da una sequenza più lunga di stimoli a frequenze più
basse.
Questi fenomeni sono stati studiati nell’ippocampo e sono necessari per l’apprendimento sinaptico, inteso come
creazione di circuiti neuronali “preferenziali”. Si caratterizzano per il crearsi di attività elettriche simultanee nei
neuroni sia pre- sia post-sinaptici.
H2N COOH
γ2 α1
M1 M2 M3 M4 β2 β2
α1
Recettore GABAA
B) RECETTORI DEL GLUTAMMATO → Appartengono a questa classe i recettori ionotropi del glutammato (AMPA,
Kainato, NMDA) in base al legame. Le subunità sono costituite da un’unica catena polipeptidica con ampia
regione N-terminale extracellulare, quattro regioni tra cui M2 intracellulare.
H2N
M1 M2 M3 M4
COOH
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C) RECETTORI DI cGMP ed cAMP → Il sito del ligando è intracellulare, anche le due estremità carbossi- ed ammino-
terminale sono intracellulari, è composto da 6 regioni trans membrana ed una regione P tra M5 ed M6.
1 2
M1 M2 M3 M4 M5 P M6
2 1
H2N COOH
D) RECETTORI IONOTROPICI DI ATP P2X → Sono costituiti da due regioni trans membrana ed un ampia regione
extracellulare.
M1 M2
H2N COOH
Nei recettori A il canale è formato essenzialmente dalle subunità M2 attorno alle quali sono posizionate le altre. Le
M2 presentano amminoacidi carichi posizionati in modo tale che quando le 5 subunità sono affiancate formano il
canale la cui composizione amminoacidica varierà in base allo ione ed al tipo di canale. Nei recettori B e C il poro è
rappresentato dalle zone P ed M2.
L’entità della risposta di questi recettori è modulabile da: differenza di potenziale e durata della stimolazione, a ciò
fanno eccezione i recettori attivati da amminoacidi eccitatori che richiedono anche una parziale depolarizzazione
della membrana. La desensitizzazione è una proprietà intrinseca di questi recettori.
E1 E2 E3 E4
H2N
GTP
α β γ GDP
i4
COO-
i2 β γ
i1 i3 GDP
α β γ α EFF
GTP EFF
Le proteine G possiedono attività GTPasica intrinseca e svolgono la loro azione in 3 passaggi principali:
I. Formazione di etrodimero GDP-α-βγ
II. Legame con il ligando: dissociazione di GDP che viene sostituito da GTP, separazione del complesso βγ ed
interazione con gli effettori.
III. Spegnimento del segnale: α idrolizza GTP e si ritorna al primo stadio.
In alcuni casi l’effettore di α può accelerare l’idrolisi di GTP (come nel caso delle proteine Gq).
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La subunità α può differenziarsi in classi:
SUBUNITA’ ES. DI RECETTORI AZIONE
αS TSH, β ↑Adenilato ciclasi
αi1 αi2 αi3 Somatostatina,
↓Adenilato ciclasi
α0 αt neurotrasmettitori, peptidi
αq TRH, M1 ↑Fosfolipasi C
α12 α13 A2 per il trobossano ↑Rho, GEF
La proteina GT accoppia la rodopsina e ↑fosfodiesterasi che idrolizza cGMP.
Tossine come quella del colera e quella della pertosse hanno come bersaglio le subunità α.
Le subunità βγ sono in grado di regolare diversi enzimi: ↑PLC, ↑↓cAMP, ↑PI3K, ↑K+, ↓Ca2+.
H2N COO-
C1 C2
5’-AMP
↑PLC
•β → Gq PIP2
•γ → Rec. fattori di •DAG → PKC Fosfatidilinositolo Fosforilazione 1,2
crescita
•IP3 → ↑Ca2+
•δ → Rec. intracellulari
•ε → Ras
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Il DAG attiva le PKC che fosforilano serina e treonina in numerosi substrati, il DAG è rapidamente metabolizzato
da specifiche lipasi.
IP3 è idrofilo, diffonde nel citoplasma dove lega specifici recettori sul reticolo endoplasmatico, sono canali che
liberano calcio in un rapido passaggio in quanto IP3 è subito metabolizzato.
I recettori a 7 domini trans membrana interagiscono inoltre con proteine ed enzimi coinvolti nell’endocitosi come le
proteine HOMER che guidano la localizzazione dei recettori nella membrana post-sinaptica. Le β-arrestine si legano
ai recettori attivati e ↑ endocitosi.
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Il calcio stesso può giocare il ruolo di induttore (CICR), liberazione di calcio indotta da calcio. Oltre al RE anche i
mitocondri sono importanti ammortizzatori locali di calcio essendo caratterizzati da un altissimo potenziale di
membrana che costituisce una forza di trazione per il trasportatore specifico a bassa affinità di Ca2+.
Il citosol risulta essere quindi un luogo dove avvengono scambi e movimenti di Ca 2+, al suo interno si riconoscono
una serie di proteine che interagiscono con il calcio caratterizzate da un motivo EF-HAND comune, un esempio sono
annessine e calmudulina.
I depositi di Ca2+ a scambio rapido permettono che la concentrazione di calcio intracellulare aumenti e muti
continuamente anche in zone profonde della cellula.
La regolazione dell’omeostasi è importante per la prevenzione di patologie e necrosi cellulari improvvise
(eccitotossicià neuronale). Le proteasi calcio-dipendenti come le calpaine partecipano alla rimodulazione di molti
processi fisiologici come il turnover dei recettori, il rimaneggiamento del citoscheletro e la mitosi.
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o CODA CITOPLASMATICA → Contiene circa 250 aa, presenta residui di Tyr e sequenze consenso fondamentali per
innescare la trasduzione del segnale nel citosol.
Questo tipo di recettori si attivano per dimerizzazione che stabilizza lo
stato attivo ed avvicina il substrato (dominio intracellulare di un altro
recettore), in modo che si verifichi la trans-fosforilazione.
Un esempio di questi recettori è l’IRK (insulin receptor kinase) che è un
etero tetramero (2α, 2β) il cui legame con insulina ne cambia la
conformazione dell’unità β che è responsabile dell’attività chinasica,
quest’ultima fosforila i residui di tirosina nel dominio citoplasmatico così
come i substrati IRS.
Il legame di dimerizzazione è reversibile, una volta avvenuta la
fosforilazione di Tyr, le fosfo-tirosine si associano mediante domini SH2
(Src homology domain 2) che legandole localizzano diverse proteine
idonee a svolgere la funzione di trasmissione del segnale. Nonostante Src
e analoghi siano citoplasmatiche, queste possono legarsi a RTKs, Scr sono
tirosin-chinasi non recettoriali.
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8.0 Recettori intracellulari
Si distinguono dagli altri recettori in quanto il meccanismo d’azione non richiede sempre un ligando specifico e
l’attività intracellulare non è mediata da secondi messaggeri in quanto possono legare direttamente il DNA. Hanno
un’organizzazione strutturale simile, sono tutti formati da una catena polipeptidica di 400-1000 aa:
A | B | C | D | E | F
H2N COOH
AF1 DBD LBD AF2
Nella zona C troviamo il DNA binding domain che è responsabile di legare il DNA, LBD è il Ligand binding domain, gli
AF sono siti di interazione con l’apparato trascrizionale.
I recettori intracellulari sono veicolati nel nucleo una volta terminata la sintesi nel reticolo endoplasmatico, i
recettori senza ligando non possono completare la trascrizione in quanto sono associati a proteine inibitorie,
un’eccezione sono gli ormoni tiroidei.
I recettori del progesterone, estrogeni e COUP possono essere attivati in seguito all’attivazione di recettori di
membrana come EGF, IGF, TGF o neurotrasmettitori come la dopamina.
I meccanismi d’azione sono due: uno in presenza di ligando e l’altro in assenza di ligando:
Extracell. Extracell.
Segnale
Nucleo Nucleo
RNAPII
B F
D B F RNAPII E
TATA box D TATA box H
Il TFIIH è reclutata per lo srotolamento e la denaturazione locale del DNA.
Si è scoperto dell’esistenza di cofattori che non si legano direttamente al DNA ma formano un ponte attivatore:
o TAF → Riconoscono elementi del DNA come Inr (iniziatore) o DPE (downstream promoter element).
o MEDIATOR → Complesso multi modulare che interagisce con RNAPII stimolando la fosforilazione del dominio
carbossi-terminale.
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Il DNA è organizzato in una struttura nucleo-proteica nota come cromatina, organizzata in nucleo somi ossia 146
paia di basi di DNA arrotolato due volte attorno ad un core proteico contenente due copie di ciascuna delle proteine
isotoniche H2A, H2B, H3 ed H4, pertanto per iniziare la trascrizione si necessita di riorganizzazione che è mediata da
due complessi:
o COMPLESSI ATP-DIPENDENTI → Usano l’energia derivata dall’idrolisi dell’ATP per promuovere lo slittamento del
nucleo soma esponendo e mascherando specifiche sequenze di DNA.
Sono strutture multi proteiche con una subunità ad attività ATPasica, nell’uomo si riconoscono 3 distinte
famiglie. Si ipotizza che le proteine accessorie promuovano la localizzazione.
o COMPLESSI MODIFICATORI DEGLI ISTONI → Sono elementi in grado di modificare covalentemente gli istoni
all’estremità N-terminale attraverso reazioni di acetilazione, metilazione e fosforilazione.
La cromatina si può a sua volta classificare in due categorie:
EUCROMATINA → Meno condensata, corrisponde a zone dove vi è un’intensa attività trascrizionale.
ETEROCROMATINA → Componente più condensata, corrisponde a zone prive di attività trascrizionale.
La trascrizione è inducibile da stimoli extracellulari, esistono almeno 3 classi di fattori di trascrizione in grado di
generare questo tipo di risposta:
1. Fattori attivati da ligando: es. recettori per ormoni steroidei
2. Fattori attivati da modificazioni post-traduzionali: correlate allo stato di fosforilazione di specifici residui di
serina e di treonina
3. Fattori regolati a livello trascrizionale.
G1 S G2 M G0
Thr161 Cdk7
Cdc25
Thr14 Cdk1 ClnB Cdk1 ClnB Cdk1 ClnB
Tyr15
Wee1
Nel caso in cui avvenga un danneggiamento del DNA entrano in gioco gli inibitori delle Cdk che fungono da punti
controllo nel ciclo cellulare:
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10.1 Inibitori del ciclo cellulare
o Rb → è una piccola proteina ubiquitaria che prende nome dal fatto che la sua mutazione può essere causa del
retino blastoma, il prodotto di rb è una proteina che svolge un ruolo chiave nella transizione da G1/S,
controllando l’attività del fattore di trascrizione E2F che attiva una varietà di geni che codificano per enzimi
indispensabili per la duplicazione. Rb inibisce E2F sequestrandolo in una tasca della molecola, tale legame
dipende dallo stato di fosforilazione di Rb; quest’ultima inizia ad essere fosforilata in G1 da parte di ClnD/Cdk4 e
ClnD/Cdk6 e per finire da ClnE/Cdk2.
o p21, p27, p57 → inibiscono principalmente Cdk4 e 2 (G1/S, S/G2) legandosi al complesso con la rispettiva Ciclina
in rapporto di 2:1 (inibitore:complesso).
o p16 → può indurre l’arresto del ciclo in G1, circostanza che si verifica solo prima che venga superato il primo
punto di transizione in presenza di Rb funzionante, ciò suggerisce che p16 svolga la sua funzione bloccando la
fosforilazione di Rb operata da ClnD/Cdk4.
o p53 → regolatore della progressione della mitosi ed induttore di apoptosi. Svolge la sua funzione non solo nel
passaggio G1/S ma anche in quello G2/M (il trattamento con nocodazolo blocca le cellule in G2 solo in presenza
di p53). La sua attività è regolata a livello di sintesi post-traduzionale. In condizioni normali la proteina è
normalmente sintetizzata e si mantiene con livelli cellulari molto bassi.
Tra gli inibitori del ciclo cellulare troviamo anche chemioterapici, anti-tumorali:
o Attivatori della via di p53:
attivatori del DNA-damage (classici etoposide, cisplatino, doxorubicina, antracicline
antimetaboliti (metotrexate, 5-FU, etc.)
"small peptides" che attivano direttamente p53
inibitori del proteasoma che ne impediscono la degradazione (bortemizib)
o Inibitori delle Cdk:
SNS-032 inibitore dei complessi CDK2/Cicline E,A e del CAK
Inibitori della cdc25 (il naphtofurandione, derivati della dysidiolide, etc.)
o Inibitori del fuso mitotico
modulatori della polimerizzazione della tubulina, alterazione del fuso mitotico (Tassani,
Combretastatani, Colchicina)
modulatori del "Kinetocore assembling" (inibitori delle cinasi Aurora e Polo-like, peptidi che mimano la
Survivina)
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2. Eliminazione di corpi apoptotici → I macrofagi riconoscono queste cellule dall’alterazione delle glicoproteine
di membrana e le fagocitano, degradando i corpi all’interno dei fagosomi.
I corpi non fagocitati possono andare incontro a degradazione incontrollata che potrebbe produrre una
risposta infiammatoria.
Sono state identificate due possibili vie apoptotiche in cui le caspasi e le proteine della famiglia Bcl-2 giocano un
ruolo molto importante. Bisogna tenere presente che anche p53 svolge un ruolo importante nel processo di
apoptosi, qualora avvenga un’interruzione del ciclo e questa non si possa riparare, p53 può indurre apoptosi
inducendo sintesi proteica specifica.
o VIA INTRINSECA → Le caspasi, Bcl-2 e Bax giocano un ruolo fondamentale. Bcl-2 è una proteina anti-apoptotica
che omodimerizza per svolgere la sua funzione, quando eterodimerizza con Bax può avvenire induzione
dell’apoptosi dovuta allo squilibrio di interazioni. Questo fenomeno può avvenire in seguito a radiazioni,
somministrazione di farmaci, segnali recettoriali che inducono Bax che una volta legato a Bcl-2 con l’aiuto del
citocromo c rilasciato dai mitocondri contribuisce all’attivazione della caspasi-9 che attiva la caspasi-3 che taglia i
Caspasi-9 Caspasi-3
CD95-L CD95-R
Caspasi-9
DED
FADD
DD
DED
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11.0 Recettori che mediano l’adesione cellulare
La matrice extracellulare (ECM) è quella parte di tessuto che provvede alle funzioni di supporto ed ancoraggio della
cellula, formazione di tessuti ma anche altre funzioni in base alle componenti che la caratterizzano:
Collagene Insolubile: componente strutturale, responsabile della resistenza e resilienza dell’ECM.
Proteoglicani: ammortizzatori cellulari
Proteine della matrice con funzioni adesive: legano le componenti sopracitate ai recettori cellulari.
Le differenti combinazioni di queste tre componenti contribuiscono alla caratterizzazione di ECM peculiari e sono
inoltre capaci di influenzare il comportamento cellulare. L’interazione dell’ECM con specifici recettori fa si che si
sviluppino segnali on-off diretti alla cellula in diversi pathway, è oltretutto in grado di sequestrare growth factors ed
ormoni legandoli e modulandone la capacità di attivare i segnali cellulari.
Le molecole che mediano all’adesione cellulare sono implicate in fenomeni adesivi, controllo della migrazione,
riparazione di danni a strutture vascolari e trasmettono segnali all’interno della cellula regolando anche
proliferazione, sopravvivenza e trascrizione. Questi recettori si possono legare in modi differenti tra loro:
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o INTEGRINE → Mediano l’adesione con l’ECM ed il citoscheletro, sono etero dimeri costituiti dall’associazione di
una catena α ed una β e vengono classificate in base a
quest’ultima. Le integrine agiscono come punto di
aggregazione per complessi multi proteici all’interno della
cellula che interagiscono con actina formando una
struttura tridimensionale (adesioni focali) e connettono
la ECM con il citoscheletro, sono giunzioni non ancoranti
e calcio-dipendenti. Il legame ha come cofattore dei
cationi divalenti di Mg2+ o Mn2+. L’adesione è regolata
tramite up-regulation/down-regulation delle integrine.
Sono responsabili della formazione di emidesmosomi
ossia desmosomi tra la cellula e la lamina basale che sono costituiti da filamenti di collagene e laminina.
Entrambi i tipi di giunzione (adesioni focali ed
emidesmosomi) coinvolgono le integrine quali
proteine trans membrana. Le integrine sono
connesse alla matrice extracellulare tramite
fibronectina e laminina. Differiscono per gli
elementi citoscheletrici citoplasmatici a cui le
integrine sono collegate: i microfilamenti nei
contatti focali; i filamenti intermedi negli
emidesmosomi.
L’attivazione delle integrine genera una serie di
segnali come l’attivazione e formazione di adesioni
focali innesca la segnalazione da parte di FAK (focal
adhesion kinase) che media alla motilità ed alla
crescita della cellula.
Il controllo della segnalazione integrinica è regolata
dallo stato di attivazione, serve un attivatore come ad esempio la β-endonexina.
o SELECTINE → Mediano adesioni transienti nel circolo sanguigno, i leucociti usano le loro proprietà adesive per
passare da un tessuto all’altro, le selectine sono lectine (proteine che legano i carboidrati), sono calcio-
dipendenti, sono proteine trans membrana con dominio lectinico altamente conservato che lega specifici
residuo oligosaccaridici, si dividono in 3 tipologie:
L-Selectina = molecola di adesione caratteristica dei leucociti.
P-Selectina = piastrine e cellule endoteliali
E-Selectina = cellule endoteliali attivate
I passaggi che caratterizzano la migrazione leucocitaria sono:
1. I leucociti interagiscono con l’endotelio (rolling) mediante mucine (PSGL-1 sul leucocita e GlyCam e
MadCam sull’endotelio) e selectine (L-selectina sul leucocita ed E-selectina sull’endotelio). L’espressione
di P-selectina (contenuta normalmente in vescicole) endoteliale è in risposta a diversi agenti quali la
trombina, l’istamina mentre la E-selectina è regolata da meccanismi trascrizionali in risposta a citochine.
2. Adesione salda della cellula leucocitaria mediata dall’interazione tra integrine β1-2 e i loro ligandi
endoteliali VCAM-1 e ICAM-1,2. Questa adesione dipende dallo stato di attivazione delle integrine, ossia
deve esserci un segnale chemiotattico dall’interno dela cellula che le attivi.
3. Transmigrazione: i leucociti si muovono insinuandosi tra le cellule endoteliali, movimento dettato
dall’esistenza di un gradiente di sostanze chemiotattiche che orienta la cellula verso il punto con
maggiore concentrazione di esse. In questo passaggio le interazioni PECAM-1-PECAM-1 e CD99-CD99
delle cellule endoteliali vengono sostituite dalle stesse interazioni con le proteine del leucocita.
o Ig-LIKE → Sono proteine di adesione della famiglia delle immunoglobuline, hanno interazioni omofiliche ed
eterofiliche deboli e transitorie, sono specifiche per il tessuto, legano varie componenti dell’ECM tra cui Ig-CAM
ed integrine.
Le integrine ed altri recettori adesivi sono responsabili dell’adesione ed aggregazione delle piastrine, il processo di
emostasi avviene qualora ci sia un danno tissutale, ma altresì può essere causa della formazione di trombi.
Le piastrine sono cellule contenenti actina, gli attivatori sono ADP, epinefrina, collageno, trombina, PAF (platelet
activating factor), una volta attivate si innesca una serie di passaggi:
1. Adesione al collagene tramite il VWF che legandosi al collagene ha un cambiamento conformazionale che
rende riconoscibile alla glicoproteina Ib-IX-V, inoltre riconosce l’integrina αIIbβ3.
2. Attivazione che induce un cambiamento conformazionale da discoide a sferica con rilascio di attivatori.
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3. Outside-in signaling tramite PAF e trombossani.
4. Degranulazione con conseguente rilascio di ADP, trombossano, fattori della coagulazione, serotonina
(vasocostrittore), fattori di crescita (riparazione dei vasi).
5. Inside-out signaling Polimerizzazione e Aggregazione (esposizione ed attivazione II3 integrine, recettore
per il fibrinogeno).
Nella trasduzione del segnale da parte delle molecole di adesione sono coinvolte delle tirosin chinasi, in particolare
FAK e Src, sembrano essere implicate in un circuito di feedback positivo nella generazione di una serie di
meccanismi:
I. Fosforilazione di proteine citoscheletriche (↑associazione), transfosforilazione tra integrina e FAK in Y397
II. Fosforilazione di enzimi (PLCγ, PIPK)
III. Autofosforilazione e fosforilazione adattatori (Cas, Crk, Shc) per il riconoscimento dei domini
IV. Fosforilazione GEF (↑Rac ↓Rho)
Il CD44 partecipa alla trasduzione legando precursori di GF facilitandone la conversione nella forma attiva,
organizzare complessi multi molecolari legando proteine della famiglia ERM.
FANS e corticosteroidi inibiscono l’espressione di selectine su leucociti e cellule endoteliali.
Actina
Ca2+
Rilascio
GTP
Rab3
SNARE-SINTAXINA-SNAP25
Un altro meccanismo importante è quello del recupero dei neurotrasmettitori che è mediato da endocitosi
dipendente da clatrina che forma delle fossette ed insieme ad altre proteine favorisce l’internalizzazione:
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Clatrina
Sinaptotagmina
Endocitosi
AP180
AP2
Dinamina
+30 mV
Soglia
-40mV
-70mV
1. La cellula subisce uno stimolo depolarizzante fino al valore di soglia che apre i canali Na+ voltaggio dipendenti e
lo ione sodio entra nella cellula, i canali del K+ iniziano lentamente ad aprirsi
2. Il rapido ingresso di Na+ depolarizza la cellula
3. Si chiudono i canali Na+ e si aprono i canali K+ il cui ione si sposta dalla cellula al liquido extracellulare
4. Il K+ continua ad uscire della cellula iperpolarizzandola, questi canali si chiudono gradualmente così che la cellula
impiega più tempo a tornare ad uno stato di riposo.
Da questo si deduce che il meccanismo principale di depolarizzazione della cellula è dovuto all’entrata di ioni Na + e Ca2+
che restano normalmente chiusi a potenziali inferiori di -60mV, viceversa l’uscita di ioni K+ e Cl- rappresenta il principale
meccanismo di iperpolarizzazione. In alcuni canali oltre allo stato chiuso-aperto esiste anche uno stato inattivo.
I canali ionici sono proteine integrali di membrana che si possono assemblare in tetrameri. La componente principale
del canale è costituita da una struttura il cui peso molecolare è circa 200-250kDa, nel caso del canale del sodio, si ha
una struttura composta da una singola catena α organizzata a tetramero, mentre nel caso di K+ si associano 4 distinti
polipeptidi per ottenere un tetramero con lo stesso ruolo funzionale.
I quattro domini del canale del sodio costituiti ciascuno da circa 300-400aa si possono considerare ad ogni effetto
delle subunità, l’omologia tra i vari domini è molto alta. Questa struttura consente di recepire gli stimoli di voltaggio
grazie ad un sensore che rappresenta il “cancello” di attivazione del canale. Per questo ruolo è stato preposto il
segmento transmembranario S4, infatti ciascuno di questi presenta residui amminoacidici carichi positivamente (Arg
o Lys) che si ripetono ad intervalli regolari.
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13.1 I canali al sodio ed anestetici locali
Questi canali sono responsabili della fase di depolarizzazione del potenziale d’azione, questi possono contribuire a
determinare la soglia per la generazione dei potenziali d’azione ed influenzare il rilascio di neurotrasmettitori.
Questo canale nelle regioni S5 ed S6 contiene siti di legame per tossine ed altri farmaci, la fosforilazione tramite PK-
cAMO-dipendente causa riduzione del flusso ionico sia a livello cerebrale che cardiaco, mentre la fosforilazione via
PKC rallenta la velocità di inattivazione nelle cellule nervose. Sono presenti diverse forme di subunità α.
Questi canali sono ubiquitari, nei neuroni sono concentrati nelle terminazioni pre-sinaptiche altri, in densità post-
sinaptiche.
Il blocco dei canali sodio voltaggio-dipendenti è mediato da:
Anestetici locali, che bloccano i canali dei nervi periferici (Lidocaina, Benzocaina)
o Il sito di legame è situato all’interno del poro ionico e gli anestetici accedono prevalentemente dal lato
intracellulare, quelli idrofilici possono legarsi soltanto quando il “cancello” è aperto mentre quelli
idrofobici quando il cancello è chiuso.
Antiaritmici di classe I, che bloccano i canali cardiaci (Propranololo, Atenololo)
Anticonvulsivanti sottoclasse I che bloccano i canali dei neuroni centrali.
L’interazione di questi farmaci è dipendente dallo stato in cui si trova il canale del sodio, infatti quest’ultimo assume
conformazioni distinte per ogni fase del processo depolarizzazione-ripolarizzazione, ad esempio l’anestetico locale
accede al canale solo quando quest’ultimo è attivato e poi ha alta affinità di legame per lo stato inattivato.
Muscolari Neuronali
Subunità α1-β1-γ/ε-δ α7 α4-β2 α4-β4 α3-β4 α4-α6-β2
Localizzazione Neuromuscolare SNC, gangli pre SNC, Abenula Gangli post Retina
e post-sinapsi presinapsi SNC pre Striato
Postinaptico
Ioni Na Ca Na Na Na Na
Agonisti Ach, Colina Epibatidina Epibatidina Citisina Ach
Succinilcolina Nicotina Nicotina Ach
Antagonisti Curaro-α- Bungarotossina β- β- β- Conotossina
Bungarotossina eritroidina eritroidina eritroidina M2
curaro curaro curaro
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RECETTORI MUSCARINICI → Sono recettori accoppiati a proteine G, presentano un alto grado di omologia
soprattutto nella regione trans membrana con meno omologie nella regione delle anse intracitoplasmatiche.
I recettori M1, M3 ed M5 stimolano la PLC inducendo la formazione di IP3 e DAG, gli M2 ed M4 interagiscono con
Gi/o sensibile alla tossina della pertosse, inibendo adenilato ciclasi e stimolando PLC, inoltre aprono conduttanze
di ioni K+ in entrata, inibendo Ca2+. Gli M2 sono accoppiati ad una G0 a canali potassio la cui apertura è
responsabile di bradicardia dovuta ad Ach.
Nome / Tipo M1 M2 M3 M4 M5
nervoso cardiaco ghiandolare
Localizzazione Corteccia, SNC presinaptico Ghiandole SNC, polmone, SNC
ippocampo, esocrine, muscoli utero
gangli, cellule lisci, endotelio
parietali e
gastriche
Agonisti Ach Ach Ach Ach Ach
Antagonisti sel. Pirenzepina Tripitramina 4-DAMP MT3 ?
(tossina mamba
verde)
Trasduzione ↑IP3, DAG ↓cAMP ↑IP3, DAG ↓cAMP ↑IP3, DAG
↑Ca2+ intracell ↑Correnti K ↑Ca2+ intracell ↑Correnti K ↑Ca2+ intracell
↑cAMP ↓Correnti Ca ↑cAMP ↓Correnti Ca ↑cAMP
Proteine G q/11 i/0 q/11 i/0 q/11
Per quanto riguarda i farmaci attivi sui recettori nicotinici, la nicotina è l’unico usato su larga scala, la d-tubocurarina,
l’atracurio e il vecuronio sono antagonisti competitivi, insieme alla succinilcolina sono usati in anestesia per indurre
rilassamento muscolare. La galantamina è un inibitore delle colinesterasi che ha anche effetto sui nicotinici ed è
utilizzata per il morbo di Alzheimer.
Per i recettori muscarinici la pilocarpina è usata come miotico e per stimolare la salivazione, il cabacolo come miotico
nel glaucoma, il betanecolo usato per la ritenzione urinaria e nell’ileo paralitico. Gli antagonisti sono numerosi,
l’atropina, la scopolamina, sono usati come midriatici o per
ridurre la secrezione gastrica, antispastici in coliche intestinali e
biliari.
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Benzodiazepine ed altre molecole BZD-mimetiche, che si trova sui recettori formati dalle subunità αβγ ed è
riconosciuto anche da ligandi agonisti inversi come le beta-carboline. Questo sito è riconosciuto anche da
farmaci privi di attività intrinseca come antagonisti competitivi (Flumazenil).
Barbiturici e il loro antagonista, la picrotossina. Si trovano all’interno del canale per lo ione, importanza
funzionale in quanto possono potenziare il flusso anche in assenza di GABA al contrario delle benodiazepine.
L’inibizione o l’attivazione di uno qualsiasi di questi siti porta conseguenze sulla capacità di interagire con altri ligandi
specifici, modulando così l’attività recettoriale.
Le benzodiazepine hanno siti di legame distinti da quello per il GABA pertanto fungono anch’essi da modulatori
allosterici. Inoltre è stato verificato che sono sottotipi recettoriali a mediare i veri effetti delle benzodiazepine ed
ogni sottotipo reagirà in modo differente.
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