LEZIONE N°3 22/03/2017

La volta scorsa abbiamo fatto delle premesse, oggi andiamo a dettagliare i fatti. Quello di cui
parleremo è una parte tecnica.
Quando abbiamo un pezzo operatorio, se non lo fissiamo bene in formalina, si rischia di
precludere un esame istologico e questo poi è un problema anche di ordine medico-legale.

Precisiamo che quando preleviamo un pezzo, se per esempio abbiamo fatto una asportazione di
frammenti (biopsie endoscopiche) in ambiente ambulatoriale (dermatologo, endoscopista in un
centro specialistico privato) lo si deve mettere in delle provette con il fissativo che è la
formalina al 10% e lo si manda in anatomia patologica; quando lo si porta in anatomia
patologica? Quando vuoi ma se non puoi portarlo subito va comunque lasciato a temperatura
ambiente a fissare in formalina; il frigo non c’è, togliamo il concetto del frigorifero!

Il processo di fissazione in formalina è un processo di fissazione chimica ed è come se si

regalasse l’immortalità a quel frammento; quanto può stare in formalina? teoricamente 24 h
ma anche 150 anni! Il punto è quello di portare il frammento in anatomia patologica prima
possibile perchè in base alla dimensione dei frammenti per la fissazione occorre un certo
tempo (4 ore per i piccoli pezzi) ma in genere mediamente per tutti i pezzi operatori noi li
teniamo 24h; se ci sta un po’ di più (48-72h) non succede nulla ma già dopo il terzo si rischia la
iperfissazione cioè la fissazione esasperata che non ha poi tanti artefatti sull’esame istologico
però potrebbe darmi dei problemi se devo applicare a quei frammenti delle metodiche ancillari
come l’immunoistochimica perchè la formalina che tiene tutto assieme cioè senza farlo
degradare, per un processo chimico complicato, crea dei legami metilenici tra le diverse
proteine e quindi è come se creasse una sorta di groviglio, una sorta di impalcatura che è come
se congelasse tutte le proteine dei tessuti.
L’ideale quindi è mettere il pezzo in formalina e portarlo in anatomia patologica entro
24h lasciando il tutto a temperatura ambiente.
Quindi qualunque tessuto va fissato adeguatamente in formalina al 10% e si lascia a
temperatura ambiente fino a quando lo si porta in anatomia patologica.
Quindi no fisiologca, no altri liquidi, no alcol ma formalina punto e basta! Alcol no perchè, pur
essendo un liquido che fissa, è un liquido che ha capacità di disidratare il pezzo e quindi lo
asciuga in una maniera tale da alterare poi l’esame istologico; l’alcol non è un buon fissativo.

Ribadisco che la fissazione adeguata, corretta è un atto fondamentale per l’esame istologico.

Ci può essere una occasione invece in cui il pezzo mi serve fresco, non si deve mettere in
formalina ?
Normalmente a tutto’oggi, per fare un esame istologico e quindi per arrivare a quel vetrino
che ha distesa una sezione sottile di qualche micron in modo che la luce del microscopio ottico
la attraversi e io possa avere una immagine, è necessario che il tessuto sia fissato in formalina
e poi subisca un altro processo chimico. Tutto il processo chimico dopo la fissazione si chiama
processazione dei pezzi in modo tale che poi questo pezzo arrivi incluso in paraffina.
Fissazione> processazione chimica> inclusione in paraffina.
Questo tessuto nella paraffina è stato reso solido e quindi una lama molto sottile è in grado di
tagliare delle sezioni sottili (2-3-4 micron); in base a come metto la lama posso anche
immaginare gli intervalli di taglio e poi in base alla lama potrò avere un certo numero di sezioni
(più è fine più sezioni potrò ottenere).
Dopo la processazione dei pezzi e l’inclusione in paraffina, tutto verrà colorato e questo è
l’ideale affinché abbia un preparato istologico da vedere al microscopio.
Per avere un esame istologico ideale oggi non posso fare a meno di fissazione, processazione,
inclusione e taglio ma tutto questo mi porta via almeno 24 h perchè la processazione fa più o
meno 18-19 h.
La ricerca è andata avanti, potrei avere della strumentazione che mi fa tutto in 6-7 ore ma
comunque per avere una buona sezione e fare la diagnosi oggi mediamente aspettiamo 24h.

Torno alla domanda di prima… ma sempre un pezzo da vedere al microscopio ottico deve fare
questo percorso? Si perchè è fondamentale per avere la migliore immagine possibile ma c’è un
però perchè ci sono delle situazioni in cui ho bisogno di avere la diagnosi nel giro di 5 minuti e
allora come è possibile se, per ottenere un preparato istologico buono, devo fare fissazione,
processazione, inclusione e taglio che richiedono minimo 24h?
In quali condizioni devo dare la diagnosi in 5 minuti?
Nell’esame estemporaneo al congelatore (frozen section).
Per fare questo ho bisogno di un congelatore. Questo esame viene richiesto in delle condizioni
particolari; estemporaneo significa che devo farlo subito, nel gito di pochi minuti! Se uno fa
una biopsia è importante che io lo dica in 5 minuti? no! quindi qual’è la condizione in cui ho
bisogno di un esame subito?
Fondamentalmente le condizioni sono due:
1) esame estemporaneo al congelatore occasionale: è un etsemporaneo che consiste in questo
cioè io sto eseguendo un intervento chirurgico x (per es colecistectomia per calcoli della
colecisti), durante l’intervento chirurgico mi accorgo che nel dotto della colecisti c’è un
tessuto a manicotto che voglio capire cos’è (processo flogistico, carcinoma?) perchè in
base a quello che potrebbe essere questa lesione io posso anche modellarmi nel senso
sapere se devo continuare l’intervento chirurgico in un certo modo. Quindi io in maniera
fortuita, occasionale, inaspettata, a sorpresa mi trovo di fronte ad un qualcosa che non mi
aspettavo e vorrei capire cos’è. In questi casi ho bisogno di sapere in poco tempo cos’è
quindi faccio il prelievo, la biopsia. Abbiamo detto che esiste l’agobiopsia, la biopsia
endoscopica ma qui non c’entra; precisiamo che ci sono due tipi di biopsia:
-biopsia incisionale: prelevare un frammento di tessuto da una massa
-biopsia escissionale: togliere tutta la massa.
Quindi da una biopsia incisione che si fa chirurgicamete, con bisturi o lama a freddo, preso
questo frammento che facciamo? Questo frammento è un tessuto a fresco e che si fa se
voglio sapere in pochi minuti cos’è; non posso metterò in formalina, processarlo ecc ecc perchè
ci vogliono 24 e voi ne avete vista gente che rimane a dormire 24 h?!
E’ ovvio che il risultato finale deve essere lo stesso cioè devo ottenere una sezione di quel
tessuto da vedere al microscopio quindi il risultato finale è sempre il vetrino con quella
sezione ma come ci arrivo a fare sta cosa in 5 minuti?
No formalina perchè se ci metto la formalina comprometto tutto; per l’esame in estemporaneo
la formalina non c’entra.
Il pezzo per l’esame estemporaneo al congelatore deve essere un pezzo a fresco! Il pezzo a
fresco come deve arrivare in anatomia patologica?A fresco, così com’è! Lo mettete in un
contenitore senza niente e lo mandate, senza alcun liquido, senza niente!
Il pezzo fresco arriva in anatomia patologica ma come arriviamo a far diventare duro il pezzo
fresco così da poterlo tagliare?
C’è questo congelatore che ha all’interno un sistema con una lama particolare e all’esterno c’è
un sistema con una rondella che permette alla lama di tagliare; ma il pezzo come lo solidifichi?
C’è una rondellina metallica, metti del gel su di questa, il tutto lo metti dentro il congelatore
ma prima di metterlo dentro immergi nel gel il tessuto che hai quindi dentro il congelatore che
cosa va?
La rondellina metallica col gel e dentro il gel vai a mettere il tessuto. Il congelatore lo metti a
-20° e nel giro di 4-5 minuti gel e tessuto immesso dentro solidificano; in questa metodica si
usa il freddo cioè il freddo diventa il mezzo fisico per fissare tutto nel giro di poco tempo.
Questo congelatore con la la lama dentro si chiama criostato.
Il tessuto può essere tagliato perchè è stato solidificato in questo sistema.
Invece di avere il blocchetto in paraffina col tessuto dentro qui ho il pezzo solidificato bianco
fatto dal gel con dentro il tessuto e quindi è solido e lo posso tagliare.
Come mai se ho questa tecnica così rapida non si usa sempre questa invece di quella che dura
24h?
Perchè l’immagine è sempre qualità inferiore.
Quindi taglio, coloro guardo e faccio diagnosi in pochissimo tempo.

Un’altra tipologia che rientra in questo esame è la donazione degli organi; si mette in moto una
macchina particolare, bisogna valutare per es quei reni, quel fegato per sapere se sono
trapiantatili o meno, devo escludere che ci siano dei tumori perchè esiste gente trapiantata a
cui è stato trapiantato il tumore ed è morta perchè gli si è regalata pure la metastasi oppure
è inutile trapiantare dei reni che hanno la glomerulosclerosi! Queste valutazioni si fanno
prelevando dall’organo piccoli frammenti, dei cilindri e passandoli all’esame estemporaneo al
congelatore che in questo caso è pure occasionale.

Anche se l’estemporanea è più rapida non la sia sempre perchè anche qui le verità sono
empiriche! Se io noto che faccio quell’esame (formalina, paraffina ecc ecc) ho un immagine
ottima ma se dovessi fare tutte le indagini in estemporanea al congelatore non ho la stessa
qualità perchè qui c’è il freddo e il freddo è come se aggredisse le cellule.
le immagini che ottengo dall’esame al congelatore sono sempre inferiore, col freddo ci sono
moltom artefatti e sono così tanti che anche l’immagine del tessuto è molto lontana dalla
realtà (per es le cellule diventano più grandi); la sintesi è che con l’estemporanea non hai
empiricamente lo stesso risultato di qualità di quello definitivo con fissazione e processazione
per cui questo esame in estemporanea non può essere utilizzato di routine.
Oggi esistono dei microtomi che effettivamente sono molto simili all’immagine bella che si ha
con il classico processo ma ancora però non ci siamo, l’esame in estemporanea al congelamento
va riservato in alcuni casi.

2)esame estemporaneo al congelatore programmato: il chirurgo vuole sapere una diagnosi di

una patologia ma lui già sà, non è una sorpresa; per es c’è un nodulo alla mammella dove ha
fatto un agoaspirato e ha un dubbio; il chirurgo, prima di fare un intervento demolito, vuole la
certezza per cui fa la biopsia incisionale e la manda all’anatomopatologo. Quindi ci sono delle
situazioni in cui ho programmato questo.
Oppure nella tiroide ho un nodulo sospetto, anche l’agoaspirato mi ha lasciato dei dubbi e
quindi prima che faccio lo svuotamento dei linfonodi riserve sapere se è un carcinoma
papillifero.
Quindi è tutto programmato ma questo esame nel tempo si è ridotto in termini di frequenza
perchè era quasi esclusivamente appannaggio del carcinoma della mammella.
Negli Anni 80-90’ quando si aveva un nodulo alla mammella, prima, si faceva l’esame in
estemporanea e poi si faceva la quadrantectomia o mastectomia e cavo ascellare, ma erano
altri tempi. Oggi io non lo faccio l’esame in estemporaneo per il carcinoma della mammella, solo
quando ho dei dubbi ma nella maggior parte dei casi non lo faccio perchè oggi è cambiato il
modo di vedere il cancro alla mammella. Oggi si fa l’agobiopsia con la fissazione e la
processazione normale, il patologo mi dice cos’è, se è un carcinoma, il grado, i recettori che
esprime e alla luce di ciò si stabilisce il trattamento. Oggi non si fa quasi più l’esame in
temporaneo alla mammella perchè oggi si lavora su agobiopsia.
Quindi questi esami estemporanei programmati diventano sempre meno frequenti.
Per le lesioni cerebrali invece spesso ce lo chiedono.

Il prof ci fa vedere il blocchetto con il pezzo in paraffina; per avere il vetrino dobbiamo prima
portare il pezzo a questo livello. Il blocchetto è del pz, lo devo conservare per 20 anni, io sono
solo il custode del pz; è una sorta di banca biologica di pezzi fissati in formalina e inclusi in
paraffina.

Come si fa questa processazione chimica?

Quindi abbiamo il pezzo in formalina da 24h e lo dobbiamo portare in paraffina, “cera” che è
idrofoba, l’acqua non le piace quindi devo togliere l’acqua dal tessuto (la formalina è anche
diluita in acqua) e allora chi toglie l’acqua ? l’alcol! L’alcol disidratata quindi etanolo prima al
75%,poi a 85%, a 95% fino a etanolo al 100% (ci voglio 4-5-6h) , alla fine l’acqua contenuta nel
tessuto viene estratta.
A questo punto dobbiamo arrivare alla paraffina ma questa in natura è solida e a noi serve
liquida quindi immaginate che c’è un contenitore che riscalda la paraffina a 60à e la paraffina
aspetta il pezzo che arriva.
Il pezzo, una volta tolta l’acqua, non è ancora pronto per buttarsi direttamente nella
paraffina quindi dopo la disidratazione c’è un altro passaggio preparatorio, la diafanizzazione>
il pezzo viene immerso nello xilolo che è un liquido che prepara il pezzo prima di arrivare al
bagno di paraffina che è liquida perchè abbiamo detto che la paraffina viene tenuta liquida. Lo
xilolo è quindi un liquido di preparazione, come un unguento, diafanizza cioè purifica. Alla fine,
dopo che il pezzo è stato nello xililolo e fa il bagno in paraffina calda e ci sta 3-4-5-6h e alla
fine viene tirato fuori e il pezzo viene messo in una macchina che alla fine mi dà il pezzo
incluso in paraffina solidificata. A questo punto il pezzo è duro e posso tagliarlo.
Fissazione> processazione> inclusione in paraffina> taglio con il microtomo e si possono fare
tante sezioni> poi vetrino> colorate.
Quindi avremo alla fine delle sezioni colorate o delle cellule colorate.
Quando tagliate tutta sta cosa in paraffina avete solo dei pezzi bianchi e non vedreste niente
se non colorate. La colorazione standard è ematossilina ed eosina; l’ematossilina colora in blu
mentre l’eosina in rosa.
Ma allora cosa vediamo, la verità?! Noi vediamo una verità colorata, noi abbiamo descritto
malattie con dei colori ma nella realtà le cellule non sono colorate, noi non vediamo una realtà
ma quella che percepiamo in base ai colori. La realtà esiste solo che per me, quello che è
realtà, è la sintesi di quello che il sistema neurale mi permette di vedere; noi vediamo una
piccola finestra della realtà, noi vediamo una sintesi enorme della realtà.
Addirittura noi qui non vediamo la realtà perchè vediamo sezioni, non tridimensionali, che
coloriamo. I nostri cervelli sono abituati a vedere un mondo microscopico che non è la realtà
ma un filtro per capire il mondo macroscopico. Tra noi è la realtà c’è il linguaggio, la mente
umana non può immaginare tutto.

Quello che vediamo al microscopio è bidimensionale e colorata e quindi è una sintesi. Non c’è
uno strumento che ci dà la realtà perché tra noi e la realtà ci siamo noi che siamo un filtro.
Noi però grazie a tutto ciò abbiamo una conoscenza per forma, morfologica. La base è la
forma, io conosco per forma e allora l’esame istologico, l’esame citologico cosa sono ?
Morfologia!
L’anatomia patologica e quindi il mondo microscopico è una scienza morfologica, una scienza
che studia la forma delle cose; studia le forme alterate del male di vivere perchè quando hai
un tumore vedi le cellule alterate che si discostano dalla realtà quindi il male di vivere in
realtà è la patologia cellulare, il mare di vivere è cellulare.

Ma allora oggi come si fa la diagnosi? Se abbiamo detto che lei vuole conoscere per forma
quale sarebbe il migliore microscopio? Uno penserebbe di usare il microscopio elettronico
perchè per conoscere la realtà l’uomo pensa che i suoi occhi devono essere più vicini possibili
all’oggetto da studiare ma così avrei poco (il prof ci fa vedere una calza di Maryln ma per dirci
che in realtà così abbiamo poco). Il microscopio elettronico ci fa vedere il reticolo
endoplasmatico, la membrana nucleare ecc ecc ma è come avere gli occhi proprio attaccati su
qualcuno e non capiremo chi è; dobbiamo stare ad una certa distanza, questo è il concetto del
riduzionismo filosofico cioè io per conoscere una cosa la conosco per forma ma devo stare
rispetto all’oggetto conosciuto ad una certa distanza, alla distanza giusta perchè più mi
avvicino, più vado nel dettaglio, più perdo il contorno e non so che cos’è. Nessun uomo è in
grado di fare diagnosi di benignità e malignità col microscopio elettronico perchè ci mette
troppo vicino alla realtà. L’uomo quando è troppo vicino alla realtà non la comprende, l’uomo
comprende la realtà quando sta ad una certa distanza da essa esattamente quando sta ad un
punto di osservazione giusto, idoneo per i propri mezzi e quindi col MICROSCOPIO OTTIVO
cioè devo vedere le cellule ma non devo stare dentro le cellule perchè non le capirei.
Vi ho spiegato che e diagnosi istologiche si fanno con il microscopio ottico e non con
l’elettronico. Oggi il microscopio elettronico è utilizzato per alcune cose, studi di ricerca o per
biopsia dei glomeruli, per alcune glomerulopatie ( per es la glomerulopatia da pedicelli o
nefrosi lipoidea) oppure per lo studio delle patologia muscolari, articolari ultraselettive e per
lo studio del nervo periferico.