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INDAGINI ISTOLOGICHE

 L’indagine istologica per la microscopia ottica si compie attraverso una serie di 6 fasi: PRELIEVO, FISSAZIONE,
INCLUSIONE, TAGLIO DELLE SEZIONI, COLORAZIONE e MONTAGGIO DEL VETRINO.

PRELIEVO
 Il prelievo del tessuto o dell’organo va effettuato immediatamente dopo la morte dell’animale sacrificato, per
non andare incontro alla degradazione dovuta all’azione di microrganismi (come le muffe) o all’azione di enzimi liti-
ci endocellulari liberati dall’organismo stesso dopo la morte.

FISSAZIONE
 È una tappa fondamentale per avere un buon preparato. Lo scopo è di bloccare i rapidi processi di degenerazio-
ne cellulare e tissutale e di avere quindi un quadro risultante che sia il più possibile vicino a quello del vivente.
 I metodi di fissazione provocano tutti una disidratazione del pezzo perché, sottraendo acqua ai tessuti, si va ad
alterare il microambiente delle proteine (e perciò degli enzimi), impedendone l’azione.
 I fattori decisivi per una buona fissazione sono:
1) Temperatura di fissazione: deve essere bassa, sui 4-5°C, sempre perché è essenziale bloccare
l’azione enzimatica. Contemporaneamente non si deve mai raggiungere gli 0°C, in quanto
l’acqua presente nei tessuti cristallizzerebbe, danneggiandoli.
2) Volume del pezzo da prelevare: deve essere piuttosto piccolo in quanto la fissazione si compie
prima in superficie e solo successivamente nelle parti profonde. Più il volume del pezzo è piccolo,
più la fissazione risulterà veloce. Ovviamente sono molto migliori i pezzi con grande superficie e
piccolo volume (è meglio, ad esempio, una lamina di un cubo).
 La fissazione può essere di due tipi: CHIMICA o FISICA. La prima fa uso di fissativi che agiscono con meccanismi
differenti e che hanno il compito, o di bloccare l’azione degli enzimi, o di stabilizzare i tessuti (formando legami con i
componenti dei tessuti stessi); la seconda ha un vantaggio notevole e cioè quello di non utilizzare sostanze che posso-
no provocare alterazioni chimiche nel pezzo da trattare. La fissazione fisica più utilizzata è il congelamento unito al-
la disidratazione (FREEZEDRYING).
 Per quanto riguarda la fissazione di tipo chimico, invece, il discorso si fa un po’ più complicato in quanto il tipo di
fissativo varia a seconda dell’inclusione che si desidera fare (per la microscopia elettronica, o per l’ottica, ad esem-
pio), a seconda del pezzo che dobbiamo andare ad includere, e a volte anche a seconda della colorazione che poi
dovremo effettuare sulla fetta tagliata.
 Generalmente, per lavori come quelli che eseguiremo durante l’internato, si utilizzerà la formalina, un buon fissa-
tivo per la maggior parte delle colorazioni utilizzate, e per il tipo di inclusione (inclusione in paraffina) comunemente
effettuato.

INCLUSIONE DEI PEZZI PRELEVATI IN PARAFFINA


USIAMO COME ESEMPIO L’INCLUSIONE DOPO FISSAZIONE IN FORMALINA.

 Dopo aver tagliato i pezzi, li pongo in formalina in modo che questi vengano fissati.
 Porli in alcool 80° (occorre la disidratazione completa del pezzo, visto che la paraffina non è solubile in H2O) dove
possono rimanere anche per alcuni giorni (i tempi variano a seconda delle dimensioni del pezzo da trattare).
 Poi effettuare un passaggio in alcool 96° (max 8 ore), e quindi in alcool assoluto (min 2-3 ore).
 A questo punto, per completare la disidratazione, è necessario effettuare un passaggio in xilolo (max 30 minuti).
 Adesso è il momento dell’immersione in paraffina. Si hanno due tipi di paraffina, che vengono distinti per il loro
grado di purezza: paraffina I (impura per la presenza di residui di xilolo) per almeno 30 minuti (per pezzi piccoli), e
quindi paraffina II (più pura, avrà la medesima composizione della paraffina di inclusione) per 2 ore minimo.

 I passaggi in alcool 80° e 96° servono per pulire il pezzo. Allo scopo di detergerlo più rapidamente, il 1° giorno pos-
so cambiare più volte l’alcool 80° e quindi posso effettuare più cambi anche con il 96°.
 In linea di massima:

Lunedì mattina Ore 09.00 Alcool 80° (uno o più cambi)


Martedì mattina Ore 09.00/13.00 Alcool 96° (uno o più cambi)
Ore 13.00 Alcool assoluto
Martedì pomeriggio Ore 18.00 Xilolo
Ore 19.00 Paraffina I
Mercoledì mattina Ore 13.00 Paraffina II
Mercoledì pomeriggio Ore 16.00 Inclusione dei pezzi

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 Per l’inclusione: prendere lo stampo metallico dalla stufa, versarvi un po’ di paraffina liquida, prendere il pezzo e
posarlo nella vaschetta.
 Aspettare che intorno al pezzo si formi un alone perché versando la paraffina per rabboccare lo stampo, il pezzo
potrebbe spostarsi, quando ciò è avvenuto versare la paraffina liquida sul pezzo facendo attenzione che non si for-
mino bolle d’aria e che il pezzo sia completamente coperto.
 Aspettare finché la paraffina non si è solidificata bene, quindi mettere il tutto in frigorifero per 5 minuti.
 Una volta estratto il pezzo dallo stampo, questo è già pronto per essere tagliato.

PREPARAZIONE DELLE SEZIONI PER IL MICROTOMO


 Prendere il pezzo incluso e montarlo sul cubetto di legno (se non è già montato e se non è stato incluso sulle lami-
ne di plastica per l’inclusore), fluidificando la paraffina con una spatola di ferro riscaldata.
 Mettere il tutto in frigorifero per alcuni minuti.
 Preparare il microtomo. Montare la lama e quindi il pezzo sul supporto avendo cura di porlo parallelamente alla
lama.
 Preparare una vaschetta con H2O distillata e gelatina (agar agar) e scaldarla su una stufetta (la temperatura su
una stufa a termostato dovrebbe essere di 37°/40°.
 Avere sempre a disposizione del ghiaccio per raffreddare la paraffina in cui è incluso il pezzo.
 Posizionare le misure del taglio sullo spessore desiderato (in generale 8-10 m per il tessuto nervoso, e 4 m per gli
altri tessuti. A volte però le misure vanno variate).
 Prelevare le fettine con un pennellino e depositarle nella vaschetta in modo che si distendano sul pelo dell’acqua.
Fare attenzione perché la temperatura dell’acqua non sia troppo alta: scioglierebbe la paraffina.

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TECNICHE DI COLORAZIONE
SPARAFFINATURA DELLE FETTE

 I passaggi per la sparaffinatura delle fette sono sempre gli stessi, qualsiasi colorazione dobbiamo effettua-
re:

Soluzione di immersione Tempo di immersione


Xilolo I 5 minuti
Xilolo II 5 minuti
Alcool assoluto (100°) 5 minuti
Alcool 96° 2 minuti
Alcool 80° 2 minuti
Acqua distillata 2 minuti

 I tempi di immersione possono variare leggermente a seconda della dimensione della fetta sul vetrino e del
suo spessore. Ovviamente, una fetta di dimensioni e spessore maggiori, avrà bisogno di un maggior tempo di
immersione per poter essere sparaffinata in modo adeguato.
 Il passaggio in acqua, generalmente è d’obbligo. Se dovesse essere necessario saltarlo, sarà indicato nella
procedura specifica della colorazione presa in esame.

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EMATOSSILINA – EOSINA

 Dopo aver effettuato la sparaffinatura, occorrono i seguenti passaggi:

Soluzione di immersione Tempo di immersione


Acqua di fonte 1 minuto
Ematossilina di Mayer 8 – 10 minuti *
Acqua di fonte Almeno 2 minuti **
Eosina G 15 – 20 secondi
Acqua di fonte Passaggio veloce ***
Alcool 80° Passaggio veloce ***
Alcool 96° Passaggio veloce ***
Alcool assoluto (100°) I 2 minuti
Alcool assoluto (100°) II 2 minuti
Xilolo 4 minuti

* = La variazione tra 8 e 10 minuti è indicata in quanto il colorante “nuovo” colora più facilmente ed è suffi-
ciente un minor numero di minuti di immersione. Se dovesse essere necessaria una colorazione molto pallida,
per far sì che l’ematossilina non copra altre strutture positive al colorante “parallelo”, potrebbero essere suffi-
cienti anche soli 2 minuti di immersione.
** = Il passaggio in acqua di fonte dopo l’immersione in ematossilina, serve a differenziare la tonalità del colo-
rante che, da un rosso brunastro di partenza, deve raggiungere un colore violetto intenso. Una volta raggiun-
ta la gradazione di colore desiderata, si può procedere al passaggio successivo.
*** = Si effettuano solamente passaggi veloci (e cioè immersioni rapide con un certo movimento del vetrino
all’interno del pozzetto) per dilavare l’eosina in eccesso senza toglierla del tutto. Nel passaggio in alcool asso-
luto, la possibilità di dilavare il colorante cessa, in quanto manca la componente acquosa. Durante i passaggi
veloci si consiglia di portare avanti un vetrino alla volta fino all’alcool assoluto.

EMATOSSILINA = Colorante basico che si lega agli acidi nucleici e dà un colore violetto.
EOSINA = Colorante acido che si lega alle proteine basiche del citoplasma e dà un colore rosso-rosato.

EMATOSSILINA-EOSINA = Colorazione di base che ci permette di identificare chiaramente, all’interno di un


tessuto, i nuclei delle cellule che lo compongono (colorati in viola) e le strutture cellulari di base (il cui citopla-
sma è colorato in rosa).

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VAN GIESON

 Dopo aver effettuato la sparaffinatura, occorrono i seguenti passaggi:

Soluzione di immersione Tempo di immersione


Acqua di fonte 1 minuto
Ematossilina di Mayer 8 – 10 minuti *
Acqua di fonte Almeno 2 minuti **
Soluzione Van Gieson 30 secondi
Acqua di fonte Passaggio veloce ***
Alcool 80° Passaggio veloce ***
Alcool 96° Passaggio veloce ***
Alcool assoluto (100°) I 2 minuti
Alcool assoluto (100°) II 2 minuti
Xilolo 4 minuti

* = La variazione tra 8 e 10 minuti è indicata in quanto il colorante “nuovo” colora più facilmente ed è suffi-
ciente un minor numero di minuti di immersione. Se dovesse essere necessaria una colorazione molto pallida,
per far sì che l’ematossilina non copra altre strutture positive al colorante “parallelo”, potrebbero essere suffi-
cienti anche soli 2 minuti di immersione.
** = Il passaggio in acqua di fonte dopo l’immersione in ematossilina, serve a differenziare la tonalità del colo-
rante che, da un rosso brunastro di partenza, deve raggiungere un colore violetto intenso. Una volta raggiun-
ta la gradazione di colore desiderata, si può procedere al passaggio successivo.

VAN GIESON = Dà una colorazione giallo-rosata ai tessuti: il tessuto connettivo e le fibre collagene colorano in
rosso, il tessuto muscolare e l’epitelio corneificato colorano in giallo. L’ematossilina dà il tipico colore violetto ai
nuclei cellulari.

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ALCIAN BLU

 Dopo aver effettuato la sparaffinatura, occorrono i seguenti passaggi:

Soluzione di immersione Tempo di immersione


Acido acetico 3% 3 minuti *
Alcian blu (soluzione a pH 2.5) 30 minuti
Acido acetico 3% 3 minuti **
Acqua di fonte Passaggio veloce
Ematossilina di Mayer 8 – 10 minuti ***
Acqua di fonte Almeno 2 minuti ****
Alcool 80° 1 minuto
Alcool 96° 1 minuto
Alcool assoluto (100°) I 2 minuti
Alcool assoluto (100°) II 2 minuti
Xilolo 4 minuti

* = Il primo passaggio in acido acetico, serve a mordenzare la fetta in modo che questa “si prepari” alla colo-
razione tramite la soluzione di alcian.
** = Il secondo passaggio in acido acetico, serve a dilavare l’alcian in eccesso (quei residui che non hanno colo-
rato specifiche strutture, ma sono solo rimasti a “sporcare” la colorazione) dalla fetta.
*** = La variazione tra 8 e 10 minuti è indicata in quanto il colorante “nuovo” colora più facilmente ed è suffi-
ciente un minor numero di minuti di immersione. Se dovesse essere necessaria una colorazione molto pallida,
per far sì che l’ematossilina non copra altre strutture positive al colorante “parallelo”, potrebbero essere suffi-
cienti anche soli 2 minuti di immersione.
**** = Il passaggio in acqua di fonte dopo l’immersione in ematossilina, serve a differenziare la tonalità del co-
lorante che, da un rosso brunastro di partenza, deve raggiungere un colore violetto intenso. Una volta rag-
giunta la gradazione di colore desiderata, si può procedere al passaggio successivo.

ALCIAN BLU = E’ una colorazione specifica per i mucopolisaccaridi acidi, che generalmente viene usata in as-
sociazione con la colorazione in ematossilina (per meglio evidenziare le strutture cellulari). I mucopolisaccaridi
acidi vengono colorati in azzurro intenso (così come la cartilagine, ove presente).
Se la colorazione è usata in associazione con Van Gieson, il colore Alcian Blu diventa verde.

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REAZIONE P.A.S.

 Dopo aver effettuato la sparaffinatura, occorrono i seguenti passaggi:

Soluzione di immersione Tempo di immersione


Acido periodico 1% 5 minuti *
Acqua di fonte Passaggio veloce
Reattivo di Schiff 15 minuti **
Acqua di fonte Almeno 5 minuti ***
Ematossilina di Mayer 8 – 10 minuti ****
Acqua di fonte Almeno 2 minuti *****
Alcool 80° 1 minuto
Alcool 96° 1 minuto
Alcool assoluto (100°) I 2 minuti
Alcool assoluto (100°) II 2 minuti
Xilolo 4 minuti

* = Il passaggio in acido periodico serve a provocare una reazione chimica all’interno del tessuto trattato: si ha
la formazione di aldeidi.
** = Il reattivo di Schiff è tossico, perciò va maneggiato con cura, andrebbero usati i guanti. Non deve venire a
contatto con alcun tipo di metallo, altrimenti si ossida e non colora più; se dovesse accadere che la soluzione di
lavoro si ossidasse, non riutilizzarla ma gettarla via. Il reattivo va tenuto in frigorifero, al riparo dalla luce.
Quando si effettua questo tipo di colorazione occorre prendere lo Schiff dal frigorifero appena prima
dell’utilizzo, in modo che sia ancora fresco.
*** = Il passaggio in acqua di fonte dopo l’immersione nel reattivo di Schiff ha la funzione di evidenziare il co-
lore rosso fucsia tipico di questa colorazione. Infatti, il reattivo è di colore trasparente (se fosse rosa potrebbe
essere stato contaminato da residui di acqua) e non evidenzia colorazione all’interno del tessuto fintanto che
non si immerge il vetrino in acqua.
**** = La variazione tra 8 e 10 minuti è indicata in quanto il colorante “nuovo” colora più facilmente ed è suf-
ficiente un minor numero di minuti di immersione. Se dovesse essere necessaria una colorazione molto pallida,
per far sì che l’ematossilina non copra altre strutture positive al colorante “parallelo”, potrebbero essere suffi-
cienti anche soli 2 minuti di immersione.
***** = Il passaggio in acqua di fonte dopo l’immersione in ematossilina, serve a differenziare la tonalità del co-
lorante che, da un rosso brunastro di partenza, deve raggiungere un colore violetto intenso. Una volta rag-
giunta la gradazione di colore desiderata, si può procedere al passaggio successivo.

P.A.S. = E’ un tipo di colorazione particolare, in quanto si tratta di un metodo ISTOCHIMICO (vengono effet-
tuati legami di tipo chimico tra alcune sostanze all’interno del tessuto, in modo da evidenziarle). L’immersione
in acido periodico forma delle aldeidi alle quali si lega poi il reattivo di Schiff (formando un composto color
magenta, insolubile), colorandole elettivamente nel tipico rosa fucsia, in modo che esse siano visibili al micro-
scopio ottico. Tra i componenti tissutali P.A.S.-positivi, abbiamo le membrane basali, la colloide della tiroide e
della ghiandola pituitaria, l’elastina, la chitina e le mucine neutre.

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ALCIAN – P.A.S.

 Dopo aver effettuato la sparaffinatura, occorrono i seguenti passaggi:

Soluzione di immersione Tempo di immersione


Acido acetico 3% 3 minuti *
Alcian blu (soluzione a pH 2.5) 30 minuti
Acido acetico 3% 3 minuti **
Acqua di fonte 1 minuto
Acido periodico 1% 5 minuti ***
Acqua di fonte Passaggio veloce
Reattivo di Schiff 15 minuti ****
Acqua di fonte Almeno 5 minuti *****
Ematossilina di Mayer 8 – 10 minuti ******
Acqua di fonte Almeno 2 minuti *******
Alcool 80° 1 minuto
Alcool 96° 1 minuto
Alcool assoluto (100°) I 2 minuti
Alcool assoluto (100°) II 2 minuti
Xilolo 4 minuti

* = Il primo passaggio in acido acetico, serve a mordenzare la fetta in modo che questa “si prepari” alla colo-
razione tramite la soluzione di alcian.
** = Il secondo passaggio in acido acetico, serve a dilavare l’alcian in eccesso (quei residui che non hanno colo-
rato specifiche strutture, ma sono solo rimasti a “sporcare” la colorazione) dalla fetta.
*** = Il passaggio in acido periodico serve a provocare una reazione chimica all’interno del tessuto trattato: si
ha la formazione di aldeidi.
**** = Il reattivo di Schiff è tossico, perciò va maneggiato con cura, andrebbero usati i guanti. Non deve venire
a contatto con alcun tipo di metallo, altrimenti si ossida e non colora più; se dovesse accadere che la soluzione
di lavoro si ossidasse, non riutilizzarla ma gettarla via. Il reattivo va tenuto in frigorifero, al riparo dalla luce.
Quando si effettua questo tipo di colorazione occorre prendere lo Schiff dal frigorifero appena prima
dell’utilizzo, in modo che sia ancora fresco.
***** = Il passaggio in acqua di fonte dopo l’immersione nel reattivo di Schiff ha la funzione di evidenziare il
colore rosso fucsia tipico di questa colorazione. Infatti, il reattivo è di colore trasparente (se fosse rosa potrebbe
essere stato contaminato da residui di acqua) e non evidenzia colorazione all’interno del tessuto fintanto che
non si immerge il vetrino in acqua.
****** = La variazione tra 8 e 10 minuti è indicata in quanto il colorante “nuovo” colora più facilmente ed è
sufficiente un minor numero di minuti di immersione. Se dovesse essere necessaria una colorazione molto pal-
lida, per far sì che l’ematossilina non copra altre strutture positive al colorante “parallelo”, potrebbero essere
sufficienti anche soli 2 minuti di immersione.
******* = Il passaggio in acqua di fonte dopo l’immersione in ematossilina, serve a differenziare la tonalità del
colorante che, da un rosso brunastro di partenza, deve raggiungere un colore violetto intenso. Una volta rag-
giunta la gradazione di colore desiderata, si può procedere al passaggio successivo.

ALCIAN – P.A.S. = Anche questa è una colorazione istochimica, e quindi è più specifica delle semplici colora-
zioni istologiche. Evidenzia i mucopolisaccaridi acidi in azzurro intenso e i mucopolisaccaridi neutri in rosa fuc-
sia. I nuclei cellulari sono colorati con il blu-violetto tipico dell’ematossilina.

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P.A.S. ORANGE

 Dopo aver effettuato la sparaffinatura, occorrono i seguenti passaggi:

Soluzione di immersione Tempo di immersione


Acido periodico 1% 5 minuti *
Acqua di fonte Passaggio veloce
Reattivo di Schiff 15 minuti **
Acqua di fonte Almeno 5 minuti ***
Ematossilina di Mayer 8 – 10 minuti ****
Acqua di fonte Almeno 2 minuti *****
Orange G 20 – 30 secondi
Acqua di fonte Passaggio veloce
Alcool 80° 1 minuto
Alcool 96° 1 minuto
Alcool assoluto (100°) I 2 minuti
Alcool assoluto (100°) II 2 minuti
Xilolo 4 minuti

* = Il passaggio in acido periodico serve a provocare una reazione chimica all’interno del tessuto trattato: si ha
la formazione di aldeidi.
** = Il reattivo di Schiff è tossico, perciò va maneggiato con cura, andrebbero usati i guanti. Non deve venire a
contatto con alcun tipo di metallo, altrimenti si ossida e non colora più; se dovesse accadere che la soluzione di
lavoro si ossidasse, non riutilizzarla ma gettarla via. Il reattivo va tenuto in frigorifero, al riparo dalla luce.
Quando si effettua questo tipo di colorazione occorre prendere lo Schiff dal frigorifero appena prima
dell’utilizzo, in modo che sia ancora fresco.
*** = Il passaggio in acqua di fonte dopo l’immersione nel reattivo di Schiff ha la funzione di evidenziare il co-
lore rosso fucsia tipico di questa colorazione. Infatti, il reattivo è di colore trasparente (se fosse rosa potrebbe
essere stato contaminato da residui di acqua) e non evidenzia colorazione all’interno del tessuto fintanto che
non si immerge il vetrino in acqua.
**** = La variazione tra 8 e 10 minuti è indicata in quanto il colorante “nuovo” colora più facilmente ed è suf-
ficiente un minor numero di minuti di immersione. Se dovesse essere necessaria una colorazione molto pallida,
per far sì che l’ematossilina non copra altre strutture positive al colorante “parallelo”, potrebbero essere suffi-
cienti anche soli 2 minuti di immersione.
***** = Il passaggio in acqua di fonte dopo l’immersione in ematossilina, serve a differenziare la tonalità del co-
lorante che, da un rosso brunastro di partenza, deve raggiungere un colore violetto intenso. Una volta rag-
giunta la gradazione di colore desiderata, si può procedere al passaggio successivo.

P.A.S. ORANGE = Colorazione istochimica; un’estensione della P.A.S. reazione. E’ la colorazione elettiva per
l’ipofisi, in quanto serve a distinguere, all’interno della popolazione cellulare dell’ipofisi, i diversi tipi di cellule.
Nell’ipofisi anteriore, infatti, le cellule basofile si colorano in fucsia ( Schiff), quelle acidofile in arancio (orange
G) e quelle cromofobe in blu- violetto (ematossilina).
In genere, con il color giallo-arancio tipico dell’orange G, si colorano appunto le cellule acidofile dell’ipofisi an-
teriore, i globuli rossi ed i vasi sanguigni.

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CRESILVIOLETTO (COLORAZIONE DI NISSL)

 Dopo aver effettuato la sparaffinatura, occorrono i seguenti passaggi:

Soluzione di immersione Tempo di immersione


Acqua di fonte 1 minuto
Cresilvioletto 3 – 5 minuti *
Acqua di fonte Passaggio veloce **
Alcool 96° Passaggio veloce ***
Alcool assoluto (100°) I 2 minuti
Alcool assoluto (100°) II 2 minuti
Xilolo 4 minuti

* = Il tempo di immersione può variare a seconda dello spessore della fetta, della intensità di colore desidera-
ta, e della freschezza della soluzione di cresilvioletto (più è fresca, meglio colora).
** = Il passaggio in acqua di fonte dopo l’immersione in cresilvioletto deve essere necessariamente molto velo-
ce. Infatti l’acqua dilava molto facilmente il colorante dalla fetta, che rischia di rimanere troppo chiara.
*** = Si passa direttamente in alcool 96° (saltando il passaggio in 80°) per lo stesso motivo che ci impone di ef-
fettuare un passaggio veloce in acqua: il colorante si dilaverebbe troppo. Se però la fetta dovesse essere mol-
to colorata, e fosse necessario schiarirne la tonalità, è possibile effettuare un passaggio intermedio in alcool
80°, sempre stando molto attenti a non perdere completamente la colorazione.

CRESILVIOLETTO = Questa colorazione è specifica per gli acidi nucleici e per la sostanza di Nissl (componente
del sistema nervoso). È appunto utilizzata come colorazione di base all’interno del sistema nervoso.

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LUXOL

 Dopo aver effettuato la sparaffinatura, saltando l’immersione in acqua distillata, occorrono i seguenti pas-
saggi:

Soluzione di immersione Tempo di immersione


Luxol Fast Blue Tutta la notte a 60°C *
Alcool 96° Risciacquo **
Acqua distillata Passaggio veloce
a) Carbonato di litio
b) Alcool 70° Passaggi veloci ripetuti***
c) Acqua distillata
Acqua distillata 1 minuto
Cresilvioletto 3 – 5 minuti ****
Acqua di fonte Passaggio veloce *****
Alcool 96° Passaggio veloce ******
Alcool assoluto (100°) I 2 minuti
Alcool assoluto (100°) II 2 minuti
Xilolo 4 minuti

* = Avere cura di chiudere bene il contenitore con la soluzione e i vetrini. Il colorante, infatti, è a base alcolica,
ed evaporerebbe in fretta, alla temperatura necessaria per la colorazione.
** = Effettuare più lavaggi di risciacquo con alcool 96° in modo da togliere ogni residuo di colorante in eccesso.
*** = Ripassare in a, b e c finché la sostanza grigia e quella bianca non sono ben differenziate l’una dall’altra: il
colore blu-verde dei fasci di sostanza bianca, deve contrastare i colori pallidi della sostanza grigia.
**** = Il tempo di immersione può variare a seconda dello spessore della fetta, della intensità di colore deside-
rata, e della freschezza della soluzione di cresilvioletto (più è fresca, meglio colora).
***** = Il passaggio in acqua di fonte dopo l’immersione in cresilvioletto deve essere necessariamente molto ve-
loce. Infatti l’acqua dilava molto facilmente il colorante dalla fetta, che rischia di rimanere troppo chiara.
****** = Si passa direttamente in alcool 96° (saltando il passaggio in 80°) per lo stesso motivo che ci impone di
effettuare un passaggio veloce in acqua: il colorante si dilaverebbe troppo. Se però la fetta dovesse essere
molto colorata, e fosse necessario schiarirne la tonalità, è possibile effettuare un passaggio intermedio in alcool
80°, sempre stando molto attenti a non perdere completamente la colorazione.

LUXOL = Si tratta di una colorazione elettiva per il tessuto nervoso. Serve ad evidenziare in modo chiaro e
preciso i fasci di sostanza bianca all’interno del sistema nervoso centrale. Questi fasci vengono colorati in blu
dal luxol, mentre il cresilvioletto colora in viola le cellule nervose.

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IMPREGNAZIONE ARGENTICA
Metodo Bielschowsky modificato da Gless

 Dopo aver effettuato la sparaffinatura, occorrono i seguenti passaggi:

Soluzione di immersione Tempo di immersione


Sol. acquosa fresca di Nitrato d’Argento 20% 5 minuti *
Formalina 10% Almeno due cambi **
Acqua di fonte Lavaggio accurato
Argento ammoniacale 40 secondi / 1 minuto ***
Formalina 10% Almeno due cambi di 1
minuto ciascuno ****
Acqua di fonte Lavaggio accurato *****
Tiosolfato di sodio 5% 3 minuti
Acqua di fonte Lavaggio accurato
Alcool 80° 1 minuto
Alcool 96° 1 minuto
Alcool assoluto (100°) I 2 minuti
Alcool assoluto (100°) II 2 minuti
Xilolo 4 minuti

* = Questo passaggio va effettuato al buio e alla temperatura di circa 50°C. Bisognerà perciò evitare
l’esposizione alla luce diretta durante l’immersione del vetrino nella soluzione e quindi porre la vaschetta in
stufa. Inoltre, la soluzione di nitrato d’argento non deve venire a contatto con metalli di alcun genere, perciò
dovremo aver cura di evitare questo tipo di contatto.
N.B.: la soluzione in oggetto va FILTRATA con una certa scrupolosità prima dell’immersione del vetrino, al fi-
ne di evitare un eccessivo deposito di residui sulla fetta.
** = Dopo aver fatto raffreddare la soluzione di nitrato d’argento, ed aver accuratamente sgocciolato il vetri-
no, senza però lavarlo in acqua, è necessario effettuare un “lavaggio” in formalina 10%, ed i due cambi si ren-
dono fondamentali in quanto al primo cambio la soluzione viene “sporcata” eccessivamente per effettuare un
buon lavaggio.
*** = Asciugare delicatamente il vetrino con la sezione e porlo nella soluzione di argento ammoniacale, che
deve essere preparata al momento.
**** = Dopo aver sgocciolato i vetrini, immergerli in formalina (i due cambi hanno esattamente la stessa fun-
zione che avevano al primo passaggio in questa soluzione). Durante l’immersione la fetta dovrebbe assumere
un color tabacco intenso.
***** = Dopo il lavaggio in acqua, è utile un passaggio ulteriore per indicare se l’impregnazione è avvenuta
correttamente: osservare il vetrino al microscopio ottico. Se le strutture da evidenziare sono già tutte ben
chiaramente differenziate, procedere con il resto della colorazione, diversamente, se l’impregnazione non è
completa, effettuare nuovamente i passaggi dall’immersione in argento ammoniacale in poi.

RISULTATO = I neuroni e le neurofibrille sono colorate in nero, sia per quanto riguarda il pirenoforo, che per
l’assone, i nuclei assumono una tonalità dal nero al marrone, e la colorazione di fondo è bronzo-dorato. Si
mettono in evidenza in nero anche le fibre amieliniche e le terminazioni nervose.

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P.T.A.H.

 Dopo aver effettuato la sparaffinatura, occorrono i seguenti passaggi:

Soluzione di immersione Tempo di immersione


Fluido di Zenker 20 minuti a 60°C
Acqua di fonte 5 minuti
Soluzione di Lugol 10 minuti
Alcool 96° 15 minuti*
Acqua distillata 3 minuti
Permanganato di Potassio 8 minuti**
Acido ossalico 5% 3 minuti***
Acqua di fonte 3 minuti
Acqua distillata Passaggio veloce
Soluzione P.T.A.H. 24 ore
Alcool 96° Passaggio veloce****
Alcool assoluto (100°) I 4 minuti
Alcool assoluto (100°) II 2 minuti
Xilolo 4 minuti

* = Il tempo di immersione è indicato approssimativamente, in quanto questo passaggio serve per decolorare
le fette: se dovesse essere necessario, si può aumentare il tempo.
** = Come per il reattivo di Schiff, è necessario prestare attenzione affinché la soluzione non venga a contatto
con metalli di alcun genere.
*** = L’acido ossalico decolora completamente la fetta dall’eccesso di permanganato.
**** = Il passaggio in alcool 96° serve a cominciare la disidratazione, ma bisogna stare attenti a non lasciarvi le
fette troppo tempo. E’ sufficiente scuotere il vetrino nel pozzetto dell’alcool 96° per qualche secondo e passare
all’immersione in alcool assoluto.

RISULTATO = Questa colorazione è specifica per il sistema nervoso centrale. Nel cervello e nel midollo spinale
il corpo cellulare dei neuroni si presenterà in giallo-arancio, le fibre nervose in viola-blu e le fibre mieliniche in
viola intenso. Ovviamente all’interno del midollo il viola sarà più intenso per la presenza di un maggior nu-
mero di fibre mieliniche.

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SAFRANINA – VERDE LUCE

 Dopo aver effettuato la sparaffinatura, occorrono i seguenti passaggi:

Soluzione di immersione Tempo di immersione


Safranina alcolica di Pfitzner 24 ore
Acqua distillata Passaggio veloce
Soluzione acquosa satura di acido picrico Differenziare*
Verde luce 30 secondi
Alcool assoluto (100°) I 2 minuti**
Alcool assoluto (100°) II 2 minuti**
Xilolo 4 minuti

* = Il tempo varia a seconda della velocità di differenziazione. La cosa migliore per capire quando togliere le
fette dall’acido picrico sarebbe aiutarsi con il microscopio finché non si nota che il citoplasma è decolorato
quasi completamente.
** = Se si nota un eccessivo scolorimento del verde durante i passaggi in alcool assoluto, ridurre i tempi al mi-
nimo necessario per una disidratazione accettabile e passare in xilolo.

SAFRANINA – VERDE LUCE = Colorazione di insieme che può essere messa a parallelo con la classica ematos-
silina-eosina. Il citoplasma viene colorato dal verde luce e presenta perciò diverse tonalità di verde mentre i
nuclei si colorano in rosso.

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