Corso di laurea triennale in

Scienze Biologiche e
Biotecnologie
Corso a scelta in BIOCHIMICA CLINICA

Lezione 2

Errori e Variabilità

1
 Variabilità Totale
Pre-ANALITICA

Variabilità
Totale

Analitica Biologica

Pre- Post- Intra Inter

analitica Analitica analitica individuale individuale

2
 Errori di campionamento (I)

Gli errori effettuati nella fase di raccolta del campione biologico in molti casi
possono invalidare i risultati dell’intero processo analitico!
Comunemente sono commessi errori al momento del prelievo:
• Emolisi del campione di sangue in seguito a veno-puntura.
• Emoconcentrazione che può essere causata da stasi prolungata, se il laccio
emostatico non è rimosso subito dopo la puntura.
• Erronea scelta del contenitore per il campione biologico (esempio, provetta con
l’anticoagulante non idoneo all’analisi richiesta).

3
 Errori di campionamento (II)
Emolisi

L'emolisi è il processo di distruzione dei globuli rossi. L'emolisi è un

processo fisiologico in ogni essere umano ed è necessario per rinnovare la
popolazione degli eritrociti, che solitamente hanno una vita media di circa
120 giorni.

4
 Errori di campionamento (III)

• Sito inappropriato di prelievo (es., prelievo arterioso e non venoso).

• Conservazione sbagliata del campione (es., ritardo nell’invio del campione al
laboratorio).
• Campione insufficiente (errore di raccolta delle urine per l’esame delle urine
delle 24 h; non corretto bilanciamento della quantità di sangue prelevata con
l’anticoagulante già presente nella provetta).
• Errori nel campionamento a tempo.

5
 Errori durante il trasporto (I)

E’ molto importante che i tempi non siano eccessivi perché influenzano la

stabilità del materiale e quindi l’accuratezza della misura.
In generale, dal momento in cui si effettua il prelievo è importante eseguire:
• I test su fattori della coagulazione immediatamente;
• La centrifugazione entro 1 h (se si lavora sul siero);
• L’esame emocromocitometrico entro 7 h;
• La VES non oltre le 24 h dal prelievo.

6
 Errori durante il trasporto (II)

Non tutti gli analiti presentano la stessa STABILITA’ in un campione di

SANGUE INTERO conservato A TEMPERATURA AMBIENTE.
Ad esempio:
• Ormoni → 1 settimana
• Na +, acido urico, colesterolo, trigliceridi →3 giorni
• amilasi, transaminasi → 2-3 giorni
• glucosio, lipasi → meno di 4 ore
• ammonio → rapido aumento
• glucosio→ diminuisce a tutte le temperature, perché viene metabolizzato
• K+→aumenta a causa della lisi eritrocitaria e piastrinica

7
 Errori durante il trasporto (III)
A distanza

Vi sono dei casi in cui è necessario inviare un campione biologico in laboratori

distanti; è necessario rispettare alcune norme:
• I contenitori impiegati per la spedizione devono essere di dimensioni idonee,
infrangibili e muniti di tappi a tenuta sicura.
• Durante il trasporto vanno evitate eccessive vibrazioni per i loro effetti dannosi
sui fattori della coagulazione e sugli elementi figurati del sangue.
• Se il campione esige una conservazione a bassa temperatura è indispensabile
l’aggiunta di ghiaccio sintetico o secco o azoto liquido nella spedizione, in modo
da mantenere il campione alla temperatura prevista per il tempo necessario al
trasporto.

8
 Errori durante il trasporto (IV)
A distanza

Ogni campione deve giungere al laboratorio già accuratamente

etichettato:
• indicati dati identificativi del soggetto;
• inchiostro indelebile su etichetta ben adesa al tubo.
• indicati data e ora del prelievo.
Il laboratorio può rifiutare i campioni:
• Se non sono etichettati o sono etichettati in modo improprio;
• Se si sono danneggiati durante il trasporto;
• Se non sono raccolti e/o conservati correttamente;
• Se sono contaminati esternamente.

9
 Errori di conservazione (I)

Quando il laboratorio non è in grado di eseguire immediatamente tutti gli esami

richiesti, il campione biologico deve essere conservato nel modo migliore in
modo che non intervengano variazioni nella sua composizione o nelle sue
proprietà.
La natura delle variazioni che possono alterare la composizione di un
campione biologico è riconducibile a:
Cause di tipo fisico: avvengono in tempi lunghi e riguardano
fondamentalmente dei cambiamenti fra fasi differenti (liquido-solido, liquido-
vapore, ecc.), ad esempio, l’evaporazione.

10
 Errori di conservazione (II)

Cause di tipo chimico-fisico: avvengono in tempi brevi o medi e sono

processi chimico-fisici in grado di indurre modificazioni o nella composizione o
nella struttura di alcuni costituenti biochimici, ad esempio, l’effetto fotochimico,
denaturazione e aggregazione.

11
 Errori di conservazione (III)

Cause di tipo biochimico o biometabolico: avvengono in tempi brevi o

brevissimi. Al momento del prelievo vengono a mancare i sistemi biologici di
regolazione generale e cambiano drasticamente le condizioni ambientali,
pertanto le sostanze che in vivo si trovano in uno stato metabolico dinamico
possono subire ampie modificazioni nella concentrazione; Le modificazioni
nel tempo dopo il prelievo di alcune sostanze possono essere di entità
drammatica sia in aumento (H+, acido lattico, NH4+), sia in diminuzione
(glucosio).

12
 Per una corretta conservazione dei campioni

• Rapida sieratura e tempestiva separazione del siero o del plasma dalla parte
corpuscolata;
• Refrigerazione dei campioni a 4 °C: e’ raccomandata ogni qualvolta
l’esecuzione delle analisi è prevista oltre le 4 ore dopo il prelievo poiché rallenta i
processi metabolici;
• Refrigerazione dei campioni che lo necessitano a -20 °C;
• Conservazione al buio: alcune sostanze biologiche (ad es. bilirubina,
riboflavina, b-carotene, ecc.) tendono a degradarsi con le radiazioni solari;
• Uso di provette con tappo a tenuta: evita l’alcalinizzazione
dei campioni causata dall’evaporazione della CO2; minimizza
l’evaporazione dei campioni e riduce il rischio infettivo per il
personale.
13
 Variabilità Totale
ANALITICA

Variabilità
Totale

Analitica Biologica

Pre- Post- Intra Inter

analitica Analitica analitica individuale individuale

14
 Variabilità analitica (I)

Se uno stesso campione biologico viene analizzato ripetutamente (nello stesso

laboratorio o in laboratori differenti) anche utilizzando lo stesso metodo di analisi
e gli stessi strumenti, non si ottengono gli stessi valori.

La variabilità analitica è uno dei fattori responsabili delle differenze che si

osservano tra i valori analitici ripetuti e dipende dal metodo analitico utilizzato.
Qualunque metodo di misura, basato su qualunque principio, mostra una
variabilità. La variabilità analitica è legata a due componenti: ACCURATEZZA (o
INACCURATEZZA) e PRECISIONE del metodo di misura .

15
 Variabilità analitica (II)
Accuratezza e Inaccuratezza

ACCURATEZZA: E’ il grado di concordanza tra la stima ed il valore vero della

grandezza. Il termine accuratezza si riferisce alla affidabilità di una metodica,
quindi riflette l’abilità di un metodo a riprodurre i valori dei campioni di
riferimento a concentrazione nota.
INACCURATEZZA: rappresenta lo scostamento tra la stima ed il valore vero.
L’inaccuratezza è la discordanza tra la media dei valori ottenuti misurando un
campione a concentrazione nota per un analita ed il valore vero dello stesso,
ottenuto mediante metodi “Gold standard”. E’ dovuta all’errore sistematico
(errore ripetuto). Per effetto dell’errore sistematico tutti i valori sono
uniformemente più alti o più bassi del valore vero.

16
 Variabilità analitica (III)
Precisione e Imprecisione

PRECISIONE: è il grado di concordanza tra misure replicate effettuate sul

medesimo campione.
Se il metodo e’ preciso, la variazione dei valori segue una distribuzione gaussiana:
• il 68% delle osservazioni cade tra la media e ± 1DS
• il 95 % delle osservazioni cade tra la media e ± 2DS
IMPRECISIONE: è dovuta all’errore casuale (inevitabile, involontario, di piccola
entità). Per effetto dell’errore casuale, i valori analitici replicati risultano
occasionalmente superiori o inferiori al valore vero.
La precisione si misura in termini di deviazione standard o di coefficiente di
variazione.

17
 Variabilità analitica (IV)
Distribuzione normale o gaussiana

La distribuzione gaussiana è una distribuzione di probabilità, continua, simmetrica

e completamente determinata da due parametri che sono la media μ e la
deviazione standard σ. La media è semplicemente la somma dei singoli casi
diviso i casi sommati, e la deviazione standard indica la dispersione dei valori
attorno alla media. 18
 Variabilità analitica (V)
Distribuzione normale o gaussiana

Deviazione standard (DS) o di coefficiente di variazione: La DS viene

generalmente espressa in CV%.
E’ la variazione rispetto alla media, ossia di quanto si discostano dalla media i
valori riscontrati nelle ripetute misurazioni dello stesso campione.

DS
CV (%) = X 100
media

19
Variabilità analitica (VI)
Esempi

20
 Variabilità analitica
Ricapitolando

üL’errore totale deriva dalla interazione di due tipi fondamentali di errore

- Errore casuale
- Errore sistematico

üTali errori sono la conseguenza di due distinte caratteristiche del metodo

- Imprecisione → Errore casuale (Deviazione Standard/CV%)

- Inaccuratezza → Errore sistematico (Bias)

21
 Controllo qualità

Allo scopo di tenere sotto controllo l’efficienza dei metodi di misura, ed in

particolare la precisione e l’accuratezza, si utilizzano i sistemi di controllo di
qualità.
Nei sistemi di controllo “esterni” (extralaboratorio) il laboratorio riceve,
periodicamente, campioni di controllo a concentrazione ignota e li analizza
insieme ai campioni provenienti dai pazienti.
Nei sistemi di controllo “interni” (intralaboratorio), il laboratorio usa dei
campioni a concentrazione nota e li analizza insieme ai campioni provenienti
dai pazienti.
E’ buona norma usare campioni che hanno concentrazioni diverse, in tutto il
range di valori che si possono ottenere da un paziente (entro le 2 DS).

22
 Controllo qualità

Sistema controllato

Sistema fuori controllo

23
 Caratteristiche dei metodi analitici

I metodi analitici si distinguono in base al loro grado di accuratezza in:

METODO DEFINITIVO: Risultato “definitivo”. Migliore approssimazione al
valore “vero” (per es: Spettrometria di massa)
METODO DI RIFERIMENTO: Metodo con inaccuratezza trascurabile. (per es:
Spettroscopia di assorbimento)
METODO AD ERRORE NOTO: In cui l’entità dell’errore è stabilita (mediante
comparazione con un metodo di riferimento).
I metodi di riferimento e quelli definitivi sono indaginosi, costosi e difficilmente
applicabili alla routine; la maggior parte dei metodi usati in laboratorio sono
quindi i metodi ad errore noto, che consentono di ottenere risultati ben
utilizzabili nella gestione clinica dei pazienti, purché si adottino le strategie
corrette di controllo di qualità.
24
 Caratteristiche dei metodi analitici
Sensibilità, linearità e specificità

Altri parametri importanti del metodo di misura sono la “sensibilità analitica”, la

“linearità” e la “specificità analitica”.
Sensibilità analitica: minima concentrazione di analita che il metodo permette di
distinguere dal bianco.
• Si misurano analiti presenti in piccolissime concentrazioni (nanomoli, picomoli),
e ciò riguarda soprattutto analisi di ormoni o farmaci;
• Piccole variazioni delle concentrazioni di analita sono significative da un punto
di vista clinico (ad es. determinazioni degli elettroliti, oppure determinazioni
collegate all’equilibrio acido-base).

25
 Caratteristiche dei metodi analitici
Sensibilità, linearità e specificità

La linearità: La linearità è importante quando si misurano analiti i cui valori

possono (in alcune condizioni patologiche) oscillare in un range molto ampio,
e raggiungere concentrazioni molto elevate rispetto ai valori di riferimento. Per
esempio gli enzimi sierici come le transaminasi possono raggiungere valori
anche 100 volte più elevati rispetto ai valori di riferimento. Quindi, è necessario
che il metodo analitico sia in grado di misurare in modo accurato e preciso
anche grandi concentrazioni della sostanza. Quando i valori ottenuti sono
superiori al limite di linearità del metodo, occorre diluire il campione e poi
ripetere la misura, riportando il valore all’interno del range di linearità del
metodo.

26
 Caratteristiche dei metodi analitici
Sensibilità, linearità e specificità

La specificità analitica è la capacità di un metodo di determinare solamente il

costituente che si intende misurare senza risentire di interferenze.
Interferenza: situazione in cui componenti differenti, pur non generando di per sè
un segnale, amplificano o deprimono il segnale generato nel metodo dal
componente oggetto della misura.
Diversi farmaci, ed alcuni alimenti possono causare interferenze nelle misurazioni
analitiche in biochimica clinica, e per ogni metodo di laboratorio sono note le
sostanze (anche farmacologiche) che provocano interferenza.

27
 Variabilità Totale
Post-ANALITICA

Variabilità
Totale

Analitica Biologica

Pre- Post- Intra Inter

analitica Analitica analitica individuale individuale

28
 Variabilità post-analitica

Compilazione del referto

Refertazione corretta:
• Dati del paziente
• Tipo di campione
• Unità di misura
• Metodo di analisi
• Intervalli di riferimento

29
 Variabilità biologica

Variabilità
Totale

Analitica Biologica

Pre- Post- Intra Inter

analitica Analitica analitica individuale individuale

30
 Variabilità biologica

Una serie di fattori legati all’individuo possono essere responsabili del fatto
che, i valori di un parametro analitico possano variare nello stesso individuo
(anche se non sono intervenute patologie), oppure siano differenti da
soggetto a soggetto.

Variabilità biologica controllabile:

• Influenze fisiologiche a lungo termine (età, sesso, fattori ambientali e
climatici, obesità, stato nutrizionale, stile di vita, gravidanza);
• Influenze fisiologiche a breve termine (postura, veglia, sonno, esercizio
fisico, variazioni cicliche);
• Assunzione di farmaci, droghe;
• Risposte fisiopatologiche dell’organismo (febbre, stress, ansia, dolore);
• Influenze genetiche.
31
 Variabilità biologica

Una serie di fattori legati all’individuo possono essere responsabili del fatto
che, i valori di un parametro analitico possano variare nello stesso individuo
(anche se non sono intervenute patologie), oppure siano differenti da
soggetto a soggetto.

Variabilità biologica non controllabile:

Variabilità intra-individuale: i valori misurabili in un determinato momento in un
individuo sono il risultato di un equilibrio dinamico che tende a mantenerli
costantemente aggiustati ad un valore detto punto omeostatico;
Variabilità inter-individuale: il punto omeostatico non è uguale per tutti gli
individui di un gruppo omogeneo.

32
 Variabilità totale

Sommando gli effetti della variabilità analitica e di quella biologica, si ottiene una
variabilità totale, il cui effetto è chiamato differenza critica.
La differenza critica indica di quanto un determinato valore di laboratorio può
cambiare, senza indicare il cambiamento dello stato fisiopatologico di un individuo.
La variabilità biologica non può essere modificata, per ridurre la differenza critica è
necessario ridurre la variabilità analitica, ossia cercare di ottenere metodi di
laboratorio sempre più accurati e precisi.
L’obiettivo analitico (o traguardo analitico) è definito da una variabilità analitica
inferiore o uguale alla metà della variabilità biologica intra-individuale per ciascun
parametro di laboratorio:
La variabilità analitica (CVA) = 1/2 variabilità biologica individuale (CVI)
Ad obiettivo raggiunto, l’imprecisione analitica incide per meno del 12% sulla
variabilità totale del risultato. 33
 Variabilità totale
Differenza critica

La differenza critica è la differenza minima tra due valori ottenuti sullo stesso
paziente che può essere considerata significativa; permette di stabilire con una
probabilità definita se la differenza fra due risultati per uno stesso paziente deve
essere considerata significativa.

I parametri da conoscere per il calcolo della differenza critica sono la variabilità

analitica-CV(a) e la variabilità biologica-CV(b).

34
 Variabilità totale
Differenza critica – IL CALCOLO

Su base statistica si valuta che la differenza di misure successive nel tempo di uno
stesso analita è significativa (o critica) quando il suo valore è ≥ 2,77 x CV-totale.

Differenza critica % = K x CV(t)

K= 2,77

CV(t)= √CV(a2) + CV(b2)

K x CV(t);
2,77 x √CV(a2) + CV(b2)

35
 Variabilità totale
Differenza critica – ESEMPIO

La terapia eseguita è stata efficace?

La variabilità analitica (CVa) dei trigliceridi è del 10%

La variabilità biologica (CVb) dei trigliceridi è del 20%
Il valore dei trigliceridi prima della terapia è di 500 mg/dl
Il valore dei trigliceridi dopo la terapia è di 180mg/dl
CV(t)= √CV(a2) + CV(b2)
CV(t)= √CV(102) + CV(202)
CV(t)= √CV(100) + CV(400)
CV(t)= √500
CV(t)= 22

Differenza critica % = 2,77 x CV(t)

Differenza critica % = 2,77 x 22 = 61%

Quindi, la differenza critica è stata valutata pari al 61%. La differenza osservata

tra i due valori di colesterolo (500 e 180) è del 64%, di conseguenza possiamo
affermare che la terapia è stata EFFICACE.
36
 Variabilità totale
Differenza critica – ESEMPIO

La terapia eseguita è stata efficace?

La variabilità analitica (CVa) del colesterolo è del 3%

La variabilità biologica (CVb) del colesterolo è del 6%
Il valore del colesterolo prima della terapia è di 210 mg/dl
Il valore del colesterolo dopo la terapia è di 185 mg/dl
CV(t)= √CV(a2) + CV(b2)
CV(t)= √CV(32) + CV(62)
CV(t)= √CV(9) + CV(36)
CV(t)= √45
CV(t)= 6,7

Differenza critica % = 2,77 x CV(t)

Differenza critica % = 2,77 x 6,7 = 18.6%

Quindi, la differenza critica è stata valutata pari al 18.6 %. La differenza

osservata tra i due valori di colesterolo (210 e 185) è del 12%, di conseguenza
possiamo affermare che la terapia NON è stata EFFICACE.
37
 Test Diagnostici
Il test ideale

Un buon test diagnostico tende a fornire esiti positivi in soggetti che presentano
la malattia.

Un buon test diagnostico tende a fornire esiti negativi in soggetti che non
presentano la malattia.

38
 Test Diagnostici
Sensibilità e Specificità diagnostica

La sensibilità diagnostica di un test serve per indicare l’incidenza di risposte

positive che si ottengono applicando il test a pazienti affetti.

Un test ha sensibilità del 100% quando in 100 pazienti affetti da malattia si

osservano 100 risposte positive, se il numero di risposte positive nei 100
pazienti è 85, la sensibilità sarà dell’85%, i restanti 15 pazienti avranno un
risultato negativo (ma sono malati!) saranno quindi falsi negativi

SOGGETTI MALATI CON TEST POSITIVO VP

Sensibilità diagnostica: x 100
TOTALE DEI SOGGETTI MALATI VP + FN

39
 Test Diagnostici
Sensibilità e Specificità diagnostica

La specificità diagnostica di un test serve per indicare l’incidenza di risposte

negative che si ottengono applicando il test a pazienti sani.

Un test ha specificità del 100% quando in 100 persone sane si osservano 100
risposte negative, se il numero di risposte negative nelle 100 persone è 85, la
specificità sarà dell’85%; i restanti 15 pazienti avranno un risultato positivo (ma
sono sani!) saranno quindi falsi positivi.

SOGGETTI SANI CON TEST NEGATIVO VN

Specificità diagnostica: x 100
TOTALE DEI SOGGETTI SANI VN + FP

40
 Test Diagnostici
Valore predittivo

Valore predittivo positivo: La probabilità che un soggetto con test positivo sia
realmente malato
Valore predittivo negativo: La probabilità che un soggetto con test negativo sia
realmente sano

Valore predittivo SOGG. CON TEST POSITIVO REALMENTE MALATI VP x 100

positivo: TOTALE DEI SOGGETTI CON TEST POSITIVO VP + FP

Valore predittivo SOGG. CON TEST NEGATIVO REALMENTE SANI VN x 100

negativo: TOTALE DEI SOGGETTI CON TEST NEGATIVO VN + FN

41
 Test Diagnostici
Quale valore è da preferire?

Se il fine è individuare il maggior Se il fine è individuare i soggetti

numero di malati, il test migliore ha sicuramente malati, il test migliore

sensibilità maggiore. ha specificità maggiore.

42
 Test Diagnostici
Effetto dello spostamento del cut-off

Se per esempio vogliamo valutare la glicemia possiamo decidere di usare come

valore soglia un valore di 140 mg/dL. In questo caso, vi saranno pochissimi
soggetti sani che hanno una glicemia superiore a 140 mg/dL, per cui avremo
pochi soggetti falsi positivi. Il test avrà un’altissima specificità diagnostica
(perché tutti i soggetti positivi al test sono realmente malati) tuttavia vi saranno
diversi diabetici con glicemia inferiore a 140 mg/dL che non saranno riconosciuti
dal test. Il test avrà quindi una bassa sensibilità diagnostica.

43
 Test Diagnostici
Effetto dello spostamento del cut-off

Se invece usiamo un valore soglia più basso, per esempio 90 mg/dL di glicemia,
vi saranno pochissimi diabetici con glicemia inferiore a 90 mg/dL, quindi il test
avrà un’altissima sensibilità diagnostica. Tuttavia, vi saranno molti soggetti
normali con glicemia superiore a 90 mg/dL, e quindi avremo una serie di falsi
positivi. Cioè il test avrà una scarsa specificità diagnostica.

44
 Test Diagnostici
ESEMPI

Validità diagnostica della mioglobina e della cTroponina I

Per la diagnosi di infarto del miocardio, sono disponibili due marcatori
biochimici, la mioglobina e la troponina. Il dosaggio della miogobina presenta
una sensibilità diagnostica del 98% e una specificità diagnostica del 55%.
Il dosaggio della cTroponina I presenta una sensibilità diagnotica pari all’85%
e una specificità diagnostica del 100%.
Inoltre, la mioglobina aumenta nel siero più precocemente rispetto alla
troponina.
In un pronto soccorso è assolutamente necessario riconoscere quanti più
soggetti possibile affetti da infarto. Quindi, la strategia più idonea è quella di
utilizzare la mioglobina (che ha un’elevata sensiiblità diagnostica) e
successivamente la troponina (molto specifica).
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