Controlli di Qualità

Microbiologici
dei
Radiofarmaci

Dott. ssa A.L. Viglietti

- Cuneo -
 NBP-MN

Aspetti microbiologici dei preparati

radiofarmaceutici
L’assicurazione della Asepsi è garantita
solamente dalla stretta osservanza delle
procedure, da ambienti dedicati e controllati
in modo adeguato,da appropriate
attrezzature, da personale qualificato,
dalle procedure di pulizia e disinfezione, dal
ciclo di sterilizzazione utilizzato, dalle
tecniche asettiche impiegate, dai monitoraggi
microbiologici ambientali.
 Procedure
L’impostazione di un sistema di assicurazione
della qualità necessita la predisposizione di un
articolato sistema documentale (cartaceo o su
supporto informatico) costituito da documenti,
procedure operative e sistemi di registrazione
relativi a tutte le fasi che portano al rilascio per uso
clinico del radiofarmaco, che deve garantire la
tracciabilità dell’intero complesso di operazioni e
verifiche.

Occorre documentare e garantire la

tracciabilità di tutto ciò che riguarda gli aspetti
microbiologici dei preparati radiofarmaceutici.
La scelta della tipologia di ambiente è in
funzione del tipo di preparazioni effettuate e
deve considerare:
A – protezione del personale
• rischio biologico
( 4 gruppi di rischio in funzione della
pericolosità dei microrganismi )
• rischio chimico
• rischio radiologico
B – protezione del prodotto
• rischio microbiologico della preparazione
La classificazione degli ambienti
( Clean room e clean air device ) deve essere
impostata in base alle operazioni
a minor rischio microbiologico
( sterilizzazione terminale ) e
ad alto rischio microbiologico
(ripartizioni asettiche, manipolazioni di
prodotti sterili, preparazioni che non
possono essere sottoposte a sterilizzazione
terminale, manipolazioni successive alla
sterilizzazione terminale che espongono il
radiofarmaco già sterilizzato all’ambiente )
 Attrezzature
Arredo
Nelle aree operative solo attrezzature, strumenti, materiali,
prodotti necessari alle fasi di lavorazione.
Attenzione alle cariche elettrostatiche che richiamano e
trattengono particelle di polvere e sporco.
( indumenti e tappeti antistatici )
Apparecchiature
• qualificate e controllate sia in fase di installazione
che in fase di utilizzo
• pulite con modalità definite e secondo calendarizzazione
( procedura specifica )
Materiali
• puliti
• sterili e monouso
 Personale
L’uomo è la fonte principale di contaminazione
( circa 80 % )
comportamenti scorretti quali
movimenti veloci, abbigliamento inadatto possono
alimentare la formazione di particelle.
 Personale

Un programma di training che include gli aspetti

di lavorazione in asepsi, descritto in una
apposita procedura operativa, deve essere
pianificato per il personale; per tutti gli operatori
deve essere presente un record che attesti
l’avvenuto training. Qualora vengano introdotte
modifiche significative alle varie fasi coinvolte
nella preparazione può rendersi necessario
procedere ad un aggiornamento e verifica del
livello di addestramento del personale operativo.
 Pulizia e disinfezione

La pulizia e la disinfezione rappresentano una

parte integrante del processo di preparazione
dei radiofarmaci e hanno lo scopo di
rimuovere gli agenti che potenzialmente
potrebbero inquinare il prodotto.
 Pulizia e disinfezione

• Selezione del disinfettante

Identificazione dei microrganismi
selezione
del “biocida” adatto.

Ascca News – Luglio/Settembre n. 3 - 2008

 Pulizia e disinfezione
Frequenza
La aree critiche richiedono una maggior
frequenza di pulizia per garantire che i livelli
prefissati di contaminanti non vengano
superati.
La frequenza diminuisce passando dalle aree
critiche a quelle generali e alle bussole.
Frequenza in “operational state”
Occorre stabilire se e quale tipo di pulizia può
essere effettuato, in fase di lavorazione, senza
danneggiare il prodotto che rischia di entrare
in contatto con agenti inquinanti.
 Ambiente

Le condizioni degli ambienti/zone a

contaminazione controllata devono essere
verificate e monitorate
( aria, superfici, vestiario )

Programma di monitoraggio ambientale

 Programma di monitoraggio ambientale

Conta particellare
Velocità dell’aria con anemometro
Efficienza dei filtri HEPA/ULPA
Smoke test per efficienza della barriera frontale
Determinazione della contaminazione microbica

Il controllo dell’aria può essere fatto

• per aspirazione di volumi unitari di aria con

un campionatore e successivo conteggio dei
microorganismi cresciuti nel terreno in cui il
flusso d’aria è stato convogliato.
Determinazione della contaminazione microbica

Il controllo dell’aria può essere fatto con un

campionamento passivo in cui si espongono, per
opportuni intervalli di tempo, piastre contenenti
idoneo terreno di coltura:
su di esse si raccolgono, per sedimentazione, i
microorganismi veicolati da particelle solide
o liquide sospese nell’aria.
Controllo delle Superfici
• con piastre a contatto contenenti terreno
TSA ( trypticase Soy Agar ) per la conta del
numero totale dei microorganismi
o TSA + neutralizzante per contrastare l’effetto
battericida o batteriostatico dei disinfettanti utilizzati
per la pulizia
I punti da monitorare ( posizioni geografiche
documentate ) sono i punti critici scelti in funzione
del contatto potenziale tra prodotto, contenitore,
chiusura, operatore )
Determinazione della contaminazione microbica

Le piastre sono incubate in appositi termostati a

temperature controllate
( 3 giorni a 22°C e 2 giorni a 33°C ).
Il numero di unità formanti colonia ( UFC ) va
riferito alla superficie della piastra/guanti.
CRITERI di accettazione e interpretazione dei risultati

Conforme a specifica

Monitoraggio periodico
 CRITERI di accettazione e interpretazione dei risultati

Non conforme a specifica

livello di allerta stabilito sulla base di

un dato storico secondo un programma di
monitoraggio: livello di azione

il n° di UFC è tale da indicare una situazione da correggere subito
deviazione rispetto alle condizioni
azione correttiva
operative standard

attenta valutazione dei processi e del
comportamento del personale.
Incremento dei controlli e della loro
frequenza.

( Report di indagine e azione correttiva )

CRITERI di accettazione e interpretazione dei risultati

Se ci sono UFC occorre identificare i

microorganismi ( ambiente, cute, altro )
responsabili della crescita.
Questo è particolarmente importante
nella selezione del disinfettante da impiegare.
Convalida del processo in asepsi

Media fill
La lavorazione in asepsi deve essere
convalidata con una procedura ( media-fill)
che utilizza, in sostituzione del prodotto, un
terreno di coltura sterile sottoposto,
prima dell’utilizzo, a un test di fertilità con ceppi
microbici previsti dalla Farmacopea .
Il test deve essere eseguito dal personale
addetto alla preparazione, nell’ambiente in cui
avviene la preparazione con simulazione molto
precisa del processo operativo ( temperatura,
materiali, tempi di lavorazione, modalità
operative ); se il processo viene fatto in area
controllata occorre monitorare le attività svolte
a mezzo di controlli ambientali
L’accuratezza della simulazione è garantita
• quando la durata complessiva del protocollo
Media-Fill risulta sovrapponibile a quella del
normale processo di preparazione e
frazionamento
• il numero delle unità ripartite ha la stessa
dimensione della preparazione
• i contenitori utilizzati sono in vetro chiaro in
modo da permettere l’esame microbiologico
visivo
• il minimo volume utile finale di terreno è di
almeno di 2 mL
•è impiegato un terreno sterile e fertile
( certificato di sterilità e fertilità) non selettivo e
ad ampio spettro di crescita microbica come
ad es. il trypcase soy broth ( TSB ) .
 Media Fill

• Convalida iniziale di una produzione

• Con frequenza programmata per la riconvalida
• A seguito di modifiche o problemi
• Per inserimento di nuovo personale a
completamento dell’addestramento
 Simulazione della fase di eluizione del generatore

Prima di procedere alla simulazione:

1. Eseguire un’
un’eluizione,
eluizione, come da prassi,
con soluzione fisiologica
2. Eseguire una seconda eluizione F1
utilizzando un flacone contenete terreno Conservare
colturale sterile (F0, 10 ml), scartando
2 ml
l’eluato

E1 Flacone vuoto sterile utilizzato di routine

(1) per eluire il generatore
(2)

Terreno sterile
E1
F1 Conservare
15 ml (3)
10 ml

Flacone contenete
Flacone contenente 10 ml
terreno colturale
di terreno di coltura,
sterile che simula la
simula l’eluato di Tc-99m
soluzione fisiologica
per eluizione

Generatore usato
G
completamente decaduto

Eseguire altre 2 volte dal punto (1).

Al termine delle 3 prove devono essere conservati F1
per i test di sterilità: F2 E1 E2 E3
F3 +
3 ml
3 ml
3 ml 10 ml 10 ml 10 ml
 Simulazione della fase di preparazione di un radiofarmaco
ottenuto utilizzando un kit

S1 (1 ml di terreno)
siringa monouso sterile S1
E4 (4) (schermata se di prassi) (6)
(5)
Prelevare da E4
1 ml di terreno
5ml
Flacone contenete terreno S1
colturale sterile che simula
l’eluato E4

5ml
Calibratore di dose

S1
(7) (2 ml di terreno)
(8)
prelevare S1 A
Iniettare in A
1 ml di terreno da F4

2 ml

Flacone contenete terreno A (9) (10)

colturale sterile che simula F4 A
la soluzione fisiologica per
diluizione 5 ml
2 ml

Flacone sterile vuoto che simula il

kit contenente il liofilizzato
Bagno riscaldante Miscelatore a rulli

A
Eseguire altre 2 volte dal punto (5)
utilizzando gli stessi flaconi E4 ed F4. C
Al termine delle 3 prove devono essere conservati B
Per i test di sterilità: A F4 E4 2 ml
2 ml
2 ml
+ Conservare
2 ml 2 ml 2 ml
 Simulazione della fase di preparazione di un radiofarmaco
ottenuto utilizzando un kit
S (13) (Utilizzando una siringa monouso sterile, bucare
per 10 volte consecutivamente il flacone D)

D Flacone contenete terreno

colturale sterile che simula
il kit ricostituito
6 ml

t0 (12) t1 0’ (14) D
(11) Contare D
(prelevare 2 ml di terreno (prelevare altri 2 ml di terreno
dal flacone D,contare la siringa dal flacone D,contare la siringa,
e iniettare il contenuto nel depositarla in un porta siringa,
flacone D1) e dopo 60’ iniettare il contenuto 2 ml
4 ml nel flacone D2)
D Conservare
per controllo
SD1
sterilità
6 ml SD2, (2 ml di terreno)
Calibratore di dose SD2
SD1

SD2

t60’

Eseguire altre 2 volte dal punto (11)

Al termine delle 3 prove devono essere
conservati
per i test di sterilità:
D1 D1 D2 D2

D 2 ml 2 ml
G
H D1 D2 G1 G2 H1 H2
2 ml
2 ml
+
2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml
Simulazione della fase di frazionamento Aspirare 1 ml di soluzione fisiologica
di un radiofarmaco prodotto da ciclotrone
SF (2)

Aspirare 1 ml di FDG
5 ml
(1)
F
Aspirare i 2 ml in siringa
(3)
5 ml
Trasportare la siringa nel
contenitore schermato

(4)

Misurare la siringa nel (5) (6)

calibratore

PZ

F SF
2 ml
Eseguire altre 2 volte dal punto (1).
Al termine delle 3 prove devono essere conservati
per i test di sterilità:
5 ml 2 ml PZ1 PZ2 PZ3

2 ml 2 ml 2 ml
 Simulazione della fase di preparazione di un radiofarmaco
estemporaneo di cellule autologhe marcate

(6)

(1) (2) (5)

(3)
(4) Sedimentazione
(1) (1) (1)
(7)
e separazione
(1)
A H S
(8)
AHS AHS

1
1

ASH

A H S
RF

Prelievo
Lav P PPC

P4
P4
PPC
RF

Marcatura
PPC

P4
PPC

Pz
P
Pz Pz
CRITERI di accettazione e interpretazione dei risultati

• Il risultato ottimale del Media-Fill è quello di

ottenere 0 unità contaminate

• Poiché il numero di campioni finali è piccolo

la presenza di un solo campione contaminato
determina un risultato non conforme
• I campioni derivanti dalla simulazione , compresi i
residui di terreno contenuti nei vari flaconi, sono
incubati in appositi termostati
per 7 giorni a 22,5±2,5°C
e
per 7 giorni a 33,5±2,5°C.

Fertilità finale del terreno

Il terreno deve essere sottoposto, al termine dei 14

giorni di incubazione, al test di fertilità con ceppi
microbici previsti dalla Farmacopea al fine di
dimostrare la sua funzionalità anche dopo il periodo di
incubazione nei termostati.
 Sterilizzazione terminale del radiofarmaco
Le preparazioni termostabili possono essere
sterilizzate al calore mediante autoclave.
Per la convalida dell’autoclave si utilizzano
indicatori biologici di sterilizzazione
che sono spore di microroganismi non patogeni ,
( generalmente bacilli stearothermophilus)
resistenti al calore, a concentrazione nota, che
permettono di accertare in modo diretto il
raggiungimento delle condizioni letali in un ciclo di
sterilizzazione.
Se non avvengono variazioni di torbidità o di
colore la sterilizzazione è stata efficace.
 Sterilizzazione terminale del radiofarmaco
Per un completo programma di sterilizzazione in
autoclave si possono utilizzare:

• indicatori chimici che virano il colore al

raggiungimento di una determinata temperatura
• integratori chimici che virano il colore in
progressione in funzione del tempo/temperatura.
Permettono di verificare la corretta penetrazione
del calore.

Sterilizzazione terminale del radiofarmaco

Sterilizzazione con filtro
Verifica integrità del filtro
 Prodotto
Controllo microbiologico sui prodotti finiti

Saggio di sterilità
Il saggio di sterilità deve essere fatto secondo
quanto descritto in Farmacopea.
Il saggio si effettua in condizioni asettiche
I terreni di coltura utilizzati devono soddisfare il
saggio di fertilità.
E’ necessario fare un saggio di convalida, per il
radiofarmaco impiegato, del metodo utilizzato per
dare evidenza che il prodotto in esame non
possegga attività antimicrobica nelle condizioni del
saggio.
 Saggio di sterilità
Fase di convalida:
Inoculare il campione in due flaconi contenenti il
terreno di coltura.
Aggiungere ad uno dei due flaconi,
opportunamente siglato come controllo positivo,
un piccolo numero di microrganismi vivi
( 10 – 100 UFC ) secondo la tabella della
Farmacopea.
Fase routinaria/riconvalida:
Il saggio può essere effettuato in routine
inoculando il campione in un flacone con lo stesso
terreno e nelle condizioni operative utilizzate nella
fase di convalida.
 Interpretazione saggio di sterilità

Negativo Positivo

Conforme Identificazione microrganismi

Cute/ambiente Altro

Riconvalida del
processo in Valutazione dati
asepsi operatore/paziente/
ripetizione test
 Prodotto
Saggio delle Endotossine Batteriche

Il saggio per le endotossine batteriche è usato

per rilevare o quantificare, mediante l’uso di
amebociti di limulo
( Limulus polyphemus o Tachypleus tridentatus ),
le endotossine che derivano dai batteri
gram-negativi.
Secondo le indicazioni della Farmacopea la
concentrazione limite di endotossina ( CLE )
somministrabile per via endovenosa per i
radiofarmaci non deve essere superiore a 175/V UI
di endotossina/mL di soluzione iniettata dove V è
la dose massima raccomandata in mL.
 Prodotto
Saggio delle Endotossine Batteriche

Metodi descritti in F.U. per effettuare il saggio:

tecnica di gelificazione
formazione di un gel

tecnica turbidimetrica
sviluppo di torbidità
tecnica cromogena
sviluppo di colore
Nuovo metodo spettrofotometrico di facile esecuzione
approvato dalla FDA ( Food and Drug Administration )

Vantaggi : reazione in 15 minuti

quantitativo
registrazione dei risultati

Svantaggio : costo
Campione : i campioni da analizzare devono essere
conservati in contenitori apirogeni.

Interferenze:
sostanze che chelano i cationi, proteine, alcooli e
fenoli.

Per evidenziare l’interferenza si deve sempre

eseguire il controllo del campione mescolato
all’endotossina.
Il controllo del campione con l’endotossina ( Spike )
deve risultare positivo.
 Come si eliminano le interferenze ?
- trattamento del campione
- diluizione del campione

Trattamento del campione :

• Per i campioni che contengono proteine come le
preparazioni cellulari

inattivazione delle proteasi a 70°C per 10’
• Il pH della soluzione deve essere compreso tra 6 e 8

se il pH non è in questo range si può diluire il campione
o utilizzare soluzioni tampone (NaOH o HCl ) apirogene
In generale la diluizione del campione riduce la
concentrazione e l’attività delle sostanze interferenti
consentendo di ottenere risultati validi.

Quale è la massima diluizione valida (MDV ) usata nel

saggio per ottenere la massima certezza che un
saggio negativo significhi che la concentrazione di
endotossina del prodotto è inferiore alla CLE e che un
saggio positivo significhi che il lisato riveli almeno la
CLE ?

MDV = CLE/λ dove λ è la sensibilità del lisato in UI di

endotossina per mL.
Il Limulus individua solo endotossine derivanti dai
gram negativi.
Resta il rischio di pirogeni derivanti dai batteri gram positivi
e molecole di origine virale e fungina.

Per colmare il gap di sicurezza che comporta l’impiego del

LAL nei controlli parenterali esistono metodi innovativi che
utilizzano cellule umane come biosensori .

Si impiegano leucociti (monociti) che emettono mediatori

infiammatori in risposta alla contaminazione.
Occorre documentare e garantire la
tracciabilità di tutto ciò che riguarda gli aspetti
( ambiente, processo e prodotto )
microbiologici dei preparati radiofarmaceutici.

STRUMENTI di REGISTRAZIONE
FOGLIO di LAVORAZIONE

REPORT FINALE
 REPORT di Indagine e Azioni Correttive

Qualunque deviazione delle procedure deve

essere registrata

( NBP-MN cap. 2
gestione delle deviazioni e

dei cambiamenti )

Lo strumento indispensabile per controllare la

deviazione del Sistema Qualità è l’Autoispezione.
 Aspetti pratici

• Microbiologia Ospedaliera/Direzione Sanitaria

• ARPA
• Ditte

Contratti esterni
I controlli di qualità possono essere eseguiti da un
laboratorio esterno a quello nel quale il radiofarmaco
viene preparato purchè in conformità con le norme.
Deve essere stipulato un accordo scritto tra committente
e contrattista (laboratorio che esegue i controlli ).
Il committente ha la responsabilità finale del rilascio per
l’uso clinico del radiofarmaco.
GRAZIE