CASE HISTORY
I criteri di scelta dei terreni microbiologici
e la relativa qualifica
P. Lazzeri – G. Dalmaso (Particle Measuring Systems – Fonte Nuova – RM)
Parole chiave: Terreni colturali – Campionamento superfici – Piano di monitoraggio – USP 116 – Growht Promotion Test – Colonie fun-
gine – Microrganismi anaerobi – Analisi dei trend
Sicuramente il monitoraggio microbiologico rappresenta una delle più cri-
tiche e complesse strategie di controllo della contaminazione attuate in
aree classificate GMP ed i terreni colturali svolgono un ruolo di primaria
importanza. In questo articolo si approfondiranno i limiti e i vantaggi di dif-
ferenti tipologie di terreni microbiologici utilizzati nei monitoraggi ambien-
tali, fornendo al contempo utili informazioni relative ai test di convalida.
I terreni colturali vengono utilizzati per le analisi microbiologiche
di prodotti sterili (test di sterilità) e non obbligatoriamente sterili
(TAMC & TYMC e ricerca patogeni), per test di verifica di qualità
degli impianti e dei processi produttivi (Media Fill), per il controllo
e la rilevazione di contaminazione microbica in aree classificate
(aria/gas compressi, superfici, acqua), per la identificazione degli
isolati ambientali e per altri test di laboratorio.
Le normative vigenti EP-USP richiedono che sia verificata la qualità
dei terreni microbiologici da utilizzare in aree classificate GMP te-
stando:
• la sterilità del terreno (ovvero l’assenza di crescita microbica
dopo il dovuto tempo di incubazione alla temperatura appro-
priata);
• la fertilità del terreno (‘Growth Promotion Test’ – “GPT” - ovvero
la capacità di promuovere la crescita del microrganismo inocu-
lato);
• la conformità del terreno (ovvero la corrispondenza con i requisiti
di farmacopea degli ingredienti della preparazione, inclusa la
sterilizzazione)
Valutazione del confezionamento terreni
in piastra per campionamenti ambientali
I terreni devono essere confezionati in maniera da consentirne
l’utilizzo in cleanroom limitando il rischio di ingresso di contaminanti
dall’esterno; è idoneo che i terreni da utilizzare in arre classificate
A-B siano in confezionamento sterile, protetti da triplo imbusto,
gammati. Particolare importanza riveste la quantità di piastre per
unità di confezionamento al fine di ottimizzare la quantità di ma-
teriali introdotta in area sterile, evitare spreco e contenere i costi.
La maggior parte delle aziende farmaceutiche prevede che piastre
introdotte in aree sterili, ovvero liberate dagli involucri di protezione,
se non utilizzate vengano rimosse e gettate. È in riferimento a
tale procedura che l’utilizzo di terreni in piastra in confezionamenti
in cui limitate quantità di piastre sono raggruppate ed imbustate
è da preferirsi.
18
È altresì diffuso l’uso di piastre con chiusura atta a ridurre la pos-
sibilità di apertura accidentale delle piastre; la conseguente pos-
sibilità di ridotta aereazione del terreno richiede che siano atten-
tamente seguite le istruzioni operative fornite dal produttore per
evitare di interferire con la fertilità del terreno.
La quantità di terreno con cui vengono riempite le singole piastre
non è specificamente normata, pertanto sono disponibili sul mer-
cato piastre a differente riempimento.
Le piastre per campionamento delle superfici (‘Rodac’) sono so-
litamente riempite con 17 ± 1 ml di terreno. Le piastre da 90mm
sono disponibili con quantità di terreno variabile da un minimo di
15 ml ad un massimo di 30 ml. La qualità dell’agar e la quantità
di terreno presente nella piastra determinano un differente grado
di disidratazione durante l’esposizione, sia in caso di campiona-
menti attivi che passivi; la perdita di peso dei terreni in piastra
dopo l’uso rappresenta uno dei parametri critici da valutare per
verificare la conformità del terreno essendo nota la perdita di fer-
tilità di terreni con ridotta idratazione. Anche in questo caso, la
differenza di costi derivante dal diverso grado di riempimento
delle piastre è da valutare considerando la ‘resistenza’ dei terreni
all’uso (si pensi alla possibilità di campionamenti frazionati quale
alternativa all’aspirazione continua).
Alcuni terreni pronti in piastra devono essere conservati in con-
dizioni di temperatura refrigerata; tale procedura può garantire
maggior stabilità/validità del terreno limitando gli sprechi ma è
da considerare il costo della gestione refrigerata. L’intervallo della
temperatura di stoccaggio indicato dal produttore deve essere
tenuto in considerazione per poter correttamente gestire idoneo
controllo della temperatura durante il trasporto e l’immagazzina-
mento.
Growth Promotion Test (GPT)
e temperature di incubazione
Scopo del Growth Promotion Test è determinare l’idoneità del
terreno di coltura. Il terreno è ‘sfidato’ con un piccolo numero
di microrganismi per assicurare i complessi nutritivi. Il test è
descritto nelle <USP 61> - <USP 62> - <USP 71> - EP 2.6.1.
– EP 2.6.12 – EP 2.6.13 ed è armonizzato per le Farmacopee
USP, EP e JP.
I terreni devono essere testati sia versus ceppi ATCC indicati
dalla Farmacopea che versus isolati ambientali, inoculando 100
cfu o meno di ciascun ceppo. I microorganismi devono derivare
dal lotto primario ‘Reference culture’ mediante non più di 5 pas-
saggi.
Ascca News n. 2/2016
Procedura del GPT per controllo su terreni in uso
il test deve essere eseguito su ogni nuovo lotto di terreno in in-
gresso; eventuale audit al produttore e convalida del processo
di trasporto possono consentire di ridurre la frequenza dei test
da eseguire sui materiali in ingresso. La percentuale di recovery
deve essere compresa tra 70% e 200%. In caso di terreni selettivi,
il microrganismo di cui è inibita la crescita non deve sviluppare
colonie.
Procedura del GPT per convalida nuovi terreni
Dopo l’incubazione, la crescita dei microrganismi su nuovo terreno
è comparata alla crescita sul terreno già in uso applicando i criteri
di accettazione indicati dalle linee guida: la USP 61 indica che il
numero di colonie rilevate sul nuovo terreno deve essere parago-
nabile a quanto rilevato sul terreno in uso per un fattore 2 ovvero
non meno della metà / non più del doppio. (Esempio: conta su
terreno in uso= 40 cfu – conta ammessa su terreno nuovo = 20-
80 cfu). I test eseguiti per accettazione della conta di specifici mi-
crorganismi, come da USP 62, devono dimostrare che il numero
di colonie sul nuovo agar deve essere comparabile con le conte
sui terreni già in uso. (in questo caso NON è previsto che si
applichi il fattore 2). In caso di GPT su terreni selettivi, eventuali
microrganismi inibiti non devono crescere. Il numero e l’aspetto
delle colonie devono essere comparabili in numero ed aspetto a
quanto rilevato sul terreno in uso. I microbiologi raccomandano
fortemente che i test di GPT su nuovo terreno siano eseguiti in
parallelo con terreni in uso per comparazione. I test in parallelo
sono condotti con la medesima sospensione, dallo stesso tecnico,
con lo stesso metodo, nelle stesse condizioni; unica variabile
deve essere il terreno.
Riguardo le temperature di incubazione, la USP <61> specifica le
temperature per i Growth Promotion Test e per le conte totali
TAMC & TYMC indicando 20-25°C per miceti e 30-35°C per i
batteri. La USP <1116> , relativa alle metodiche di monitoraggio
microbiologico delle aree in asepsi, specifica che ‘la durata e le
temperature di incubazione sono definite sulla base dei tipi di ter-
reno che sono stati selezionati’. La Normativa riporta: ‘Tipica-
mente, per terreni di crescita generici come il TSA, le temperature
di incubazione sono comprese nell’intervallo 20°-35°C e devono
essere rispettate per un tempo di incubazione non inferiore a 72
ore. Si possono valutare tempi maggiori di incubazione in consi-
derazione di eventuali contaminanti a lenta crescita. Le tempera-
ture sopra indicate non hanno alcun valore ‘assoluto’.
Numerosi sono i microbiologi di aziende di produzione farmaceu-
tica che attuano l’incubazione dei terreni in piastra usati nei mo-
nitoraggi, a due diverse temperature; la procedura più diffusa
prevede incubazione di TSA per 3 giorni a 20-25 °C e per 2
giorni a 30-35 °C. La successione dei due test (prima 20-25°C e
poi 30-35°C o viceversa) è definita dai singoli laboratori. Molti
sono, per contro, i microbiologi farmaceutici che scelgono di in-
cubare i terreni usati nei monitoraggi alla temperatura di 30-35
°C per 5 giorni.
Da numerosi studi eseguiti presso laboratori microbiologici ac-
creditati e/o presso aziende farmaceutiche, i dati di letteratura
evidenziano che, sebbene differenti temperature di incubazione
possano influire sulla crescita delle colonia microbiche, ciascuna
delle strategie di incubazione sopra descritte consente una idonea
rilevazione di eventuali contaminanti; ciò che in questo articolo si
vuole evidenziare è che l’intervallo / gli intervalli di temperatura e
la durata dell’incubazione dei terreni usati nei monitoraggi non è
definita dalle linee guida bensì è richiesto sia valutata e definita
dal microbiologo.
Ascca News n. 2/2016
Coerentemente con quanto sopra indicato, gli Enti Regolatori /
Ispettivi invitano a valutare sulla base di considerazioni scientifiche
quali siano le più idonee condizioni di incubazione per singola
applicazione; un esempio può aiutare a chiarire questo concetto.
La ricerca di contaminanti microbici in impianti di WFI porterà a
considerare la possibile presenza di specie microbiche che pre-
diligono più elevate temperature (si ricorda, infatti, che la tempe-
ratura della WFI in loop farmaceutici difficilmente scende al disotto
dei 60°C) ovvero ad attuare un incubazione dei terreni a 30-35°C
o superiori; un eventuale implementazione della rilevabilità dei
contaminanti potrà aversi attuando incubazioni di maggior durata,
ma appare poco probabile che una incubazione a più bassa tem-
peratura possa agevolare la rilevazione di specie microbiche con-
taminanti un loop di WFI.
La scelta delle tipologie di terreno
da usare per i monitoraggi
La USP <1116> esplicita che: ‘un terreno microbiologico ‘gene-
rico’, come il TSA, in molti casi è idoneo al monitoraggio ambien-
tale perché sconsente la crescita di ampia varietà di batteri, lieviti
e muffe. Questo terreno può essere arricchito con additivi per
aumentare o minimizzare gli effetti indotti dagli agenti sanitizzanti
o dagli antibiotici (ndr: stress del microrganismo). I Produttori do-
vrebbero valutare la ricerca specifica di lieviti e muffe. Se neces-
sario, possono essere usati terreni generalmente idonei alla cre-
scita di specie fungine come il Sabouraud (SDA), il Sabouraud
modificato o terreni selettivi.’
La USP <797> esplicita che, al termine del periodo di campiona-
mento o esposizione, le piastre sono incubate capovolte ad una
temperatura e per una durata che consenta la crescita microbica.
Si suggerisce di incubare il TSA a 30-35°C per 48-72 ore e viene
aggiunto che ‘Il Malt Extract Agar o altro terreno idoneo ai funghi,
è consigliato sia incubato a 20-25°C per 5-7 giorni’.
Numerosi sono i microbiologi farmaceutici che evidenziano una
non significativa differenza di fertilità microbica tra TSA e SDA, in
particolare, numerosi sono gli studi che escludono una più efficace
rilevazione dei miceti mediante l’impiego di SDA rispetto al TSA
nel corso dei monitoraggi routinari. In considerazione di ciò, molte
sono le aziende farmaceutiche in cui il monitoraggio microbiologico
è attuato utilizzando esclusivamente TSA, con incubazione ad
unico intervallo di temperatura o con ‘doppia incubazione’, ma
escludendo l’uso routinario del SDA.
Le esplicite richieste normative relativamente all’attenzione da ri-
volgere alle rilevazioni di eventuali contaminanti a lenta crescita
nonché alla valutazione d’uso di terreni idonei a favorire lo sviluppo
di determinate specie microbiche, portano alcuni microbiologi a
valutare l’uso di terreni atti alla crescita dei miceti. L’esperienza e
la letteratura evidenziano come il Malt Agar (MEA) ed il Potato
Dextrose Agar (PDA) o Potato Sucrose Agar (PSA) siano terreni
idonei a favorire la crescita di lieviti e muffe; in particolare, studi
approfonditi, portano a ritenere genericamente più idonei allo svi-
luppo dei lieviti i terreni PDA e PSA indicando il MEA come idoneo
a favorire lo sviluppo di molte specie di muffe.
Scopo dell’implementazione di un terreno particolarmente indi-
cato per la crescita delle muffe non è sostituire il SDA quale ter-
reno da affiancare al TSA nei monitoraggi routinari, bensì valutare
l’implementazione di campionamenti microbiologici da eseguire
in punti ritenuti a maggior rischio di contaminazione fungina. Un
attento studio dei locali classificati GMP eseguito allo scopo di
individuare i punti in cui i parametri ambientali ed i dati di biobur-
19
den possano essere correlati al maggior rischio di sviluppo dei
miceti, porterà a definire un programma di monitoraggio finalizzato
ad escludere il rischio di contaminazione da muffe, con particolare
riguardo alle specie a lenta crescita. I locali in cui sono poste le
autoclavi, le sale lavaggio, le celle refrigerate e, più in generale,
le aree in cui condizioni di temperatura/umidità o persistenza di
acqua, possono essere monitorate con frequenze annuali o in-
feriori, utilizzando, per esempio, MEA e prevedendo incubazioni
prolungate fino ad oltre 3 settimane. Vantaggi correlati a tale
strategia di monitoraggio sono: la possibilità di eseguire una ri-
cerca specifica di forme fungine difficilmente rilevabili con terreno
generico e/o forme a lenta crescita senza dover modificare il
piano routinario di monitoraggio ambientale e la possibilità di ri- Figura 2 - Aspergillus Niger su Malt Extract Agar
levare le colonie fungine con un aspetto che ne consenta una
più agevole identificazione.
In caso di studi di convalida di terreni microbiologici da utilizzare
per la ricerca di forme fungine a lenta crescita, è idoneo utilizzare
oltre ai ceppi standard di Farmacopea, quali Candida albicans
ATCC 10231 ed Aspergillus niger ATCC 16404, ed a ceppi isolati
ambientali, anche il micete rappresentante delle forme a lenta
crescita ovvero il Tricophyton mentagrophytes ATCC 9533.

L’aspetto delle colonie fungine su differenti terreni

I micologi evidenziano come l’uso di terreni specifici possa age-

volare lo sviluppo di colonie fungine il cui aspetto assuma morfo- Figura 3 - Aspergillus Niger su Czapek Agar
logia e/o colorazioni che ne facilitano l’identificazione. La crescita
delle colonie fungine risulta più rapida su MEA o PDA/PSA o Cza- Il Fusarium cresce bene su MEA ma è vantaggioso utilizzare PDA
pek Agar rispetto ad analoghe condizioni di incubazione su TSA o PSA incubando con luce piena, a circa 25°C per 7/14 gg sino
(lo ‘Czapek Agar’ è un terreno semisintetico, contenente sacca- ad ottenere evidenti e riconoscibili colonie di Fusarium che, se di
rosio quale fonte di Carbonio e Nitrato come unica fonte di azoto). specie diverse, evidenziano colori diversi; è interessante eviden-
È noto che il MEA è il terreno indicato per coltivazione ed identifi- ziare che alcuni Fusarium si sviluppano bene anche per un‘incu-
cazione di molti Zigomiceti (per es: Rhizopus..) l’incubazione a bazione con terreni a basso contenuto di nutrienti , a 25°C , per
20-36°C ha durata media di 1 settimana. 7-14 gg ma in condizioni poca luce a 310-360 nm (vedi Figg. 4,
Alcuni dei miceti più frequentemente rilevati in aree Farmaceutiche 5 e 6).
appartengono ai Deuteromiceti; questi funghi producono spesso
metaboliti tossici e, generalmente, si sviluppano su MEA oppure
su OA Agar in 10-14 con incubazione a 20-30°C gg. Alcune fa-
miglie di Aspergilllus crescono e si sviluppano meglio se al terreno
è aggiunto saccarosio. L’Aspergillus fumigatus, frequente negli
HVAC e sistemi di umidificazione, vive e si sviluppa a temperature
elevate, fino anche a 55°C, ma cresce e si moltiplica anche a
25°C; ciò è confermato osservando che con incubazione a 25°C
si ha evidenza di colonie distinte crescita in un tempo medio di
10-14 giorni ma con incubazioni a 35-40°C la crescita è più ve-
loce. L’Aspergillus Niger su Czapek agar cresce a 25°C raggiun-
gendo 4-5 cm di diametro in 7 giorni, con aspetto bianco/giallo e Figura 4 – a) Fusarium su Sabouraud Agar in crescita; b) e dopo sei giorni di incubazione
dense linee marroni-nere (vedi Figg. 1, 2 e 3).

Figura 1 - Aspergillus Niger su Potato Dextrose Agar (PDA), su Malt Yeast Agar (MYA) e su
Sabouraud Agar(SDA) Figura 5 - Fusarium (ceppi mutati) su Malt Extract Agar

20 Ascca News n. 2/2016


Figura 6 - Fusarium su Potato Dextrose agar (Fusarium graminearum)
Tra gli Ascomiceti, per una coltivazione ottimale di molte specie
di ‘Penicillium’ si usa MEA, meglio se con aggiunta di saccarosio
o di NaCl. Per la rilevazione è idoneo utilizzare MEA; con incu-
bazione su MEA a 24°C in 7-14 gg si formano colonie del dia-
metro di 6-7 cm aventi tipiche colorazioni giallo-arancio-verde
(vedi Fig. 7).
Figura 7 - Penicillium cainii CNU 114236. Colonies grown on Czapek yeast extract agar (A, B),
malt extract agar (C, D), and yeast extract sucrose agar (E, F) for 7 days at 25 , conidiophores
(G~I), conidia (J) (scale bars: G = 20 µm, H~J = 10 µm)
Ascca News n. 2/2016
La ricerca di microrganismi anaerobi
La USP <1116> chiaramente indica che: ‘In generale, il monito-
raggio (ambientale)per anaerobi obbligati non è eseguito perché
tali microrganismi sono inidonei a vivere in presenza di aria. Co-
munque, nei processi asettici possono essere presenti anaerobi
facoltativi. In caso di condizioni di anaerobiosi o per completezza
di investigazioni (per es. identificazioni di questi microrganismi nel
corso di test di sterilità) è idoneo garantire monitoraggio per la ri-
levazione di anaerobi facoltativi e/o organismi che crescano in
condizioni di scarsa ossigenazione’.
Ancora una volta, la lettura delle linee guida offre spunti di riflessione
per un corretto ed esaustivo piano di monitoraggio ambientale
ovvero per la definizione di una efficace strategia di controllo e
contrasto alla contaminazione microbica. Così come è richiesto
che sia valutato il rischio correlato a processi produttivi in condizioni
di anaerobiosi al fine di considerare l’idoneità di Media Fill mediante
Fluid Thyoglicollate Medium (FTM), è idoneo valutare l’esecuzione
di campionamenti in anaerobiosi. Per esempio, per campionamenti
su aria compressa e su azoto è adeguato prevedere anche l’uso
di un terreno diverso dal TSA; FTM, Columbia Agar e altri terreni
che favoriscono lo sviluppo microbico in anaerobiosi. Columbia
Agar, così come altri terreni atti ad incubazione in anaerobiosi,
sono idonei per i campionamenti routinari su azoto ma ciò non
esclude l’uso saltuario (per es.: 1 volta ogni uno/due anni) di TSA
o altri terreni da incubare in aerobiosi al fine di escludere il rischio
di contaminazione da forme sporali di microrganismi aerobi.
Differenti strategie di campionamento delle superfici:
contact o swabs?
Scopo di questo articolo non è illustrare le differenti soluzioni usate
nel monitoraggio microbiologico ma, per completezza di trattazione,
esaminiamo alcuni aspetti correlati all’uso di piastre contact e/o
swabs per il campionamento delle superfici. Le linee guida preve-
dono che il campionamento delle superfici piane possa essere
eseguito sia mediante piastre contact che mediante swabs ma
evidenziano la necessità di ricorrere ai tamponi per le superfici di
forma non-piana (per es.: parti macchina, maniglie, griglie, lume
delle tubature). Numerosi sono gli studi che evidenziano come l’ef-
ficienza di recupero delle piastre contact sia mediamente stimata
in circa il 70% mentre l’efficienza di recupero degli swabs varia
molto a seconda del tipo di tampone utilizzato; si rileva da un
minimo recupero del 25% per tamponi in rayon ad un massimo re-
cupero del 85% per tamponi floccati. Gli swabs possono essere
utilizzati per il campionamento delle superfici sia prevedendone
un’incubazione in brodo di coltura (generalmente TSB) che utiliz-
zando i tamponi stessi per semina su piastra. Il campionamento
delle superfici critiche di aree sterili può essere finalizzato ad eseguire
un test qualitativo (presenza/assenza) oppure quantitativo (conta
microbica) ma un aspetto importante è utilizzare tecniche di cam-
pionamento che non distruggano il campione ovvero prevedere la
possibilità di recuperare i microrganismi eventualmente rilevati per
la identificazione. Un importante criterio di valutazione del più idoneo
metodo di monitoraggio delle superfici è la possibilità che residui di
terreno possano permanere dopo il campionamento. L’esperienza
e la letteratura dimostrano che non si può escludere il rischio che
tracce di terreno possano essere rilevate sulle superfici campionate;
ciò può contribuire ad innalzare il rischio di contaminazioni micro-
biche ma, soprattutto, eventuali residui di terreno su superfici critiche
dovrebbero essere valutati in fase di Cleaning Validation. Gli indu-
21
menti protettivi indossati dagli operatori così come i guanti devono
essere routinariamente monitorati e l’uso di piastre contact o tam-
poni può essere causa di differenti operatività. I campionamenti
degli indumenti eseguiti mediante terreno in piastra obbligano gli
operatori a cambiare la divisa da cleanroom. Ciò può comportare
che, nel corso delle attività produttive, un operatore debba lasciare
la cleanroom, recarsi nello spogliatoio e tornare all’operatività solo
dopo aver indossato una tuta pulita. Analogamente, il campiona-
mento dei guanti può essere eseguito utilizzando terreni in piastra
oppure tamponi; nel primo caso il campionamento sarà limitato
alle aree dei polpastrelli mentre l’uso di swabs può consentire il
campionamento delle dita e dei palmi.
Differenti procedure di manipolazione dei campioni ottenuti mediante
piastre contact o mediante tamponi, la facilità o meno di effettuare
autonomamente il campionamento degli indumenti da parte degli
operatori, la sensibilità dei metodi ed i rischi correlati ad eventuali
residui devono essere valutati dal microbiologo per definire le più
idonee strategie di campionamento per singola area. In ultima ana-
lisi, ma non per minor importanza, è importante considerare quanto
chiaramente evidenziato dal ‘PDA Technical Report n°69’ relativa-
mente alle più recenti scoperte scientifiche riguardo la localizzazione
dei microrganismi in cleanroom e la loro rilevabilità. Per lungo tempo
si è ritenuto che la maggior parte delle forme microbiche presenti
in cleanroom fossero isolate, disperse nell’aria in forma planctonica
mentre i più recenti studi evidenziano come forme microbiche ag-
gregate, anche miste, siano sovente presenti adese su superfici a
formare Biofilm. Il PDA TR 69 evidenzia l’importanza di valutare il
rischio di Biofilm su superfici di cleanroom e sottolinea che, non
potendo ad oggi indicare metodi più efficaci nella rilevazione di
forme aggregate in Biofilm, è idoneo considerare l’uso di differenti
strategie di campionamento delle superfici; anche l’uso di Metodiche
di Microbiologia Rapida (RMM) può supportare i microbiologi con-
sentendo lo studio dei trend di bioburden in tempi brevi.
Qualunque sia la metodica di campionamento microbiologico delle
superfici, il terreno utilizzato deve essere idoneo a promuovere la
crescita microbica anche in presenza di eventuali residui di agenti
sanitizzanti e/o di composti antibiotici. Le linee guida riportano
quanto indicato da studi scientifici circa i neutralizzanti da utilizzare
per inattivare l’azione antimicrobica che eventuali residui di sanitiz-
zanti potrebbero causare in fase di campionamento delle superfici
mediante terreni solidi o liquidi. L'associazione lecitina-polisorbato
-istidina -tiosolfato neutralizza la maggior parte dei disinfettanti.
Recenti studi hanno evidenziato la possibilità che materiali semi-
porosi possano assorbire perossido di idrogeno durante l’esposi-
zione a trattamento VPHP in isolatori; gli effetti antimicrobici dovuti
ad eventuale tardivo rilascio del perossido di idrogeno possono
essere contrastati efficacemente utilizzando terreni pronti con ag-
giunta di piruvato. Le aziende produttrici di farmaci antibiotici devono
prevedere l’uso di terreni con aggiunta di enzimi inattivanti degli
antibiotici. L’efficacia di neutralizzanti dei sanitizzanti e degli inattivanti
degli antibiotici deve essere dimostrata con studi di validazione.
I limiti di allerta e di azione
Il monitoraggio di una cleanroom di produzione farmaceutica, di
RABS e di isolatori, comporta la registrazione dei risultati e la re-
lativa gestione dei dati in forma di trend la cui analisi consenta di
evidenziare alterazioni del ‘normale’ livello di contaminazione di
ogni specifica area.
In pratica, le attività di campionamento microbiologico e la conse-
guente raccolta dei dati di monitoraggio sono finalizzate ad elabo-
22
rare un ‘quadro’ del livello di contaminazione delle differenti aree
dello stabilimento che, attraverso l’evidenza di eventuali variazioni,
consenta di gestire il rischio microbiologico. I numerosi dati ottenuti
attraverso i monitoraggi vengono elaborati sotto forma di trend, i
cui andamenti standard e le cui variazioni al di sopra di determinati
limiti costituiscono campanelli di allarme per i microbiologi.
Gli Enti Regolatori ed Ispettivi invitano ad esaminare con attenzione
eventuali variazioni dei trend, sia in termini di superamento dei
limiti di allerta e/o di azione (‘Out Of Specification’ - OOS) che di
deriva dei trend (‘Out Of Trend’ – OOT). La USP <1116> sottolinea
che eventi isolati di contaminazione in aree non critiche possono
essere considerati come eventi correlati ad attività routinarie che
si svolgono nelle cleanroom ma variazioni nei trend relativi ai mo-
nitoraggi devono essere rilevati, esaminati e corretti.
Il crescente utilizzo di software per la gestione dei dati di monito-
raggio microbiologico in aree classificate, consente di esaminare
sia i contaminanti microbici più frequentemente rilevati nelle singole
aree, di definirne numero e frequenza di rilevazione e, quindi, di
elaborare rapidamente trend che possano evidenziare eventuali
variazioni del bioburden. L’esperienza dei microbiologi evidenzia, a
tal riguardo, l’importanza di un’attenta valutazione dei limiti di allerta
al fine di agevolare la esaustiva esamina dei dati. Coerentemente
con quanto richiesto dagli Enti Regolatori e chiaramente esplicitato
e descritto dal PICs (Pharmaceutical Inspection Convention and
Pharmaceutical Inspection Co-operation Scheme), i limiti di allerta
ed azione per singola area classificata devono essere definiti sulla
base dei dati rilevati nel corso dei monitoraggi considerando i limiti
di contaminazione ammessi per classe come riferimento per le
sole attività di classificazione/convalida ambientale periodica.
Un esempio consentirà di chiarire quanto sopra esposto:
I limiti di contaminazione ammessi per classe sono riportati nella
tabella in calce:
Recommended limits for microbial contamination (a)
Grade air sample settle plates contact plates glove print
cfu/m3 (diameter (diameter 5 fingers
90 mm) 55 mm) cfu/glove
cfu/4 hours(b) cfu/plate
A <1 <1 <1 <1
B 10 5 5 5
C 100 50 25 -
D 200 100 50 -
Notes – a) These are average values; b) individual settle plates
may be exposed for less than 4 hours
Prendiamo in considerazione un’area di Grado C ed ammettiamo
che si utilizzino i valori di 100 cfu/m3 come limite di azione per i
dati inerenti il campionamento attivo dell’aria ed il limite di 25
cfu/plate per le superfici e completiamo il nostro esempio ipotiz-
zando un limite di allerta per il campionamento attivo dell’aria di
70 cfu/m3 ed un limite di allerta per le superfici di 14 cfu/piastra.
I valori di tali limiti sono ‘concettualmente’ ammissibili ma per ve-
rificarne l’adeguatezza relativamente alla possibilità di rilevare
eventuali variazioni dei trend, OOT, devono essere valutati in rela-
zione ai dati di bioburden.
Ipotesi = valori medi della contaminazione: in aria 25-30 cfu , su
superfici 6-9.
Nel caso i dati medi di bioburden si mantenessero entro i valori
indicati in questo esempio, i su indicati limiti di allerta risulterebbero
Ascca News n. 2/2016
eccessivamente elevati; il software non evidenzierebbe, infatti, al-
cun ‘fuori standard’ anche nel caso in cui il bioburden dovesse
divenire doppio rispetto al livello medio. Limiti di allerta inferiori,
ovvero coerenti con i dati medi di bioburden (per esempio: 35
cfu/m3 per l’aria e 10 cfu/plate per le superfici) consentirebbero
di rilevare eventuali variazioni del livello medio di contaminazione
ed esaminarne le cause al fine di attuare idonee azioni correttive.
Frequentemente si rileva l’abitudine ad indentificare esclusiva-
mente gli isolati rilevati in caso di fuori limite occorsi nelle aree
classificate A-B; al fine di una esaustiva conoscenza del bioburden
delle aree classificate è idoneo prevedere la identificazione degli
isolati ambientali presenti nelle cleanroom di grado C. Senza voler
appesantire il lavoro routinario del Laboratorio Microbiologico,
può essere sufficiente effettuare una volta l’anno l’identificazione
delle forme microbiche rilevate nel corso di campionamenti effet-
tuati nell’arco di un giorno in un’area di Grado C. La conoscenza
delle specie microbiche presenti nelle aree circostanti i locali sterili
può risultare un interessante strumento di analisi in caso di inve-
stigazioni e può supportare i microbiologi nella definizione della
più idonea frequenza d’uso di agenti sanitizzanti e/o sporicidi.
I controlli microbiologici quale strumento
di indagine e di prevenzione
L’identificazione microbica delle colonie rilevate durante i monito-
raggi deve essere eseguita a livello di “genere” qualora sia superato
il limite di Allerta ed a livello “specie” in caso di superamento dei
limiti di Azione. Per esempio, sarà sufficiente indicare se trattasi
di batterio del genere ‘Staphylococcus’ in caso di superamento
di limite di Allerta ma si dovrà giungere a specificare la specie
(Staphylococcus Hominis, Staphylococcus epidermidis, Staphy-
lococcus aureus…) se è stato superato il limite di azione.
Attento esame della distribuzione degli isolati ambientali e della
frequenza di recupero costituiscono parte integrante delle indagini
che consentiranno al microbiologo di comprendere le cause della
contaminazione e di definire / attuare le idonee azioni correttive.
Si tenga presente che, in caso di superamento dei limiti di Azione
(‘Out of Specification’ – OOS) si deve valutare il rischio di conta-
minazione del prodotto farmaceutico con conseguente possibilità
di blocco di uno o più lotti produttivi.
Le problematiche economiche dovute al mancato rilascio di lotti
produttivi e le implicazioni legali correlate a failure di sterilità con-
fermano l’importanza dei controlli microbiologici e chiaramente
evidenziano la criticità delle scelte dei terreni microbiologici, alla
corretta gestione delle procedure di controllo e di identificazione.
Il rischio di disidratazione dei terreni in piastra
Una fase fondamentale negli studi di valutazione della qualità di
un terreno microbiologico è rappresentata dalla capacità dell’agar
di mantenere livello di idratazione idoneo a favorire la crescita mi-
crobica. La maggior dei terreni in piastra utilizzati nei monitoraggi
Volume riempimento Perdita peso Peso
per disidratazione del terreno
18 ml 3 grammi 18 g
25 ml 3 grammi 25 g
30 ml 3 grammi 30 g
Ascca News n. 2/2016
ambientali sono dedicati al campionamento dell’aria. Le normative
richiedono, infatti, monitoraggio attivo (mediante aspirazione) e
passivo (esposizione statica) delle cleanroom. Le piastre utilizzate
per il campionamento attivo sono sottoposte a flussi d’aria anche
molto intensi (sino a 100 – 180 litri/minuto) ma tale condizione si
protrae, genericamente, per tempi brevi, viceversa, le piastre per
campionamento passivo rimangono esposte all’aria per lungo
tempo (genericamente per 4 ore in continuo). Il grado di dissec-
camento di un terreno in piastra deve essere valutato in fase di
convalida per garantirne la fertilità al termine dell’uso anche in
condizioni di esposizione prolungata in aree con flussi intensi ed
elevati ricambi d’aria.
Una prima ed importante valutazione da tener presente è la scelta
delle condizioni di test; poiché i test di convalida sono spesso
eseguiti in cappe di laboratorio, è importante scegliere cappe a
flusso verticale e non a flusso orizzontale e verificare che la velocità
del flusso sia rappresentativa delle condizioni di processo. com-
patibilmente con le esigenze dei reparti produttivi, può essere
conveniente eseguire alcuni test di convalida delle piastre preve-
dendone esposizione negli stessi locali in cui saranno utilizzate.
Un interessante articolo pubblicato sul PDA Journal già nel 1986
definisce alcuni parametri che possono aiutare i microbiologi nella
convalida dei terreni: si evidenzia che una disidratazione media
pari 13 % del peso iniziale del terreno influenza la crescita micro-
bica in funzione dell’8% circa. L’autore mette in correlazione tale
grado di disidratazione ad una esposizione di terreni in piastra
per 24 ore in condizioni ‘ambientali’ (‘aria ferma’), per 6 ore sotto
flusso unidirezionale e per 1 ½ ora in aspirazione a circa 30 litri/mi-
nuto. Attualmente, numerosi sono i microbiologi che considerano
una perdita in peso dei terreni in piastra non superiore al 10-13%
quale parametro di accettazione negli studi di mantenimento della
fertilità (Growth Promotion Test) dopo esposizione.
È importante evidenziare che una corretta valutazione della perdita
percentuale di peso dei terreni in piastra deve essere eseguita te-
nendo presente alcuni variabili importanti quali il volume di riem-
pimento della piastra e l’incidenza del peso del contenitore pla-
stico. Procediamo con esempi chiarificatori.
Ammettiamo che una piastra petri da 90mm pesi mediamente
10 grammi ed ipotizziamo di testare tre tipi di piastre con egual
contenitore (piastra petri diametro 90 mm e peso 10 g) ma con
diversi riempimenti (18 ml; 25 ml; 30 ml). Ipotizziamo che nel
corso della esposizione ad un egual flusso tutti e tre i tipi di piastre
perdano la medesima quantità di acqua ossia si disidratino con
conseguente perdita di peso pari a 3 grammi cadauna. Ovvia-
mente la piastra con minor volume di riempimento si rileverà la
meno efficace nel contrasto alla disidratazione ma i dati del test
potrebbero non evidenziare chiaramente le differenze qualitative
tra i diversi terreni. (per semplicità, consideriamo 1 ml di terreno =
1 grammo).
Accade sovente che il test di valutazione della disidratazione dei
terreni in piastra dopo esposizione sia eseguito senza tener conto
dell’incidenza che il peso del contenitore plastico può avere nella
valutazione finale ma la tabella sopra riportata indica chiaramente
l’importanza di tale variabile.
Riduzione Peso piastra Riduzione
peso % con plastica peso %
-17% 28 g -10%
-12% 35 g -8,5%
-10% 40 g -7,5%
23
Conclusione
Il monitoraggio microbiologico rappresenta certamente una delle
più critiche e complesse strategie di controllo della contaminazione
attuate in aree classificate GMP. La scarsa innovazione dei metodi
microbiologici più ampiamente utilizzati ha portato a non consi-
derare i dipartimenti di microbiologi come esecutori e responsabili
di alcune tra le più importanti procedure di controllo del rischio di
contaminazione delle aree di produzione farmaceutica.
Oggi, le recenti conferme di aggregati microbici potenzialmente
resistenti all’azione dei biocidi (‘biofilm’), la crescente disponibilità
di differenti tipologie di terreni pronti unitamente alle scoperte tec-
nologiche che hanno consentito la realizzazione di sistemi di mi-
crobiologia a più elevata sensibilità e più rapida risposta rendono
la microbiologia farmaceutica sempre più atta a supportare le
esigenze della produzione farmaceutica. I microbiologi possono
oggi disporre di differenti strategie di rilevazione della contamina-
zione microbica, di diversi terreni colturali, di software per la miglior
gestione dei dati di bioburden nonché di strumenti che sollevano
gli operatori da procedure routinarie garantendo, al contempo,
standardizzazione di operatività critiche. La conoscenza delle
scoperte scientifiche e delle più recenti soluzioni tecnologiche si
affianca alla ampia scelta di attrezzature/materiali di microbiologia
tradizionale per una sempre più esaustiva comprensione dei rischi
di contaminazione microbiologica e per l’implementazione di fattive
e concrete strategie di contrasto e prevenzione di rischi per la sa-
lute dei pazienti.
Per avere ulteriori informazioni sull’articolo inviare una
e-mail a redazione@asccanews.it

Bibliografia
USP <71> Sterility Test
USP <61> Microbiological Examination of Nonsterile Products: Microbial Enumeration Tests.
USP. <62> Microbiological Examination of Nonsterile Products: Tests for Specified Microorganisms
USP <1227> Validation of microbial recovery fron Pharmacopoieal Articles
USP <1116> ‘Microbiological Evaluation of Cleanroom and other Controlled Enviroments’
USP <797> ‘Pharmaceutical Compounding—Sterile Preparations’
Ph. Eu <2.6.12> Microbiological Examination of Nonsterile Products
Ph. Eu <2.6.12> Microbiological Examination of Nonsterile Products: Tests for Specified Microorganisms
PDA TR n° 13 – ‘Fundamentals of an Environmental Monitoring Program – rev 2001’
PDA TR n° 69 – ‘Bioburden and Biofilm Management in in Pharmaceutical Manufacturing Operations’
– ‘Airborne Bacteria Sampling: The Effect of Dehydration and Sampling Time’ – Whyte and Niven. PDA Journal 1986.
‘Microbiological Culture Media in Pharmaceutical Industry – Ibrahim Hashim – 2013
‘Detection, Isolation and Identification of Mold Found in Environmental Monitoring’ – 2003 PDA Annual Meeting – John Brecker
Optimal Media for Use in Air Sampling To Detect Cultivable Bacteria and Fungi in the Pharmacy’ – Weissfeld,Joseph,Le, Trevino, Schaeffer, Vance – Journal
ASM Ottobre 2013.
Comparison of Different Fungal Agar for the Environmental Monitoring of Pharmaceutical-Grade Cleanrooms’ – Gebala, Sandle - PDA Journal 2013.

24 Ascca News n. 2/2016