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I TRASPORTI - FISIOLOGIA ! !

De Simone Anna

Introduzione al corso di Fisiologia Nel passaggio dalla vita unicellulare a quella pluricellulare, in particolare con gli organismi superiori, le cellule si sono organizzate in tessuti per poi costituire gli organi dando cos vita a veri e propri apparati. Per capire il funzionamento degli apparati bisogna conoscere i meccanismi dei sistemi di regolazione, di comunicazione e tutto ci che alla base della loro attivit. Tutti gli organi del sistema digerente formano una cavit tappezzata da una parete costituita da pi strati, quello pi profondo dato da cellule epiteliali che assorbono le sostanze (sotto-strati energetici) consentendone lingresso nelle cellule dellorganismo. Le cellule epiteliali sono caratterizzate da due tipologie di membrana, una apicale che sporge nella cavit dellapparato gastrointestinale e una vaso-laterale bagnata dai liquidi interstiziali. I sotto-strati energetici attraversano in un primo momento la membrana apicale e poi dal citoplasma di queste cellule devono attraversare la membrana vaso-laterale per immettersi nei liquidi interstiziali. Dai liquidi interstiziali, i sotto-strati energetici arrivano ai vasi sanguigni del sistema circolatorio garantendo cos le varie attivit degli apparati. Per permettere il passaggio dei sotto-strati energetici le cellule attuano dei meccanismi di trasporto. Introduzione ai trasporti Al contrario di ci che avviene con leso- e lendo-citosi, i trasporti sono fenomeni che consentono il passaggio attraverso la membrana plasmatica senza alterarne la conformazione. Le sostanze lasciano lambiente extracellulare (passano dai liquidi interstiziali al citoplasma cellulare) ed entrano nella cellula, o al contrario lasciano il citosol per immettersi nella soluzione interstiziale. Quindi il passaggio attraverso il plasmalemma pu avvenire in entrambi i sensi. La membrana plasmatica costituita da un doppio strato fosfolipidico e dal colesterolo ed necessaria per regolare i passaggi delle sostanze e garantire lintegrit dellambiente intracellulare. Le sostanze che attraversano la membrana possono essere idroliche (o lipofobe) e idrofobe (lipole). Tutte le sostanze idroliche sono solubili in acqua e nel corpo umano si trovano in soluzioni, mentre le sostanze idrofobiche (O2, CO2, N2) non si sciolgono in soluzione acquosa a causa di forze di repulsione ma sono solubili in solventi apolari come quello costituito dal doppio strato fosfolipidico. Una seconda classicazione pu essere effettuata in base alla carica, infatti le sostanze possono essere neutre -senza carica nettaoppure cariche -ioni positivi e negativi-, tutti gli ioni sono solubili in acqua. Le molecole neutre possono essere sia idroliche (polari) che idrofobiche (apolari). La polarit di una molecola dipende dagli atomi che la costituiscono, se questi hanno una differente capacit di attrarre gli elettroni (elettronegativit) daranno vita ad una molecola polare. Un esempio di molecole neutre polari dato dai gruppi OH e NH, qui, sia lossigeno che lazoto sono pi elettronegativi dellidrogeno quindi attraggono di pi gli elettroni di valenza creando un dipolo: - per lO2 e N2 mentre + per lidrogeno. Lacqua, il solvente dellorganismo, lesempio di molecola neutra polare per eccellenza, porta cio due cariche parziali (- e +).

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Tutte le sostanze che posseggono una carica, sia netta che parziale, possono dar vita ad interazioni elettrostatiche dette legame idrogeno (tra la carica netta e il opposto, o tra le due cariche nette opposte). Le molecole idroliche e neutre polari sono solubili in acqua proprio perch formano questi legami pertanto sono poco permeabili nella membrana plasmatica. Le sostanze neutre apolari, come ad esempio gli acidi grassi che formano il doppio strato membranoso, sono costituite da molecole date da atomi che non hanno una differenza di elettronegativit, per questo sono idrofobiche e solubili in altri solventi apolari ma non in quelli polari come lacqua. Le sostanze di natura idrofobica possono attraversare la membrana plasmatica solubilizzandosi nel doppio strato lipidico: le molecole lipole sono permeabili nella membrana plasmatica. Oltre la natura chimica, un altro parametro discriminante per il passaggio attraverso la membrana dato dal peso molecolare: le molecole a basso peso molecolare avranno una maggiore permeabilit (passano pi facilmente attraversare la membrana), in questo vi un eccezione, gli ioni, a causa della loro carica netta, per quanto piccoli possano essere, non riusciranno ad attraversare il doppio strato perch la carica netta ne impedisce il passaggio. Le molecole polari neutre a basso PM -come lacqua, lurea, lammoniaca, letanolo, il glicerolo...- (PM < 120) sono permeabili. Al contrario, gli ioni e tutte le sostanze con un peso molecolare maggiore (PM > 120, es.: amminoacidi, glucosio...), genereranno delle forze di attrito che ostacoleranno il loro passaggio. Per consentire il passaggio delle sostanze impermeabili nella membrana, sono presenti delle proteine transmembrana: proteine canale e carrier. I trasporti che avvengono in forma libera (mediante il doppio strato fosfolipidico) o attraverso canali (pori costituite da proteine canale), sono passivi e classicati come diffusione semplice; la diffusione semplice non utilizza trasportatori mentre i trasporti che avvengono con lausilio di proteine carrier/trasportatori sono detti trasporti mediati. DIFFUSIONE SEMPLICE: TRASPORTO IN FORMA LIBERA La diffusione in forma libera avviene attraverso la matrice fosfolipidica, senza lausilio di canali o altre proteine transmembrana. Le molecole, per poter attraversare il doppio strato lipidico devono essere apolari (o scarsamente polari), di dimensioni ridotte e devono presentare un gradiente di concentrazione. La velocit di diffusione attraverso la membrana cellulare dipende dalla capacit della molecola di sciogliersi nello strato lipidico della membrana; per questo motivo, le molecole solubili nei lipidi (lipole o idrofobiche) sono in grado di attraversare il doppio strato fosfolipidico anche in assenza di trasportatori. La velocit di diffusione attraverso la membrana direttamente proporzionale allarea della membrana stessa: maggiore sar larea e maggiore sar il numero di particelle che possono attraversarla in ununit di tempo. Il trasporto in forma libera un meccanismo passivo: le particelle attraversano la membrana cellulare solo in favore di un gradiente perci lenergia necessaria al trasporto proviene dalla dissipazione del gradiente che muove le particelle (gradiente di concentrazione e/o di potenziale elettrico). Un caso particolare di diffusione in forma libera dato da alcune molecole che mutano la loro natura chimica, queste passano da uno stato polare (quindi lipofobico), ad una forma apolare (permeabile nella membrana); il mutamento della polarit pu essere determinato
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da piccole variazioni di PH; una molecola che si trova nella sua forma indissociata (apolare), pu transitare rapidamente attraverso la membrana plasmatica e giungendo al lato opposto, dove vi sar un valore di PH diverso, potr assumere la sua forma dissociata (polare). Questo tipo di diffusione detta non ionica e pu avvenire solo in una direzione preferenziale perch, una volta che la molecola si sar dissociata, a quel particolare valore di PH non potr pi tornare alla sua forma apolare. Questo lunico esempio di trasferimento passivo in cui pu vericarsi il passaggio totale di una sostanza, dallambiente extra- intra-cellulare. La diffusione in forma libera non ionica interessa vari processi metabolici, lesempio pi importante riguarda lammoniaca derivata dalla deaminazione degli amminoacidi nel citoplasma delle cellule epiteliali dei tubuli renali. Lammoniaca (NH3) viene prodotta allinterno delle cellule dei tubuli renali nella sua forma indissociata (liposolubile), una volta che avr attraversato la membrana plasmatica questa sar idratata nello ione ammonio (NH4+) che, non essendo pi liposolubile, non potr diffondersi in senso retrogrado nelle cellule e sar escreto con lurina. DIFFUSIONE SEMPLICE: MIGRAZIONE MEDIANTE CANALI La migrazione mediante canali, come quella in forma libera, di tipo passivo perch consiste in un processo sostenuto dalla agitazione termica delle molecole: le particelle di un soluto tenderanno a diffondersi dalle regioni di una soluzione ove sono pi concentrate a quelle ove lo sono meno, nch si sia raggiunta la condizione di equilibrio. Allequilibrio*2 la concentrazione del soluto sar la medesima in entrambi i compartimenti perch in questo stato i due ussi unidirezionali saranno uguali e contrapposti e il usso netto diverr nullo. La presenza di pori a livello membranoso indispensabile perch consente il passaggio di particelle con un PM < 120, soluti disciolti in soluzione acquosa (neutri polari e ioni), che per loro natura sono impermeabili nel doppio strato lipidico e non possono diffondersi in forma libera. I canali sono proteine integrali di membrana costituite da un numero variabile (da 4 a 6) di segmenti transmembrana che disponendosi in cerchio formano le pareti di un poro idrolo. Gli amminoacidi idroli si affacciano verso il centro del canale creando un passaggio pieno di acqua, in tal modo, le molecole che migrano non passano da un solvente di natura idrolo ad uno di natura lipolo perch resteranno in ambiente acquoso. I pori possono essere ionici o acquaporine. I canali ionici permette il transito di ioni (Na+, K+, Ca2+, Cl-), mentre le Acquaporine regolano il passaggio dellacqua. In ogni caso, possibile la migrazione di molecole di piccole dimensioni come lurea, lammoniaca, letanolo e il glicerolo, nelle acquaporine, questo dipende dalla selettivit del ltro. Oltre ai segmenti transmembrana vi sono le anse intra- e extra-cellulare, sono delle strutture atte a collegare i vari segmenti. In tutte le proteine canale e nei carrier, le due estremit (N-Terminale e C-terminale) sono sempre nel citosol.

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DIFFUSIONE SEMPLICE: REGOLAZIONE DEL FLUSSO La diffusione semplice pu avvenire mediante proteine canale o in forma libera, in ogni caso si tratta di trasporto passivo ovvero, di un meccanismo che non necessita di ATP e il suo usso dipende da vari fattori: - la supercie della membrana: larea direttamente proporzionale al usso. - grado di permeabilit della sostanza: idrofobicit e peso molecolare. - forza spingente: maggiore sar il gradiente di concentrazione e maggiore sar il usso. Vi sono parametri che teoricamente dovrebbero inuenzare il usso ma dal momento che sono valori costanti, questi non lo alterano: - Temperatura: direttamente proporzionale al usso, ma in ambiente siologico la T costante*1. - La distanza da percorrere: lo spessore della membrana costante, inferiore ai 100 (1 angstrom = 0,1 nm); il tempo di percorrenza*2 direttamente proporzionale al quadrato della distanza da ci si evince che i processi di diffusione sono rapidi solo per le brevi distanze, a causa delle reciproche e innumerevoli collisioni che fanno rimbalzare le molecole modicandone continuamente il moto. - coefciente di viscosit: indirettamente proporzionale al usso ma la composizione della membrana plasmatica costante. La diffusione semplice un processo passivo perch la forza spingente data dallenergia cinetica generata dal gradiente di concentrazione; i processi passivi tendono a creare una situazione di equilibrio*3 con usso netto uguale a zero. Lentit del usso netto pu essere calcolata mediante una legge che collega tutti i parametri che inuenzano la cinetica del trasporto: La legge di Fick. J= P C. J calcolato in riferimento al numero di moli diffuse in ununit di tempo e, essendo direttamente proporzionale allarea della supercie membranosa (Am) avremo che il usso (phi) denito come /Am = D /X C. C determina il usso netto e rappresenta la differenza di concentrazione (C1 - C2) tra i due lati della membrana, dove C1 > di C2. P il coefciente di permeabilit ed diverso tra la diffusione in forma libera e la migrazione dei canali. P calcolato P= D /X Il usso direttamente proporzionale anche alla forza chimica (gradiente di concentrazione) e si esprime come C/X dove X rappresenta lo spessore della membrana -per il trasporto in forma libera- ed equivalente allaltezza del poro -per la migrazione mediante canali-. Per stimare il usso necessario considerare anche la viscosit del solvente e la grandezza molecolare della particella, per questo motivo introdotto il coefciente di Diffusione, (D). D pu essere calcolata facilmente utilizzando altre costanti: D= R T/ N x 6 r dove R il coefciente universale dei gas, T la temperatura assoluta che in condizione siologiche non patologiche costante. N il numero di Avogadro (numero di molecole contenute in una mole di sostanza). 6 r rappresenta il coefciente di viscosit che nello specico dato da (eta). La viscosit del solvente costante perch la composizione del doppio strato lipidico non cambia. Proprio come anche 6 e sono valori costanti, quindi non possono inuenzare il usso ne positivamente ne negativamente. Lunico parametro che inuenza il usso r. Questo valore indica il raggio della particella ed direttamente proporzionale al peso molecolare. Da ci si evince che il usso indirettamente proporzionale al peso molecolare ( proprio per questo che r si trova al denominatore). A determinare il grado di permeabilit di una sostanza non solo il peso molecolare, ma anche il grado
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di idrofobicit. Questo introdotto nella legge di Fick con il coefciente di ripartizione (), questo pu essere calcolato sperimentalmente -con lutilizzo di un densitometro- mettendo a rapporto la concentrazione di una sostanza disciolta in un solvente di natura lipidica (es. olio) e in acqua. = C(olio)/C(H2O). Da ci si evince che se >1, la sostanza idrofobica perch la concentrazione sar maggiore nella soluzione di natura lipidica, al contrario, se < 1, lo sar nella soluzione acquosa. Se il soluto dato da sostanze anpatiche, = 1, questo perch le sostanze anpatiche hanno equivalenti porzioni idroliche e idrofobiche. Mettendo a confronto tutti questi parametri si avr: /Am= D / C X. Come abbiamo visto, X, D e sono dei valori costanti che determinano il coefciente di permeabilit, si avr che J= P C, dove J il usso inteso come n/cm2 sec. La legge di Fick (J= P C) applicabile anche alla migrazione mediante i canali, ma in questo caso varia il coefciente di Permeabilit. P= D /X, per i canali il valore = 1. rende conto del passaggio tra due differenti solventi, ma con i canali la particella rester in ambiente acquoso perch migrer attraverso un poro idrolo. D, il coefciente di diffusione, differente ma anche in questo caso si tratta di un valore costante; lo spessore della membrana corrisponde esattamente allaltezza del poro, perci X non varia. Per i canali la legge di Fick pu essere applicata solo se si assume che la particella che attraversa il canale ha un diametro di almeno 10 volte inferiore al diametro del ltro di selettivit presente sul poro. Il coefciente di permeabilit, per la migrazione mediante canali, decresce rapidamente con laumentare del diametro ionico. Con un diametro maggiore entrerebbero altre forze in gioco (interazioni) che renderebbero nulla la legge di Fick. Per i canali, il principale fattore determinante per il grado di Permeabilit dato dal numero di pori presenti a livello del plasmalemma. Il numero dei canali, come quello dei trasportatori, pu essere regolato dalla cellula: se la diffusione in forma libera dipende esclusivamente dalla quantit delle sostanze liposolubili, con i trasportatori e i pori la cellula sar capace di regolare selettivamente gli scambi con lambiente esterno. La regolazione degli scambi dei canali ionici, determinata dalla conformazione strutturale del poro. La cellula pu aprire e chiudere i canali ionici variandone la conformazione. Per quanto riguarda le acquaporine, queste sono presenti selettivamente solo a livello della membrana plasmatica di alcune cellule. *1 A temperature pi elevate, le particelle dovrebbero muoversi pi velocemente, quindi il passaggio tra le due regioni (da quella che presenta pi soluto a quella
ove la soluzione meno concentrata) dovrebbe essere pi rapido. A livello siologico, la temperatura non inuenza la velocit del usso perch costante, dunque il usso dipende unicamente dal gradiente di concentrazione. La temperatura inuenza il usso solo in condizioni patologiche con uno stato di ipertermia (es. febbre). *2 Si calcolato che 100 sono attraversati in un tempo di 10-6 secondi, mentre ci vogliono 30 ore per percorrere una distanza pari ad 1 cm.

*3 Equilibrio dinamico costituito da un movimento molecolare continuo dato da due ussi esattamente uguali e opposti che generano un usso nullo.

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CANALI IONICI I Canali ionici sono proteine che formano un poro acquoso transmembrana che permeabile a specici ioni. E evidente che la permeabilit di una membrana cellulare ad un determinato ione dipende dalla relativa abbondanza (densit) nella sua struttura dei canali selettivi per quel tipo di ione. La selettivit di ciascun tipo di canale ionico data dalla diversa natura degli amminoacidi che compongono il ltro di selettivit del poro. La maggioranza di canali ionici non offre solo una selezione qualitativa degli ioni che devono superare la membrana, ma anche una quantitativa con la controllabilit. Questa propriet rappresenta la facolt di passare da uno stato aperto in cui ammesso il passaggio degli ioni, ad uno stato chiuso, in cui gli ioni non possono transitare. Grazie alla controllabilit, lintensit del usso transmembranario di una determinata specie ionica, pu essere nemente regolata. Il usso ionico, cio la velocit di trasporto, cresce linearmente al crescere del gradiente di concentrazione, proprio come predetto dalle leggi sulla diffusione di Fick. LE ACQUAPORINE Una particolare famiglia di canali costituita dalle Acquaporine, una proteina integrale di membrana specica per lacqua. Le acquaporine sono state osservate per la prima volta alla ne del secolo scorso, quando gli scienziati iniziarono ad ipotizzare la presenza di pori che consentissero il passaggio rapido dellacqua, cos, nel 1990 si riusc ad isolare dalla membrana plasmatica degli eritrociti la prima acquaporina. Quando si parla di acquaporine, si fa riferimento ad una famiglia proteica perch esistono circa 11 differenti isoforme, alcune di queste -una piccola minoranza- consentono il passaggio di composti idroli come lurea o il glicerolo, ma nessuna isoforma consente lo scambio ionico. In ordine cronologico di scoperta, le acquaporine sono denominate 1, 2, 3... La struttura dellAcquaporina-1 comprende 6 segmenti transmembrana ad alfa-elica, uguali a tre a tre: i primi tre segmenti sono speculari ai tre che seguono ma con orientamento opposto. questi sono uniti da tre anse extracellulari e due anse intracellulari (zone della catena polipeptidica che non fanno parte della membrana che quindi si affacciano allesterno -tre anse- o allinterno -due ansedella cellula). Le anse citosoliche (B,D) costituiscono il poro. La differenza tra le classi che consentono esclusivamente il passaggio dellacqua e quelle che permettono anche il passaggio di molecole neutre (es.: glicerolo e urea), sta nella sequenza specica di amminoacidi che costituiscono linterno del canale. Una sequenza amminoacidica altamente conservata presente sulla parte mediana di due delle anse. Queste, penetrando nello spessore della membrana con andamento antiparallelo permettono laccostamento del motivo aminoacidico che formando un poro dal diametro di 4 , zona cardine del ltro selettivo per la molecola idrica. La sequenza alla quale si lega la molecola dacqua per poi essere rilasciata, data dai tre amminoacidi: A-P-N ovvero Alanina, Prolina e Asparagina, ed altamente conservata perch consente alle AQP di svolgere il loro ruolo caratteristico, infatti, a secondo della sequenza amminoacidica della regione mediana delle anse citosoliche che costituiscono il ltro di selettivit, si avranno AQP speciche per lacqua o che consentono il passaggio di altre molecole.
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Nella parte centrale del canale presente il ltro di Selettivit. Il canale che costituisce le acquaporine si restringe nella parte interna con il ltro di selettivit- e si slarga nelle due porzioni esterne. Le misure: Il ltro di selettivit ha un diametro che oscilla nelle varie isoforme, questo va da 4 ad 8 ed determinante per il passaggio esclusivo dellacqua (diametro minore) o del glicerolo e dellurea (diametro di 8 ); il diametro delle porzioni slargate di 30 . La lunghezza corrisponde pi o meno allo spessore della membrana, ed di 60 . Il peso molecolare non esattamente identico per tutte le isoforme, ma pu essere stimato intorno ai 28.000. Perch nessuna delle isoforme consente lo scambio ionico? Per rispondere a questo interrogativo sono state fatte varie ipotesi, come ad esempio lipotesi del setaccio: si ammette lesistenza di canali nella membrana che hanno un diametro non superiore a 8 , cos da consentire il passaggio solo a particelle di dimensioni inferiore. Questa ipotesi fu scartata perch tutte le acquaporine, anche quelle che hanno un ltro di selettivit dal diametro di 8 , escludono il passaggio di ioni di dimensioni pi esigue. Lesclusione delle particelle cariche spiegata con la particolare struttura della proteina canale che al contempo sia cationica che anionica. Lesterno del canale caratterizzato da una carica negativa, per questo il canale cationico ed esclude cos il passaggio degli anioni (Cl-). Nella zona centrale del canale, la carica predominante quella positiva per questo il canale si comporta come anionico ed esclude i cationi (Na+, K+, Ca2+). Il comportamento anionico o cationico del canale indotto dalla tipologia di amminoacidi: se prevalgono gli amminoacidi acidi, la carica generata sar negativa cosicch il canale avr un comportamento cationico. Al contrario se prevalgono amminoacidi basici, il canale sar caratterizzato da una carica positiva -sar anionico- e consentir il passaggio di ioni negativi. Per questo motivo il passaggio degli ioni impossibilitato, lesterno del canale impedisce il passaggio degli ioni negativi e linterno di quelli positivi sfruttando il fenomeno della repulsione elettrostatica. Le molecole dacqua sono immuni a questo fenomeno perch vi un riorientamento del dipolo dellAcqua; questo fenomeno fa si che lacqua sfrutti il suo dipolo orientandosi per realizzare sempre un legame favorevole che garantisce attrazione elettrostatica esponendo la carica + o - meno in base alle pareti. La permeabilit delle membrane plasmatiche direttamente proporzionale al numero di canali presenti, ma bisogna tenere in considerazione anche la forza spingente. Nel caso delle AQP la forza spingente data dalla pressione osmotica, quindi le molecole dacqua (il solvente) passeranno dalla soluzione meno concentrata a quella con maggiore concentrazione di soluto no ad eguagliare le concentrazioni delle due soluzioni. Se linterno della cellula dovesse risultare ipertonico (soluzione molto concentrata) si genererebbero dei ussi di acqua che penetrando allinterno della cellula potrebbero provocarne la lisi. Particolarmente ricche di acquaporine sono le cellule endoteliali che tappezzano i capillari, qui non presente una differenza di pressione. Amminoacidi Acidi, ricchi di cariche negative = Canale Cationico Amminoacidi Basici, ricchi di cariche positive = Canale Anionico

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DIFFUSIONE FACILITATA MEDIATA DA CARRIER La diffusione facilitata un trasporto mediato passivo. A differenza della diffusione semplice dove i protagonisti sono delle semplici proteine canali, qui vi sono delle proteine carrier, caratterizzate dalla presenza di un sito attivo capace di legare una sostanza in modo specico. La diffusione facilitata, essendo un trasporto mediato passivo, non caratterizzata da differenze di afnit per i siti attivi presenti ai due lati della membrana. Nel momento in cui si genera un legame tra il sito attivo del carrier e una sostanza, la proteina trasportatrice subir un mutamento conformazionale nel quale, il sito attivo si trover a rilasciare la sostanza nel lato opposto a quello in cui avvenuto il legame. Da ci si capisce che il trasporto avr luogo solo a seguito della formazione di un legame, perch proprio il legame tra il soluto ed il sito attivo del carrier ad indurre il mutamento di conformazione grazie al quale il sito di legame del soluto viene a trovarsi esposto nel lato opposto a quello della sua formazione. Dopo il cambiamento conformazionale, il soluto si dissocer facilmente dal sito attivo a causa della sua ridotta concentrazione e questa dissociazione consentir alla proteina carrier di ritornare alla sua conformazione originaria e ripetere il ciclo. La diffusione facilitata, essendo un trasporto mediato passivo, vede il formarsi e lo scindersi del complesso sito attivo-substrato solo in dipendenza dalla concentrazione del substrato in uno o nellaltro lato della membrana; in tal modo, il trasporto netto avverr dal lato ove il substrato pi concentrato al lato dove meno, quindi, pur presentando le caratteristiche di specicit, competizione e saturazione, tipiche di un trasporto mediato, il passaggio della sostanza avverr solo secondo gradiente. Poich lafnit del sito attivo non cambia, si parla di uniporto, in questo caso il vettore (carrier) pu trasportare una sola sostanza con differenti valori stechiometrici (es.: uniporto con stechiometria 3, qui il vettore avr tre siti attivi e trasporter 3 molecole della medesima sostanza). Da ci si evince che, come per i canali, anche qui la forza spingente data dalla differenza di concentrazione ed per questo che si tratta di un trasporto passivo, dove la differenza di concentrazione tende ad annullarsi a favore di un equilibrio dinamico*1. La diffusione facilitata consente il passaggio di molecole organiche attraverso la membrana cellulare con la velocit richiesta di fondamentale importanza metabolica, ne un esempio il trasporto del glucosio. La presenza di proteine carrier sulla membrana plasmatica apre le porte ad una nuova possibilit: realizzare trasporti attivi secondari mediante il trasporto accoppiato. Qui il carrier pu trasportare contemporaneamente no a tre sostanze differenti. Il trasporto passivo tende ad annullare i gradienti, al contrario, il trasporto attivo genera forza spingente, cio tende a formare gradienti di concentrazione, per questo richiede il dispendio di ATP. (vedi paragra successivi). Tutti i trasportatori sono proteine intrinseche di membrana: Sono dati da proteine che attraversano pi volte la membrana plasmatica e la proteina rappresenta un collegamento tra lambiente esterno e lambiente interno perch le anse extracellulari sono un collegamento con le anse intracellulari mediante i segmenti transmembrana. Questa struttura riconducibile anche ai recettori.
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Riassunto: Quello dei carrier un trasporto passivo perch il passaggio avverr solo secondo gradiente. I carrier hanno un sito attivo che instaurando il legame con la particella da trasportare genera una variazione della conformazione che ne determiner il trasporto: il sito attivo/di legame, si aprir nella parte opposta a quella in cui avvenuto il legame IL FLUSSO DEI TRASPORTI MEDIATI ( pi veloce per i valori di concentrazione in ambiente siologico). Per quanto riguarda i trasporti mediati, la velocit non dipende esclusivamente dalla forza spingente -come noto per la diffusione semplice-. Per i trasporti mediati, la legge di Fick*7 applicabile solo a basse concentrazioni di soluto perch le proteine che attuano questo trasporto vanno in contro a saturazione, cio, raggiungo una velocit massima (Vmax) e lintensit del usso aumenter con la concentrazione solo a concentrazioni esigue. I carrier coinvolti nei trasporti mediati presentano una cinetica di tipo Michaelis-Menten. Come abbiamo visto, il coefciente angolare della legge di Fick dato dalla permeabilit della membrana che va a determinare la pendenza della retta in una rappresentazione graca su piano cartesiano. Con la legge di diffusione di Fick, la retta ha un andamento lineare perch la velocit cresce proporzionalmente allaumentare della concentrazione; A determinare la pendenza della retta nel caso della diffusione facilitata un coefciente angolare diverso, la Km*2, cio la costante di dissociazione tra il trasportatore e il substrato. Ci signica che se la Km avr un valore elevato, la costante di dissociazione sar alta e quindi ci sar una bassa afnit. Al contrario, se la Km avr un valore basso, lafnit tra il substrato e il sito attivo del carrier sar alta. In altre parole, il valore della Km inversamente proporzionale allafnit: un basso valore della Km garantisce un trasporto anche a concentrazioni molto basse, tuttavia, a causa dellalta afnit, il carrier si satura pi facilmente, quindi la velocit massima si raggiunge presto tanto che allaumento della concentrazione non corrisponder un aumento dellintensit del usso, anzi, per il trasporto mediato, un aumento di concentrazione potrebbe essere limitante per la velocit perch si raggiungerebbe pi velocemente uno stato di saturazione. Nonostante la saturazione, la diffusione facilitata ha un usso pi intenso rispetto alla diffusione semplice, questo stato dimostrato isolando alcuni eritrociti e inserendoli in un liquido simile a quello interstiziale. A livello della membrana dei globuli rossi sono presenti sia canali per la diffusione semplice che carrier per quella facilitata. Per dimostrare la maggior velocit della diffusione facilitata sono state aggiunte delle concentrazioni note di glucosio radioattivo -per i carrier, dato la specicit del sito attivo- e un isomero del glucosio (il mannosio) per i canali; sebbene la diffusione semplice non sia saturabile, mettendo a confronto la quantit di soluto, si vericato che il trasporto facilitato avviene con una maggiore velocit per i valori di concentrazione presenti in ambito siologico. Il valore della Km non costante, per questo motivo detto apparente. Esso pu variare a causa di una delle tre propriet (specicit, saturazione e competizione) caratteristiche dei trasportatori mediati: linibizione competitiva. Questa inuirebbe sulla cinetica del trasporto diminuendone la velocit. Linibizione competitiva si verica quando sopraggiungono nellorganismo sostanze che possono reagire con il sito attivo destinato al trasporto di un determinato soluto cos da far variare lattivit della proteina trasportatrice. Questa
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inibizione non provoca una variazione della conformazione della proteina ma, interagendo con il sito attivo, compete con unaltra sostanza cos da inibirne il trasporto. Queste sostanze inibitrici, non ledono permanentemente lattivit dei carrier perch hanno un effetto Dose-Dipendente: la velocit di trasporto diminuisce allaumentare della concentrazione, ma quando questa si sar dissipata il la proteina trasportatrice riprender la sua normale attivit. La sostanza inibitrice non altera la Vmax*8, ma per raggiungere questo valore sar necessaria una maggiore concentrazione di soluto. Linibitore competitivo porter un aumento del valore della Km perch il sito attivo, potendo legare con due sostanze, perde la specicit. Lintensit del usso pu anche aumentare, questo perch alcune cellule hanno la possibilit di incrementare la densit -il numero- dei trasportatori cos da tener testa, almeno in parte, ai limiti recati dalla saturazione o linibizione. *2 Km corrisponde alla concentrazione di soluto necessaria per raggiungere la met della massima velocit di trasporto (Vmax) e rappresenta lafnit del sito attivo
con il substrato. La velocit di trasporto inversamente proporzionale alla Km: pi alta sar la Km e pi bassa sar lintensit del usso. Dunque la Km rappresenta lafnit del sito attivo con il substrato ed detta apparente perch pu variare a causa dellinibizione competitiva, una propriet peculiare dei trasportatori mediati: con lintroduzione di una sostanza capace di interagire con il sito attivo, il carrier subir una diminuzione della specicit e di conseguenza un aumento della Km. *7 A causa della saturazione la legge di Fick pu essere applicata solo a basse concentrazioni perch presente una velocit massima. *8 Pi alta sar la concentrazione di soluto necessaria per raggiungere la met della Vmax e meno sar lafnit tra il sito attivo e il soluto: la velocit di trasporto inversamente proporzionale alla Km.

TRASPORTO DEL GLUCOSIO, I GLU-T Il trasporto del glucosio, come quello degli amminoacidi, avviene per diffusione facilitata. Nel trasporto del glucosio sono presenti diverse alterazioni patologiche, ne un esempio lo stato iperglicemico; E proprio per la presenza di queste patologie che i meccanismi che regolano il trasposto del glucosio sono stati maggiormente approfonditi mentre il trasporto degli amminoacidi molto meno conosciuto. Il livello del glucosio detto Glicemia ed regolato da meccanismi di uniporto e raggiunge dei valori molto alti dopo i pasti (iperglicemia postprandiale). I trasportatori del glucosio appartengono tutti ad ununica famiglia composta da circa 13 isoforme. Isolate per la prima volta intorno agli anni 70, solo le prime 5 isoforme sono state studiate a fondo, queste sono dette Glu-T e numerate in ordine cronologico di scoperta. I Glu-T sono proteine integrali di membrana con un peso molecolare molto elevato (circa 50.000), in queste proteine il sito attivo pu trovarsi aperto, casualmente, sia allinterno che allesterno della cellula: trattandosi di diffusione facilitata mediata da carrier non ci sar nessuna differenza di specicit tra i siti attivi presenti. La proteina trasportatrice costituita da 12 segmenti ad alfa elica e come per le proteine canali, anche in questo caso entrambe le estremit (C-Terminale e N-Terminale) si trovano allinterno del citoplasma, questa
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similitudine fa supporre la presenza di una forma ancestrale comune. A collegare i 12 segmenti sono presenti 5 anse esterne e 6 interne., a livello dellansa uno i Glu-T presentano una glicosilazione e per questo sono glicoproteine. Le anse dei Glu-T non svolgono un ruolo rilevante come quello delle AQP dove formano il ltro di selettivit, nei trasportatori del glucosio, il ruolo cardine svolto dai segmenti transmembrana, questi sono disposti a formare un anello e presentano il sito attivo. Per localizzare il sito attivo lungo la glicoproteina, alcuni autori hanno utilizzato delle sostanze inibitrici cos da metterne in evidenza la presenza sui segmenti 8, 10 e 11. Di notevole importanza la composizione amminoacidica del segmento 7, infatti, se questo presenta la glutammina, la serina e la leucina (Q, S, L), il trasportatore sar specico esclusivamente per il glucosio. In assenza di questa sequenza altamente conservata, il Glu-T consentir il passaggio anche di altri esosi come il fruttosio e il galattosio. In base alle differenti esigenze dei vari compartimenti siologici, le cellule sono munite delle isoforme di Glu-T pi adatte ai loro bisogni. La Glu-T 1 ubiquitaria (eritrociti, capillari del SNC...) e per questo garantisce un trasporto basale, altamente specico per il glucosio e presenta una media intensit del usso con una Km corrispondente a 5. In Glu-T 2 la specicit per il glucosio molto pi bassa, infatti trasporta anche altri esosi di interesse siologico. Il valore della Km piuttosto elevato, per questo il trasporto lento e la glicoproteina presenta una bassa afnit. E espressa nelle cellule intestinali, renali, pancreatiche ed epatiche. E proprio il fegato a regolare i livelli di glucosio perch questo gli giunge, dopo la digestione, attraverso la vena porta. La bassa afnit della Glu-T 2 non rappresenta un problema perch a livello epatico, la cinetica della Glu-T 2 di tipo lineare: cresce proporzionalmente allaumentare della concentrazione e se le concentrazioni di glucosio dovessero calare, le cellule epatiche possono ricavare energia con un altro substrato: gli acidi grassi. La Glu-T 3 espressa a livello della glia e del cervello, altamente specica per il glucosio e presenta unaltissima afnit, la pi elevata tra le Glu-T studiate (valore Km pi basso), per questo garantisce un trasporto rapido. Questo trasportatore si trova ampiamente rappresentato nelle cellule nervose perch hanno unalta esigenza di glucosio. La presenza delle Glu-T 3 spiega perch il cervello tollera bene gli stati ipoglicemici: essendo una glicoproteina trasportatrice con un valore della costante di dissociazione molto basso, la velocit di trasporto non varia anche a concentrazioni di glucosio molto basse. La Glicemia ideale di mg 90/100, e la Glu-T 3 riesce a soddisfare il fabbisogno dei neuroni anche a livelli molto bassi (50 mg). Al contrario, in casi di iperglicemia, la Glu-T 3 si saturizza. La Glu-T 4 presente nel tessuto adiposo, in quello muscolare e in alcune cellule del cervello. La presenza di questo trasportatore variabile e dipende dallo stato nutrizionale dellorganismo. Se si in uno stato di digiuno, questo trasportatore assente, al contrario, in fase di alimentazione presente. Questo trasportatore altamente specico per il glucosio ed ha unafnit piuttosto alta con un valore di Km basso (quindi garantisce un trasporto veloce veloce). Il trasportatore Glu-T 4 sensibile allinsulina e -come gi detto- non sempre presente nella membrana plasmatica ma si trova in vescicole citoplasmatiche. I trasportatori non sono espressi in condizioni di digiuno per riservare il glucosio alle cellule nervose, al contrario, nel periodo postprandiale, viene inserito nella membrana plasmatica mediante un processo di esocitosi che si attiva grazie ad un meccanismo di comunicazione metabolica che vede come protagonista
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lormone dellinsulina. Inserito nel plasmalemma delle adipocellule e brocellule della muscolatura striata, vi un recettore proteico capace di legare linsulina. I livelli di insulina sono direttamente proporzionali a quelli del glucosio e durante la fase postprandiale, quando la glicemia si alza, aumentano anche i livelli di insulina che legandosi al recettore delle cellule adipose e muscolari innescano delle reazioni che determinano linserimento dei Glu-T 4 nella membrana cellulare, cos la membrana cellulare diverr permeabile al glucosio. I Glu-T 4 si trovano in speciali vescicole citoplasmatiche e passano nella membrana cellulare solo per esocitosi indotta dallazione dellinsulina. La Glu-T 5 presente a livello delle cellule intestinali e renali e si occupa del trasporto esclusivo del fruttosio per il quale presenta unelevata afnit. Dalla distribuzione dei trasportatori, vediamo che questi si adattano bene per il ruolo siologico che devono svolgere nellorganismo. Il trasporto mediato dai Glu-T, trattandosi di diffusione passiva, avviene secondo gradiente (la forza spingente la differenza di concentrazione) e la cinetica determinata dallafnit del sito attivo (vedi paragrafo precedente). TRASPORTI ATTIVI Per lidrolisi dellATP i trasporti attivi possono avvenire anche contro-gradiente: supponendo che le concentrazioni di substrato siano inizialmente uguali ai due lati della membrana cellulare -stato di equilibrio dinamico che rappresenterebbe la fase di stallo per un trasposto passivo-, ma che lafnit del sito attivo del carrier sia maggiore sul lato esterno della membrana e minore su quello interno; il legame tra il sito attivo e il substrato avverr in maggior misura al lato esterno della membrana e in minor misura al lato interno. Si stabilit cos un usso netto diretto verso linterno della membrana, dove la concentrazione aumenter perci il trasporto operer contro gradiente. Anche nel trasporto attivo c una tendenza a raggiungere una situazione di equilibrio dinamico con usso netto nullo ma questo avverr solo quando la concentrazione interna del substrato diventer talmente elevata da compensare alla minore afnit del carrier. Da questo esempio si capisce che il sito attivo dei carrier coinvolti nei trasporti attivi presenta una differente afnit in base al lato in cui si apre. Lenergia necessaria per attuare il trasporto contro gradiente proviene dallidrolisi dellATP e la direzione del trasporto andr dal lato in cui il sito attivo a pi alta afnit a quello in cui a pi bassa. I trasporti attivi si bloccano in assenza di ATP e possono essere Primari o Secondari. Nel trasporto secondario, il vettore deve essere necessariamente munito di almeno due siti attivi differenti cos da poter attuare trasporti accoppiati che possono essere simporti o come i trasporti primari antiporti. -simporto (cotrasporto): il trasportatore munito di due siti attivi che si aprono contemporaneamente sul lato interno o esterno della cellula. Il trasporto inizier solo quando entrambi i siti attivi avranno legato una sostanza innescando cos la variazione conformazionale. In questo tipo di trasporto, le particelle di differenti sostanze, vengono trasportate contemporaneamente nello stesso senso.

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-antiporto (controtrasporto): in questo caso, i trasportatori presentano i siti attivi aperti sui lati opposti della cellula, anche qui il trasporto avverr solo quando entrambi i siti attivi avranno legato il substrato specico. In questo tipo di trasporto, le differenti particelle vengono trasportate in senso opposto. Un esempio di antiporto dato dalla pompa sodio potassio con stechiometria 3 Na, 2 K. E bene sottolineare che nel trasporto accoppiato, il trasferimento delle due differenti sostanze obbligatorio: il trasporto non pu avvenire se un sito attivo non ha legato la sua sostanza afne. Fin ora non sono stati osservati, nella membrana cellulare, trasporti accoppiati di sole molecole organiche, il simporto o lantiporto vede sempre come protagonista almeno uno ione inorganico.

TRASPORTO ATTIVO PRIMARIO Esistono solo tre tipi di trasporti attivi primari, il nome di questi pu derivare sia dal tipo di sostanza trasportata che dalla loro caratteristica: sono ATP-asi e la loro attivit enzimatica condizionata dal legame con i cationi. I tre trasportatori attivi sono: - ATP-asi Na/K-dipendente o Pompa Na+/K+ - ATP-asi H/K-dipendente o Pompa H+/K+ - ATP-asi Ca/Mg-dipendente o Pompa Ca2+ Il nome pompa indica che si tratta di un trasporto attivo che necessita di ATP e la sua attivit. Questi trasportatori fanno parte della famiglia delle proteine ATP-asi di tipo P e si distinguono due gruppi. Il primo costituito da una struttura eteropolimerica costituita da 2 subunit e 2 (Pompa H+/K+ e Pompa Na+/K+). Al secondo gruppo appartengono monomeri costituite da una sola subunit (Pompa Ca2+). La subunit svolge un ruolo di supporto permettendo un buon inserimento allinterno del doppio strato fosfolipidico della membrana mentre la funzione di pompa e quindi di idrolisi dellATP deputata alla subunit . Come tutte le proteine trasportatrici osservate n ora, le estremit della subunit si trovano entrambe nel citosol, mentre la subunit presenta lestremit amminica allinterno e quella carbossilica allesterno della membrana, questo fattore in linea con il ruolo di supporto svolto da questa subunit. La subunit una glicoproteina (lestremit C-Terminale carbossilata) e non ha neanche unansa intramembrana: costituita da un solo segmento transmembrana ed ha un peso molecolare di 40.000 Dalton. La subunit composta da 10 segmenti transmembrana ed ha un peso molecolare di circa 110.000 Dalton. POMPA Na+/K+
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STRUTTURA E FUNZIONAMENTO

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La pompa Na+/K+ un controtrasporto (antiporto), che garantisce una bassa concentrazione di sodio nel citosol a favore del potassio. Per ogni molecola di ATP idrolizzata, la pompa Na+/K+ espelle dal citosol 3Na+ e ne immette 2K+, questa pompa quindi elettrogenica: espellendo pi cariche positive di quante ne importa, tende ad innalzare modicamente il potenziale di membrana della cellula, con un esterno positivo ed interno negativo. Unaltra conseguenza della diseguaglianza dellantiporto Na+/K+ un notevole effetto osmotico, che contribuisce a regolare la tonicit intracellulare, come dimostra losservazione che il blocco della pompa Na+/K+ porta, tra laltro, il rigonamento e inne la lisi della cellula. Come per le AQP e per i Glu-T, i segmenti transmembrana assumono una formazione ad anello, nel caso della Pompa Na+/K+, sono i segmenti 4, 5 e 6 che vanno a costituire il sito di legame. Le anse citosoliche sono molto sviluppate, la prima ansa denominata Sito A dove la A sta per Attuatore, per sottolineare che la prima ansa attua la defosforilazione della proteina. La seconda ansa citosolica, che va dal segmento 2 al 3, forma il Sito P e quello N. Al sito N si legher lATP destinato ad essere scisso in ADP + P, con la liberazione dellenergia necessaria per il controtrasporto dei due cationi. Al sito P, avviene la fosforilazione dei residui di aspartato. Il funzionamento di questo antiporto pu essere paragonato ad un ciclo, che, ogni qual volta giunge alla sua conclusione, avr utilizzato una molecola di ATP. Per facilitarne la descrizione, il ciclo pu essere diviso in due fasi, nella prima la proteina trasportatrice prende il nome di E1 e sar in grado di legare ATP e 3 ioni Na+ sul versante intracellulare. Mentre nella seconda fase, la proteina sar identicata come E2, qui la pompa si chiude verso linterno e si apre verso lesterno per rilasciare i tre ioni sodio e legare i due potassio. Il ciclo ha inizio quando una molecola di ATP si lega al sito N -localizzato a livello della seconda ansa interna-, in conseguenza di questo legame, il sito attivo che si apre allinterno della membrana, diventa ad altissima afnit per il Sodio e a bassissima per il Potassi. Quando il Na+ si lega al sito attivo, la proteina trasportatrice prender il nome di E1 Na. Il legame tra il sito attivo e il sodio determiner una variazione di conformazione del sito N che porter alla scissione dellATP in ADP + P. LADP sar rilasciato nel citosol mentre il fosfato si legher alla proteina su un residuo di aspartato presente sul Sito P. A questo punto la proteina si fosforilata. Contemporaneamente alla mutazione conformazionale, il sito attivo che lega le tre molecole di Sodio, si apre allesterno e poich non pi ad alta afnit, le molecole di sodio saranno rilasciate allesterno della cellula. Quando 3NA+ ceduto allesterno, la proteina sar identicata come E2 P (fosfato). Il sito attivo aperto allesterno, a questo punto, diverr ad altissima afnit per il potassio, cosicch, anche se questo si trova a basse concentrazioni riuscir ugualmente a legarsi dando vita al complesso E2 K. Appena le due molecole di K+ si legano al sito attivo, il sito A subir un mutamento della sua conformazione che innescher il rilascio del fosfato allinterno del citosol. A questo punto la proteina nuovamente in forma defosforilata. Solo quando il substrato -rappresentato dal potassio- si sar legato al sito attivo, questo si aprir allinterno della cellula e il Sito N cambier nuovamente di struttura e potr legare una nuova molecola di ATP. A questo punto la fase E2K terminata e inizier un nuovo ciclo con la proteina trasportatrice nuovamente in forma E1.
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Ordine in cui identicata la proteina con le varie fasi: E1

E1 NA+ E2 E2 P E2 K+

e si ritorna ad E1

POMPA Na+/K+ I SITI E LINIBIZIONE Come abbiamo visto, la struttura della subunit , comune a tutte le pompe, presenta tre domini citoplasmatici identicati per la funzione che svolge il sito di rilevanza (A: attuatore, N: nucleotide legante e P: fosforilante). Sito N: lega la molecola di ATP e la scinde in ADP che viene liberato nel citosol. Il fosfato si legher ai residui di aspartato del sito P. Fase E1, Fase E1 Na. Sito P: avviene la fosforilazione dei residui di aspartato presenti sul sito, (fosforilazione Na-dipendente). Fase E1 Na. Sito A: situato sulla prima ansa interna per questo motivo tale ansa detta Dominio Attuatore ed attua la defosforilazione della proteina (defosforilazione K-dipendente). Passaggio da E2 P a E2 K. La pompa Na+/K+ ubiquitaria e ne esistono diverse isoforme, la loro inibizione potrebbe porre rimedio a diverse patologie, ad esempio la forza contrattile del cuore potrebbe essere aumentata grazie allazione di un estratto della pianta digitale capace di legare alle isoforme cardiache. Loubaina un glicoside cardioattivo che inibisce lazione della Pompa Na+/K+ competendo con il potassio per legarsi sul sito attivo extracellulare (proprio perch loubaina una sostanza proveniente dallesterno). Il legame con loubaina blocca la pompa perch impedisce la defosforilazione attuata dal sito A che avviene solo in presenza del potassio (defosforilazione K-dipendente). In tal modo il ciclo si arrester irreversibilmente nella forma E2 P e il passaggio alla E2 K non avverr perch loubaina, legandosi al sito attivo, avr soppiantato il potassio. Inibendo il 20% delle pompe cardiache si avr un notevole miglioramento della forza contrattile del cuore. POMPA DEL CALCIO La pompa del calcio attua un trasporto attivo primario di carattere uniporto. E costituita unicamente da 2 subunit ed esistono due differenti isoforme: una tipica del reticolo sarcoendoplasmatico (sarcoendoplasmic reticulum calcium-ATPase: SERCA) e una della membrana plasmatica (plasma membrane calcium-ATPase: PMCA). La pompa Ca2+ provvede alla rimozione attiva del calcio dal citoplasma, mantenendone un valore costante molto basso: 10-7 moli/l, un valore straordinariamente inferiore a quello dellambiente extracellulare, dove la concentrazione di circa 2 mM, cio 20.000 volte superiore, per questo la pompa del calcio si trova ad operare contro un elevatissimo gradiente elettrochimico. Lelevata forza spingente non genera nessun usso a causa della scarsa permeabilit della membrana. Quando la cellula necessita di calcio, la permeabilit viene aumentata cos da consentire un trasporto passivo operato secondo gradiente, in secondo momento, per mantenere una concentrazione di calcio bassa, questo verr immesso allesterno mediante un trasporto attivo operato contro gradiente. Come la pompa Na+/K+, anche la SERCA elettrogenica: il potenziale di membrana tende ad innalzarsi perch il trasferimento coinvolge 2 ioni Ca2+ e ad ogni ciclo necessaria lidrolisi di una molecola di ATP. La pompa PMCA ha una stechiometria pari a 1.
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La differenza di stechiometria tra le due pompe causata dalla loro collocazione: le pompe situate a livello del reticolo sarcoendoplasmatico dovranno vincere solo il gradiente di concentrazione (non vi differenza di carica), mentre la PMCA, dovr vincere anche il gradiente elettrico generato dalla carica negativa presente allinterno della cellula. Pur trattandosi di un uniporto, il meccanismo dazione della pompa Ca2+ pu essere descritto come quello della Na+/K+ ovvero diviso in due fasi: E1 e E2. Nello stato E1, il calcio si lega al proprio sito attivo esposto sul versante citosolico della membrana. Analogamente alla fase E1 dellantiporto Sodio/Potassio, il sito di legame si apre nel citosol e si ha lattacco dellATP e del Mg2+ a livello del Sito N. Con lidrolisi dellATP il sito attivo diventa ad alta afnit e sar capace di legare lo ione calcio anche a bassissime concentrazioni. Il sito N liberer lADP nel citosol mentre il fosfato si legher su un residuo di aspartato presente sul Sito P. La proteina fosforilata sar detta E1 P. A seguito dellidrolisi dellATP e del legame tra il sito attivo e il calcio ha inizio la fase E2 P, dove la molecola della pompa si riorienta nello spessore della membrana esponendo il sito attivo allesterno che per la SERCA sar il lume del reticolo e per la PMCA saranno i liquidi interstiziali. Con il riorientamento della pompa, il sito attivo perder la sua alta afnit per gli ioni Ca2+ cos questi saranno rilasciati. A differenza di quanto accade nella pompa Na+/K+, dove la defosforilazione avviene dopo lattacco degli ioni K+ al versante extracellulare, con la regolazione del calcio, la defosforilazione precede il rilascio degli Ca2+ ed ed avviene ad opera dal Sito A. Lattivit svolta da questa pompa regolata dallo stesso ione calcio che agendo come molecola segnale pu attivarne o inibirne il funzionamento. Riassumendo: luniporto ha inizio quando lATP si lega al sito N e il sito attivo che contemporaneamente si apre nel citosol diviene ad alta afnit cos da garantire un legame con il calcio anche se esso presente a basse concentrazioni. Il legame con il Calcio innescher una prima variazione di conformazione che consentir al sito N di idrolizzare lATP. A questo punto la proteina passer ad uno stato ad alto contenuto energetico -pi instabile-, contemporaneamente allattacco del Calcio, come avviene per tutte le proteine trasportatrici, si avr una mutazione della conformazione strutturale che porter il sito attivo allesterno della membrana -cavit del reticolo se si tratta della SERCA, liquidi interstiziali se si tratta della PMCA-. A questo punto il calcio sar liberato perch il sito di legame non sar pi ad alta afnit: labbassamento dellafnit dettato dal passaggio della cellula da uno stato energetico molto alto ad uno stato a pi bassa energia. Con la variazione di conformazione avviene la defosforilazione ad opera del sito A e il fosforo sar rilasciato nel citosol consentendo al sito N di legare una nuova molecola di ATP e dar vita ad un nuovo ciclo. Sia per la pompa Na+/K+ che Ca2+ si verica un passaggio da uno stato ad altissima energia ad uno stato a basso contenuto energetico. Il trasporto avviene contestualmente in tempi rapidissimi, in quanto, le forme ad alto contenuto energetico sono anche le pi instabili.
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LATTIVAZIONE DELLE POMPE CALCIO Al contrario delle pompe Na+/K+ che si trovano sempre in uno stato attivo -il loro funzionamento continuo perch i trasporti attivi secondari sono Na-dipendenti-, le pompe calcio sono presenti a livello della membrana o del reticolo in uno stato di inibizione. La SERCA e la PMCA iniziano la loro attivit solo quando le concentrazioni del Ca2+ aumentano in risposta ad uno stimolo cellulare che induce una maggiore permeabilit della membrana plasmatica o del reticolo, al calcio. Quando lo stimolo cessa, le concentrazioni di calcio allinterno della cellula devono necessariamente abbassarsi ed proprio a questo punto che la SERCA e la PMCA entrano in funzione come meccanismo di feedback, per mantenere la normale omeostasi del calcio. La SERCA si trova sempre in uno stato attivo ma il suo funzionamento impedito dalla presenza, sul reticolo sarcoendoplasmatico, di una proteina che ne ostruisce il sito di legame per il Calcio. La proteina in questione il fosfolambano, ha un pm molto basso (6.000) e nella sua forma defosforilata ha una conformazione capace di ostruire il sito attivo della SERCA cos da bloccare il legame con il calcio. Lazione del fosfolambano impedita dalla sua fosforilazione a livello dellestremit amminica, su residui di serina e treonina. La fosforilazione del fosfolambano avviene ad opera della Chinasi calcio-calmodulina-dipendente. Quando la cellula riceve uno specico segnale le sue concentrazioni di Ca2+ aumentano, se i livelli di calcio sono abbastanza alti questo sar capace di interagire con la calmodulina, una proteina che possiede 4 siti di legame per il calcio. Ad alte concentrazioni di Ca2+ tutti i siti attivi della calmodulina saranno occupati dallo ione e solo cos la proteina calmodulina sar in grado di attivare le Chinasi presenti nel citosol -enzimi che idrolizzando ATP sono capaci di fosforilare un residuo aminoacidico di una determinata proteina-. Si tratta di chinasi calcio-calmodulina-dipendente che andranno a liberare il sito attivo della SERCA fosforilando i residui di serina e treonina dellestremit amminica del fosfolambano, trattandosi della SERCA, anche questa estremit sar citosolica. A seguito della fosforilazione, il fosfolambano cambier di conformazione e il calcio potr essere trasportato nel lume del reticolo. Quando i livelli di calcio calano, il complesso calcio-calmodulina non sar pi presente, dunque le chinasi non saranno attive e il fosforo presente sui residui di serina e treonina sar tagliato dalle fosfatasi presenti allinterno della cellula. La PMCA attua un meccanismo di autoinibizione dettato da particolari interazioni tra le anse interne. Linibizione cessa quando lestremit carbossilica interagisce con la calmodulina. Dunque anche in questo caso dovranno esserci alte concentrazioni di Ca2+ per garantire lattivazione della calmodulina e il funzionamento della PMCA. TRASPORTO ATTIVO SECONDARIO - TRASPORTO ACCOPPIATO Nel trasporto secondario, il vettore deve essere necessariamente capace di effettuare trasporti accoppiati per la presenza di una sostanza capace di guidare il trasporto, questa sempre uno ione di cui ci sar un gradiente favorevole; di solito lo ione che guida il trasporto il sodio - proprio per questo che a differenza delle pompe calcio, quelle Na+/K+ sono sempre attive, devono generare gradiente-. Per attuare il trasporto accoppiato il vettore sar sar munito di almeno due siti attivi differenti, uno destinato
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necessariamente allo ione che deve guidare il trasporto. La proteina che attua un trasporto attivo secondario non unATP-asi, ma in assenza di ATP il processo si blocca perch i trasportatori utilizzano i gradienti ionici generati dai trasporti attivi primari che usano in modo diretto lATP. Con i trasporti secondari, le proteine coinvolte determinano un trasporto contro gradiente -per questo detto attivoma sono Ione-dipendente (di solito Na). Il trasporto attivo secondario pu dar vita a simporti e antiporti, ma avendo differenti siti attivi non potr mai dar vita ad uniporti. A differenza dei trasporti primari che ne sono solo tre, quelli secondari sono molto numerosi. Simporto SGLT isoforma 1. Questo trasportatore particolarmente espresso nelle celle dei tubuli renali e negli enterociti, cellule epiteliali che tappezzano la mucosa intestinale. La particolarit degli enterociti sta nella membrana: quella apicale sporge nel lume della cavit intestinale ed caratterizzata dalla presenza di microvilli (piccole estroessioni digitiformi coinvolte nellassorbimento); proprio a livello della membrana apicale che si trovano i vettori SGLT-1 (S=sodio, GL=glucosio, T=trasporto). La membrana baso-laterale liscia ed bagnata dai liquidi interstiziali, solo a livello di questa membrana saranno presenti le pompe Na+/K+ necessarie a mantenere il gradiente per il Sodio che guider il trasporto consentendo il transito del Glucosio anche contro forza spingente. A causa dellazione delle pompe Na+/K+, la concentrazione di Na sempre maggiore nel lume intestinale rispetto allambiente cellulare. Oltre la forza chimica presente anche una elettrica data dal potenziale della membrana che attira il sodio allinterno della cellula; grazie a queste due forze, quando i due siti attivi per il sodio si aprono allesterno, lo ione si legher a prescindere dallafnit del sito di legame. Nellesatto momento in cui si lega il Sodio, si former un sito attivo per il glucosio che sar ad altissima afnit, quindi capace di legarsi alla molecola neutra anche a basse concentrazioni, cos da trasportare il glucosio contro gradiente. Quando i siti attivi avranno legato il substrato corrispondente, il trasportatore subir la classica mutazione conformazionale che vedr i siti di legame aprirsi allinterno del citosol. Nellambiente citosolico la concentrazione di Na sar bassa, pertanto il sodio sar rilasciato; il distacco del sodio determiner la scomparsa del sito attivo per il glucosio cosicch sar rilasciato. Stechiometria: per ogni 2 molecole di Na ne sar importata una di Glucosio. Strutturalmente il trasportatore molto simile ai GLU-T: 12 segmenti transmembrana, anse poco sviluppate e come tutti i trasportatori e le proteine canale, le due estremit carbossilica e amminica allinterno del citosol. Antiporto calcio-sodio: in questo caso saranno trasportati due ioni e la stechiometria sar 3:1, per ogni 3 molecole di sodio -ione che guida il trasporto- importate, ne sar trasportata 1 di calcio allesterno. Il calcio sar trasportato sempre contro gradiente e il trasportatore dovr vincere anche il potenziale elettrico di membrana. Lantiporto calcio-sodio collabora con la PMCA per mantenere lomeostasi del calcio (10-7 moli/l). La PMCA, essendo un trasporto attivo primario, consuma direttamente ATP, al contrario lantiporto calcio sodio consuma indirettamente lATP sfruttando il gradiente generato dalla pompa sodio potassio. Come con la SGLT-1, anche in questo caso i siti attivi per il sodio aprendosi allesterno legheranno 3 ioni Na a prescindere dallafnit del sito di legame, perch la concentrazione di Na+ allesterno della cellula nettamente superiore.
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Nellesatto momento in cui si legano i tre ioni Na+ allinterno del trasportatore, si former un sito attivo ad altissima afnit capace di legare il calcio a prescindere dalla sua bassissima concentrazione. Il calcio sar trasportato allesterno nonostante il potenziale elettrico e il gradiente avverso; con il legame del calcio si avr il classico cambiamento di conformazione che vedr lazione dellantiporto: i siti attivi del sodio si apriranno allinterno dove la concentrazione di Na+ bassa e il sito di legame del Ca2+ si aprir nellambiente extracellulare dove la concentrazione di calcio 20.000 volte superiore. Quando il sodio si dissocer dal sito di legame -a causa della sua bassa concentrazione in ambiente cellulare-, il sito attivo del calcio cambier di conformazione cos da avere una costante di dissociazione talmente alta da rendere nulla lazione del sito attivo. Alla scomparsa del sito attivo il calcio sar liberato allesterno. Lazione della ouabaina: se la concentrazione dello ione sodio aumenta, nella cellula non avverr pi il distacco di Na dal sito di attivo, e di conseguenza non sar neanche trasportato il calcio allesterno. Da ci chiaro che il funzionamento dellantiporto calcio-sodio, dipende esclusivamente dalla Pompa sodio/potassio. Per lisoforma delle cellule muscolari cardiache della pompa sodio potassio esiste un inibitore specico, si tratta della gi citata ouabaina. Da utilizzare con un dosaggio specico cos da non bloccare troppe unit pompa: il pericolo della cellula quello di contenere troppo sodio da generare un differente gradiente ionico con lambiente ectracellulare cos da attirare acqua per osmosi e andare incontro a lisi. Le due soluzioni (esterna e interna) sono isotoniche e questa situazione deve permanere costante per non andare incontro a lisi. Per questo la pompa sodio potassio indispensabile, onnipresente e sempre attiva. Non bisogna creare ripercussioni sulla pressione osmotica dellacqua, al massimo possono essere inibite solo il 20% delle pompe presenti a livello del plasmalemma. Ouabaina: glicoside cardioattivo che andr in circolo e agir sulle pompe sodio potassio delle cellule cardiache che provocher un aumento della concentrazione del sodio allinterno della cellula. Dunque diminuisce il gradiente chimico (la forza spingente) del sodio che incider sullo scambiatore sodio-calcio. Di conseguenza aumenter anche la concentrazione del calcio nel citosol. Essendo il calcio una molecola segnale, linnalzamento della concentrazione dello ione calcio nella cellula, inuenzer su alcuni fattori: nelle cellule cardiache, il ruolo principale che svolge il calcio come molecola segnale quello di indurre la contrazione muscolare; in tal modo, se i livelli di calcio sono pi elevati ci sar un proporzionale aumento delle contrazioni muscolari.

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