Cromatografia

Insiem di tecnih hec hano lo scop di

separ una celamis nei suoi compneti , per
erpmtn
l’analisi
qualitv e quantiv

Quest ectnih rutanosf la diversa

“attitudine” che i vari compneti la cemisla
hano a distrbu fra due fasi imscbl ,
una chiamt fase fisa o fase stazionr e
l’altra chiamt fase mobile o entlu , che
cefluis in contiu atrveso la fase fisa .
1
 MOBSIREAZNFLT
•Fsiaonretz :
)a solide (geldic,s aumn polverdi
odceluisatm, etc
).
b) liqude ( licons , poligc ,dipolam
poliestr,dcabu etcc… )
•Fsiamobl:
)a iqudel (comunislvetrga,ouzin
acquose)
b) seoga (argon,eli azot)

2
 CROMATOGRAFIA: definizione IUPAC*

ltionaer*(I Unio of Pure and liedAp mistry)Che

" otdMe tousa nteimarp rpe la zioneraps di e ntiecomp id una

miscela ; i ntimpoec vengo tibudsr tra due ifas una lde quali è
afis ntrem l'tra è bileom . La sefa riazonst può res un solid, o
un liqudo ortapus us id un ,solid o un gel . aL efas rianstzo può
ser taimpc in una ,acoln spar come uno to,sra o tiadsrbu
meco un film . aL finzoed "leto fico"tgram è taus meco
termin eralgn rpe dnotare una ilsaqu lde rieva forme in cui può
res taus la efas riastzon .”

Quind la fiatogrmc è una tecnia id zionespra bast sula

ziomgnera nziatredf led nzesota ad reaps rsoveta

due fasi tra loro immiscibili

3
 RAFICOTGMLE
Rapresnt il d om in cui òup esr taus al fase
,zionarst cioè :
‡ catimp in una colna . La efas zionarst è
conteua in un tubo id unoprt metrodia e unlgheza ;
la fase bilemo la versat per vitàgra o tos presion .
CROMATGFI SU ACOLN
‡ tribuads come un film id diverso oresp . aL efas
zionarst è tarsupo nei orip dela cart o us una
superfic pian etro,(v alumino, er)polist ; al efas
bilemo is e,ovmu ersoavt la efas ia,onrzst per azione
dela capilrtà o per vitàgra .
CROMATGFI RENAPL

4
atogrfiCm ntelu
nasucol

fasetzionr

5
 Cromatgfisule
( T hin L ayer C hromatgpy )( TLC)

6
 aL prima cromatgfi fu uitaegs dal
botanic orus tTswe che scoprì che in
un otesra id foglie erdiv is anotrv
sei entipgm divers ue(d clorfie e
troqua i)enodcart .

Esperimento di Tswett: un otraes

id clorfie in e r t id petroli vien
tosavr ni una colna conte la
fase zionarst , costiua ad CaO 3.
All’inizio le clorfie nos elocaizt
in taes la colna . Con l’aggiunta id
una eguatd quantià id elunt e(fas
bilemo) i divers entipgm nos
tiscnar verso li osba e is ranopes
lungo la colna formand una seri id
bande id colre e larghez divers 7
 Il iomscugl uidoql ad cui separ
CROMATOGRAFIA i nticompe vien oversat anel
nacol encot al efas fisa
(solida) che ntraei ni mod
diverso i comipnet . Le molec
ide rsidve compsti, tendica con
vari ,colri ons almentzi
mescolat (1). L’eluente ( fase
mobile ) el trascin golun al
nacol, ma al fase safi el
traien in mod tivosel (2).
Si un equilibrio tra la fase
crea
mobile (eluente) e quella fissa.
Le molec zurea son quel
con noreim tfinàa rep al fase
fisa e nos atrenu id enom ;le
verdi son el più lent, quel
rose onha una elocitàv
mediantr . L'efto sivocmple
del rocepdimnt é al separazione
dei vari costituenti la miscela (3)
8
9
 Cenni storici
1898 - 1903 D. Trebot Day,no,mericagl òpus
idrocabutlznfes.
1903-1906 M. Tswett,o,rusbtanic òpedgm
rdioveutlzanfgspc
CaO 3 detroli; p eilnchaomò
teilcmdan".orsgfuh
1930 - 1931 R. Kuhn e E. Lederer rpelaficomtguzn
zioneraptdxfcsl.
1938 N.A. Izmailov e M.S.Shaiber roescidmapl
sotileraufmgcv
1941 A.J.P. Martin e R.L.M. Synge ornimtaplse
rtizone.spaduEflvcmg
tasudieln'orbpgc
laed'istzon.cr
1952 A.J.P. Martin e R.L.M. Synge miorbeNlp
tizodrnepalsvumfcgh
gas - liqudo.
1956 J.J.van Deemter zioònerasvlupdt
.ficaromtg
1958 E.Stahl sulaficromtgendp
otile.sra
1966 ladeizofIncrmtgsvup
.zionestarldpquf 10
I METODI CROMATOGRAFICI SFRUTTANO LA
DIVERSA AFFINITA’ DELLE MOLECOLE E DEGLI
IONI NEI CONFRONTI DI DUE FASI (FISSA E
MOBILE) DIVERSE FRA LORO ED IMMISCIBILI.

Steso princo su cui si bas l’estrazi con

solvent . eL sotanze che is separno vengo
“ripartite” fra due fasi no cmisbl S e M ni
ebas la lor coefficiente di distribuzione Kd:

Kd = CS/CM

veDo Cs S)a(fisenlcoètrz e
CM ènecobila(M)zmfstr .
11
 Si realiz una estrazion dinamc ni contiu .
ùPi la sotanz è afine per la fase staonzir,
più a ungol vien traenu . nI questo mod li
suo pasgio atrveso la fase stazionr è
ralento priseto a oquel di sotanze meno
inaf per tale efas .

Kd = Cs/CM
12
 Fasiceodlmtgrfp
- il pionecam è todinr nela fase mobile o toiasdep
sula fase zionarst ;
- la fase obilem vien fat relui in contiu ersovta la
efas riazonst ;
- i neticomp lade celamis ad raesp ranove
scinatr lad fase bilemo e is tribuscond tra el due
fasi a ndaecos dela lor nitàaf varelti e ndosec il
coefint id tribuzoneds

Kd=Cs/Cm

che ivedscr il rtoap del razioncet id ogni

litan lungo li opercs rpe niog “micro
- equilib
giuntora ntedura il proces raficotgm .
13
 E’ possibile ottenere grafic
micro - equilbrzonpcda,s mt
tribuz(oneladsvg A e B)
secondi pichdonetraz ,nasigudform
deltipca CROMATOGRAMMA

A B

B
A

B
A

14
 Il CROMATG madirlgè chetroamunp
ladipenzusctor es(a
)y in funzione del tempo o
x)es(a . del
f(C) lA giosap del los
B
elunt li lesgna è ltom
A obas (linea id e)bas . lA
giosap del anzesto in
esam il egnals lesa ,
giunera li oimsa e poi
riscend . Ogni nasiug è
Tempo di ritenzione
t deto
rafico.tgpm
lI tempo id ritenzo è il mpoet rioneacs al nzasto
per esr eluita lad fase bilemo ravesot tou il
leto dela fase zionarst ( ianls tivaqul )
L’area del pico è invec dipent lad conzietra
dell’
anlit e quind lad sua quantià ( anlis tivaqun 15 ).
 SEPARAZIONE OTTIMALE

)a zionespar con
rsac risoluzne
b) lioramg al
luzioners
c) aimot risoluzne

16
I mecanis che regolan li proces
cromatgfi son moltepic, am comuni a uti
son le interazo che is verifcano tra la
sotanz da separ ( anlit ) e le due fasi . Tali
interazo son quasi sempr deboli :
‡ legamidron,ipl - dipol, dipol - dipol
indotelgamV der lsWa
.ma talvolta…
‡ onpsfrmai legamidcornz ;
‡ opureasint interazoch
sterich
17
 CLASSIFICAZIONE DELLE TECNICHE
CROMATOGRAFICHE

eL tecnih cromatgfihe onps

esr cateifls ni ebas a :

 tipo di efas mobile

 forma leto cromatgfi
(tipo di ione)luz
 mecaniso di separzion

18
 CLASSIFICAZIONE DELLE TECNICHE
CROMATOGRAFICHE IN BASE AL TIPO DI
FASE MOBILE

LSC:cromatgfi
liqudo /solid
Cromatografia liquida (LC):
LLC:cromatgfi
liqudo /liqudo

GSC:fiacromtg
gas /solid
Gas-cromatografia (GC):
GLC:fiatogrcm
gas /liqudo
19
 CLASSIFICAZIONE DELLE TECNICHE
CROMATOGRAFICHE IN BASE ALLA
FORMA DEL LETTO CROMATOGRAFICO

SU COLONNA PLANARE
aL fase zionarst è Paper chromatography (PC)
conteua all’interno id
Thin layer chromatography
una colna cilndra ,
(TLC)
che is òup pirem
entcompla ( onacl èzionarstfeL
catimp ) opure unasperfictbd
rivestn la ficesupr pian,ucheròs
intera ( colna (ceortapsu PC)ouna
tublare ) otrinalsve
(terialm TLC)
20
 tourafisgCm
uraficolnstgCm letiso
( T inh L ryea C yphromatg )
 impact ( TLC)
 tublare

21
 MECCANISMI DI SEPARAZIONE

Le singole specie sono trasportate dalla fase mobile e

ritardate in funzione della forza delle interazioni
instaurate con la fase stazionaria.
zionelpartvgschdbmI
noricsdublavtfem:z

 assorbimento superficiale

 solubilità relativa
 carica
 dimensioni
22
 CLASSIFICAZIONE IN BASE AL
MECCANISMO DI SEPARAZIONE

 adsorbimento
 ripartizione
 esclusione
 scambio ionico
 affinità

toQues tipo id zionesfcal è li ù i p izato,ul am ha i

isuo limt in quanto no sempr ientrv un unico tipo
id oneitraz ed inoltre no mpres è arochi quale del
interazo che intervgo sia inateprdom .
23
 ADSORBIMENTO

olidaèsznrtfeL ;nulsaigrpefcd
grupianodetvfblmzsch
debsconarilv( eno,idrgaml tz
lodip - lodipe - lodipersvfznt
n)Lod re.conlspamdi

24
 Esempio di cromatografia di
assorbimento

Fase mobile

 riazonsetf erpola
(silica, allumina…)
 efasmobil minorec
itdelaàporfs
no,sa(erizt CH 2 Cl 2 …)

 separa bene composti

più polari

25
 RIPARTIZIONE
aL fase zionarts è un liqudo in cui le zenstao ad
respa is lubano,izs suporta ad un lidos inert
(gel id silce, farin ilefos o celuosa),
Si tasfru la citàap id nu lsout id idstrbu tra edu
fasi in ordac la suo coefint id artizonep come in
una zionestra liqudo - liqudo .

K = Cs/Cm

rzeFo persiv,d ipold -

ol,dip oldip - dipol
oindt : ute nogica un
ruol nel efindr la
lubitàso dell’ anlit
26
CROMATOGRAFIA DI ESCLUSIONE (GEL-FILTRAZIONE)

27
 CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICO
E’ impegat per la zionespar id nzestao ionche o
ionzabl . aL efas zionarst è uitasco ad un
polimer inert nteco sit ivta ionzat o
ionzabl , i cui contri sonp res imbatsc con
altri ion entiav cari delo oste segno . lI mecanios
id ionezspar è oatbs sula competizn erp i ist id
mbiosca rat gli ion entiprs nela fase bilemo e queli
presnti nel pionecam .

28
CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICO
R - SO 3
-H + + K +  R - SO 3
-K + + H +

R - HN 3
+ HO - +Cl -  R - NH 3
+ Cl - +OH -

29
 CROMATOGRAFIA DI AFFINITA’
Larficomtgnàdèpelsz
ledicomsntrpvabh

1 1
2

30