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Quantificazione delle proteine con il metodo di Bradford

e determinazione enzimatica del colesterolo totale in un campione di


siero umano

Metodo di Bradford
Il metodo di Bradford per la quantificazione delle proteine è un metodo veloce e accurato. La
tecnica è semplice, veloce e meno soggetta ad interferenze rispetto ad altri metodi. Si utilizza
Coomassie Blu che si lega formando complessi non covalenti tramite legami elettrostatici a residui
di aminoacidi basici (Arginina e Lisina) presenti nelle proteine (non si lega agli aminoacidi liberi).
Il legame del colorante Coomassie Brilliant Blue G-250 alle proteine determina uno
spostamento del massimo di assorbimento del colorante da 465 nm (rosso) a 595 nm (blu) in
soluzioni acide.

Caratteristiche del metodo:


Vantaggi: rapido
Svantaggi: il colorante si lega in maniera più forte ai residui di arginina quindi ci potrebbe essere
variabilità tra campioni proteici a composizione diversa, per cui è necessario utilizzare standard per
la calibrazione simili alla proteina da determinare. Solitamente si utilizza albumina di siero bovino
(BSA). Il metodo è distruttivo
Sensibilità alta: 2-20 g/mL

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Determinazione enzimatica del colesterolo totale
Il colesterolo è una molecola lipidica sterolica, tipica degli organismi animali. È presente in tutti i
tessuti e in maggior quantità nel cervello, nella bile e nel sangue. A causa della sua struttura ha
caratteristiche idrofobiche ed è quindi scarsamente idrosolubile. L'intestino lo assorbe grazie ai sali
biliari.
È presente sia in forma libera (35-40% del totale) sia esterificato con acidi grassi a catena lunga. La
sintesi del colesterolo si svolge soprattutto a livello epatico, anche se vi partecipano numerosi altri
organi (surrene, testicolo, aorta ecc.). Il colesterolo viene invece eliminato con la bile, trasformato
in acidi biliari e poi in sali biliari (dai calcoli biliari il colesterolo può essere ottenuto allo stato puro
cristallino).
I trigliceridi sono gli esteri della glicerina e di acidi grassi a catena lunga, che si trovano in natura e
sono utilizzati nella preparazione di oli alimentari, di acidi grassi e di monogliceridi (stearina,
oleina). Nell'uomo i trigliceridi costituiscono la maggior parte dei lipidi assunti con la dieta e
rappresentano la forma più concentrata di energia, con cui essa viene immagazzinata nel tessuto
adiposo per il successivo utilizzo.
I valori normali (rilevati con un semplice esame del sangue) vanno da 50 a 200 mg/dl.
Il colesterolo e i trigliceridi sono trasportati dal sangue sotto forma di lipoproteine.

La possibilità di determinare enzimaticamente il colesterolo permette di avere a disposizione test


semplici, veloci ed estremamente specifici.

Il test enzimatico utilizza il seguemnte cocktail enzimatico Colesterolo esterasi, Colesterolo


ossidasi, PAP, Perossidasi e prevede i seguenti passaggi:
1)Trasformazione del colesterolo esterificato ad opera della Colesterolo esterasi in colesterolo
2)Trasformazione del colesterolo (sia quello proveniente dalle 1 sia quello già presente non
esterificati) ad opera della Colesterolo ossidasi in colestenone con produzione di H2O2
3)Trasformazione ad opera della Perossidasi del substrato PAP in presenza di H2O2 prodotta in 2 in
chinoneimina con assordimento massimo a =500 nm

Colesterolo esterasi
1) Colesterolo esterificato Colesterolo + acidi grassi

Colesterolo ossidasi
2) Colesterolo + O2 Colestenone + H2O2

Perossidasi
Chinoneimina + H2O
3) H2O2 + fenolo + PAP

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Scopo dell’esperienza
Scopo dell’esperienza è quello di utilizzare i metodi sopra citati per la determinazione del contenuto
di albumina e del colesterolo in un campione di siero umano.
A)Qauntificazione delle proteine:
preparazione della curva di taratura con soluzioni di BSA
misura del campione incognito dopo opportuna diluizione
determinazione della concentrazione per interpolazione sulla curva di taratura
B)Quantificazione del colesterolo
Misura del campione incognito
Misura dello standard di colesterolo
Determinazione della concentrazione dal rapporto dei segnali

Parte sperimentale

A.
L’esperienza prevede di costruire una curva di taratura con il metodo di Bradford utilizzando
soluzioni standards di albumina di siero bovino (BSA). Le soluzioni standards sono preparate
nell’intervallo di quantità tra 1 e 10 g di proteina per una buona applicabilità del metodo.

1)Preparazione della curva di taratura


 Preparare e siglare tante eppendorf quanti sono i punti della curva di taratura (7 punti:
bianco; S1-S10)
 Per ognuna mettere le quantità di acqua riportate in tabella e successivamente i l della
soluzione madre di BSA (0.1 mg/mL). Ad ogni eppendorf aggiungere 200 L di reagente di
Bradford. Chiudere bene e vortexare. Man mano che si passa dalla prima all’ultima
eppendorf si dovrebbe vedere una variazione di colore (dal marrone al blu).
 Aspettare almeno 10 min e trasferire 200 L di soluzione nelle piastre microtiter ed eseguire
la lettura spettrofotometrica a  620 nm.

BSA (L) H2O (L) Bradford (L) Total g BSA


0 (Bianco) 800 200 0.0 (bianco)
10 790 200 1.0 (S1)
20 780 200 2.0 (S2)
40 760 200 4.0 (S4)
60 740 200 6.0 (S6)
80 720 200 8.0 (S8)
100 700 200 10.0 (S10)

2)Preparazione del campione incognito


 Determinare il fattore di diluizione del campione sapendo che dovranno essere prelevati 10
L del campione + 790 H2O + 200 Bradford e che la quantità nei 10 L dovrà cadere
nell’intervallo usato per costruire la curva di calibrazione, e sapendo che il campione di
siero ha una quantità di albumina che rientra nell’i9ntervallo tra 2 e 10%
 Preparare la diluizione ..........

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 Prelevare 10 L del campione diluito e metterli in una eppendorf, aggiungere 790 L di
acqua e 200 di Bradford e vortexare.
 Aspettare almeno 10 min e trasferire 200 L di soluzione nelle piastre microtiter ed eseguire
la lettura spettrofotometrica a  620 nm.

3)Elaborazione dati
La retta di taratura va preparata con i campioni bianco e S1-S10:
-ad ogni valore di asorbanza sottrarre il valore del bainco
-calcolare la media delle assorbanze per ogni punto della curva
-con i valori medi risalire all’equazione della retta mettendo sull’asse X i g di BSA e sull’asse
Y la media delle OD. Con il coefficiente di correlazione valutiamo se i punti “fittano” bene con
l’equazione della retta. Tanto più R2 è prossimo a 1 tanto meglio i punti “fittano” con
l’equazione della retta.

La retta che troviamo è y= ax +b

BSA (g) OD1 OD2 ODmedia


0 (Bianco) Sottrarre bianco
1
2
4
6
8
10

Determinazione della concentrazione incognita:


-Sottrarre il valore del bianco al valore di assorbanza dei campione e calcolare la media.
-Interpolare tale valore sulla retta di calibrazione e determinare la concentrazione incognita

B.
L’esperienza prevede la determinazione enzimatica utilizzando il kit della concentrazione di
colesterolo nel siero.

1)Preparazione dello standard e del campione


-Si mettono 200 L della miscela enzimatica in una eppendorf e si ggiungono 2 L della soluzione
standard di colesterolo (200 mg/100 mL)
- Si mettono 200 L della miscela enzimatica in una eppendorf e si ggiungono 2 L del siero
-Si agitano le due eppendorf e si lasciano a temperatura ambiente per almeno 10 minuti poi si
trasferiscono i 200 L in una piastra e si esegue la lettura a 450 nm.
2)Elaborazione dati
Calcolare la concentrazione incognita dalla relazione: