Determinazione delle proteine totali con il metodo del BIURETO

Il BIURETO è un ammide dell’acido allifanico e si ottiene per condensazione, a 180°C, di due

molecole di urea con l’eliminazione di una molecola di NH3 .

NH2 NH2 NH2

180°C
C=O + C=O C = O + NH3

NH2 NH2 NH

C=O

NH2
urea biureto

Se il BIURETO è addizionato con ioni Cu++ in soluzione alcalina si forma un complesso di colore
violetto (reazione del biureto).
È stato osservato che questa reazione non è specifica del biureto, ma che gli ioni Cu ++, in ambiente
basico, reagiscono con qualsiasi composto contenente almeno 2 gruppi CONH 2 , CH2NH2 o CSNH2
.
Poiché la reazione richiede la presenza di due gruppi CONH 2 essa è negativa con gli amminoacidi e
con i dipeptidi mentre è positiva con i polipeptidi a partire dai tripeptidi e naturalmente con le
proteine.
Nel 1942 Kingsley propose un reattivo unico nel quale il Cu è presente in bassa concentrazione in
soluzione alcalina; in queste condizioni, però, il reattivo è instabile perché precipitano i sali di rame
come Cu(OH)2.
Per stabilizzare i sali di Cu, Weichselbaum (1950) propose un reattivo contenente tartrato di sodio e
potassio (sale di Seignette) e KI per impedirne l’autoriduzione.
L’intensità del colore sviluppato dalla reazione è proporzionale al n° di legami peptidici interessati
nella reazione.

Nel nostro caso l’intensità del colore prodotto dalla reazione, è proporzionale alla concentrazione
delle proteine, è quindi possibile effettuare una valutazione colorimetrica alla lunghezza d’onda di
540nm.

REATTIVO

NaOH (0,2 M) in acqua distillata senza CO2. In un pallone da litro sciogliere 45g di sale di
Seignette (tartrato di sodio e potassio)in 200cc di NaOH + 15g di CuSO 4. Quando si è sciolto
aggiungere 5g di KI e portare a volume con NaOH.
Il reattivo è stabile per 2-3 mesi a temperatura ambiente .

Per l’uso diluire il reattivo concentrato 1:3 con acqua distillata.

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PROCEDIMENTO

Preparare una soluzione contente 4g/100cc di albumina con la quale effettuare la retta di taratura.
Preparare 6 provette contenenti ciascuna 5mL di reattivo, quindi aggiungere ad ognuna:

 100L di standard (prelevare con l’apposita pipetta) 4mg

 50L “ “ 2mg
 20L “ “ 0,8mg
 10L “ “ 0,4mg
 100L di siero campione
n.b. la sesta provetta costituisce il bianco.

Agitare le provette e metterle al buio per mezzora quindi effettuare le letture a540nm azzerando con
il bianco.
Costruire la retta di taratura e determinare la concentrazione di proteine presenti nel campione di
siero; per fare ciò riportare i dati raccolti in un foglio di lavoro Excel e determinare l’equazione
della retta.

Esempio:
y = 0,0249 x + 0,0002

dove y = assorbanza
x = concentrazione di proteine

Informazioni su salute/ sicurezza/ ambiente

Consultare preventivamente le schede di sicurezza per le informazioni riguardanti
tossicità/pericolosità ed i DPI da utilizzare per la manipolazione delle sostanze previste in questo
metodo.
Per i prodotti di scarto derivanti dall’utilizzo di questo metodo attenersi alle specifiche procedure di
laboratorio.

Reagente Symboli Frasi di rischio

Sale di Seignette (tartrato di
Sostanza non pericolosa secondo la Direttiva 67/548/CEE.
sodio e potassio)
KI Sostanza non pericolosa secondo la Direttiva 67/548/CEE.

NaOH C R: 35

Albumina bovina T R:23/24/25-33-52/53

CuSO4 Xn R: 22-36/38