Il dosaggio quantitativo delle proteine viene applicato:

• Per conoscere quante proteine sono presenti in un determinato

preparato biologico, prima di procedere verso ulteriori analisi
relative ad una o più proteine; esempi:

• Per calcolare l’attività specifica durante i saggi funzionali (es. per

vel. enzimatica);

• Per calcolare la densità specifica di un recettore nei saggi di legame

(binding) dei recettori proteici;

• Come indice di purezza/resa della proteina studiata durante le fasi

progressive di purificazione;

• Prima di una separazione cromatografica o elettroforetica (SDS-

PAGE, Western blot, proteomica).
 Dosaggio della concentrazione
di proteine totali in un campione biologico

Metodi chimici:
- Metodo Kjeldahl (N totale)

Metodi spettrofotometrici:
- Metodo in assorbanza UV a 280 nm (AA aromatici)
- Metodi colorimetrici:
- Metodo del Biureto;
- Metodo di Lowry;
- Metodo BCA (Acido Bicinconinico);
- Metodo di Bradford;

Metodi turbidimetrici:
- Precipitazione in acidi TFA o TCA e analisi turbidimetrica
del precipitato.
Metodo di Kjeldahl
Determinazione dell’N proteico trasformato in g proteine mediante un fattore di conversione. Per
incrementarne l’accuratezza: precipitazione delle proteine con TCA, TFA o PCA, lavaggio per
centrifugazione e precipitato usato per l’analisi successiva:

1. Digestione: il campione con le proteine viene portato ad alta temperatura in presenza di H 2SO4
concentrato + catalizzatore (ex. Cu2SO4) + ossidanti (ex. permanganato o H 2O2); tutto l’N organico si
trasforma in NH4+, ossidazione di C e S a CO2 e SO2;

2. Distillazione: (NH4)2SO4 formato + 2NaOH = 2NH3 (raccolta x distillazione) + Na2SO4 + 2 H2O;

3. Titolazione: NH3 raccolta e titolata per aggiunta di acido forte (ex. HCl) a titolo noto.
Calcolo del contenuto di azoto o di proteine in un
campione

1 mol HCl = 1 mol NH3= 14 g N

Quantità di N nel campione in g:

ml HCl x M HCl x 14/1000

Quantità di proteine nel campione in

g: ml HCl x M HCl x 14/1000 x 100/16

se si considera che il contenuto medio di N proteico è

16%.
 Determinazione della
concentrazione della sostanza in
esame

Metodo Metodo
diretto indiretto
Metodo diretto

Legge dell’assorbimento
(legge di Lambert-Beer)

… in una cella, contenente una sostanza in

soluzione, attraversata da un raggio di luce
monocromatica…

A= ε x l x M
Metodo in Assorbanza UV a 280 nm

Gli aminoacidi aromatici fenilalanina, tirosina e

triptofano presentano assorbimenti intorno ai 280 nm
attribuibili ai cromofori degli anelli aromatici.

Rapido, non distruttivo, variabile, 20-3000 µg/ml

 Le basi puriniche, adenina e guanina e quelle
pirimidiniche, citosina e timina, hanno spettri simili con
un picco a circa 260 nm.
Metodo di Metodo del
Bradford Biureto

Determinazione della
concentrazione della sostanza in
esame

Metodo di Metodo
Lowry BCA
 Metodo di Bradford

Colorante utilizzato: Comassie Brillant blue

Sensibile, poche
interferenze
(tensioattivi)
Il legame del colorante Coomassie Brilliant Blue G250 alle
proteine determina uno spostamento del massimo di
assorbimento del colorante da 465 nm (rosso) a 595 nm (blu)
in soluzioni acide (Bradford, 1976)
 Determinazione della concentrazione
(Retta di taratura)
• Preparare una soluzione proteica a concentrazione nota.

Le proteine più
usate nel metodo di Bradford
sono:
- BSA (albumina di siero bovino)
- gamma-globuline
Metodo del Bradford: retta di calibrazione –  analitica: 595 nm
 Metodo del Biureto

Colorante utilizzato: Reattivo del Biureto, una

soluzione di solfato di rame alcalino contenente
tartrato di sodio e potassio.

R N N O

Cu 2+
CU+2

O N N R
• In condizioni alcaline gli ioni Cu2+ formano un
complesso di coordinazione con quattro gruppi -
NH presenti in altrettanti legami peptidici.

• Il complesso che si forma assorbe luce nel

visibile, con un picco a 550 nm.

• Molto selettivo, poco sensibile (campioni ad alta

concentrazione: proteine sieriche e del latte).
 1951
Metodo di Lowry

Colorante utilizzato: Reattivo di Folin-Ciocalteau,

una miscela di sali di sodio degli acidi tungstico, molibdico e fosforico
che reagisce con i gruppi fenolici delle tirosine.

• Il complesso che si forma in presenza di Cu2+

assorbe luce nel visibile, con un picco a 750 nm

• Molto sensibile: è possibile determinare

concentrazioni fino a 10 µg/ml

• Subisce molte interferenze

 Metodo BCA
acido bicinconinico

Reattivo utilizzato:
Riduzione del Cu2+ a Cu1+ in soluzione alcalina da parte
delle proteine
• Due molecole di BCA chelano uno ione Cu1+

• Tale evento determina la formazione di un

intenso colore violetto con un massimo di
assorbimento a 562 nm