Vescicole endolisosomiali

Le vescicole endolisosomiali occupano una porzione ridotta del volume cellulare (circa il 3%). I lisosomi
contengono delle idrolasi acide, chiamate catepsine, che sono in grado di degradare diversi tipi di
macromolecole. Il pH lisosomiale si aggira intorno a 5 per effetto di una V-ATPasi (vacuolare) che pompa H+
contro gradiente. I lisosomi così come gli endosomi sono in grado di rilasciare Ca2+, e la capacità di
accumulare Ca2+ al loro interno dipende proprio dal gradiente protonico.
Oltre ai canali a 2 pori, le vescicole lisosomiali contengono i canali TRPML (tutte e 3 le isoforme). A seconda
del tipo cellulare, inoltre, possono essere presenti anche altri canali permeabili al Ca2+.

Canali TRPML
TRML1 è stato scoperto studiando una malattia neurodegenerativa, la mucolipidosi di tipo 4, appartenente
alle cosiddette “malattie di accumulo lisosomiale”. Queste malattie sono caratterizzate da un
malfunzionamento dei lisosomi, che non sono più in grado di smaltire il materiale e ciò comporta
l’accumulo di mucopolisaccaridi, sfingolipidi, lipofucsina e fosfolipidi.
TRML1 presenta una relazione corrente voltaggio a rettificazione entrante (flusso di
ioni verso il citoplasma). Essendo permeabile al Na+, al Ca2+, allo Zn2+ ma anche al
Fe2+, ha un potenziale d’inversione estremamente positivo.
N.B. Non è permeabile ai H+.
TRPML1 è attivato da un fosfolipide, il fosfatidilinositolo 3,5 – difosfato, localizzato
esclusivamente sulla membrana delle vescicole endolisosomiali.
Il ruolo principale di TRPML1 è quello di generare segnali di Ca2+ (confinati alla zona peri lisosomiale) che
guidano la fusione delle vescicole.
Quando mediante endocitosi viene internalizzato del materiale, le vescicole contenenti il materiale si
fondono con gli endosomi precoci. Da questi, per un successivo processo di maturazione e di acidificazione
del lume, si originano gli endosomi tardivi che si fondono con i lisosomi, in modo tale che le catpesine
possono degradare il materiale che è stato internalizzato.

I lisosomi sono molto importanti anche nel processo di

autofagia, che consiste nel digerire porzioni di organelli
danneggiati in condizioni di carenza di nutrienti esterni,
così che la cellula possa ricavare energia da essi.
L’autofagosoma, che deriva proprio dalla porzione di
organello che deve essere smaltita, si fonde con il lisosoma.
La membrana lisosomiale contiene un gran numero di
proteine coinvolte nel processo di fusione delle membrane:
la sinaptotagmina 7 e la CaM (negli endosomi tardivi) ne
sono un esempio. Queste proteine sono Ca2+ dipendenti,
ed il Ca2+ è fornito proprio da TRPML1.

TRPML1 controlla il processo di autofagia, non solo mediando la fusione del lisosoma con l’autofagosoma,
ma stimolando anche la traslocazione nucleare del fattore di trascrizione TFEB, fondamentale per
l’attivazione del processo autofagico (stimola la biogenesi di nuovi lisosomi e l’espressione di idrolasi acide).
In una cellula che ha a disposizione tutti i nutrienti, l’autofagia è inibita dalla proteina mTORC1. Questa
chinasi ha come bersaglio: ULK1, una proteina fondamentale nella formazione dell’autofagosoma, ma
anche TFEB, che fosforilato da mTORC1 non può traslocare nel nucleo.
In una cellula starvata (in carenza di nutrienti) la [ATP] si riduce drasticamente poiché la fosforilazione
ossidativa è rallentata per la mancanza di substrato (glucosio). In compenso, aumenta la [AMP] che attiva la
chinasi AMPK, la quale ha come bersaglio mTORC1. La proteina mTORC1 fosforilata è inibita e quindi non è
più in grado di fosforilare ULK1 e TFEB.
Allo stesso modo la starvation (esposizione di una cellula ad una soluzione cellulare priva di nutrienti) causa
l’attivazione di TRPML1. TRMPL1 genera un segnale di Ca2+ locale (nel citoplasma) e attiva la calcineurina, la
quale defosforila TFEB che può quindi traslocare nel nucleo.
N.B. TRPML1 è attivato dall’enzima PIKfyve, che catalizza la fosforilazione del fosfatidilinositolo 3 – fosfato
in fosfatidilinositolo 3,5 – difosfato. Inoltre, PIKfyve è l’enzima che genera l’agonista endogeno PIP2, in
grado di attivare TRPML1.

Canali TPC
I canali a 2 pori giocano un ruolo fondamentale nell’attivazione dei virus (Ebola, MERS-CoV e SARS-CoV)
una volta che sono stati endocitati.
MERS e SARS sono dei coronavirus: hanno un envolope
con numerose copie della proteina SPIKE mediante la
quale legano uno specifico recettore presente sulla
membrana della cellula ospite. Il recettore di MERS è una
proteina chiamata dipeptidil-peptidasi IV, mentre il
recettore di SARS è ACE2. Quando la proteina SPIKE lega il
recettore specifico il virus viene introdotto nel sistema
delle vescicole endolisosomiali. Una volta che gli
endosomi tardivi si fondono con i lisosomi le catepsine
lisosomiali, ed in particolare le catepsine L, tagliano la
SPIKE protein causando la liberazione del genoma virale
nel citoplasma. Bloccando la fusione degli endosomi
tardivi con i lisosomi questo processo può essere
ostacolato.
Nel caso di Ebola, il virus penetra nella cellula ospite per
macropinocitosi. Quando gli endosomi tardivi contenenti
il virus si fondono con i lisosomi, le glicoproteine che
decorano il pericapside sono tagliate dalle catepsine L e B.
Una volta tagliate, le glicoproteine possono legare un
trasportatore per il colesterolo, NPC1, presente nella
membrana lisosomiale in modo tale da consentire la
fusione tra la membrana lisosomiale e la membrana di
Ebola. A questo punto il genoma virale viene liberato nel
citoplasma della cellula ospite.

N.B. Qualche anno fa uno studio ha dimostrato come l’infezione delle cellule ospiti da parte di uno
pseudovirione di Ebola veniva inibita in seguito al silenziamento genico di TPC1 e TPC2.
Mediante altri esperimenti di elettrofisiologia è stato dimostrato, inoltre, che la corrente mediata da TPC2
veniva bloccata da un farmaco tradizionale della medicina cinese, la tetrandrina. Tuttavia, questo farmaco
non è selettivo in quanto blocca numerosi altri canali ionici, al contrario di NED19 che è un bloccante
specifico dei TPC.
I TPC sono inibiti anche da un bloccante dei canali al Ca2+ di tipo L, il verapamil. Questo farmaco, che
normalmente è impiegato nella terapia antipertensiva, è in grado di bloccare l’infezione da Ebola.

La SPIKE è una proteina che si assembla come trimero, ma in realtà presenta:

- 2 subunità, S1 e S2;
- 2 siti di taglio anche se il più importante è quello presente sulla
subunità S2, perché è quello che deve essere attaccato dalle catepsine
lisosomiali per liberare il peptide di fusione del virus con la membrana
lisosomiale.
Il recettore ACE2 localizzato sulla membrana plasmatica della cellula ospite può essere isolato oppure può
trovarsi in prossimità di una serin-proteasi transmembrana di tipo II.
Quando la SPIKE protein di SARS-CoV lega con la subunità S1 il recettore ACE2, espone il sito di taglio in S2.
Se il recettore ACE2 è “accoppiato” alla serin-proteasi è questa ad effettuare il taglio proteolitico in S2. In
conseguenza di ciò viene rilasciato il peptide che consente la fusione della membrana virale con la
membrana plasmatica della cellula ospite, per cui l’RNA virale viene liberato nel citoplasma.
Se ACE2, invece, non è fiancheggiato dalla serin-proteasi il virus va incontro ad un processo di endocitosi
fino quando l’endosoma tardivo non si fonde con i lisosomi. Nei lisosomi, dove il pH è acido, sono le
catepsine L ad effettuare il taglio proteolitico in S2 e a consentire la fusione delle membrane e la
liberazione dell’RNA virale.
A tal proposito la clorochina e l’idrossiclorochina essendo delle basi: da un lato alcalinizzano il lume dei
lisosomi e prevengono l’attività proteolitica delle catepsine, che operano a pH acido; dall’altro dissipano il
gradiente protonico, indispensabile per l’accumulo di Ca2+, e quindi svuotano le riserve di Ca2+ dei lisosomi
impedendo la fusione degli endosomi tardivi con i lisosomi (processo Ca2+ dipendente).

Un altro esperimento ha dimostrato che alcalinizzando i lisosomi con il NH4Cl e la bafilomicina A

(antibiotico, inibitore della V-ATPasi) l’infezione della cellula ospite da parte di SARS-CoV e SARS-CoV2
veniva clamorosamente inibita. Sempre in questo studio è stato testato un altro farmaco, apilimod, che ha
come bersaglio PIKfyve. Bloccando questo enzima, e quindi la sintesi di PI(3,5)P2, si è visto ancora una volta
come il tasso di infezione della cellula ospite da parte di SARS e MERS diminuiva in maniera significativa.
L’anno scorso inoltre è stato dimostrato come l’inibizione genica dei TPC è effettivamente in grado di
ridurre l’infezione virale della cellula ospite, per cui è ormai comprovato il ruolo centrale dei TPC nel
meccanismo di attivazione virale.