Basi biologiche: biologia cellulare Professore: Federico Gulluni

Lezione n° 19 Sbobinatori: Emanuele Santospirito

22/11/2022 Simona Santoro

LA COMUNICAZIONE CELLULARE

Nella lezione precedente abbiamo descritto la parte relativa alla segnalazione intracellulare
mediata dai recettori a sette passaggi e avevamo anche visto che tra i secondi messaggeri
prodotti in risposta all’attivazione di questi recettori, vi era l’AMP ciclico. Esso agiva
attivando la PKA, la quale a sua volta fosforilava le proteine target, trasducendo il segnale
all’interno della cellula.

La via del Ca2+

Oltre alla via dell’Amp ciclico esiste un’altra via analoga, che è quella mediata dal calcio. Il
calcio presenta concentrazioni bassissime a livello citosolico, il motivo è proprio perché deve
essere rilasciato in grandi quantità, come risposta all’attivazione di determinate vie di
segnalazione; quindi avremo degli eventi per il rilascio del calcio, che agirà sul secondo
messaggero citosolico attivando qualcosa e trasducendo il segnale che ne aveva determinato
il rilascio.
−7
Il calcio, a livello citosolico, non supera mai i 10 Molare di concentrazione perché abbiamo
dei trasportatori, come ad esempio l’antiporto sodio/calcio, che è in grado di portare fuori il
calcio e portare dentro il sodio. Quindi rimuove il calcio dal citosol.
Analogamente abbiamo delle pompe ATPasiche che usano l’energia dei fosfati per portare
contro gradiente il calcio dal citosol verso l’esterno della cellula. In maniera del tutto analoga
queste pompe, che troviamo sulla membrana plasmatica, sono presenti anche sul reticolo
endoplasmatico: in questo caso vanno ad accumulare calcio nel lume del reticolo
endoplasmatico.
In particolar modo viene accumulato calcio all’interno del reticolo sarcoplasmatico, una
sorta di reticolo endoplasmatico “modificato”, tipico delle cellule muscolari.
Oltre all’accumulo all’interno del reticolo, in alcuni casi possiamo avere delle proteine capaci
di immagazzinare calcio all’interno dei mitocondri. Anche in questo caso si andrà a togliere
del calcio a livello citosolico e lo accumuleremo all’interno o di comparti intracellulari o
all’esterno della cellula.

Due vie di segnalazione attraverso cui il Ca2+ entra nel citosol in risposta ad
un segnale extracellulare
Infine ci sono delle proteine che sono in grado di legarsi al calcio libero, sequestrandolo e
impedendo che questo vada ad attivare qualcosa a livello di segnalazione cellulare.
Come viene liberato il calcio?

A) Prima via di segnalazione nel caso della contrazione muscolare, che prevede
l’arrivo di un impulso nervoso che va a depolarizzare la membrana plasmatica
aprendo i canali voltaggio dipendenti; l’apertura di questi canali voltaggio dipendenti,
fa entrare il calcio secondo gradiente di concentrazione. Dunque mentre prima era
abbondante all’esterno della cellula, adesso entrerà all’interno mediando la sua
segnalazione cellulare.

B) La seconda via di segnalazione è rappresentata da questi recettori (nell’immagine

in verde) che sono organizzati sulla membrana del reticolo endoplasmatico; questi
sono canali che si apriranno con l’arrivo del loro ligando specifico rilasciando il calcio
immagazzinato dal reticolo endoplasmatico a livello del citosol.

In entrambi i casi porteremo ad un rilascio di calcio o dal reticolo o dall’esterno della cellula.

I fosfatidilinositoli
Come avviene l’apertura di questi canali a livello del reticolo endoplasmatico?
Si legano dei ligandi di origine lipidica, i fosfatidilinositoli, che si trovano nel doppio strato
della membrana, in particolare sul versante citosolico. Sono dei lipidi particolari con il
carbonio che può essere fosforilato nelle posizioni 3-4-5.
Normalmente lo troviamo sotto forma di fosfatidilinositolo senza fosforilazioni. Arriverà una
fosfoinositide 4 chinasi, questa prenderà un fosfato dall'ATP e attraccherà un fosfato in
posizione quattro generando il “fosfatidilinositolo 4 fosfato”.
Analogamente nello step successivo un’altra chinasi prenderà un altro fosfato dall’ ATP e lo
attaccherà in posizione 5 creando il “fosfatidilinositolo 4-5 difosfato”.

Perché è importante questo? perché viene tagliato da una lipasi (proteina in grado di tagliare
i lipidi), la Fosfolipasi c, che
separa il diacilglicerolo, che
rimane attaccato al versante
citoplasmatico della membrana,
dall’inositolo. L’inositolo libero
sarà fosforilato in posizione
1-4-5.
Avremo dunque due molecole
segnale: il diacilglicerolo e
l’inositolo 1,4,5-trifosfato
chiamato anche IP3.
Il diacilglicerolo chiaramente
rimane legato alla membrana
plasmatica per la sua coda
lipidica e attiverà una proteina
chinasi c, chiamata così perché sensibile al calcio. Mentre l’IP3 si muoverà a livello citosolico
e raggiungerà proprio quei canali presenti sul reticolo endoplasmatico.
Via di segnalazione per il rilascio di calcio dal lume del RE

Abbiamo il recettore a 7 passaggi accoppiato alla proteina G, arriva la molecola segnale (in
rosso), attiva la proteina G alfa che si lega al GTP, che si dissocia dalla subunità beta-gamma ,
questa va ad attivare la fosfolipasi C (che taglia il fosfatidilinositolo 4-5 difosfato) generando:
il diacilglicerolo (in rosso) e l’IP che si muove a livello citosolico e va a raggiungere il
recettore del canale del calcio. L’IP3 si lega a questo canale del calcio e ne determina
l’apertura.
Il calcio esce dal lume del reticolo endoplasmatico e si lega a questa proteina chinasi C. Una
volta che è arrivato il calcio, sulla membrana plasmatica, la chinasi si lega e si lega anche al
diacilglicerolo; dunque entrambi questi secondi messaggeri servono ad attivare la chinasi
che andrà ad attivare una catena di altre proteine coinvolte nella funzione del segnale.

La calmodulina
Il calcio serve anche ad attivare una serie di altre proteine tra cui la
calmodulina, una delle proteine più abbondanti nelle cellule eucariotiche,
che ha una struttura particolare a manubrio con 4 siti di legame per il
calcio.
Nella zona amminoterminale si legheranno 2 ioni calcio ed è esattamente speculare alla
zona carbossiterminale, la quale anch’essa legherà 2 ioni calcio.

In seguito al legame con il calcio, questa proteina subisce un cambio conformazionale e si

avvolge attorno ad altre proteine presenti nel citosol. Non c’è un’attività chinasica, non
fosforilla nulla, semplicemente si avvolge attorno a delle proteine e ne modifica il
comportamento.

Ad esempio riesce, durante la contrazione

muscolare, a legarsi alla miosina e attivarla
facilitando la sua funzione.
In maniera analoga è in grado di legarsi alle
CaM chinasi, la quale è responsabile del
riporto del calcio nel reticolo endoplasmatico
o fuori dalla cellula. Questo avviene in modo
tale da spegnere il segnale una volta
raggiunto.

Processo a cascata

Ovviamente i segnali vengono poi amplificati dal fatto di

avere così tanti secondi messaggeri, i quali attiveranno
centinaia di proteine all’interno della cellula; si creerà una
cascata di attivazione che modificherà il segnale
originario.

Esempio: pensiamo ad una radiazione luminosa che

colpisce il recettore della rodopsina, presente sui
bastoncelli della retina, una sola interazione
recettore-ligando sarà in grado di attivare almeno 500
proteine G, queste andranno ad attivare altri 500 enzimi, i
5
quali produrranno 10 secondi messaggeri (come il GMP ciclico), questi chiuderanno 250
7
canali ionici e di fatto bloccheranno l’afflusso di 10 ioni sodio. Tutto questo porterà il
potenziale di membrana ad aumentare di 1 mV e trasdurre questo segnale all’encefalo.
Meccanismi di inattivazione del segnale

Esistono dei meccanismi di controbilanciamento, a ciascuno di questi passaggi dovrà

corrispondere un modo per bloccare e arrestare il processo.
Uno dei modi, con cui la cellula va a bloccare la segnalazione, è quello di utilizzare delle
chinasi del recettore, chiamate GRK, queste sono capaci di usare l’ATP e di formare delle
fosforilazioni sul versante citosolico del recettore a 7 passaggi che media l’attivazione della
proteina G. Queste tre fosforilazioni bloccano di fatto l’attivazione della proteina G
corrispondente al recettore.
In più vengono riconosciute una serie di proteine, chiamate arrestine, che si legano alla
tasca interna fosforilata e bloccano la capacità di quel recettore di attivare la proteina G
corrispondente.
In questo modo il segnale viene arrestato e soprattutto l’arrestina è in grado di indurre
endocitosi del recettore, quindi rende ancor di più stabile la segnalazione cellulare.

Recettori con attività enzimatica

L’ultima categoria è quella dei recettori con capacità enzimatica intrinseca, cioè il recettore è
in grado di auto-fosforilarsi in seguito al legame con il ligando.

In particolar modo in foto è possibile osservare la struttura

tridimensionale, data da un esperimento di cristallografia
degli anni ‘90. La molecola in rosso è l’ormone della
crescita. In questo lavoro si è scoperto per la prima volta
che esistevano dei recettori monomerici (quello in azzurro e quello in verde) che erano in
grado di riconoscere porzioni diverse dello stesso ligando.
Dunque uno stesso ligando determinava l’avvicinamento di due recettori dipendenti che
venivano portati vicini e associati a regioni differenti del ligando.
Ha spiegato per la prima volta come facessero questi recettori “tirosin-chinasici” ad
auto-attivarsi in seguito all’interazione con il ligando. Da qui sono derivate tutte le
classificazioni delle sottofamiglie tirosin-chinasi. Hanno tutti in comune:
-la posizione, si presentano nel versante citosolico;
-il dominio, che può essere fosforilato sulle tirosine.
-legano un ligando in ambiente esterno con la posizione N-terminale, dimerizzano con un
altro ricettore e così facendo attivano il recettore.

La maggior parte sono riguardanti il fattore della crescita.

Nella tabella sono elencate tutte le varie molecole che attivano tutti i recettori
tirosin-chinasici.

Come funziona questo processo? Abbiamo la proteina segnale in ambiente esterno, avrà due
regioni affini a ciascun recettore che dovrà dimerizzare. Arriva la proteina segnale, si lega ad
entrambi e li avvicina; avvicinandosi i recettori avvicinano i loro domini tirosin-chinasici, i
quali sono in grado di trans-fosforilasi (ovvero ciascuno fosforila l’altro) e si attivano.
I fosfati che si legano al dominio interno del recettore serviranno a reclutare una serie di
proteine che presenteranno un dominio specifico in grado di riconoscere queste tirosine
fosforilate. Queste proteine, che si sono avvicinate, potranno comodamente attivarsi l’una
con l’altra e mediare la cascata di segnalazione a valle.
Effetto dominante negativo
Può capitare che ci siano alcune mutazioni che bloccano il dominio di fosforilazione.
Potremo avere dunque una versione normale e una con la mutazione sul dominio
tirosin-chinasico. Quando arriverà la molecola segnale, questa sarà ancora in grado di legarsi
al recettore, ma questo non sarà in grado di auto-fosforilarsi, e quindi non si avrà la
trasduzione del segnale. Questa specifica condizione, ovvero la presenza del recettore
mutato, prende il nome di effetto dominante negativo ( dominante perché il ligando si lega
ancora e fa avvicinare i due recettori, ma negativo perché non si ha una trasduzione del
segnale in funzione dell’arrivo della molecola segnale).

Come avviene il reclutamento delle proteine sulle tirosine fosforilate? Avviene perché
queste proteine presentano un dominio SH2, che sta per Src (si legge “sarc”) Homology 2
domain; conosciuto così perché è stato trovato per la prima volta sulla proteina Src.
In realtà è presente su un grande numero di proteine che agiscono a valle dei recettori
tirosin-chinasici. Avremo la molecola segnale che arriva e fa avvicinare i due recettori;
abbiamo la trans-fosforilazione, l’esposizione delle tirosine fosforilate e le proteine che con il
dominio SH2 si legano a fosfati differenti.
I domini SH2 possono inserirsi in qualsiasi posizione perché sono a sé stanti e non
deformano la struttura. Possono trovarsi vicini sulla stessa proteina, sulla zona N-terminale o
su quella C-terminale.

In base a cosa la proteina sceglie una tirosina al posto di un’altra? Il dominio SH2 oltre a
riconoscere la tirosina fosforilata riconosce la sequenza di amminoacidi.
La fosfolipasi C

La fosfolipasi C gamma avrà un dominio SH2 che si associerà alla tirosina fosforilata,
dopodiché attraverso una molecola di ATP si potrà attivare e potrà andare a tagliare il
fosfatidilinositolo in: diacilglicerolo e IP3.

Proteine con funzioni analoghe possono attivarsi a valle sia da recettori protein-chinasici sia
a valle di recettori accoppiati a proteine G.
Avremo dunque in questo esempio una fosfolipasi C di tipo beta accoppiato a valle con una
proteina G e una fosfolipasi C di tipo gamma che sarà attivata da un recettore
protein-chinasico.
L’effetto è lo stesso, però in questo modo la cellula sarà in grado di utilizzare uno stesso
meccanismo per generare un secondo messaggero (in questo caso il calcio) a valle di
segnalazioni cellulari differenti.
La via delle proteine chinasi attivate dal mitogeno (MAPK)
Adesso andiamo a vedere alcune delle vie attivate a valle dei recettori tirosin chinasici. La
prima è la via delle MAP chinasi (MAPK) che sono delle proteine chinasi attivate da stimoli
mitogenici, cioè da molecole extracellulari, come fattori di crescita, che inducono
sopravvivenza, proliferazione e crescita della cellula. La molecola principale che trasduce a
valle dei recettori tirosin chinasici una segnalazione mitogenica, è la proteina Ras.
La proteina Ras è una GTPasi, quindi avremo la Ras inattiva GDP e la Ras attiva GTP.

Esistono diverse tipologie di Ras:

H-Ras, K-Ras, N-Ras. Tutte quante agiscono a valle dei recettori tirosin chinasici e mediano
un segnale di tipo mitogenico, quindi di proliferazione. In particolare modo in questa
famiglia delle Ras, perchè sono tutte proteine strutturalmente correlate tra di loro, Ras e
Rho (quest’ultima l’abbiamo vista durante il citoscheletro in grado di modellare la struttura
di actina) sono le uniche due che funzionano essendo legate alla membrana plasmatica.
Avranno una coda lipidica inserita nella membrana plasmatica e quindi agiscono sulla
membrana. Le altre GTPasi, come le ARF e le Rab, che abbiamo visto nel grafico vescicolare,
agiscono su vescicole e strutture ormonali interne alla cellula. Quindi solamente Ras e Rho
trasmettono segnali a recettori tirosin chinasici presenti sulla superficie cellulare. Le altre
della famiglia Ras, come ARF, Rab,etc… funzionano sulle vescicole interne.
Gli RTK attivano la small GTPasi Ras
Nell’immagine seguente è raffigurata la via di Ras, cioè la via iniziale dell’attivazione della
proteina Ras.

Abbiamo il nostro solito recettore tirosin chinasico (RTK) attivato dalla molecola segnale, che
sarà tipicamente un fattore di crescita. Abbiamo le nostre fosforilazioni sulla tirosina e
reclutiamo una proteina adattatrice chiamata Grb2, che riconosce con un dominio SH2 una
fosforilazione della tirosina. La proteina adattatrice a sua volta recluta una GEF di Ras, cioè
una proteina che fa rilasciare a Ras il GDP e legare il GTP. Ras lo troviamo ancorato con la
regione rosa sulla membrana plasmatica. Quindi la Ras-GEF fa staccare il GDP e attaccare il
GTP. A questo punto Ras sarà attiva, sempre legata alla membrana plasmatica e trasdurrà
avanti il segnale.
La Ras-GEF si chiama Sos (che sta per “son of sevenless”. Scoperta in Drosophila dove agiva a
valle di un recettore chiamato sevenless. Per questo venne chiamata son of sevenless, fino a
quando hanno scoperto la stessa proteina nell’uomo e nei vertebrati, ma è comunque
rimasta con lo stesso nome).
Quindi quello che
succede è che avremo
questa proteina
adattatrice Grb2 che
recluta il complesso
Sos a valle di un
recettore tirosin
chinasico grazie al suo
dominio SH2 che
riconosce la tirosina
fosforilata. A sua volta
Grb avrà due domini
SH3, i quali
differiscono dai domini SH2, poichè gli SH2 riconoscono la tirosina fosforilata, mentre gli SH3
riconoscono delle sequenze di proline, quindi mediano delle interazioni proteina-proteina e
non c'entrano con la fosforilazione. Quindi Grb2 recluta Sos con cui forma queste interazioni
proteina-proteina, mediata dai domini di SH3. Sos attiva Ras, il quale scambia il GTP con il
GDP, che a sua volta trasduce il segnale reclutando la proteina Raf. Questa cascata è una
delle vie di segnalazione più importanti proprio per mediare la proliferazione cellulare.

RASopatie
Quali saranno le cellule che avranno un interesse ad iperattivare questa via di segnalazione?
Saranno delle cellule tumorali, per cui quasi il 30% di tutti i tumori di diverso genere avrà
delle mutazioni su Ras che lo rendono attivo, cioè non più in grado di idrolizzare il GTP.
Quindi indipendentemente dalla presenza dello stimolo mitogenico esterno, queste cellule
saranno in grado di sostenere una proliferazione attiva.
Inoltre se queste mutazioni a carico di Ras o delle proteine a valle di Ras della via di
segnalazione, colpiscono delle cellule germinali, avremo delle RASopatie, delle patologie
legate a mutazioni di Ras.Le due più note sono la Sindrome di Noonan (SN) e la Sindrome
Cardio-facio-cutanea (CFC). Questo nome è dovuto al fatto che i fenotipi che si osservano in
questi pazienti sono proprio a carico ad esempio del volto, per cui abbiamo dei dismorfismi
facciali (forme alterate del volto), abbiamo cardiopatie congenite, cardiopatie ipertrofiche
(ispessimento dello strato interno dei ventricoli). Inoltre tutti questi pazienti sono soggetti
ad una serie di tumori molto rari, come ad esempio la leucemia linfoblastica acuta nei
bambini. Questo perché la via di segnalazione è estremamente importante per controllare
proprio la proliferazione, la sopravvivenza e l’attività cellulare.
La via della fosforilazione della MAP- chinasi serina/treonina attivata da Ras
A valle della segnalazione attivata da
Ras troviamo le MAP chinasi, che
sono delle proteine che vengono
fosforilate non solo sulle treonine, ma
anche sulle serine e in seguito a
fosforilazione attivano la proteina
successiva.
Quindi abbiamo Ras GTP attiva che va
ad attivare Raf (chiamata anche MAP
chinasi chinasi chinasi), la quale
idrolizza l'ATP; poi va a fosforilare Mek
(chiamata anche MAP chinasi chinasi)
e infine fosforila Erk (chiamata MAP
chinasi). Questi sono i tre passaggi
essenziali nella via di attivazione di
Ras. Dopodichè Erk che è una proteina
chinasi, è in grado o di fosforilare le
proteine citosoliche di cui ne cambia l’attività, oppure può entrare nel nucleo e fosforilare
dei fattori di trascrizione alterando così l’espressione genica. Quindi avremo sia risposte
rapide dovute alla modificazione di alcune proteine nel citosol, sia risposte un po’ più lente
date da un’alterazione dell’espressione genica.

Nell’immagine a fianco osserviamo la via di

segnalazione visualizzata in maniera un po’ più
chiara. Abbiamo Ras, Raf reclutata a livello della
membrana sotto Ras, Mek attivata da Raf, Erk
attivata da Mek. Erk entra dentro il nucleo,
prende dei fosfati derivanti da ATP e va a
fosforilare il complesso Elk-1, che attiva SRF ed
SRE (fattori trascrizionali presenti sul DNA
all’interno del nucleo). Tutto questo serve per
andare ad esprimere dei geni connessi alla
proliferazione cellulare, in particolar modo in tutti
i geni delle cosiddette cicline G1 (geni che dicono
alla cellula di iniziare a crescere, ad aumentare il
numero di proteine, enzimi e membrane e di
prepararsi alla divisione mitotica).
Questi geni sono anche chiamati geni precoci
immediati, perché la loro trascrizione avviene in
pochi minuti, quindi in tempi molto rapidi.
L’organizzazione della MAP- chinasi con proteine impalcature nel lievito
Queste MAP chinasi sono presenti non solo nei vertebrati , ma un po’ in tutti gli eucarioti
compreso il lievito. In esso esistono ad esempio 6 moduli differenti di MAP chinasi, le quali
sono organizzate da proteine impalcature. Sono organizzate con proteine impalcature
perché la stessa MAP chinasi (chinasi A) nell’impalcatura 1 e nell'impalcatura 2, potrebbe
regolare processi differenti. Ad esempio potremmo avere un fattore di accoppiamento del
lievito, che attiva la chinasi A, la quale deve attivare la chinasi B e C, per avere come risposta
l’accoppiamento delle cellule di lievito che si fondono. Se loro fossero libere nel citosol, la
chinasi A potrebbe andare ad esempio ad attivare un’altra proteina dominio chinasi e quindi
porterebbe alla sintesi di glicerolo, piuttosto che mediare la risposta di accoppiamento del
lievito. Quindi per evitare un’interferenza tra le vie di segnalazione, il lievito ha organizzato
le sue MAP chinasi in modo tale da veicolare un unico messaggio: risposta di accoppiamento
o sintesi del glicerolo o delle MAP chinasi organizzate in maniera differente.

Questo non esiste nel nostro caso, perché le MAP chinasi sono citosoliche o libere e quindi
possono attivare una cascata senza essere legate a proteine impalcature. Ci saranno quindi
delle MAP chinasi che rispondono, come già detto, a stimoli di fattori di crescita e sono
quelle già viste (Ras, Raf, Mek, Erk) che danno come risposta proliferazione, differenziazione,
sopravvivenza cellulare.
Poi avremo delle altre MAP chinasi differenti che agiranno su una via attivata da citochine o
da stress proveniente dall’ambiente extracellulare. Queste coinvolgeranno altre proteine,
analoghe a queste MAP chinasi e a loro volta medieranno una risposta differente correlata
allo stimolo, quindi se lo stimolo era la citochina, la risposta sarà una diminuzione o un
aumento dell’infiammazione; se lo stimolo era uno stress per la cellula, quella cellula
potrebbe essere mandata in apoptosi e quindi la risposta potrebbe essere la morte cellulare.
A seconda di quello che è lo stimolo avremo una cascata MAP chinasi corrispondente.
La via di PI3K/Akt
Adesso vediamo un’altra via diversa da quella delle MAP chinasi: la via delle PI3 chinasi
(PI3K), che agiscono a valle dei recettori tirosin chinasici. Le PI3 chinasi sono delle lipide
chinasi, cioè non fosforilano le proteine come tutte le altre che abbiamo visto, ma
fosforilano i lipidi. In particolar modo fosforilano i fosfatidilinositoli presenti in membrana. Si
chiamano 3-chinasi poiché fosforilano la posizione 3 dell’anello dell’inositolo. Quindi
genereranno 3 tipi di fosfatidilinositolo: PI 3-fosfato, PI (3,4)-bisfosfato, PI (3,4,5)-trisfosfato .
Ciascuno di questi medierà una segnalazione differente a valle, all’interno della cellula.
Quello più studiato è il PI (3,4,5)-trisfosfato, che è quello che vedremo di seguito, perché
anche questo è connesso alla sopravvivenza e alla crescita della cellula.
Come nel caso delle chinasi proteiche che fosforilano le proteine, anche in questo caso ci
saranno degli antagonisti delle chinasi che saranno delle fosfatasi, che rimuoveranno il
fosfato attaccato all’inositolo. Questa fosfatasi in particolar modo viene chiamata PTEN, una
delle fosfatasi più mutate nel cancro, perchè avere una mutazione sulla fosfatasi permette di
avere una segnalazione mediata dal PI (3,4,5)-trisfosfato attiva e quindi mediare una
costante proliferazione cellulare.

Domanda: chi compie le fosforilazioni sul fosfatidilinositolo? Le fosforilazioni le fanno le PI 3 -

chinasi, le PI 4-chinasi (fosforilano in posizione 4), le PI 5-chinasi (fosforilano in posizione 5).

L’attivazione della proteina chinasi Akt

Quello su cui ci concentreremo in seguito è
il PI (3,4,5) P3. Si origina con la fosforilazione
in posizione 3 dell'anello di inositolo da
parte della PI 3-chinasi. Quindi sul 4,5 loro
aggiungono il 3 e fanno 3,4,5. Il 3,4,5 serve
per reclutare sulla membrana plasmatica la
proteina Akt e la proteina PDK. Esse
vengono reclutate perchè hanno un dominio
chiamato PH che è specifico per il legame al
fosfatidilinositolo (3,4,5)- trisfosfato. Quindi
l'Akt e il PDK vanno sulla membrana
plasmatica riconoscendo il 3,4,5 prodotto
dalle PI3K. Una volta sulla membrana
plasmatica PDK è in grado di fosforilare Akt,
la quale diventa attiva, si stacca dalla
membrana e va a segnalare all’interno della
cellula un segnale di sopravvivenza e di
crescita della cellula stessa.
Sopravvivenza cellulare attraverso la PI3K
Le PI3K possono agire a valle di recettori tirosin chinasici e produrre 3,4,5, oppure possono
anche agire a valle dei recettori accoppiati a proteine G. In particolar modo esistono 4 enzimi
differenti: α, β, γ, δ. α, β e δ agiscono a valle dei recettori tirosin chinasici, che sono
chiamati “Class IA”, invece γ agisce a valle dei recettori accoppiati a proteine G ed è chiamata
“Class IB”. Nell’immagine sottostante vediamo la via di segnalazione delle PI3K che media la
sopravvivenza della cellula. Abbiamo il recettore tirosin chinasico (RTK) attivato, che recluta
la PI3K (azzurra) e la attiva. La PI3K attivata trova il PI(4,5)P2 sul versante citosolico della
membrana, gli attacca un fosfato in posizione 3, generando il PI(3,4,5)P3. Questo agisce da
substrato per reclutare PDK1 e Akt. Entrambe hanno il dominio PH che riconosce il 3,4,5.
Quindi entrambe vanno insieme sulla membrana plasmatica. PDK fosforila Akt sulla treonina
308 e mTOR (altra proteina chinasi presente a livello citosolico e coinvolta nella
proliferazione cellulare) fosforila sempre Akt sulla serina 473. Questa doppia fosforilazione fa
staccare Akt dalla membrana plasmatica in formato attivo. Akt attiva, va a fosforilare la
proteina Bad, la quale viene sequestrata e inattivata dalla proteina citosolica 14-3-3. Tutto
questo libera una proteina chiamata Bcl2 che è una proteina che inibisce l’apoptosi.

In sostanza il risultato finale di questa catena è che noi abbiamo una proteina che impedisce
a quella cellula di andare in apoptosi e quindi ne media la sopravvivenza e la proliferazione.
Questa è una delle tante vie di segnalazione che possiamo avere, perché se guardiamo nel
complesso la segnalazione che possiamo avere a valle di recettori accoppiati a proteina G e
recettori tirosin chinasici, si vede che possono attivare tantissime proteine differenti, su
cascate di segnalatori differenti, i quali alla fine convergono nel mediare una segnalazione
comune. Quindi esistono dei sistemi per rafforzare la segnalazione e ottenere un effetto
comune da più segnalazioni differenti.

La via del JAK/STAT

Adesso vediamo un’altra via di segnalazione dipendente da delle citochine, quindi va ad
agire su recettori tirosin chinasici tipicamente presenti su cellule del sistema immunitario.
In questo caso i recettori sono recettori che non hanno un dominio tirosin chinasico
intrinseco, per cui quando dimerizzano in seguito all’ arrivo della citochina, non sono capaci
da soli di auto fosforilarsi (come abbiamo visto finora per gli altri). Presenteranno proteine
accessorie come le JAK che si attaccheranno
al dominio intracellulare ed esse agiranno da
chinasi citoplasmatiche in grado di mediare la
funzione dei domini tirosin chinasici che
erano intrinsechi nella maggior parte degli
altri recettori tirosin chinasici visti in
precedenza. Quindi arriva la citochina che
dimerizza il recettore; le proteine accessorie
JAK si auto fosforilano e fosforilano il
recettore. Il recettore a sua volta recluta le
proteine STAT e quindi questa sarà la via di
segnalazione JAK/STAT. Le STAT non sono
delle proteine chinasi (quindi non inducono
fosforilazioni a valle), ma sono dei fattori
trascrizionali: sono in grado di traslocare il
nucleo e attivare direttamente una
trascrizione genica una volta attivate. Quindi
abbiamo la chinasi associata alla porzione
intracellulare che è il recettore tirosin
chinasico, le JAK si auto fosforilano e a loro
volta attivano le STAT. Le STAT avranno dei
domini SH2 che riconosceranno la
fosforilazione mediata da JAK sulle tirosine, si dissoceranno dal recettore fosforilato e si
legheranno tra di loro (il dominio SH2 di ciascuna JAK, sarà in grado di riconoscere la
fosforilazione della proteina stessa formando un dimero, il quale entrerà nel nucleo e
altererà la trascrizione).
Proteine segnale che agiscono tramite la via JAK-STAT
Esistono 4 JAK differenti, che rispondono a degli stimoli extracellulari differenti, quindi
-
L

potremmo avere l’interferone γ che attiverà la JAK1 e la JAK2, che attiveranno la STAT1, che
~s

porteranno all’attivazione dei macrofagi e quindi avremo un processo di fagocitosi.

Potremmo anche avere l’interferone α che agisce su una JAK diversa che si chiama Tyk2 (la
prima JAK che hanno individuato) e insieme alla JAK2 attivano la STAT1 e la STAT2 che
faranno aumentare la resistenza cellulare alle infezioni virali. Nel caso dell’ormone della
crescita, questo andrà ad attivare il JAK2, che attiverà la STAT1 e la STAT5 che stimoleranno la
crescita inducendo la produzione di IGF1, che è un fattore di crescita che agirà su un altro
recettore tirosin chinasico.

Nella via di segnalazione di JAK/STAT la dimerizzazione come in questo caso mediata

dall'interferone α, avviene su un recettore legato a Tyk2 e l’altro a Jak1 , cioè i due dimeri
legano delle JAK differenti. Quindi quando avviene la dimerizzazione indotta dall’interferone,
i JAK sono in grado di cross fosforilarsi (cioè si fosforilano a vicenda). Si cross fosforilano e a
loro volta fosforileranno il recettore, il quale recluta STAT1 e STAT2 con dominio SH2. Questi
vengono fosforilati dalle due JAK e si staccano. Utilizzando lo stesso dominio SH2 legano la
STAT adiacente, formando un dimero. Questa struttura dimerica è in grado di migrare e
traslocare nel nucleo, attaccarsi sul promotore dei geni che devono essere ridotti
dall’interferone α e quindi trascrivere e produrre i geni di riferimento.

Finora abbiamo visto tutte proteine tirosin chinasi, ma ovviamente ci saranno anche delle
tirosin fosfatasi, cioè quelle che fanno l'opposto e riescono a rimuovere la fosforilazione. Tra
quelle più note abbiamo le SHP-1 e SHP2 che sono delle tirosin fosfatasi che agiscono ad
esempio sulle JAK. Quindi vanno a togliere la fosforilazione su JAK1 spegnendo tutta la via di
segnalazione a valle. Ovviamente non sono specifiche solo per la via di JAK, ma possono
agire anche sulle altre vie mediate da recettori tirosin chinasici visti in precedenza (sono
segnali di spegnimento della via).
La via di segnalazione Smad-dipendente attivata da TGF-β
Infine abbiamo ancora un’ultima tipologia di via di segnalazione che è quella caratterizzata
da fattori trasformanti di crescita beta, TGF-β. Si tratta di piccole molecole dimeriche, cioè
esistono associate a due a due e sono in grado di mediare tutta una serie di effetti correlati
allo sviluppo, quindi proliferazione cellulare, differenziamento cellulare, apoptosi e
mantenimento dell’omeostasi cellulare. Queste TGF-β agiscono sul TGF-β receptor e a
differenza degli altri recettori che erano tirosin chinasici, questi sono serin/treonin specifici,
quindi le fosforilazioni sono sulla serina e sulla treonina, non sulla tirosina. Quello che
succederà è che avremo la nostra proteina TGF-β dimerica (in rosso) che si legherà a un
recettore TGF-β di tipo II, con un dominio serin/treonin chinasico (e non tirosin chinasico).
Questi dimerizzano con un recettore differente di tipo I e quello che viene fosforilato è
questo recettore di tipo I. Questa fosforilazione, attiva delle proteine a valle chiamate Smad2
e Smad3, che sono proteine citosoliche piegate su loro stesse in forma inattiva. Quando
abbiamo la fosforilazione sul recettore TGF-β di tipo I, vengono attivate e fosforilate a loro
volta, aprendosi nella versione finale. Questa versione è in grado di attivare altre proteine
Smad (ad esempio la Smad4), formando dei dimeri, in maniera simile a quella vista per
STAT1 e STAT2 che emigravano come dimeri nel nucleo. Queste Smad fanno la stessa cosa,
cioè come dimeri si muovono dal citosol al nucleo e vanno ad alterare l’espressione genica
associandosi ad altre proteine. Queste sono vie specifiche di riparazione del danno e sono
mediate dalle TGF-β e dalle proteine BMP, che agiscono sugli stessi recettori.