Segnali bioelettrici

Il potenziale di membrana è la differenza di potenziale a cavallo della membrana plasmatica, dovuto

all’asimmetrica distribuzione di ioni tra il LIC ed il LEC.
È una proprietà di tutte le cellule di un organismo ed il primo
segno di morte cellulare, dal punto di vista elettrofisiologico,
è proprio la perdita del potenziale di membrana.

Gli ioni sono particelle dotate di carica elettrica e su di essi

agiscono principalmente due forze:
1. Gradiente di concentrazione, dato dalla differenza di
concentrazione che esiste tra le diverse specie
ioniche a cavallo della membrana plasmatica;
2. Campo elettrico, generato dalle cariche elettriche degli stessi ioni presenti in soluzione.

Ipotizziamo di avere una membrana permeabile ad un solo ione che separi un compartimento privo di ioni
da un compartimento dove vi sono uguali concentrazioni di ioni positivi e negativi, come nel caso del
cloruro di potassio. Inizialmente entrambi i compartimenti sono elettricamente neutri. Il passo successivo è
quello di collocare un canale ionico, selettivamente permeabile ai cationi (K +), a livello della membrana.
Quando il canale ionico è aperto gli ioni positivi diffondono seguendo il loro gradiente di concentrazione
(diffusione facilitata) spostandosi verso il compartimento dove la loro concentrazione è nulla.
Nel compartimento di destinazione si accumulano cariche positive mentre nell’altro compartimento vi sarà
un eccesso di cariche negative, per cui la condizione di elettroneutralità viene persa e si genera un
gradiente elettrochimico. Man mano che si accumulano cariche positive nel secondo compartimento,
queste stesse cariche esercitano una forza repulsiva nei confronti delle cariche positive che dal primo
passano al secondo compartimento.
Infine, si arriverà ad una condizione nella quale il flusso di cariche dovuto al gradiente di concentrazione
eguaglia il flusso dovuto al gradiente elettrico; si raggiunge così l’equilibrio dove il flusso netto degli ioni
sarà pari a zero.

Il potenziale di equilibrio di uno ione è la differenza di potenziale di membrana alla quale il movimento di
ioni lungo il gradiente di concentrazione è esattamente uguale e opposto al movimento di ioni lungo il
gradiente elettrico. Al potenziale di equilibrio il flusso netto degli ioni attraverso la membrana è pari a zero.

Il potenziale di membrana altro non è che un potenziale di equilibrio in cui i flussi degli ioni attraverso la
membrana spinti dal gradiente elettrico sono controbilanciati dai flussi degli ioni in direzione opposta spinti
dal gradiente di concentrazione.

L’equazione di Nernst consente di calcolare il potenziale di equilibrio di uno ione.

Approssimativamente il potenziale di equilibrio del K+ è -90 mV, mentre quello del Na+ è +70 mV.
N.B. È importante conoscere il potenziale di equilibrio di ciascuno ione perché tutti i canali ionici generano
correnti la cui natura ionica può essere riconosciuta dal loro potenziale di inversione (o di equilibrio).
Ad esempio, se un canale genera una corrente con un potenziale d’inversione di -90mV sicuramente non è
una corrente Na ma molto probabilmente è una corrente K.
È possibile definire il potenziale di equilibrio come il potenziale a cui il flusso netto di uno ione a cavallo
della membrana plasmatica è pari a zero. Ad esempio, se il potenziale di membrana è -90 mV il flusso netto
di ioni K+ è zero.
Si può quindi desumere che quando un canale ionico si apre, genera una correte che porta il potenziale di
membrana al valore del potenziale di equilibrio dello ione per il quale è permeabile.
Affinché un gradiente di concentrazione sia in grado di generare e mantenere un potenziale di membrana
devono verificarsi due condizioni:
- La specie ionica sia presente in concentrazione diversa ai due lati della membrana;
- La membrana sia selettivamente permeabile ad almeno una specie ionica.

La membrana plasmatica è permeabile a più ioni (K +, Na+, Ca2+, Cl-) ma la permeabilità basale al K+ è molto
superiore rispetto alla permeabilità basale agli altri ioni, ovvero il numero di canali permeabili al K + sono più
numerosi di tutti gli altri. Ciò significa che il potenziale di membrana raggiunge un valore molto vicino al
potenziale di equilibrio per il K+.
L’equazione di Goldman-Hodgkin-Katz è un’equazione di Nernst modificata, nella quale si considerano i
gradienti di concentrazione delle tre principali specie ioniche presenti a cavallo della membrana plasmatica
(Na+, K+, Cl-) ma introduce anche un fattore aggiuntivo, la permeabilità della membrana per quella specie
ionica. Lo ione che ha una permeabilità maggiore incide maggiormente sul valore del potenziale di
membrana, per cui un neurone o una fibra muscolare, che presentano un’elevata permeabilità al K +, hanno
un potenziale di membrana molto vicino al potenziale di equilibrio dello ione K +.

Circuito elettrico equivalente

Un canale ionico è equivalente ad un resistore che ha, nel momento
in cui il canale si apre, una specifica conduttanza  ed è posto in serie
ad una batteria di forza elettromotrice E (pari al potenziale di
equilibrio dello ione per il quale il canale è permeabile).
Es. Quando un canale per il K+ si apre, nel circuito fluisce una corrente
che impone ai due capi del circuito una differenza di potenziale V m
che corrisponde al potenziale di equilibrio di Nernst dello ione K +.

N.B. Un resistore è un elemento circuitale che, al passaggio della

corrente, offre una resistenza elettrica di valore noto, provocando
una caduta di tensione e riscaldandosi.
La conduttanza è l’inverso della resistenza.

La corrente ohmica che fluisce lungo il circuito obbedisce alla legge di Ohm:
La forza elettromotrice Vm (che guida il flusso di una corrente attraverso
un canale ionico) è data dalla differenza tra il potenziale di membrana (V m)
a cui si misura la corrente e il potenziale di equilibrio dello ione (E).

Nell’esempio della corrente K+, la relazione corrente-voltaggio è una

relazione lineare di tipo ohmico (definita dalla legge di Ohm), ciò significa
che la corrente è direttamente proporzionale al gradiente elettrochimico.
Tuttavia, pochi canali presentano una relazione di questo tipo, ne sono un
esempio i recettori nicotinici.
La conduttanza corrisponde al coefficiente angolare (pendenza) della retta
che descrive la relazione corrente-voltaggio.
La conduttanza esprime la capacità di far passare cariche elettriche (ioni) in
presenza di una forza elettromotrice, che dipende da:
- Differenza di potenziale ai due capi della membrana;
- Differenza di concentrazione ionica ai due lati della membrana.
La conduttanza (g=1/R) si misura in Siemens (1/Ohm). Per i canali ionici la conduttanza è nell’ordine dei pS
(1 pS = 10-12 S).
La conduttanza totale di una membrana per una specie ionica è data dal prodotto della conduttanza del
singolo canale per il numero totale di canali presenti sulla membrana.
Per convenzione dei sistemi
biologici, si definiscono
negative le correnti dovute a cariche elettriche positive che entrano nella cellula (es. Na+) o generate da
cariche elettriche negative che escono dalla cellula (es. Cl-).

La corrente ENTRANTE di Na+ è

DEPOLARIZZANTE.

Per convenzione dei sistemi biologici, si definiscono positive le correnti dovute a cariche elettriche positive
che escono dalla cellula (es. K+) o generate da cariche elettriche negative che entrano nella cellula (es. Cl-).

La corrente USCENTE di K+ è IPERPOLARIZZANTE.

Dunque, ogni canale ionico (x), aprendosi, tende a spostare il valore del potenziale di membrana (V m) verso

il valore del suo potenziale di equilibrio (E x).

Se Vm= -70 mV, l’apertura dei canali al K+ tenderà ad iperpolarizzare la membrana fino a – 90 mV (E K). Ne
consegue che la corrente di K+ (IK) avrà una direzione uscente.
Se Vm = -70 mV, l’apertura dei canali al Na + tenderà a depolarizzare la membrana fino a +65 mV (E Na). Ne
consegue che la corrente di Na+ (INa) avrà una direzione entrante.
Potenziale d’azione
Il potenziale d’azione è una rapida variazione del potenziale di membrana che, da valori negativi raggiunge
valori più positivi rispetto allo zero.
Nei mammiferi, il p.d.a. assolve principalmente a due distinte funzioni:
1. Nelle fibre muscolari scheletriche e cardiache l’attivazione dei p.d.a. induce il processo della
contrazione. Le fibre muscolari scheletriche generano il p.d.a. più rapido.
 2. Nei neuroni i p.d.a. consentono la propagazione delle informazioni tra neuroni, lungo le fibre
nervose.
In un neurone il potenziale di membrana a riposo è di circa -70 mV. In un neurone un p.d.a insorge in
seguito alla iniezione di una corrente elettrica depolarizzante (cariche positive come Na +) da parte dello
sperimentatore o all’arrivo di correnti elettrotoniche (generate a livello dendritico e causate dall’apertura
dei recettori ionotropici) in corrispondenza del cono di emergenza. In entrambi i casi le correnti entranti
determinano una depolarizzazione, detta piede, che porta il potenziale di membrana fino ad un valore
soglia (-55 mV). A questo valore si ha una rapidissima escursione del potenziale di membrana che,
superando lo zero, diventa progressivamente più positivo. In questa fase, detta eccedenza, si inverte la
polarità della membrana. Il picco dell’eccedenza è generalmente +40 mV.
Dopo il picco, altrettanto rapidamente il potenziale di membrana torna ad essere più negativo, fino a
raggiungere un valore più negativo rispetto al potenziale di riposo. Questa fase è detta iperpolarizzazione
postuma, ed è caratteristica dei neuroni.
Le correnti depolarizzanti che consentono alla membrana di raggiungere il valore soglia sono dette stimoli
liminari; le correnti che superano ampiamente la soglia di attivazione del p.d.a. sono definite stimoli
sovraliminari, mentre quelle che non sono in grado di innescare un p.d.a. sono dette stimoli sottoliminari.

Il potenziale di membrana di un cardiomiocita a riposto è di circa -80 mV. Il p.d.a. cardiaco, in particolare
dei miociti ventricolari, non consente la trasmissione di informazioni ma serve ad innescare la contrazione
(compito biomeccanico). Anche in questo caso la soglia di attivazione del p.d.a. si attesta intorno ai -55 mV.
In un p.d.a. cardiaco tra la fase di ripolarizzazione precoce e quella tardiva vi è la fase di plateau, nella quale
il potenziale di membrana è compreso tra 0 mV e +20 mV. Durante questa fase entra lo ione Ca 2+ che
innesca la contrazione del miocardio ventricolare. Dopo la fase di plateau segue la fase di ripolarizzazione
tardiva che porta il potenziale di membrana al suo valore di riposo.
A differenza del p.d.a. neuronale non sussiste la fase di iperpolarizzazione postuma, ed inoltre, il p.d.a.
cardiaco è decisamente più lungo (circa 250 ms) e ciò è dovuto
proprio alla fase di plateau.

Il potenziale d’azione obbedisce alla legge del tutto o nulla.

Ciò significa che il p.d.a. insorge solo quando viene iniettata una
corrente depolarizzante che raggiunge il valore soglia (stimolo
liminare). In seguito a stimoli sottoliminari la membrana si
depolarizza ma non raggiunge la soglia di attivazione, mentre in
seguito a stimoli sovraliminari l’ampiezza del p.d.a. innescato resta
costante a quella evocato da stimoli liminari.
La legge del tutto o nulla è dimostrata dal fatto che l’ampiezza del
p.d.a. evocata dallo stimolo liminare è già la massima possibile e
non aumenta con l’intensità degli stimoli al di sopra della soglia.
Anche se l’ampiezza dei p.d.a. non cambia ciò che può variare è la frequenza, cioè il numero dei p.d.a.
nell’unità di tempo.
Se aumenta l’intensità dello stimolo aumenta anche la frequenza con cui insorgono i p.d.a.

Voltage clamp
La tecnica del voltage clamp consiste nel bloccare (clampare) il potenziale di membrana (V m) ad un valore
costante nel tempo (definito potenziale di comando) e nel registrare le correnti ioniche transmembrana
generate a tale potenziale di membrana.

I due studiosi che hanno contribuito maggiormente alla messa a punto di tale tecnica sono stati Hodgkin e
Huxley. Inoltre, con il metodo del voltage clamp sull’assone gigante di calamaro (diametro di 1 mm) hanno
compreso quali sono gli ioni coinvolti nella genesi del potenziale d’azione.
Nello specifico, il voltage clamp consiste nel bloccare il potenziale di membrana ad un valore costante e
stazionario definito dallo sperimentatore: si depolarizza la membrana iniettando gradini di corrente
depolarizzante di ampiezza progressivamente maggiore.
Ad esempio, partendo da un potenziale di membrana di -70 mV, si passa progressivamente ad un
potenziale di comando di -40 mV, -30 mV, -20 mV, fino a raggiungere un valore di +90 mV.
In corrispondenza di ogni valore del potenziale di membrana viene registrata la corrente ionica generata.
Per applicare questa tecnica occorrevano due elettrodi: uno di stimolazione, collegato ad un generatore di
corrente (impulsi depolarizzanti), ed uno di registrazione, in grado di registrare la corrente evocata dalla
depolarizzazione della membrana. Questo è il motivo per cui
inizialmente si utilizzavano organismi di grosse dimensioni
come l’assone gigante di calamaro, le uova di riccio o le
uova di Xenopus, che avevano un diametro sufficientemente
grande per inserire i due elettrodi.
Lo scopo del voltage clamp era quello di individuare quali
fossero le correnti ioniche attivate in risposta ad una
depolarizzazione (liminare o sopraliminare).
I due ricercatori osservarono che, in risposta all’iniezione di
un gradino di corrente depolarizzante la membrana
generava una corrente bifasica, ovvero una corrente iniziale
negativa (entrante) e a rapida attivazione che, una volta
raggiunto il picco, si riduceva progressivamente di intensità
fino ad invertire il proprio segno e a generare una corrente
positiva (uscente) più lenta che si mantiene costante nel tempo.
In generale, in risposta ad uno stimolo depolarizzante la membrana genera una rapida corrente entrante di
Na+, seguita da una più lenta corrente uscente di K +.

Hodgkin e Huxley supposero che, essendo il Na + lo ione più abbondante nell’ambiente extracellulare, la
corrente rapida entrante fosse proprio quella del Na.
Per confermare tale ipotesi, i due scienziati misero a punto un esperimento tanto semplice quanto
informativo.
Essi misurarono la corrente evocata dalla depolarizzazione della membrana in presenza di una soluzione
extracellulare che conteneva solo il 10% di
Na, ed osservarono solo una lenta corrente
uscente (K+) che persisteva al termine della
depolarizzazione.
Sottraendo la corrente registrata in
assenza di Na alla corrente di controllo,
ottennero una pura corrente entrante
dello ione Na+.
In sintesi, le due correnti (Na e K) hanno
una cinetica di attivazione diversa:
 - le correnti Na+ si attivano/inattivano
rapidamente;
- le correnti K+ si attivano lentamente e non si
inattivano. Tali correnti sono chiamate
Delayed rectifer.

Un’altra tecnica utilizzata per caratterizzare le

correnti Na e K, che sottendono il p.d.a. nervoso, è
la separazione farmacologica delle correnti, nella
quale vengono utilizzati dei bloccanti selettivi per
ciascuna corrente ionica.
La TTX (tetradotossina) è un bloccante selettivo dei canali v.d. al Na +, e si trova nel pesce palla.
In presenza di TTX si misura esclusivamente una corrente lenta uscente di K +.
La TEA (tetraetilammonio) è l’inibitore selettivo dei canali v.d. a lenta attivazione al K +, per cui in presenza di
TEA si registra una corrente entrante di Na +.
La relazione corrente/voltaggio di un canale ionico si misura utilizzando la tecnica del voltage clamp, e
corrisponde alla relazione che intercorre tra il potenziale di comando al quale la membrana viene bloccata
e l’ampiezza di picco della corrente evocata a quel determinato valore di potenziale.
Queste due correnti presentano una relazione corrente/voltaggio molto differente tra di loro.
In figura si può osservare come le correnti K+ siano uscenti mentre le
correnti Na+ siano inizialmente entranti e poi uscenti.
Solitamente, le correnti di K+ delayed rectifer si attivano ad un potenziale
di membrana pari a -20 mV, mentre la soglia di attivazione per le correnti
Na+ è circa -55 mV.

Per giustificare tali correnti ioniche attraverso la membrana, Hodgkin e

Huxley supposero che la membrana plasmatica contenesse delle proteine
canale (concetto sconosciuto al tempo), e che queste proteine fossero sensibili al voltaggio e dotate di
gates.

Canali per il sodio

I canali voltaggio-dipendenti per il Na+ sono dotati di due porte:
- gate di attivazione, che mantiene chiuso il canale quando la membrana è iperpolarizzata, mentre si
apre e consente l’ingresso di Na+ quando la membrana è depolarizzata;
- gate di inattivazione, che non occlude il poro del canale quando la membrana è iperpolarizzata.
Tuttavia, in seguito alla depolarizzazione ha luogo la chiusura della porta di inattivazione che blocca
il passaggio di ioni Na+.

N.B. Chiusura e inattivazione sono due processi differenti, anche se il risultato finale è lo stesso: occludere il
poro del canale. La chiusura è dovuta al
ripiegamento della porta di attivazione quando la
membrana è iperpolarizzata, l’inattivazione,
invece, è dovuta al ripiegamento della porta di
inattivazione quando la membrana è
depolarizzata.
Per ripristinare le condizioni iniziali di un canale
inattivato, la membrana deve essere
ripolarizzata, in quanto la porta di inattivazione
viene dislocata dal poro del canale e la porta di
attivazione si chiude per essere nuovamente
aperta da uno stimolo depolarizzante.
Canali per il potassio
I canali voltaggio-dipendenti per il K+ (di tipo delayed rectifer) sono dotati solo di una porta di attivazione,
che si apre quando la membrana viene depolatizzata e si richiude quando la membrana viene ripolarizzata.

N.B. La porta di attivazione dei canali al Na si apre più velocemente rispetto a quella dei canali al K.
Al potenziale di riposo il gate di attivazione dei canali al Na e al k è chiuso; quindi, non ci sono flussi ionici se
non quelli di leakage.
Quando la membrana è interessata da una corrente depolarizzante si apre la porta di attivazione dei canali
al Na (hanno una cinetica di attivazione più rapida rispetto a quelli al K). Il valore soglia di attivazione del
p.d.a. di -55 mV è proprio il potenziale di membrana in corrispondenza del quale si ha l’apertura dei canali
v.d. al Na+. Man mano che il Na+ entra, con esso entrano cariche positive che depolarizzano ulteriormente la
membrana, e ciò consente l’attivazione di altri canali al Na + (che hanno
una soglia di attivazione più alta).
Si parla quindi di un fenomeno autorigenerativo (feedback positivo)
perché una volta innescato, sono gli stessi canali al Na che provvedono
a depolarizzare ulteriormente la membrana e ad attivare altri canali al
Na.
I canali al Na hanno lo scopo di portare il potenziale di membrana al
potenziale di equilibrio dello ione Na + (+70 mV). Tuttavia, nella fase di eccedenza si raggiunge il picco di +40
mV in quanto si ha la simultanea inattivazione dei canali al Na e l’apertura dei canali al K.
Le correnti di K tendono a ripolarizzare la membrana, che diventa progressivamente più negativa. Inoltre,
esattamente come i canali al Na, anche i canali al K tendono a portare il potenziale di membrana al
potenziale di equilibrio dello ione K+ (-90 mV). La lenta cinetica di chiusura dei canali al K consente infatti
un’ulteriore fuoriuscita di cariche positive responsabili della fase di iperpolarizzazione postuma. Durante
questa fase tutti i canali v.d. al Na+ tornano nella configurazione iniziale.

Ricapitolando: la depolarizzazione della membrana, evocata da uno stimolo liminare o sopraliminare, causa
un rapido aumento della conduttanza al Na che poi si riduce a causa del processo di inattivazione mentre
aumenta la conduttanza al K.

Un’altra caratteristica del potenziale d’azione è la refrattarietà.

La refrattarietà consiste nel lasso di tempo in cui uno stimolo liminare non è più in grado di indurre un
nuovo p.d.a. in una membrana che ne abbia appena prodotto uno.
Si parla di:
- refrattarietà assoluta, durante la quale anche uno stimolo sopraliminare non è in grado di generare
un p.d.a. La fase di refrattarietà assoluta coincide con la durata del p.d.a. Durante un p.d.a. uno
stimolo non è in gradi di generare
un altro p.d.a. poiché i canali al
Na sono inattivati e la membrana
deve ripolarizzarsi. La
refrattarietà assoluta è seguita
dalla fase di refrattarietà relativa.

- refrattarietà relativa, durante la

quale solo uno stimo sopraliminare è in grado di generare un nuovo p.d.a. che ha una soglia più alta
ed una minore intensità. Questo lasso di tempo, infatti, coincide con la fase di iperpolarizzazione
postuma, dove la maggior parte dei canali al Na è ritornata nella configurazione iniziale, per cui
possono attivarsi.
Al termine della fase di refrattarietà relativa uno stimolo liminare è nuovamente in grado di indurre
un p.d.a.
 Patch clamp
La tecnica del voltage clamp aveva comunque delle limitazioni
viste le dimensioni degli elettrodi a disposizione all’epoca, in
quanto poteva essere applicata solo a cellule piuttosto grandi
come le uova di echinodermi o l’assone gigante di calamaro
ma non a cellule di mammifero. Si cercò quindi di fabbricare
un amplificatore in grado di utilizzare lo stesso elettrodo sia
per clamplare il potenziale di membrana al valore del
potenziale di comando, sia per registrare la corrente
transmembrana evocata a ciascun potenziale di comando.

La tecnica del patch clamp (blocco di area), messa a punto da due ricercatori tedeschi, Erwin Neher e Bert
Sakmann, è una tecnica elettrofisiologica che consente di bloccare il voltaggio di un pezzo isolato di
membrana cellulare o dell’intera cellula e di registrare le correnti ioniche che fluiscono attraverso un
singolo canale ionico (nell’ordine dei picoAmpère, 10 -12) o attraverso i canali dell’intera superficie di
membrana. Tale tecnica si può utilizzare su colture cellulari, su cellule isolate, su cellule di sottili fettine di
tessuto cerebrale e su cellule che sono state transfettate con cloni di determinati canali ionici. Grazie a
questa tecnica, inoltre, è possibile studiare l’attività elettrica dei neuroni nel cervello di un animale sveglio.

Set-up per il patch clamp

Il patch clamp consente di eseguire esperimenti di voltage clamp utilizzando un solo microelettrodo (dalla
forma affusolata) sia per bloccare il potenziale di membrana al potenziale di comando desiderato che per
misurare le corrispondenti correnti ioniche transmembrana. L’elettrodo viene inserito in una pipetta di
vetro (riempita con una soluzione ionica in grado di condurre le correnti generate dall’apertura del singolo
canale) che viene appoggiata delicatamente e fatta aderire alla superficie della membrana plasmatica.
Il microelettrodo viene appoggiato delicatamente sulla superficie della membrana grazie all’uso di
micromanipolatori molto precisi. A questo punto si deve sigillare la punta della micropipetta alla superficie
della membrana e ciò si fa applicando una suzione molto delicata (per mezzo di una siringa o con le labbra).
Questa suzione risucchia la porzione di membrana sottesa dalla punta della micropipetta, formando una
sorta di omega. In questo modo si raggiunge una condizione detta di “Gigaseal”, in cui la resistenza che c’è
tra la punta della micropipetta e la membrana è pari a 1 Giga Ohm (10 9 Ohm), ovvero una resistenza molto
elevata in quanto la membrana aderisce strettamente alla punta della micropipetta. Se si è fortunati,
troveremo un pezzo di membrana con un solo canale ionico e quindi potremo bloccare il potenziale di
membrana soltanto di questo pezzo di membrana e quindi studiare l’attività elettrica di questo singolo
canale. Se non si raggiunge la condizione di Gigaseal, e quindi se la resistenza è bassa, si ha una dispersione
della corrente, che quindi non viene interamente registrata perché fluisce.
Quando si effettuano questi tipi di studio occorrono: il microscopio, con il quale osservare le cellule; una
camera di registrazione, cioè una vaschetta nella quale c’è una soluzione, generalmente preparata per
mimare la composizione della soluzione dei tessuti biologici; il micromanipolatore per muovere con
precisione il microelettrodo; pre-amplificatore, dove viene inserito il microelettrodo e che è collegato
all’amplificatore vero e proprio; l’oscilloscopio, che però non viene più utilizzato, infatti i segnali elettrici ora
vengono monitorati utilizzando dei softwear, meno sensibili degli oscilloscopi; un tubicino che si diparte dal
pre-amplificatore e che è collegato direttamente alla micropipetta, utilizzato per applicare la pressione
negativa necessaria per raggiungere il Gigaseal.
Quando conduco l’esperimento, come faccio a capire se si è raggiunto il Gigaseal? Attraverso la
micropipetta applico un gradino di potenziale, cioè una corrente. Quando la micropipetta tocca la
membrana, la corrente si riduce perché incontra una resistenza. Nel momento in cui si raggiunge il
Gigaseal, non passa più corrente tra la pipetta e la soluzione extracellulare, di conseguenza si registra un
segnale piatto.
Configurazioni del patch clamp
Il patch clamp presenta 3 diverse configurazioni:

1. Cell-attached: è la configurazione di base, quella da cui si parte per

ottenere tutte le altre. In questa configurazione la membrana forma un
sigillo con la punta della micropipetta contenente l’elettrodo. La punta
della pipetta da patch ha un diametro di circa 1 micron, ne consegue
che con un po' di fortuna, il frammento (patch) di membrana che
sottende la punta dell’elettrodo contiene un solo canale ionico.
Quando viene applicata la pressione negativa, che consente la
formazione del sigillo, la membrana che sottende la punta
dell’elettrodo si introflette all’interno della micropipetta formando una
sorta di omega (si stabiliscono delle interazioni tra i fosfolipidi e il vetro
borosilicato della pipetta). In prossimità del sigillo la resistenza è pari
ad 1 Giga Ohm (109 Ohm), e la corrente che fluisce attraverso il canale
ionico non si disperde nel mezzo extracellulare ma passa attraverso
l’elettrodo e viene registrata dall’amplificatore.
Tale configurazione consente di effettuare registrazioni di singolo
canale in condizioni in cui la cellula è intatta, il suo mezzo intracellulare
imperturbato, in condizioni quindi il più libere possibile da artefatti
sperimentali.
È possibile studiare le correnti Na e K a livello di singolo canale.
Supponiamo che una membrana si trovi ad un potenziale di riposo pari a -80
mV, e immaginiamo di applicare un potenziale di comando di -40 mV, superiore
alla soglia di attivazione dei canali v.d. al Na + (che è -55 mV). Così facendo
determino l’apertura del canale al Na localizzato nel patch di membrana che
sottende la punta dell’elettrodo. Quindi, effettuo un numero di misurazioni
statisticamente rilevante (almeno 100) della risposta del singolo canale ionico
all’iniezione di un gradino depolarizzante.
Dai singoli tracciati si evince che i canali al Na + si aprono con un breve ritardo
rispetto all’inizio della depolarizzazione e restano aperti per un periodo molto
breve (le aperture sono per la maggior parte concentrate all’inizio della
depolarizzazione).
Le correnti di Na+ v.d. si attivano rapidamente e altrettanto rapidamente si
inattivano.
N.B. I rettangoli corrispondono alla rapida transizione del canale al Na + dallo stato chiuso a quello aperto.
I singoli eventi di apertura oltre ad avere durata differente non sono sincroni, cioè non si registrano mai
eventi di apertura sovrapponibili.
Calcolando la media delle registrazioni di singolo canale si ottiene un tracciato che rappresenta la corrente
entrante transiente di Na+. Dunque, le correnti ioniche transmembrana globali riflettono l’attività delle
singole proteine canale.

Effettuando lo stesso tipo di misurazioni su canali al K + si evince che i canali al K+ si aprono con un ritardo
maggiore rispetto all’inizio della depolarizzazione, restano aperti più a lungo e le aperture si protraggono
per tutta la durata della depolarizzazione. La cinetica di attivazione dei canali v.d. al K + di
tipo delayed rectifer è infatti più lenta rispetto alla cinetica di attivazione dei canali al Na +.
Calcolando la media delle correnti di singolo canale si ottiene un tracciato che
rappresenta una corrente uscente di K+.

Si deduce quindi che tutte le correnti ioniche transmembranarie globali riflettono la

somma delle attività delle singole proteine canale.
 2. Inside-out: configurazione nella quale il patch di membrana che sottende la punta della
micropipetta è staccato dal resto dal resto della membrana (si libera il canale ionico dalla

membrana in cui era inserito).

In questo caso il foglietto citosolico della membrana plasmatica è esposto all’esterno, verso il LEC
(soluzione di registrazione), mentre il foglietto extracellulare della membrana è interno alla
micropipetta. Lo sperimentatore può quindi modificare la composizione del LEC e per questo la sua
principale applicazione è nello studio dei canali chemio-dipendenti attivati da secondi messaggeri
intracellulari. Es. Canali attivati dal diacilglicerolo,
acido arachidonico o i canali GIRK.

3. Whole-cell: partendo dalla configurazione di cell-

attached, applicando un’ulteriore suzione gentile, si
può rompere il patch di membrana e stabilire
l’accesso diretto tra microelettrodo e citoplasma,
senza peggiorare la qualità del sigillo.
Mediante tale configurazione è possibile estendere
l’esperimento di voltage clamp effettuato
sull’assone gigante di calamaro a cellule di piccole
dimensioni, come le cellule di mammifero. Si può
quindi misurare l’attività elettrica di tutti i canali
ionici inseriti nella membrana al potenziale di comando stabilito dallo sperimentatore.
4. Outside-out: dalla configurazione “whole-cell” si può passare alla configurazione outside-out, nella
quale il patch che sottende la punta della micropipetta viene escisso dalla membrana e presenta il
foglietto extracellulare della membrana rivolto verso l’esterno (soluzione di registrazione).
Tale configurazione è utile per lo studio di canali ionici, come i recettori ionotropici, attivati da
agonisti extracellulari (es. recettore nicotinico per l’ACh), ma dato che è molto difficile ottenerla
non viene utilizzata quasi mai.

Probabilità di apertura
Ad eccezione dei canali di leakage, i canali ionici anche in presenza di uno stimolo
attivatore fluttuano continuamente da uno stato chiuso ad uno stato aperto; per cui
anche in assenza di uno stimo attivatore possono verificarsi dei rapidissimi eventi di
apertura.
Lo stimolo attivatore (depolarizzazione, stimolo chimico o variazione della temperatura)
aumenta la probabilità di apertura del canale. Dunque, non è possibile predire con esattezza il momento in
cui un canale transita dallo stato chiuso allo stato aperto, in quanto si tratta di un evento stocastico.
Per calcolare la probabilità di apertura di un canale, in presenza di un certo stimolo, lo sperimentatore deve
effettuare più registrazioni lunghe e ripetute nel tempo (così da avere una valenza statistica).
Aumentando progressivamente l’intensità dello stimolo aumenta la probabilità di apertura. La probabilità
di apertura oscilla tra 0 e 1. Un canale che ha una probabilità di apertura pari a 0,1 trascorre la maggior
parte del tempo allo stato chiuso, mentre un canale che ha probabilità 0,9 trascorre la maggior parte del
tempo allo stato aperto.

Nella configurazione di cell-attached, oltre a registrare la corrente che fluisce attraverso un singolo canale
(es. canale v.d. al K+ di tipo delayed rectifer), si può anche calcolare la probabilità di apertura del canale
ionico a ciascun potenziale di comando.
La relazione fra probabilità di apertura del canale e potenziale di membrana è definita dall’equazione di
Boltzman (la probabilità di apertura è funzione esponenziale di V m).
Quando si misurano le correnti macroscopiche di K + mediante la configurazione whole-cell del patch clamp,
si misura l’attività elettrica di ogni singolo canale al K + della membrana plasmatica.
Occorre, quindi, considerare:
- La conduttanza di singolo canale;
- Il numero totale di canali al K +;
- La probabilità di apertura di un singolo canale al K +.
Nel grafico in B si osserva come la relazione corrente-voltaggio non è lineare, in quanto i canali ionici
difficilmente obbediscono strettamente alla legge di Ohm.

La relazione corrente-voltaggio di un canale ionico, descritta inizialmente da Hodgkin e Huxley, dipende da:

- conduttanza del singolo canale o conduttanza della membrana per lo ione (data dal prodotto della
conduttanza di singolo canale per il numero di canali presenti sulla membrana);
- probabilità di apertura;
- gradiente elettrochimico.

La relazione corrente-voltaggio fornisce essenzialmente due importanti parametri:

- Conduttanza, che corrisponde al coefficiente angolare (pendenza) della retta che descrive la
relazione corrente-voltaggio;
- Potenziale di inversione dello ione, ovvero il valore di potenziale a cui il flusso netto di corrente
attraverso la proteina canale è pari a zero. In altre parole, rappresenta il potenziale a cui le correnti
 da entranti, man mano che la membrana si depolarizza,
diventano uscenti.

Ad ogni valore di potenziale l’intensità della corrente è data dal prodotto

della conduttanza per la differenza tra quel determinato potenziale di
membrana e il potenziale di equilibrio dello ione.

I =  x (Vm – E)

Se il potenziale di equilibrio di uno ione è pari a zero, l’intensità della corrente è pari a zero. I canali cationici
non selettivi, che non discriminano tra Na + e K+, (es. recettori nicotinici, recettori AMPA e Kainato)
presentano un potenziale di inversione pari a zero. In questi canali la relazione corrente-voltaggio è lineare
e segue la legge di Ohm, per cui la corrente è direttamente proporzionale al gradiente elettrochimico per
ogni valore del Vm (la conduttanza è la medesima sia a potenziali negativi che positivi).

La maggior parte dei canali ionici ha una relazione corrente-voltaggio di tipo non lineare; si comportano
come rettificatori di corrente, cioè conducono gli ioni maggiormente in una direzione piuttosto che
nell’altra. In tal caso, la conduttanza del canale non è costante ma varia a seconda del V m.

Nell’esempio in figura, la conduttanza è maggiore a potenziali di membrana positivi.

Un canale ionico avente una conduttanza maggiore a V m positivi, si dice che rettifica correnti uscenti. Es.
canale v.d. al K+ di tipo delayed rectifer.

Altri canali, tuttavia, conducono meglio a V m negativi e diremo che rettificano correnti entranti. Es. canale al
K+ di tipo inward rectifer. Questo è un canale ubiquitario che contribuisce, ad esempio, a mantenere il
potenziale di membrana estremamente negativo nei cardiomiociti e nei neuroni.
Un altro canale a rettificazione entrante, presente nelle cellule sia eccitabili che non eccitabili, è il canale
ORAI, che media l’ingresso di Ca2+ in seguito allo svuotamento del reticolo endoplasmatico.